实验二 RNA 提取、

逆转录 PCR

（ 8： 00~8： 05）

• 实验回顾实验一、基因组 DNA 的提取、 酶切及电泳

目的 DNA 片段 质粒

TA载体

连接

重组质粒

目的 DNA

转化

无质粒的 E.Coli 死亡 有质粒的 E.Coli 存活

含抗生素培养基中生长

PCR

2-3min

平板筛选

实验二 实验二 RNARNA 提取、逆转录提取、逆转录 PPCRCR

实验内容

1、小鼠肝脏组织总 RNA的提取；2、 RNA的琼脂糖凝胶电泳；3、以总 RNA为模板的逆转录反应；4、以 cDNA为模板的特定基因的 RT-PCR: 注：本次实验扩增 GAPDH基因 (746bp)5 、 PCR产物的电泳及回收

（ 8： 05~8： 15）

总 RNA

真核细胞的 RNA主要分为：

1、mRNA: 1-5% 起始密码： AUG 终止密码： UAA,UAG,UGA 。 5`鸟嘌呤 7 —位甲基化 CH3 修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A) 尾巴结构 20--200个 A. 翻译所必需。

2、 tRNA: 10-15%

3、 rRNA: 80-85% 大亚基 60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基 40S: 18S=1874nt

RNA 提取操作注意事项

RNA 分离的关键因素是减少 RNA 酶污染。

RNA 酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。 RNase 耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。 1 、尽量避免外源性 RNase 污染 a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） c. 一次性塑料器材最好是新开封并经过 DEPC 水处理及高压灭菌。 d. 玻璃器材、水都应该经过去 RNase 处理。对玻 璃器材还应该进行高温烘烤。

2 、应用 RNase 抑制剂抑制内源性 RNase 活性。

1 ）将 1 ml Trizol 试剂分装到 Eppendorf 管中备用。2 ）实验教师操作 : 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大 , 放在玻片上立即研磨 , 研磨要彻底。 3 ）将研磨后的组织（小米粒大小）转移至 1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合 2 min 以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4 ）室温孵育 10 min 。

（ 8 ： 15~9 ： 05 ）

发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。强调肝脏组织块不宜过大 , 研磨要彻底。

•第一部分：提取小鼠肝脏组织的总 RNA

1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，

还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总 RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。

2、 Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总 RNA， 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。

3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的 3末端有 ploy(A) 尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总 RNA中分离出来。

课间介绍 RNA提取的几种方法室温孵育 10 min

RNase抑制剂介绍1、 DEPC, 二乙基焦炭酸盐

RNA操作时最常用的 RNase 抑制剂，对核酸酶有很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的 RNase 。 RNA 提取中 所有液体试剂都应该用 DEPC处理。 有效浓度： 0.05%---0.1%，室温磁力搅拌 20分钟。 灭活条件：高压消毒，或 70 C 1 h。 在 Tris溶液中半衰期为 1.25min。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。 4 C ，或液氮中。

2、肝素 使用浓度： 0.1—10mg/ml

效 果 : 37 C 时，可抑制 95%的 RNase 活力。 如果与 DEPC 联合应用，具有极强的抑制效果。

室温孵育 10 min 结束

5）加入 200 l氯仿，震荡混匀 20-30 s，室温放置 5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体） 10, 000 rpm ，离心 5 min (统一离心 )

7）将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。

9 ： 05~10 ： 05

RNA ( 清澈透明 )

DNA

Protein

•第一部分：提取小鼠肝脏组织的总 RNA

• RNA 提取 :

RNA ( 清澈透明 )

DNA

Protein

8）沉淀 RNA：加 0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温 10 min。 10, 000rpm， 4C， (统一 ) 离心 10 min，弃上清。

10）加 1ml 75%乙醇洗涤。

11） 7500rpm， 4C 离心 1 min，弃上清 再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。

在用 TriZol 试剂提取总 RNA 时，全程均在室温进行，当 RNA 沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，而且尽可能快地进入下一个环节。

离心 10 分钟时—课间休息

注意：

75% 乙醇的作用：

不起沉淀作用，只是为了清洗管壁

加入方法一定是贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀

12）室温干燥 3－ 5 min（根据 RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥 , 此步骤非常关键。）

注意事项：RNA:

自然室温干燥

避免放在 37oC 孵箱中过度干燥以防无法溶解。

RNA 沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成 RT 的失败，但过分干燥又是造成 RNA 不溶解的主要原因 。判断 RNA 沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。

RNA pellet ：乳白色，透明胶样干燥后无色透明

13）用加样器吸取冰冷 DEPC-H2O 18 l，加到 RNA上，进行吹打溶解 RNA 沉淀。溶解的 RNA应置冰上保存。

14) 吸出 9 l 溶液放到冰上备用 ( 将用于电泳 ).15) 剩余 9 l 溶液 , 放到冰上备用（用于 RT－PCR ） .

RNA 的溶解：

注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响 RNA的溶解。

避免气泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体

判断溶解程度：

吹打时液体流动不拐弯为止。

逆转录酶：

存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型 37oC，禽类型 42oC 。

以 mRNA为模板的 DNA聚合酶，形成与 RNA碱基相互补 DNA链，后者称为互补DNA－ cDNA。

RNAaseH的活性：切掉 DNA和 RNA杂合链上的 RNA。

• RT 第二部分：逆转录反应 (RT)

AAAAAA(n)

mRNA

AAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-5

68-70oC, annealing

AAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-5

37-42oC, RTase

mRNA

mRNA

cDNA

10min

1-2h

• RT

按照下列配方进行 RNA的 RT反应：

第一步：

总 RNA 9l Oligo dT (0.05g/ml) 1l (终： 2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置 65℃水浴 10min后， 立即冰浴 2min。

在水浴 10 分钟时，开始 RNA 电泳。

RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。

关键点：•RNA 是否充分溶解•根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用 1ml Trizol 试剂提取出来的总 RNA适合于 20l体积的逆转录反应体系。

•引物的量是否合适•高温退火避免 Oligo dT锚锭点错误，同时，打开 RNA链之间的二级结构，利于 RT 。

•退火后一定迅速放在冰上在水浴 10 分钟时，开始 RNA 电泳。

将 RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳

9 l RNA 样品 2~3 l 上样液轻轻混匀， 上样 电泳 : 120伏， 10～ 20 分钟

注意 : 电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！

紫外透射仪观察电泳结果

RNA 电泳结果

rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察 rRNA的两条带（ 28S和 18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。

RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定 RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中 RNA可能发生降解。

重点讲解 28S 、 18S和 5S 的比例。

分析本次实验结果： 28S 、 18S和 5S 的比例。

RNA电泳结果分析

第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：

5RT-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l

轻弹管底混合，可用离心机甩一下。置 42 oC 水浴 1h 。将上述反应移至 68 oC 水浴 10min 以灭活 RTase ，并冰浴，保存备用。

（ 10 ： 30~11 ： 30 由老师结束实验，放 -20 oC ，下午使用 ）

cDNA 4 l

10PCR buffer（含MgCl2 ） 5 l

dNTPs (10mmol/L) 1 l

5’ 引物 (10mol/L) 1 l

3’ 引物 (10mol/L) 1 l

去离子水（补足反应体系） 39 l

Taq DNA pol. (2U/l) 1 l

轻弹管底混合（用离心机甩一下）注意：最后加入 Taq 酶。

PCR 操作

50l

在一微量离心管中依次加入下列试剂：

PCR仪设定的反应条件：94oC 45 S DNA变性55 oC 45 S DNA复性72 oC 1 min 产物链延伸25-30 个循环后 72 oC 10 min

根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片段在 500-1000bp左右时，可按下列条件进行 PCR 。

PCR仪介绍：

如果上盖加热的 PCR仪，可以直接放入仪器中进行 PCR；

如果下面加热的 PCR仪，加入 2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。

PCR反应期间讲解： 1： 20~3： 00

PCR仪内发生的反应

1）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情 况时，一定要防止污染，尤其是 PCR产物的

污 染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可 少的。

2）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板 退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模 板结合，因此，适量模板量是非常重要的。 模板过多还能大量消耗镁离子。

PCR反应注意事项：

根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间，小于 500bp，一般采用 1分钟即可，大于 500bp，可采用 2分钟，但一般超过 2000bp，一般可适当延长延伸时间 2-3分钟。 变性温度一般选用 941oC，变性时间可根据模板大小和浓度确定，一般采用 30秒。 退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和 GC含量有关。 引物长度一般在 15-25bp之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T)

如何确定 PCR 的变性、退火和延伸温度和时间？

RT 的引物选择：

• Oligo (dT)15-18

• Specific anti-sense primer

• Random primer 因为基因序列与mRNA序列是一致的。

病毒 RNA 作为 RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链 RNA病毒？负链RNA病毒？

•正链 RNA病毒： RT引物用 anti-sense primer；•负链 RNA病毒： RT引物用 sense primer 。

1.为什么要加入镁离子？ 镁离子是 Taq DNA聚合酶的辅酶， 2.0mM的浓度时酶活性最高。镁离子能够和负离子集团结合，在 PCR反应中，模板 DNA、引物 DNA、 dNTP均可和镁离子结合，尤以 dNTP影响最大。一般镁离子应比 dNTP高 0.5-1.0mM。

2.dNTP的浓度对 PCR有什么影响？ dNTP浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。

3.为什么有时候需要进行热启动？ 热启动就是让 DNA在变性温度下开始， Taq DNA聚合酶在 DNA双链充分打开之后再加入 PCR反应体系中，这样可以保证模板 DNA变性充分，引物结合顺利并特异。

PCR反应相关问题：

4、 DNA聚合酶：

1） Taq DNA聚合酶的特性 :半衰期： 95oC ， 40分钟

活 性： 5`--3`方向的聚合酶活性。 5`--3`外切酶活性。 缺乏 3`--5`外切酶活性。 因此没有校正功能。

2） Vent-TM DNA聚合酶：半衰期： 100 oC ， 95分钟

活 性：还具有 3`--5`外切酶活性。

引物设计 1、 GC比值：碱基对中的 GC之间有三条氢键， AT之间有两

条 氢键， GC和 AT在引物序列中的合理比例是设定 PCR退 火温度的 重要依据。通常在一个引物中 GC和 AT各半。

2、引物特异序列的长度至少为 15-18bp。 3、引物的方向：引物的方向永远是 5‘→3’方向，正向（ Sense）引物是与一股模板 DNA序列相一致的，而反向（ Antisense）引物则与这股模板 DNA序列相互补。 4 、引物的酶切位点：通常在引物的 5‘- 端设计适当的限制 性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。 5、引物上启始和终止密码：如果想表达 DNA片段，所 用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在 引物的酶切位点之后、特异性 DNA序列之前。 6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要 的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。

引物设计方法例：

通常在引物的 5‘-端设计适当的限制性酶切位点

凝胶成像系统：

凝胶成像系统：

播放 PCR Flash 动画 PCR 在法医学上的应用

引物的配制：

Primer 1:OD=5

注意：•计算一管引物的总含量或克分子数•先配成 100mM 的浓度作为储存液•工作液可以通过稀释获得

•如果需要反复应用的引物，配制后一定要分装保存，一段时间后弃掉。

切记：

不要将合成回来的引物一次性配成工作液！

• PCR:

PCR 的基本流程：

94oC, 45 sec

55oC, 1 min

72oC, 2 min

•退火温度的变化是根据引物的 GC比例确定或估计的；•退火时间的变化是根据引物的长度调整的。

热启动：避免发夹结构或其他二级结构影响引物的退火。

两种方式加入 DNA聚合酶：

热启动结束后暂停 PCR反应，在 PCR仪上直接趁热加入 DNA pol；

热启动结束后将反应管迅速放在冰上，然后加入 DNA pol 。

PCR 的反应体系：模板 cDNA 2 l

10buffer (MgCl2): 5 l

引物 : anti-sense (10mM) 0.5l

sense (10mM) 0.5l

dNTP (10mM): 1 l

Taq DNA pol (5U/l): 0.25 l

Add ddH2O to final volume 50l

记住：•引物和模板的退火是随机碰撞的结果。•加入顺序不是随机的： DNA聚合酶一定要最后加入。

加各种成分一定要在冰上进行。

用 PCR 合成基因：

5

5

3

3

第一对互补引物按 1:1比例加入。

变性 退火 延伸60oC 70oC

以后的 PCR 以第一轮产物为模板。注意：

PCR产物一定要从胶上纯化后再用。

实验课结束，请值日生值日。