Je dédie ce travail

à Sophie, la femme qui partage ma vie

et me supporte tous les jours,

à mes parents pour leur soutien.

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Pr P. Calvas qui m’a fait l’honneur de présider le jury de

cette thèse.

Je remercie également le Dr P. Desprès et le Pr L. Becquemont d’avoir accepté d’être les

rapporteurs de cette thèse, ainsi que pour leurs nombreuses remarques et suggestions sur

l’écriture de ce manuscrit.

Je remercier le directeur de cette thèse, le Pr D. Brassat pour m'avoir fait confiance en me

laissant une grande liberté et en me déléguant plusieurs responsabilités dont j'espère avoir

été à la hauteur.

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance au Pr R. Liblau pour m’avoir permis de faire

parti de son équipe durant mon année de M2R, mais aussi pour ses nombreux conseils

scientifiques durant les années qui ont suivies.

Pour sa confiance et son soutien financier durant ma thèse je remercie vivement. Pr M.

Clanet.

Je remercie les Pr A. Saoudi et D. Dunia pour m’avoir initié aux Emit et aux sessions

d’immunologie auxquelles ils m’ont permis d’assister et de participer

J’ai aussi une pensée particulière pour le Pr J. Zappulla qui m’a encadré durant l’année de

M2R, ainsi que le Pr. E. Piaggio pour sa présence bienveillante.

Je remercie les deux femmes de mon équipe, Florence et Lise, pour leusr aides et pour leur

bonne humeur.

Je remercie toutes les personnes des équipes Liblau, Saoudi et Dunia qui se reconnaitront

pour tous les bons moments passés à l’heure du déjeuner et des poses.

Je remercie l’ARSEP qui a financé ma thèse et qui m’a permis d’assister à des présentations

passionnantes sur la sclérose en plaques.

Afin merci à toute ma famille, mes amis, et mes compagnons de capoeira pour m’avoir permis

de passer des bons moments en dehors du laboratoire durant cette thèse.

Résumé

Nicolas Couturier

Etude génétique et épigénétique de la sclérose en plaques :

Susceptibilité et réponse au traitement

Directeur de thèse : Pr. David Brassat

Thèse soutenue à Toulouse, le 28 Octobre 2009

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune démyélinisante du système

nerveux central. Cette maladie multifactorielle est la cause majeure de handicap chez le jeune

adulte et affecte préférentiellement les femmes. Bien que sa pathogénie soit encore mal

comprise, la communauté scientifique s’accorde à dire que la SEP se développe chez des

individus génétiquement susceptibles, qui ont été en contact avec des facteurs

environnementaux, qui pourraient modifier les facteurs épigénétiques. Ces derniers seraient

impliqués dans deux étapes de la maladie, auxquelles je me suis intéressé pendant ma thèse:

(1) la susceptibilité à la maladie et (2) la réponse au traitement.

En effet, la composante génétique influence la susceptibilité à la SEP, avec

l’imputabilité de très nombreux loci ayant de faibles effets lorsqu’ils sont pris dans leur

individualité. Historiquement, le complexe majeur d’histocompatibilité fut le premier locus de

susceptibilité à la SEP découvert. Ce n’est qu’avec la généralisation des puces à

polymorphismes et l’utilisation de larges cohortes de patients que de nouveaux gènes ont pu

être découvert. Ainsi, deux gènes ont été identifiés en 2008: IL-2RA et IL-7R. Au cours de

ma thèse, un polymorphisme localisé dans un nouveau gène de susceptibilité à la SEP, TYK2,

a été identifié par une étude génétique dans la population française. Ce gène, codant pour une

tyrosine kinase associée à de nombreux récepteurs aux cytokines telles que l’IFNβ, l’IL-6,

l’IL-10, l’IL-12 et l’IL-23, présente un polymorphisme modifiant sa structure primaire et

possiblement son activité enzymatique. Afin de déterminer les conséquences de ce

polymorphisme sur la signalisation et la réponse immunitaire, une étude fonctionnelle a été

réalisée. Par ailleurs, dans la population française, un autre gène (OAS2) serait associé à une

plus grande susceptibilité à la SEP. Ce gène code pour la 2’-5’-oligoadénylate synthétase 2.

Cependant, ces données restent à confirmer sur des cohortes indépendantes de tailles plus

importantes à celle utilisée dans notre étude.

Résumé

L’autre composante qui peut influencer la susceptibilité à la SEP est la composante

épigénétique. L’épigénétique regroupe toutes les modifications transmissibles et réversibles

de l'expression des gènes ne s'accompagnant pas de changements des séquences

nucléotidiques. L’importance de cette composante est particulièrement marquée chez les

jumeaux monozygotes, qui par définition partagent la même information génétique, mais qui

peuvent être discordants dans leur statut clinique pour la SEP. Le mécanisme d’inactivation

du chromosome X fait partie de cette composante épigénétique. Chez les femmes,

contrairement aux hommes, les cellules possèdent deux chromosomes X. Par un mécanisme

de compensation, chaque cellule va décider d’inactiver un des deux chromosomes X et

conserver ce profil jusqu’à sa mort. Normalement, on retrouve dans le sang 50% de cellules

exprimant le chromosome X d’origine paternelle et 50% celui d’origine maternelle. Il a été

démontré que dans certaines pathologies auto-immunes, cela n’est plus le cas. En comparant

une population de femmes souffrant de SEP à une population de femmes « saines », nous

avons pu observer une différence dans le profil d’inactivation du chromosome X.

Une fois la maladie diagnostiquée, un traitement est proposé aux patients. La

composante génétique peut alors influencer la réponse du patient au traitement. Cela a été

précédemment démontré pour certains médicaments, comme la warfarine, anticoagulant

utilisé dans le traitement des troubles du rythme cardiaque. Dans le cadre de la SEP, il serait

important de mieux comprendre et de prédire la réponse au traitement par l’IFNβ.

L’utilisation de cette molécule immunomodulatrice apporte un réel progrès dans le traitement

de la SEP, mais avec l’apparition de nouveaux traitements il devient impératif pour le

médecin d’avancer vers une approche thérapeutique personnalisée, à la fois plus efficace et

mieux tolérée par le malade. Pour cela, nous avons constitué une cohorte européenne de

patients souffrant de SEP et traités par IFNβ. Les données cliniques disponibles sur ces

patients nous ont permis de les classer en deux groupes : les répondeurs et les non-répondeurs

au traitement. Une analyse préliminaire des polymorphismes contenus dans des gènes de la

cascade de signalisation de l’IFNβ a révélé que plusieurs polymorphismes présents dans la

séquence du gène codant pour l’enzyme 2’-5’-oligoadénylate synthétase 1 (OAS1) et du gène

TRAIL pourraient influencer la réponse des patients atteints de SEP à cette molécule.

Abstract

Nicolas Couturier

Genetics and Epigenetics in Multiple Sclerosis:

Susceptibility and Response to Treatment

Thesis supervisor : Pr. David Brassat

Toulouse, October 28th 2009

Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating disease of the central nervous system that

leads to disability in young adults. As other autoimmune diseases, MS is characterized by a

striking female predominance; however its pathogenesis remains elusive. It is widely believed

to occur in genetically susceptible individuals after exposure to undefined environmental

factors that influence epigenetic factors. These factors may act at two different levels: (1) on

the susceptibility to develop MS and (2) on response to MS treatment

Little is known about genes that are involved in MS susceptibility. Over more than 30

years, with the discovery of the association of major histocompatibility complex with MS risk

and it confirmation in a wide range of population, lead us to search whether other new

susceptibility genes are also involved. With the development of genome-wide association

studies, two non-HLA variants (IL-2R and IL-7R variants) have been implicated with strong

confidence in MS susceptibility. Recently genetic association studies have identified a

polymorphism (rs34536443) in TYK2 gene associated with MS susceptibility, and we

confirmed this association in the French population. Rs34536443 polymorphism localizes in

the exon 21 of TYK2 gene, and codes either a proline (major allele) or an alanine at position

1104, in the tyrosine kinase. A functional consequence of this polymorphism could be to alter

kinase function of this protein as suggested by two independent studies. Moreover, TYK2

deficiency revealed an important role in immunity and in lymphocyte differentiation as

demonstrated in mouse model. Given these data, we investigated the potential functional

consequences of the rs34536443 polymorphism on TYK2 activation, and in lymphocyte

polarization. Moreover, our preliminary data suggest association between OAS2

polymorphisms and MS susceptibility. This association has to be confirmed in a new

independent MS cohort.

Abstract

In biology, the term epigenetics refers to changes in gene expression caused by

mechanisms other than modifications in the underlying DNA sequence. These changes may

remain through cell divisions. These epigenetic modifications could be implicated in MS

susceptibility too. Monozygotic twins share the same genetic information but two third of

identical twins are discordant for MS status. In this case, the importance in MS susceptiblity

of epigenetic factors is clearly visible. X-chromosome inactivation is an epigenetic

mechanism occurring only in females. In female mammalian cells, one of the two X-

chromosome is inactivated in early embryonic life. Thus, females are mocaics for two cell

populations, cells with either the paternal or the maternal X in the active form. X-choice is

assumed to be random, and the result is generally 50% of cells expressed the paternal and the

remaining 50% expressed the maternal genes. Studies reported for some autoimmune disease

(lupus, autoimmune thyroid diseases and rheumatoid arthritis) an association with a deviation

from this ratio 50:50%. In MS, ours results revealed a difference in degree of skewing in MS

patients compare to controls.

After MS development, genetic factors may influence patient response to MS

treatment. Pharmacogenetics is a science that provides some clue on how to define best

responders. For instance, variants in the VKORC1 gene could explain why efficient

anticoagulant warfarin dose is variable between patients. Ten years ago, interferon beta

(IFNβ) was the first therapy proposed with a demonstrated efficacy in MS. This

immunomodulatory drug is a major advancement in MS therapy as it allows a 30% decrease

in the relapse rates, in disability progression and in lesion load, and an increase in patient’s

quality of life. But with the development of new drugs, it will be of importance to personalise

medicine. Hence, exploring the degree of variability in candidate genes for direct association

with treatment response represents a promising approach to improve the overall efficacy of

the treatment. For this study, naïve patients to immunotherapy and starting IFNβ treatment

were recruited in the European community. We categorized MS patients on clinical criteria in

two groupes: responders and non-responders to IFNβ treatment. In a preliminary study,

significant associations with OAS1 and TRAIL polymorphisms were found suggesting that

genetic variants in these two genes may be of clinical interest in MS as predictors of the

efficacy to IFNβ therapy.

Sommaire

ABREVIATION ET ANGLICISMES P1

LISTE DES FIGURES P3

INTRODUCTION P7

II .. LL aa sscclléérr oossee eenn ppllaaqquueess P9

I.1. Les différentes formes cliniques de sclérose en plaques et évolution de la

maladie P10

I.2. Conséquences anatomiques de la maladie P13

I.3. Pathogénie de la sclérose en plaques P13

I.4 Critères de diagnostic de la sclérose en plaques ou critères de McDonald P15

I.5. Les méthodes d’investigation paracliniques P16

I.5.1. Imagerie par résonnance magnétique

I.5.2. Analyse du liquide céphalo-rachidien

I.5.3. Examen des potentiels évoqués visuels

I.6. Mesure de la progression du handicap P19

II II .. LL eess ffaacctteeuurr ss ddee ssuusscceepptt iibbii ll ii ttéé àà llaa sscclléérr oossee eenn ppllaaqquueess P23

II.1. Les facteurs génétiques P23

II.1.1. Les éléments soulignant l’importance de la génétique dans la maladie

II.1.2. Etiologie génétique de la sclérose en plaques

II.1.3. Les différentes classes de polymorphismes génétiques chez l’Homme

1.3.1. Les polymorphismes d’un seul nucléotide

1.3.2. Les polymorphismes structuraux

II.1.4. La notion de déséquilibre de liaison entre plusieurs polymorphismes

II.1.5. Les moyens mis en œuvre dans l’identification des gènes de susceptibilité

à la sclérose en plaques

1.5.1. L’approche gène candidat vs l’approche sans à priori

a. Approche gène candidat

b. Approche sans à priori par GWAS

1.5.2. Configuration des cohortes utilisées en association génétique

II.1.6. Importance du complexe majeur d’histocompatibilité dans la susceptibilité

à la sclérose en plaques

1.6.1. Implication du CMH-II dans la susceptibilité à la sclérose en plaques

Sommaire

1.6.2. Implication du CMH-I dans la susceptibilité à la sclérose en plaques

II.1.7. Les autres gènes associés à la susceptibilité à la SEP

1.7.1. Le récepteur à l’IL-7

1.7.2. Le récepteur à l’IL-2

1.7.3. Le CD58

1.7.4. La tyrosine kinase 2

II.2. Les facteurs environnementaux P51

II.2.1. Les risques micro-environnementaux

II.2.2. Les risques environnementaux

2.2.1. Les agents infectieux

a. Le virus d’Epstein-Barr

b. Les autres pathogènes suspectés

2.2.2. L’exposition lumineuse et la vitamine D

2.2.3. La cigarette

II.3. Les facteurs épigénétiques P60

II.3.1. Influence de l’épigénétique dans la susceptibilité aux maladies auto-

immunes

II.3.2. Comment l’épigénétique pourrait modifier la susceptibilité à la sclérose

en plaques ?

3.2.1. Modification épigénétique du locus PAD2

3.2.2. Impact de l’épigénétique sur la différenciation cellulaire

3.2.3. L’inactivation du chromosome X

a. Mécanismes d’inactivation du chromosome X

b. Implication de l’inactivation du chromosome X dans l’expression phénotypique

c. Causes du biais dans l’inactivation du chromosome X

d. Conséquences de l’inactivation du chromosome X

e. Monosomie ou perte du chromosome X

II II II .. TTrr aaii tteemmeenntt eett pphhaarr mmaaccooggéénnéétt iiqquuee ddee llaa sscclléérr oossee eenn ppllaaqquueess P77

III.1. Les traitements de fond disponibles en 2009 P77

III.1.1. L’interféron bêta

III.1.2. L’acétate de glatiramère

III.1.3. L’anticorps monoclonal natalizumab

III.1.4. La mitoxantrone

III.2. Comparaison de l’efficacité des thérapies actuelles P85

Sommaire

III.3. Optimisation des traitements existants P86

III.4. Les nouveaux traitements en cours de développement P88

III.5. Définition de la réponse au traitement dans la sclérose en plaques P93

III.5.1. Traitement de la sclérose en plaques par une approche d’escalade

thérapeutique

III.5.2. Prédiction de la réponse au traitement des patients sclérose en plaques

en vue d’une médecine personnalisée

5.2.1. Recherche de bio-marqueurs prédictifs de la réponse au traitement

5.2.2. Anticiper la réponse au traitement par analyse de l’expression génique

5.2.3. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au traitement

IV. Les iinntteerr fféérr oonnss ddee ttyyppee 11 P99

IV.1. La voie de signalisation des interférons de type 1 P99

IV.2. Les protéines antivirales induites par les interférons de type 1 P100

IV.2.1. La protéine MxA

IV.2.2. La voie des OAS et de la RNaseL

IV.2.3. La protéine kinase PKR

IV.2.4. Le facteur ISG15

IV.3. Interférons de type 1 et sclérose en plaques P105

IV.3.1. Evidences de l’importance des interférons de type 1 dans la sclérose

en plaques

IV.3.2. Mécanisme d’action de l’IFNβ dans le traitement de la sclérose en plaques

3.2.1. Effet de l’IFNβ sur la migration des cellules immunes

a. Adhésion à la barrière hémato-encéphalique

b. Migration à travers l’espace péri-vasculaire

3.2.2. Effet de l’IFNβ sur l’activation et la polarisation des cellules immunes

3.2.3. Effet de l’IFNβ sur l’apoptose des cellules immunes

MATERIELS ET METHODES P113

RESULTATS P125

Facteurs génétique et susceptibilité à la SEP P127

Facteurs épigénétiques et susceptibilité à la SEP P153

Facteurs génétiques et réponse au traitement P163

Sommaire

DISCUSSION ET PERSPECTIVES P175

ANNEXES P191

BIBLIOGRAPHIE P197

1

ABREVIATIONS ET ANGLICISMES

APC Cellules présentatrices de l’antigène Mx Myxovirus-Resistance-Protein

ARNdb ARNs doubles brins MZ Jumeaux monozygotes

BBB Barrière hémato-encéphalique Nabs Anticorps neutralisants

BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor NO Oxyde nitrique

CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité OAS 2’-5’OligoAdénylate Synthétase

CNV Variation du nombre de copies OPC Oligodendrocyte Precursor Cell

DZ

EAE

Jumeaux dizygotes

Encéphalomyélite Auto-immune

PKR

PLP

Protéine Kinase Régulée par les ARNs

Protéine protéolipide de la myéline

EDSS

Expérimentale

Echelle élargie de progression du

PP-MS

PEV

SEP progressive primaire

Potentiels Evoqués Visuels

handicap PF Paramètres Fonctionnels

EBV Virus d’Epstein-Barr RR-MS SEP rémittente-récurrente

GA Acétate de glatiramère SNC Système Nerveux Central

GWAS Genome-Wide Analysis Study SEP Sclérose En Plaques

HHV6 Virus herpétique humain 6 SNP Single Nucleotide Polymorphism

IFN Interféron SP-MS SEP progressive secondaire

IgG Immunoglobuline d’isotype G S1P Sphingosine-1-Phosphate

IL Interleukine TDT Test de Déséquilibre de Transmission

ILxR Récepteur à l’interleukine x Thx Lymphocytes T-helper x

IRM Imagerie par Résonnance Magnétique TYK2 Tyrosine Kinase 2

ISGF3 IFN-Stimulated Gene Factor 3 VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1

ISRE IFN-Stimulated Response Element VD Vitamine D

JAK

KIR

Janus Kinase

Killer cell Immunoglobulin-Like

VLA-4

Xce

Very Late Activating Antigen-4

X-Controlling Element

Receptor XCI Inactivation du chromosome X

LCR Liquide Céphalo-Rachidien Xic X Inactivation Center

LD

LEMP

Déséquilibre de liaison

LeucoEncéphalopathie Multifocale

Xist

XITE

X -Inactive Specific Transcript

X-Inactivation Intergenic Transciption

MAF

Progressive

Fréquence de l’allèle mineur d’un

Xpr

Elements

X-Pairing Region

polymorphisme

MBP Protéine basique de la myéline

MMP Métallo-protéases

MSSS Score de sévérité de la sclérose en

plaques

MTX Mitoxantrone

2

3

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Schéma des principaux symptômes rencontrés dans la SEP.

Figure 2 : Description schématique de l’évolution clinique de la SEP.

Figure 3 : Présence de bandes oligoclonales d’IgG retrouvées uniquement dans le LCR d’un

individu souffrant de SEP.

Figure 4 : Comparaison d’un PEV enregistré chez un individu souffrant de SEP avec celui

d’un individu sain.

Figure 5 : Echelle EDSS simplifiée, ne présentant que les scores principaux de la SEP.

Figure 6 : Score de sévérité de la SEP (MSSS) global.

Figure 7 : Les différentes voies pouvant conduire au développement de la SEP.

Figure 8 : Risque de récurrence intrafamiliale pour la SEP.

Figure 9 : Les variants de faible fréquence et la susceptibilité aux maladies.

Figure 10 : Les différentes catégories de polymorphismes génétiques chez l’Homme.

Figure 11 : Nombre de polymorphismes détectés dans le génome de 4 individus de

différentes ethnies.

Figure 12 : Nombre et caractéristiques des variations structurales détectées dans le génome

d’un individu d’origine caucasienne.

Figure 13 : Les déséquilibres de liaison des variants communs du génome humain diffèrent

entre les populations.

Figure 14 : Association des polymorphismes par une approche directe ou par une approche en

tagSNP.

Figure 15 : Recouvrement des loci contenant les facteurs de risque génétique aux maladies

communes humaines.

Figure 16 : Approche GWAS en plusieurs étapes afin de réduire la taille des échantillons.

Figure 17 : Allèles de l’haplotype du HLA-DR2 associés à la sclérose en plaques

(l’implication des marqueurs entre parenthèse semble due à un déséquilibre de liaison).

Figure 18 : Risque génotypique relatif pour la sclérose en plaques en fonction des

combinaisons d’allèles contenues dans le locus HLA-DRB1.

4

Figure 19 : Association du HLA avec la sclérose en plaques.

Figure 20 : Les gènes associés au risque de développer une sclérose en plaques.

Figure 21 : Récepteurs aux cytokines qui utilisent TYK2 dans leur voie de signalisation.

Figure 22 : Prévalence de la SEP dans le monde.

Figure 23 : Représentation schématique de l’incidence de la SEP en fonction de l’infection

par le virus d’Epstein-Barr.

Figure 24 : Métabolisme de la vitamine D.

Figure 25 : Modèle pour la transmission d’un phénotype en l’absence de mutation du gène

Kit proposé par Rassoulzadegan et al.

Figure 26 : Mécanisme proposé dans le développement de la SEP suite à une dérégulation

épigénétique du gène PAD2 conduisant à la surexpression de la protéine dans les

oligodendrocytes.

Figure 27 : Modèle possible d’inactivation du chromosome X.

Figure 28 : Mécanisme expliquant le biais dans l’inactivation du chromosome X.

Figure 29 : Représentation schématique du mécanisme proposé pour expliquer l’effet

immuno-modulateur de l’acétate de glatiramère.

Figure 30 : Les différents types d’anticorps monoclonaux utilisés en thérapie.

Figures 31 : Les cibles thérapeutiques possibles dans le traitement de la sclérose en plaques.

Figures 32 : La voie de signalisation des interférons de type 1.

Figure 33 : Mécanisme d’action de la protéine MxA.

Figure 34 : La voie antivirale OAS1-RNase L.

Figure 35 : Mécanisme d’action de la PKR.

Figure 36 : Mécanisme de l’ISGylation.

Figure 37 : Le polymorphisme rs34536443 ne modifie pas l’expression protéique de TYK2.

Figure 38 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de TYK2.

Figure 39 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de la voie de

signalisation de l’IFNβ.

5

Figure 40 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des gènes induits

par l’IFNβ.

Figure 41 : Le polymorphisme rs34536443 influence l’expression des facteurs nucléaires

impliqués dans la polarisation lymphocytaire.

Figure 42 : L’expression des facteurs nucléaires impliqués dans polarisation lymphocytaire

permet de classer les individus en fonction de leur génotype pour le polymorphisme

rs34536443.

Figure 43 : Le polymorphisme rs34536443 influence la sécrétion de cytokines par les

lymphocytes T.

Figure 44 : Etude par cytométrie de l’effet du polymorphisme rs34536443 sur la production

de cytokines par les lymphocytes.

Figure 45 : Comparaison de l’expression des gènes de la voie des IFNs de type 1 chez des

patients SEP par rapport à des témoins.

Figure 46 : Le gène OASL n’est pas associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles

trio françaises.

Figure 47 : Le gène OAS2 est associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles trio

françaises.

Figure 48 : Protocole expérimental permettant de mesurer le profil d’inactivation du

chromosome X chez une femme.

Figure 49 : L’immortalisation des cellules immunitaires par l’EBV modifie leur profil de

XCI.

Figure 50 : Le profil du XCI diffère entre la population de patientes SEP et la population de

témoins.

Figure 51 : Comparaison du coefficient de corrélation pour le profil du XCI au sein de

cohortes de jumelles MZ, en fonction du statut clinique pour la SEP.

Figure 52 : Monosomie du chromosome X au sein de paires de jumelles MZ discordantes

pour la SEP.

Figure 53 : Association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec la réponse au

traitement de la SEP par l’IFNβ.

6

Figure 54 : Association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la réponse au

traitement de la SEP par l’IFNβ.

Figure 55 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec

la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.

Figure 56 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la

réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.

Figure 57 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des facteurs

nucléaires de polarisation lymphocytaire en présence d’IFNβ.

Tableau I : Critères de McDonald révisés (2005) pour le diagnostic de la SEP.

Tableau II : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP par

une approche en cas-témoins.

Tableau III : Analyse TDT du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP sur 640

familles trio françaises.

Tableau IV : Analyse d’association du polymorphisme rs12815666 d’OAS2 dans la SEP par

une approche en cas-témoins.

Tableau V : Analyse d’association du polymorphisme rs1298301 d’OAS2 dans la SEP par

une approche en cas-témoins.

Tableau VI : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 avec la réponse

au traitement de la SEP par l’IFNβ.

Tableau S1 : Liste et localisation sur la plaque de PCRarray des gènes amplifiés.

Tableau S2 : Analyse TDT des polymorphismes rs3741981 et rs10774671 d’OAS1 dans la

SEP sur 591 familles trio françaises.

Tableau S3 : Analyse TDT des haplotypes formés par des polymorphismes rs3741981 et

rs10774671 d’OAS1 dans la SEP sur 591 familles trio françaises.

7

II NNTTRROODDUUCCTTII OONN

Introduction

8

Introduction

9

I. La sclérose en plaques

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire chronique

touchant le système nerveux central (SNC), c'est-à-dire le cerveau ainsi que la moëlle

épinière. Elle affecte environ 2,5 millions de personnes dans le monde (80 000 personnes en

France) et en moyenne 120 personnes pour 100 000 habitants sont nouvellement

diagnostiquées chaque année [Compston et al., 2002]. 70% des nouveaux patients sont des sujets

jeunes, ayant entre 20 et 40 ans. La SEP représente la cause majeure de handicap dans cette

tranche d’âge. La prévalence de la maladie dans la population générale est variable en

fonction des régions du monde étudiées, avec 60-200 patients atteints de SEP pour 100 000

personnes en Europe et en Amérique du nord, alors que dans les zones de faible prévalence

comme le Japon, la prévalence est environ 10 fois moins importante. De façon similaire aux

autres maladies auto-immunes humaines, les femmes sont plus fréquemment touchées que les

hommes, avec un ratio homme : femme de 1:3. De plus, plusieurs études à travers le monde

suggèrent que, durant les 50 dernières années, l’incidence de la maladie a augmenté [Barnett et

al., 2003], et que cette augmentation est plus rapide chez les femmes que chez les hommes,

modifiant encore plus le ratio homme : femme [Wallin et al., 2004; Orton et al., 2006].

Chez la majorité des patients, les manifestations cliniques apparaissent dès le début de

la maladie et indiquent l’implication du système nerveux moteur, sensoriel, visuel et

autonome (Figure 1). Par ailleurs, il existent d’autres symptômes ou signes moins

perceptibles (dépression, fatigue, etc…) qui peuvent passer inaperçus et qui ne seront

diagnostiqués que de manière rétrospective [Compston et al., 2002].

Introduction

10

Figure 1 : Schéma des principaux symptômes rencontrés dans la SEP.

I.1. Les différentes formes cliniques de sclérose en plaques et évolution de la

maladie

Dès le 19ème siècle, trois signes cliniques maintenant connus comme associés à la SEP

- dysarthrie (troubles de l’articulation), ataxie (trouble de l’équilibre) et tremblements - étaient

déjà décrits par les médecins. C’est le neurologue français, Jean-Martin Charcot, qui en 1868

associa tous ces symptômes à une seule pathologie qu’il nomma la « sclérose en plaques »

[Charcot et al., 1868]. Un siècle plus tard, Schumacher et al. définirent le terme de poussées dans

la SEP. Ils les qualifièrent comme la dysfonction localisée d’une fonction, affectant la

substance blanche, et dont l’effet doit perdurer durant au moins 24 heures tout en étant

précédé d’au moins 30 jours de stabilité clinique [Schumacher et al., 1968]. Les poussées de SEP

sont le reflet clinique de la présence de foyers inflammatoires actifs au niveau du SNC. Ces

zones inflammatoires conduisent à des dommages au niveau des fibres myélinisées d’axones

et des neurones, dont la conséquence est d’entraîner des défauts dans la conduction des

signaux neurologiques. Cependant, cette définition originale de poussées n’est pas totalement

vraie. En effet, la substance grise du SNC peut elle aussi être affectée au cours de la maladie,

comme cela est visible en imagerie par résonnance magnétique (IRM ) par une diminution

du volume total de la matière grise [Sanfilipo et al., 2006] et par la présence de lésions [Bo et al.,

2003]. Par ailleurs, les 30 jours d’intervalle de stabilité clinique entre les poussées furent

arbitrairement choisis, sans aucune correspondance avec les connaissances actuelles sur la

Introduction

11

biologie de la maladie. On sait qu’un même patient présente de nombreuses lésions dans le

SNC, à des stades d’évolution différents, qui progressent de manière indépendante, et qui sont

toutes susceptibles d’induire des poussées. Enfin, il existe des pseudo-poussées, qui sont

rapidement réversibles et se déclarent en présence d’un stress physiologique. Ces pseudo-

poussées ne sont pas dues à l’apparition de nouveaux foyers inflammatoires, mais sont plutôt

la conséquence des dommages présents dans d’anciennes lésions et qui perturbent la

conduction du signal en présence d’un stress.

La SEP n’est pas une maladie homogène quant à l’expression des symptômes. En

effet, il est possible de distinguer deux formes cliniques majeures de SEP : les SEP à forme

rémittente-récurrente (RR-MS) et les SEP progressives primaires (PP-MS). Ces deux

formes peuvent être considérées comme deux maladies à part entière car très hétérogènes sur

le plan radiologique [McFarland et al., 1999 ; Rovaris et al., 2003], histologique [Lucchinetti et al.,

2000] et clinique [Sospedra et al., 2005] (Figure 2). La forme la plus fréquente (85% des cas) est

la forme RR-MS qui va présenter une évolution par poussées, tandis que les 15 autres

pourcents des cas sont des formes PP-MS présentant une évolution plus linéaire de la maladie

[Vollmer et al., 2007].

- La forme RR-MS se caractérise donc par des poussées. Une poussée est l’apparition

d’un signe clinique qui généralement perdure dans le temps (entre une semaine et un

mois). Ces poussées sont associées à l’apparition de lésions inflammatoires dans le

SNC, visibles en IRM. Au début de l’évolution de la RR-MS, la majorité des patients,

récupèrent complètement de leur handicap après ces épisodes aigüs de la maladie. On

assiste alors à une alternance dans le temps de poussées suivies de périodes de

récupération plus ou moins longues. Puis avec le temps, les poussées deviennent plus

fréquentes et le patient commence à ne récupérer que partiellement de son handicap ce

qui conduit à l’accumulation de dommages neurologiques [Lublin et al., 1996 ; Thompson

et al., 1990]. Les poussées sont des événements qu’il est toujours difficile de prédire,

cependant des changements environnementaux peuvent influencer le risque de de

survenue d’une poussée. Les changements hormonaux durant la grossesse et après

l’accouchement sont aussi connus pour affecter la fréquence des poussées. Le nombre

moyen de poussées annuelles diminue progressivement durant les 3 trimestres de

grossesse (passant de 0,7 avant la grossesse, à 0,6, puis 0,5 et enfin 0,2 aux 1er, 2ème et

3ème trimestres respectivement). Puis, rapidement après l’accouchement, le nombre

moyen de poussées annuelles augmente fortement (taux annuel moyen : 1,2) pour

Introduction

12

retrouver progressivement une valeur normale un an après l’accouchement [Confavreux

et al., 1998]. Ainsi, bien que cette période dans la vie d’une femme soit susceptible

d’influencer le nombre de poussées, si on prend l’ensemble de la période (grossesse et

post-accouchement) le risque global de progression du handicap n’est pas modifié.

Plusieurs études suggèrent également que les médiateurs inflammatoires associés à

une infection aigüe pourraient précéder le début d’une poussée dans 20 à 30% des cas.

Suite à cette période de RR-MS, environ 65% des patients entrent dans une nouvelle

phase de la maladie, appelée SEP progressive secondaire (SP-MS). A ce stade, la

maladie n’évolue plus par poussées, mais le handicap progresse de manière continue.

- La forme PP-MS se caractérise, dès le début de la maladie, par une lente aggravation

du handicap sans qu’il n’y ait de rémission constatée. Cette forme de SEP se manifeste

souvent comme une atteinte de la moelle épinière même si une atteinte du cerveau

peut aussi arriver. Comparé à la forme RR-MS, le handicap évolue généralement plus

rapidement chez les patients souffrant de cette forme de la maladie.

Il est important de noter que le temps moyen entre le diagnostic de SEP et le décès du patient

est de 30 années environ, ce qui représente une réduction de l’espérance de vie de 5 à 10 ans

[Bronnum-Hansen et al, 2004]. Les patients souffrant de SEP ont aussi un risque accru de suicide,

reflétant une augmentation des périodes de dépression au cours de leur vie [Minden et al., 1990].

Par ailleurs, chez des patients présentant des troubles neurologiques importants, le décès peut

dans 2/3 des cas être attribuable à la maladie, à une augmentation de la susceptibilité aux

pathogènes, ou à un risque de complications sévères de maladies induites par les infections.

Figure 2 : Description schématique de l’évolution clinique de la SEP. D’après Vollmer et al., J. Neurol. Sci.,

2007.

Introduction

13

I.2. Conséquences anatomiques de la maladie

La principale cellule cible du système immunitaire est l’oligodendrocyte. Cette cellule

du SNC synthétise et maintient une gaine de myéline autour de courts segments de 20 à 40

axones avoisinants. La gaine de myéline consiste en une membrane condensée, spiralée

autour de l’axone, et qui forme une gaine isolante segmentée nécessaire à la conduction

saltatoire de l’influx nerveux axonal. Ainsi, on retrouve tout au long de l’axone une alternance

de segments myélinisés et de segments non-myélinisés ou nœuds de Ranvier qui regroupent

des canaux sodium voltage-dépendants. Le potentiel d’action, lorsqu’il se propage le long de

l’axone, passe d’un nœud de Ranvier à un autre et de manière passive dans les segments

myélinisés du nerf (d’où l’utilisation du terme de conduction saltatoire).

La démyélinisation des axones explique en grande partie les signes cliniques que l’on

observe chez un patient souffrant de SEP. La destructuration de la segmentation de l’axone

empêche la conduction saltatoire, ce qui ralentit la vitesse de conduction de l’influx nerveux.

Par ailleurs, les axones démyélinisés peuvent spontanément déclencher des potentiels

d’action. Cela peut se traduire chez le patient par la sensation de décharges électriques ou la

visualisation de flashs lumineux. Enfin, si des axones démyélinisés sont proches, le signal

peut se propager d’un axone vers un autre ce qui entraîne de nombreux signes cliniques

(douleurs, tétanie…).

La caractéristique majeure de la SEP est l’apparition de lésions (ou plaques) dans le

SNC du patient. Ces lésions sont le stade final d’un procédé impliquant l’inflammation, la

succession de démyélinisation et de remyélinisation, la déplétion des oligodendrocytes,

l’astrocytose et la dégénérescence axonale et neuronale [Compston et al., 2008].

I.3. Pathogénie de la sclérose en plaques

Il est généralement admis que la SEP débute par une infiltration de lymphocytes auto-

réactifs, passant du sang vers le SNC à travers la barrière hémato-encéphalique (BBB).

Cette transition d’un état de surveillance physiologique vers une cascade pathologique se

produirait suite à un défaut de régulation. C’est ce défaut de régulation qui autoriserait aux

cellules immunitaires de monter une réponse inflammatoire dans le SNC. En effet, il a été

démontré que les cellules régulatrices de patients souffrant de SEP sont moins efficaces dans

la suppression d’une réponse effectrice [Viglietta et al., 2004]. Par ailleurs, les cellules T CD4+

Introduction

14

auto-réactives de ces patients présenteraient une sensibilité moindre à l’apoptose via la

surexpression d’une molécule de signalisation : l’arrestine bêta 1 [Shi et al., 2007]. Ce serait

aussi la défaillance de mécanismes de régulation locaux du SNC qui serait responsable de

l’accumulation périvasculaire de lymphocytes T CD8+ retrouvés à proximité (ou au contact)

d’oligodendrocytes et d’axones démyélinisés [Neumann et al., 2002]. L’importance du rôle

historiquement assigné aux lymphocytes T-helper 1 (Th1) par l’étude chez animal de

l’ encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle murin de la SEP, est

aujourd’hui remise en cause [Sospedra et al., 2005]. L’inflammation serait plutôt montée par un

nouveau sous-type de lymphocytes T capables de sécréter de l’interleukine 17 sous le contrôle

de l’interleukine 23 [Langrish et al., 2005]. Deux interleukines (IL ) sécrétées par les

lymphocytes Th17, l’IL-17 et l’IL-22, seraient impliquées dans l’ouverture de la BBB [Kebir et

al., 2007], permettant l’entrée de ce sous-type de lymphocytes dans le SNC [Tzartos et al., 2008].

Les lymphocytes Th17 pourraient alors directement tuer les neurones ou recruter d’autres

cellules impliquées dans la réponse inflammatoire conduisant à la destruction de la myéline.

Enfin, le système immunitaire inné (microglie, mastocytes…) pourrait aussi jouer un rôle

dans la progression de l’inflammation via la production de composés réactifs de l’oxygène

[Sospedra et al., 2005] ou l’implication de récepteurs membranaires de mort cellulaire [Zajicek et

al., 1992].

La question du ou des antigène(s) spécifique(s) de cette réponse immune n’a pas

encore trouvé de réponse, principalement car des lymphocytes auto-réactifs sont

naturellement présents chez des personnes saines. Historiquement, les protéines composant la

myéline était considérées comme les cibles uniques de la réponse immunitaire à l’initiation de

la SEP. Cependant d’autres composants du SNC, comme la crystalline αB [Ousman et al., 2007]

ou la neurofascine [Mathey et al., 2007] semblent aussi être la cible de la réponse immunitaire.

Les lésions débuteraient par des points focaux d’inflammation du SNC qui, par la suite,

donneraient naissance à des plaques de démyélinisation présentant une expansion radiale

progressant à travers la substance blanche d’apparence normale [Kutzelnigg et al., 2005].

Les phases de rémission dans la SEP sont le reflet d’un mécanisme au cours duquel les

gaines de myéline sont reformées et la conduction saltatoire restaurée : ce phénomène est

appelé remyélinisation [Franklin et al., 2008]. Cette remyélinisation se traduit en IRM par

l’apparition de plaques de remyélinisation dites « fantômes ». Ce phénomène, qui est

généralement plus actif dans les formes RR-MS, peut cependant avoir lieu durant la phase

progressive de la maladie. Par ailleurs, une différence inter-individuelle dans l’efficacité de la

Introduction

15

remyélinisation existe [Patrikios et al., 2006]. Les débris de myéline sont alors phagocytés et des

précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), naturellement présents dans le SNC mature [Horner

et al., 2000], peuvent migrer en réponse à des chimiokines telles que les sémaphorines 3A et 3F

[Williams et al., 2007]. Des OPC ont été retrouvés au niveau des lésions de SEP [Scolding et al.,

1998] et pourraient constituer les cellules capables de remyéliniser les axones nus [Chadran et

al., 2008]. Cependant, comme le reflète l’accumulation du handicap tout au long de l’avancée

de la maladie, la succession de cycles de démyélinisation et de remyélinisation semble

progressivement épuiser le système de réparation du tissu. Même si plusieurs hypothèses

peuvent expliquer cet épuisement, comme la présence de facteurs inhibiteurs (ou l’absence de

facteurs activateurs) de la différenciation des OPC en oligodendrocytes ou encore un

épuisement du nombre d’OPC [Franklin et al., 2002 ; Penderis et al., 2003], aucun mécanisme n’a

été clairement démontré.

I.4. Critères de diagnostic de la sclérose en plaques ou critères de McDonald

Il est important de rappeler qu’aujourd’hui encore aucun test reposant uniquement sur

l’analyse d’un seul critère clinique ou biologique ne permet de diagnostiquer de manière

fiable un début de SEP. A l’origine, le diagnostic de la maladie reposait sur des critères

cliniques et parfois paracliniques. En 2001, un regroupement international de neurologues

proposa un nouveau consensus pour le diagnostic de la SEP basé sur des critères cliniques,

paracliniques et IRM. Ce nouveau consensus fut appelé « les critères de McDonald »

[McDonald et al., 2001]. Les critères de McDonald reposent sur le principe que les lésions

doivent être disséminées dans l’espace mais aussi dans le temps afin que le diagnostic de SEP

soit posé de manière non ambiguë. Chose nouvelle, les critères de McDonald incluent aussi

un schéma permettant de diagnostiquer les formes PP-MS qui sont caractérisées, dès

l’apparition de la maladie, par l’absence d’une succession de poussées et de rémissions. A la

suite du diagnostic, le neurologue peut classer les patients en 3 catégories : patients souffrant

de SEP, patients ne souffrant pas de SEP et patients souffrant possiblement de SEP. Dans ce

dernier cas, des examens complémentaires (analyse du liquide céphalo-rachidien, examen des

potentiels évoqués visuels) doivent être pratiqués, et le patient doit être réévalué par la suite.

Ces critères sont internationalement reconnus et ont été rapidement adoptés par l’ensemble de

la communauté de neurologues. En 2005, une révision des critères de McDonald fut apportée

afin de simplifier et de raccourcir le temps de diagnostic de la SEP, tout en maintenant une

Introduction

16

bonne sensitivité et spécificité [Polman et al., 2005]. Comme représenté dans le tableau I, le

neurologue s’appuie sur des informations cliniques qui sont complétées par des informations

IRM ou parfois paracliniques.

Tableau I : Critères de McDonald révisés (2005) pour le diagnostic de la SEP. D’après Polman et al., Ann.

Neurol., 2005.

I.5. Les méthodes d’investigation paracliniques

Les différentes méthodes d’investigation paracliniques permettent d’aider le

neurologue dans son diagnostic en renforçant les observations cliniques lorsqu’elles ne sont

pas suffisantes.

I.5.1. Imagerie par résonnance magnétique

L’IRM conventionnelle est un outil paraclinique précieux pour le clinicien à la fois

dans le diagnostic d’un début de SEP et dans l’évaluation de la progression et de l’activité de

la maladie. Les lésions apparaissent sous forme de taches hypo- ou hyper-intenses reflétant

une inflammation locale ou une destructuration de l’intégrité du tissu. La prise d’images du

SNC se fait en deux temps afin de scanner le cerveau puis la moëlle épinière du patient. Les

données IRM peuvent présenter certains avantages par rapport à une approche purement

Introduction

17

clinique. D’abord, ces données sont beaucoup moins subjectives. De plus, la technique est très

sensible aux changements induits par l’avancée de la SEP [Rovaris et al. 1999] . En effet, les

événements inflammatoires visibles en IRM sont de 5 à 10 fois plus fréquents que les

poussées cliniques [Miller et al., 1996]. Cependant, la corrélation entre les mesures IRM,

l’activité de la maladie, et les manifestations cliniques sont faibles. Cette mauvaise corrélation

pourrait résulter en partie de l’incapacité à quantifier par l’approche IRM l’étendue de la

lésion, mais aussi la nature du tissu atteint.

On peut globalement dire qu’il existe principalement trois séquences d’acquisition des

images en IRM conventionnelle: la séquence T1, la séquence T1 associée à la prise de

contraste au gadolinium, et enfin la séquence T2.

- La méthode la plus sensible pour la détection de l’ensemble des lésions de SEP est

l’acquisition d’images en séquence T2. Cette sensibilité est très utile pour le diagnostic

de la maladie [McDonald et al., 2001] mais aussi pour suivre son évolution (en comptant

le nombre de nouvelles lésions, ou en observant l’extension des anciennes). Les

lésions apparaissent sous la forme de taches hyper-intenses (blanches).

- La méthode donnant des images en séquence T1 est beaucoup moins sensible que la

précédente, et certaines lésions n’y sont pas visibles. Néanmoins, elle présente

l’avantage d’autoriser la visualisation de lésions hypo-intenses (noires) qui ont été

appelées « trous noirs ». Cependant, la définition d’un trou noir n’est pas arbitraire et

dépend fortement de l’opérateur qui analyse les clichés d’IRM. Ces trous noirs sont

des lésions hypo-intenses chroniques qui ont été reportées comme étant des zones où

une très forte démyélinisation et une perte axonale ont eu lieu [Van Walderveen et al.,

1998]. Ce sont les séquelles de lésions anciennes associées à la présence d’une atrophie

locale.

- La séquence T1 associée à l’injection intraveineuse d’un composé à prise de contraste,

le gadolinium, avant l’acquisition d’images permet de distinguer les lésions actives

des lésions inactives. En effet, le gadolinium ne peut normalement pas diffuser dans le

SNC. Une prise de contraste n’est alors possible que dans les zones où la perméabilité

de la BBB est augmentée, révélant ainsi les lésions où l’inflammation a encore lieu.

Toutes ces approches permettent aussi de mesurer l’atrophie qui a lieu au niveau du cerveau et

de la moëlle épinière du patient, ce qui permet au neurologue d’estimer l’étendue de la perte

totale de tissu [Filippi et al., 2002].

Introduction

18

En plus de ces approches conventionnelles, des variations dans les protocoles

d’imagerie IRM permettent aujourd’hui de distinguer de plus en plus de composants

impliqués dans la pathologie de la SEP : l’inflammation, les dommages axonaux, la

démyélinisation, et l’astrocytose par exemple [Compston et al., 2002].

I .5.2. Analyse du liquide céphalo-rachidien

Dans 90% des cas de SEP, l’électrophorèse des protéines contenues dans le liquide

céphalo-rachidien (LCR ) révèle un profil de bandes oligoclonales d’immunoglobulines

d’isotype G (IgG) (Figure 3). Une anormalité du LCR se traduit par la présence de ces

bandes oligoclonales d’IgG qui ne sont pas présentes dans le sérum du même patient. Leur

présence indique une production locale ce qui suppose la présence de lésions immunes et

inflammatoires dans le SNC. Cette pratique fait partie du diagnostic courant de la SEP car il

permet d’éliminer les pathologies aux symptômes proches de la SEP (lupus, autres maladies

auto-immunes systémiques).

Figure 3 : Présence de bandes oligoclonales d’IgG retrouvées uniquement dans le LCR d’un individu souffrant

de SEP.

I .5.3. Examen des potentiels évoqués visuels

Les potentiels évoqués visuels (PEV) désignent un signal électrique produit par le

système nerveux en réponse à une stimulation externe de nature visuelle (flashs lumineux,

motifs à damiers). Chez une personne souffrant de SEP, le PEV enregistré présente une forme

typique : la forme en vague est conservée mais retardée dans le temps (Figure 4). Ils

Introduction

19

permettent de rechercher une atteinte spécifique du nerf optique qui serait passée inaperçue et

de poser le diagnostic de SEP si les critères cliniques et IRM sont insuffisants.

Figure 4 : Comparaison d’un PEV enregistré chez un individu souffrant de SEP avec celui d’un individu sain.

I.6. Mesure de la progression du handicap

La progression de la maladie chez un patient peut être quantifiée en se reportant à une

échelle de mesure : l’échelle élargie de progression du handicap (EDSS) [Kurtzke et al., 1955].

Bien qu’il existe d’autres échelles pour évaluer le handicap, l’échelle EDSS est l’un des

instruments les plus anciens et les plus utilisés par les neurologues pour mesurer le degré

d’invalidité du patient [Sharrack et al., 1996]. L’échelle EDSS se répartit en 20 niveaux (répartis

de 0 à 10 avec des demi-points) [Kurtzke et al., 1983]. Elle débute avec un score de 0 pour un

examen neurologique normal, et finit avec un score de 10 qui correspond au décès de

l’individu comme conséquence de la SEP (Figure 5). Les scores les plus bas évaluent surtout

des limitations fonctionnelles peu visibles, tandis que les scores les plus élevés mesurent

davantage l’invalidité. Cette échelle prend en compte 8 paramètres fonctionnels (PF) du

SNC ainsi que la capacité du patient à marcher. Les 8 PF testés (les 4 premiers sont majeurs

alors que les 4 derniers sont plus mineurs) sont mutuellement exclusifs : (1) fonction

pyramidale, (2) fonction cérébelleuse, (3) fonction du tronc cérébral, (4) fonction sensitive,

(5) transit intestinal et fonction urinaire, (6) fonction visuelle, (7) fonction cérébrale et (8)

autres fonctions [Kurtzke et al., 1984]. L’ensemble des PF couvre la totalité des déficits que l’on

peut retrouver dans la SEP. Chaque PF présente des grades ordonnés de 0 à 5 (ou 6). Jusqu'au

score EDSS de niveau 3,5 ce sont les scores obtenus dans chaque PF qui déterminent

automatiquement le score EDSS. Puis, à partir d’un score EDSS de 4, la définition de chaque

niveau est aussi complétée par la capacité de marche du patient [Sharrack et al., 1996].

Cependant, bien que ce soit le meilleur système de mesure et malgré sa popularité, l’EDSS

Introduction

20

présente plusieurs imperfections. Tout d’abord, cette échelle ne repose pas uniquement sur

des mesures objectives, mais fait appel à des mesures subjectives rendant parfois difficile

l’allocation d’un score EDSS à un patient. De plus, comme cette échelle repose sur une

combinaison de mesures de PF et de mesures ambulatoires, un patient semblant présenter une

maladie plus sévère qu’un autre peut cependant se voir attribuer un score EDSS identique. En

effet, si le score EDSS est validé pour suivre l’évolution de la maladie chez un patient, il l’est

beaucoup moins pour la comparaison de la maladie entre plusieurs patients. Enfin, il est

important de garder en mémoire que l’échelle EDSS n’est pas une mesure linéaire. En effet,

les patients progressent plus rapidement entre les scores 1 à 5 qu’entre les scores 5 à 7 [Myers

et al., 1992].

Figure 5 : Echelle EDSS simplifiée, ne présentant que les scores principaux de la SEP.

Introduction

21

Par ailleurs, la vitesse d’évolution clinique de la SEP est très variable d’un patient à un

autre. Or, en s’appuyant uniquement sur un score EDSS (qui n’est qu’une image de la maladie

au temps T), on ne prend pas en compte cette notion de vitesse d’évolution. La radiologie et le

nombre de poussées annuelles (fréquemment utilisés pour mesurer l’activité de la maladie)

n’y font pas référence eux aussi. Pourtant la durée d’évolution de la maladie est un facteur

important dans l’accumulation des dommages dans le SNC et la sommation des handicaps

physiques. En 2005, une approche basée sur un algorithme fut développée afin de prendre en

compte « l’agressivité » de la maladie : il fut nommé score de sévérité de la SEP (MSSS)

[Roxburgh et al., 2005]. En regardant la grille de MSSS (Figure 6), on se rend compte par

exemple, qu’un score élevé de MSSS peut être aussi bien assigné à un patient ayant

rapidement démontré un score EDSS intermédiaire, ou alors à un patient présentant un

handicap sévère mais après une évolution moyennement longue de la maladie. Il semblerait

que chez un même patient, le score MSSS soit relativement stable sur de longues périodes,

même si certains patients peuvent avoir des variations plus ou moins importantes [Pachner et

al., 2009]. Cette méthode pourrait ainsi être un outil utile pour prédire rapidement la sévérité de

la SEP chez un patient, c'est-à-dire son évolution au cours du temps.

Figure 6 : Score de sévérité de la SEP (MSSS) global. D’après Roxburgh et al., Neurology, 2005.

Introduction

22

Introduction

23

II. Les facteurs de susceptibilité à la sclérose en plaques

La communauté scientifique s’accorde à penser que le développement de la SEP n’est

pas sous la dépendance d’un seul facteur, mais résulte plutôt de l’action globale de plusieurs

facteurs : des facteurs de susceptibilité génétique, des facteurs environnementaux et enfin des

facteurs épigénétiques qui sont à l’interface des deux premiers facteurs cités. La maladie se

développerait chez des personnes génétiquement susceptibles qui auraient été mises en

présence de facteurs environnementaux dont une conséquence serait de modifier le profil

épigénétique du génome (Figure 7).

MS

MS

MS

MS

O1

O1

O1

O1EBV

EBVVD

VD

G

G

G

GPathway #1

Pathway #2

Pathway #3

Pathway #4

MS

MS

MS

MS

O1

O1

O1

O1EBV

EBVVD

VD

G

G

G

GPathway #1

Pathway #2

Pathway #3

Pathway #4

Figure 7 : Les différentes voies pouvant conduire au développement de la SEP. G : facteurs génétiques, VD :

carence en vitamine D, EBV : infection par le virus d’Epstein-Barr, O1-4 : autres facteurs environnementaux

inconnus. D’après Goodin, PLoS ONE, 2009.

II.1. Les facteurs génétiques

I I.1.1. Les éléments soulignant l’importance de la génétique dans la maladie

L’étiologie génétique de la SEP est suggérée par l’augmentation du risque pour un

patient de développer une SEP si un des membres de sa famille en est atteint (Figure 8). Un

outil de mesure de cette agrégation familiale est le λs. Ce paramètre est défini comme le ratio

du risque de développer une SEP chez une personne apparentée au patient SEP (Ks) sur la

prévalence de la maladie dans la population générale (K = 0,1%-0,2%) : (λs = Ks/K)

[Oksenberg et al., 2001]. Ainsi, une valeur de λs égale à 1 indiquerait l’absence d’agrégation

familiale d’une maladie. Dans la SEP, cette valeur de λs varie en général entre 20 et 40 pour

les proches parents de la personne souffrant de SEP. L’utilisation d’une méthodologie

Introduction

24

d’épidémiologie génétique standard et d’une correction du facteur âge a démontré que les

personnes liées aux 1er, 2ème et 3ème degrés à une personne atteinte de SEP présentent un risque

augmenté de développer la maladie par rapport à la population générale. Le risque passe ainsi

de 0,1% à 3% pour une personne apparentée au 1er degré (5% pour les frères et sœurs, 2%

pour les parents et 2% pour les enfants), soit un λs de l’ordre de 15 à 30. Pour les individus

apparentés au 2ème et 3ème degrés, ce risque est moins élevé (proche de 1%) mais reste qu’en

même supérieur à celui de la population générale [Robertson et al., 1996]. Cependant ces données

sont insuffisantes puisqu’elles ne permettent pas de faire la part entre le poids de la génétique

et celui de l’environnement familial [Dyment et al., 2004]. Ce sont des travaux réalisés chez des

enfants adoptés et chez des demi-frères/sœurs qui supportent le concept que les facteurs

génétiques sont majoritairement responsables de l’agrégation familiale de la maladie

[Oksenberg et al., 2001]. Les résultats de l’étude menée sur l’adoption révélèrent que, bien que

des enfants adoptés aient vécu depuis leur enfance avec une personne souffrant de SEP, ils ne

présentaient pas plus de risque de développer une SEP que la population générale (λs = 1)

[Ebers et al., 1995]. Des études furent aussi menées sur les demi-frères et sœurs, ce qui permit de

tester l’effet du partage du patrimoine génétique sur le risque de développer la maladie (les

demi-frères et sœurs partagent seulement 25% de leur information génétique, alors que les

enfants partageant les mêmes parents ont 50% de leur information génétique en commun). Il

fut montré que les demi-frères/sœurs d’un enfant atteint de SEP présentaient un risque

significativement plus faible que celui des « vrais » frères et sœurs (1,3% vs 3,5%, p < 0,001)

[Sadovnick et al., 1996]. Par ailleurs, ce travail démontra que le sexe du parent commun aux deux

enfants n’influençait pas le risque de SEP puisque les demi-frères/sœurs d’origine maternelle

et paternelle partageaient un risque comparable (risques respectifs de 1,4% et 1,2%) [Sadovnick

et al., 1996]. Enfin, des études réalisées sur des familles dont les deux parents souffraient de

SEP démontrèrent que les enfants issus de ces couples présentaient un risque

significativement augmenté par rapport à des enfants provenant de familles dont un seul

parent était atteint [Roberston et al., 1997 ; Ebers et al., 2000]. De plus, les auteurs de ce travail

confirmèrent le rôle majeur de la génétique sur l’environnement en démontrant que les

épouses de personnes souffrant de SEP présentaient un risque de développer la maladie

comparable à celui de la population générale [Ebers et al., 2000]. Enfin, des études réalisées sur

des jumeaux apportèrent la preuve du rôle majeur de la génétique dans la maladie. Alors que

des jumeaux monozygotes (MZ ) partagent 100% de leur information génétique, des

jumeaux dizygotes (DZ) en partagent seulement 50%, comme des frères et sœurs

Introduction

25

« singuliers ». La concordance observée chez les jumeaux MZ était significativement

supérieure à celle observée chez des jumeaux DZ ou frères/sœurs singuliers (concordances

équivalentes à 25% pour les jumeaux MZ, 5% pour les jumeaux DZ et 3% les frères/soeurs)

[Willer et al., 2003]. Ainsi, chez des jumeaux MZ, le risque de récurrence est d’environ 34% ce

qui confère une augmentation du risque (λs) de 170 fois [Dyment et al., 2004]. De plus,

l’importance du sexe des jumeaux fut soulignée puisque les auteurs démontrèrent que la

différence de risque observée entre des jumeaux MZ et des jumeaux DZ n’était pas retrouvée

chez des jumeaux de sexe masculin [Willer et al., 2003]. Cependant, malgré une information

génétique identique la majorité des jumeaux MZ sont discordants pour la SEP (environ 75%

sont discordants) ce qui suggère malgré tout l’importance de facteurs non-génétiques

intervenant dans l’étiologie de la maladie (nous reviendrons par la suite sur les facteurs non-

génétiques impliqués) [Willer et al., 2003].

Figure 8 : Risque de récurrence intrafamiliale pour la SEP. D’après Compston et al., Lancet, 2008.

I I.1.2. Etiologie génétique de la sclérose en plaques

La SEP fait partie de la grande famille des maladies complexes. Il est important de

comprendre la différence qu’il existe entre les maladies génétiques mendéliennes et les

maladies complexes (Figure 9). Dans les maladies génétiques à transmission mendélienne, ce

sont généralement des mutations dans un ou quelques gène(s) qui sont responsables de

l’apparition de la maladie. Par ailleurs, la présence de la mutation est associée à une très forte

pénétrance de la maladie qui est généralement égale à 100% [Prichard et al., 2002]. De plus, la

fréquence des mutations conduisant à l’apparition de la maladie est généralement faible

Introduction

26

(fréquence largement inférieure à 1%) à cause d’une grande pression de sélection visant à

éliminer la mutation au cours des générations [Pritchard et al., 2002]. Contrairement aux

maladies mendéliennes, les maladies complexes (encore appelées maladies communes) sont

mal connues dans leur pathogénie. L’une des raisons de cette méconnaissance est qu’il existe

une interaction entre les gènes et l’environnement, ce qui rend plus difficile la découverte de

facteurs génétiques impliqués dans la maladie. Cependant, on sait que la susceptibilité à la

SEP ne dépend par des gènes mutés codant pour une protéine dotée d’une activité aberrante.

Cette susceptibilité est la conséquence d’une multitude de variations génétiques (ou

polymorphismes ; voir chapitre II.1.3) présentes dans la population humaine générale et peu

soumises à une pression de sélection [Compston et al., 2008]. Ces polymorphismes, pris

individuellement, semblent n’avoir qu’un faible effet sur la prévalence de la maladie. Ils

pourraient agir soit indépendamment soit en épistasie.

Deux hypothèses ont été émises pour modéliser la relation qu’il existe entre le

développement de la SEP et la variabilité génétique. Ces deux hypothèses s’opposent quant au

nombre de variants et quant à leur poids respectif dans l’étiologie de la maladie :

(1) La première hypothèse est appelée « l’hypothèse maladie commune/variant

commun ». Elle repose sur le principe que les maladies complexes sont des maladies

bien plus communes que les maladies mendéliennes. Ainsi, il fut émis l’hypothèse que

la maladie est déterminée par la présence de variants communs à la population

humaine et ayant une pénétrance faible [Prichard et al., 2002]. En effet, les études

intrafamiliales sur le risque relatif de développer la SEP suggèrent que la majorité du

risque est portée par un nombre modeste de loci contenant des allèles de prédisposition

à la maladie ayant une fréquence importante [Reich et al., 2001]. Il est estimé qu’un

nombre compris entre 20 et 100 allèles communs, conférant chacun un risque relatif

faible (de l’ordre de 1,2-1,5), permettrait d’expliquer la susceptibilité aux maladies

complexes [Lindsey et al., 2005 ; Yang et al., 2005].

(2) A cette théorie s’oppose l’hypothèse des variants rares multiples ou de

« l’hétérogénéité ». L’argument de cette théorie est que l’appellation « maladie

complexe» est fausse. Chaque maladie serait en réalité non pas « une maladie » mais

« des maladies » qui regrouperaient une collection de conditions génétiques

hétérogènes, chacune déterminée par un allèle rare mais ayant une très forte

pénétrance [Smith et al., 2002]. La forte pénétrance fait que, chez un individu, peu de

polymorphismes pourraient expliquer la susceptibilité. Par contre, dans la population

Introduction

27

de patients SEP, l’hétérogénéité fait qu’entre les patients ces allèles de susceptibilité

ne seraient pas les mêmes. Cela supposerait que plusieurs centaines, si ce n’est

plusieurs milliers d’allèles rares, sont impliqués dans une seule maladie complexe,

même si chacun d’entre eux confère un risque relatif fort pour la susceptibilité (de

l’ordre de 10 à 20).

En s’appuyant sur cette logique, on pourrait espérer qu’environ 100 variants communs

exerçant un effet modeste sur le risque seraient impliqués dans la susceptibilité à la SEP. Par

ailleurs, chez une faible proportion des patients SEP, la base génétique impliquée dans la

maladie serait différente et reposerait sur l’effet fort d’allèles rares [Sawcer et al., 2008].

Figure 9 : Les variants de faible fréquence et la susceptibilité aux maladies. D’après McCarthy et al., Nat. Rev.

Gen., 2008.

I I.1.3. Les différentes classes de polymorphismes génétiques chez l’Homme

Ce qui ressort de l’analyse du génome de l’espèce humaine est qu’il existe une très

grande similitude entre les individus à travers le monde (si on compare deux individus,

environ 99,9% de leurs génomes sont identiques). Cependant, il existe dans de petites

fractions, réparties sur l’ensemble du génome, des variations génétiques entre les individus

[Kruglyak et al., 2001]. Ces variations génétiques, ou polymorphismes, proviennent de mutations

ancestrales qui ont été fixées dans le génome de notre espèce sous l’effet de la pression de

sélection. Ce sont ces polymorphismes qui sont responsables des différences phénotypiques

entre les individus, comme par exemple : la morphotype, une plus forte susceptibilité à une

maladie ou encore une meilleure réponse à un médicament.

Introduction

28

Ces variants génétiques peuvent être classés en fonction de la fréquence pour laquelle

l’allèle mineur est retrouvé dans la population humaine. Un polymorphisme est considéré

commun lorsque la fréquence de l’allèle mineur (MAF ) est supérieure à 1% dans la

population. Au contraire, un polymorphisme rare se caractérise par une MAF inférieure à 1%.

Les polymorphismes peuvent être aussi regroupés en deux grandes classes en fonction

de leur composition en nucléotides (Figure 10) : la classe des polymorphismes d’un seul

nucléotide (SNP) et la classe des polymorphismes structuraux [Frazer et al., 2009].

Figure 10 : Les différentes catégories de polymorphismes génétiques chez l’Homme. D’après Frazer et al., Nat.

Rev. Gen., 2009.

1.3.1. Les polymorphismes d’un seul nucléotide

Les SNPs constituent la classe la plus importante des polymorphismes génétiques

observés parmi les individus [Kruglyak et al., 2001]. Ce sont des variations dans la séquence

ADN pour lesquelles un seul nucléotide (A, T, G ou C) est altéré. Les résultats d’un

séquençage complet des génomes de 4 individus d’origines ethniques différentes (2 d’origine

caucasienne, 1 d’origine asiatique et enfin 1 d’origine africaine) permirent de mieux estimer

le nombre total de SNPs dans le génome (Figure 11). Environ 3,3 millions de

polymorphismes furent détectés dans les génomes des deux personnes d’origine caucasienne,

et légèrement moins dans le génome de l’individu asiatique. L’analyse globale de ces 3

génomes permit d’identifier 5,2 millions de polymorphismes différents dont la grande

majorité sont référencés dans la base de données dbSNPs. Enfin, le séquençage du génome

africain révéla qu’il possédait environ 1,25 fois plus de SNPs que les génomes caucasiens,

dont la majorité lui sont propres. A l’heure actuelle, on estime qu’il est raisonnable de penser

que le génome humain possède environ 11 millions de SNPs. Sur ces 11 millions de SNPs, la

Introduction

29

répartition serait la suivante : environ 7 millions auraient une MAF supérieure à 5%, les autres

posséderaient une MAF comprise entre 1 et 5% [Frazer et al., 2009].

Figure 11 : Nombre de polymorphismes détectés dans le génome de 4 individus de différentes ethnies. D’après

Frazer et al., Nat. Rev. Gen., 2009.

En plus de ces polymorphismes communs, il existe d’innombrables polymorphismes rares,

qui pour certains ne sont représentés que dans une seule famille d’individus. Ainsi, la

modification d’une paire de bases, pour peu qu’elle soit viable, peut être retrouvée dans au

moins un des 6,5 milliards d’individus présents sur Terre, et ainsi représenter un

polymorphisme rare. Cependant, bien que de tels cas extrêmes existent, il est important de

noter que la majorité des polymorphismes présents chez un individu donné sont ceux

communs à l’ensemble de la population humaine. De plus, si on compare les génomes de

deux individus, la majorité des paires de bases qui diffèrent sont celles localisées dans des

polymorphismes communs à la population dont ils font partis.

1.3.2. Les polymorphismes structuraux

La classe des variations structurales regroupe tous les polymorphismes qui ne sont pas

des variations d’un seul nucléotide. Elle comprend à la fois des variations microscopiques, et

plus communément des variations submicroscopiques telles que les délétions, les duplications

- collectivement appelées variations du nombre de copies (CNV) - ainsi que les insertions,

les inversions et les translocations [Feuk et al., 2006].

En comparaison avec les techniques utilisées pour étudier les SNPs, les technologies

permettant de détecter les variations structurales viennent tout juste d’être développées. Ainsi,

nos connaissances sur leur localisation et sur leur nombre dans le génome humain ne sont

encore qu’approximatives et la majorité des variants structuraux restent à découvrir.

L’analyse du génome humain suggère que les variations structurales comptent pour au moins

20% de toutes les variations génétiques chez l’Homme, et pour plus de 70% des changements

de bases (Figure 12). Si on prenait l’ensemble des variations structurales, cela représenterait

Introduction

30

entre 9 et 25 mégabases du génome (soit entre 0,5 et 1%), ce qui souligne l’importance de

cette classe de variations dans l’évolution du génome humain et la susceptibilité aux maladies.

Figure 12 : Nombre et caractéristiques des variations structurales détectées dans le génome d’un individu

d’origine caucasienne. D’après Frazer et al., Nat. Rev. Gen., 2009.

I I.1.4. La notion de déséquilibre de liaison entre plusieurs polymorphismes

Apparue en 1960, la notion de déséquilibre de liaison (LD ) est l’un de ces termes qui

ne révèlent pas leur signification par leur nom [Lewontin et al., 1960]. Le LD est une notion

caractérisant une association non aléatoire entre 2 polymorphismes [Slatkin et al., 2008]. Il existe

dans le génome des régions dans lesquelles peu de recombinaisons ont lieu (bloc en LD) et

qui sont encadrées par des zones de forte recombinaison (Figure 13). Ces zones de fortes

recombinaisons sont présentes tous les 200 kilobases environ et sont en général moins

importantes en taille que les blocs en LD [McVean et al., 2004]. Ces régions sont le reflet de

l’évolution de l’Homme et des populations. Ainsi, les LD ne sont pas les mêmes entre les

différentes ethnies [Frazer et al., 2009]. Bien que le LD soit un phénomène non quantifiable (il

n’existe pas d’échelle pour le mesurer), deux paramètres (dont les valeurs sont comprises

entre 0 et 1) permettent de l’estimer : le D’ et le r2. En général, l’information conférée par le r2

est similaire à celle du D’. Une valeur de D’ proche de 0 désigne une association aléatoire de

2 polymorphismes alors que la valeur 1 indique une corrélation parfaite. Le r2 est très

informatif dans les études d’association. En effet, il est inversement proportionnel à la taille

de l’échantillon nécessaire pour détecter une association à une maladie. Par exemple, prenons

deux loci dont l’allèle génotypé est proche de l’allèle de susceptibilité avec un r2 = 0,5. Pour

détecter une association avec la maladie, il faudrait alors doubler le nombre d’individus de la

cohorte par rapport à une étude où les 2 polymorphismes présentent un r2 = 1 [Wang et al.,

2005].

Introduction

31

Figure 13 : Les déséquilibres de liaison des variants communs du génome humain diffèrent entre les

populations. D’ = 0 en carré blanc, D’ = 1 en carré rouge. A droite, les triangles gris représentent l’ensemble des

SNPs. Les SNPs ayant un r2 au moins égal à 0,8 sont reliés par une ligne, ceux ayant un r2 inférieur sont en bleu.

CEU : individu d’origine caucasienne. CHB+JPT : individu d’origine asiatique. YRI : individu d’origine

africaine. D’après Frazer et al., Nat. Rev. Genet., 2009.

Ces déséquilibres de liaison permettent en théorie d’étudier l’ensemble des variations

du génome en ne génotypant que peu de polymorphismes appelés « tag SNPs ». En effet, en

génotypant les tag SNPs, il est possible de prédire le génotype des SNPs environnants (Figure

14). Cependant, même si cette approche permet de réduire les coûts des études par GWAS

(pour genome-wide association study), elle pose certains problèmes. En effet, seuls les

polymorphismes communs sont captés par cette approche (perte des polymorphismes rares et

des polymorphismes structuraux). De plus, les polymorphismes trouvés comme associés à une

maladie ne sont que très rarement des polymorphismes fonctionnels [Hirschhorn et al., 2005].

Introduction

32

Figure 14 : Association des polymorphismes par une approche directe ou par une approche en tagSNP. D’après

Hirschhorn et al., Nat. Rev. Genet., 2005.

I I.1.5. Les moyens mis en œuvre dans l’identification des gènes de susceptibilité à

la sclérose en plaques

Contrairement aux maladies mendéliennes, l’identification de gènes impliqués dans la

susceptibilité à la SEP est compliquée. Cet échec dans la découverte de gènes provient

principalement des caractéristiques propres à cette maladie [Tabor et al., 2002].

(1) La SEP est une maladie hétérogène. Cette hétérogénéité rend difficile la sélection

de la meilleure population d’étude. En effet, les patients souffrant de SEP diffèrent par

les formes cliniques de la maladie (RR-MS, PP-MS), l’âge du début de la maladie ou

l’agressivité d’évolution.

(2) L’étiologie de chaque forme de SEP peut impliquer différentes voies biologiques

qui ne sont pas forcement redondantes.

(3) La susceptibilité à la SEP dépend de l’implication de très nombreux gènes de

susceptibilité conférant chacun un risque relativement faible.

Cependant, depuis quelques années les moyens mis en œuvre pour découvrir les gènes

de susceptibilité à la SEP commencent à porter leurs fruits. Ce succès repose notamment sur

l’avancée des techniques de génotypage et sur la disponibilité de cohortes adéquates.

1.5.1. L’approche gène candidat vs l’approche sans à priori

A l’heure actuelle, deux types d’approches existent dans la découverte de gènes

impliqués dans le développement d’une maladie complexe : (1) l’approche gène candidat et

(2) l’approche sans à priori reposant sur l’utilisation de puces détectant une haute densité de

polymorphismes. Cette méthode est aussi appelée GWAS. Bien que différentes dans leur

façon d’appréhender la découverte de nouveaux gènes de susceptibilité, ces deux types

d’approches sont complémentaires.

Introduction

33

a. Approche gène candidat

L’approche gène candidat repose sur la sélection d’un gène ou d’un polymorphisme

choisi par rapport à des à priori sur la maladie étudiée. En effet, de nombreuses pathologies

humaines partagent des gènes de susceptibilité (Figure 15). Goh et al. inventèrent le terme de

« diseasome » pour parler du réseau de relations génétiques qu’il peut exister entre les

maladies [Goh et al., 2007]. Ce concept est particulièrement vrai pour les maladies auto-

immunes dont l’étiologie repose en grande partie sur une dérégulation de la composante

immunitaire. Un exemple majeur de l’application de ce concept est la région du CMH qui est

retrouvée comme associée à de très nombreuses maladies auto-immunes [Hewagama et al.,

2009]. Une fois le gène sélectionné, les polymorphismes à étudier ne doivent pas être choisis

au hasard. Ils doivent être localisés en priorité dans les régions du gène où ils ont le plus de

chance de modifier l’expression ou la fonction de la protéine (régions codantes ; régions

régulatrices : promoteur, 5’UTR, 3’UTR, domaine d’épissage).

Le principal avantage de cette approche est qu’elle nécessite une puissance statistique

relativement faible et donc une cohorte d’individus peu importante par rapport aux GWAS.

En effet, comme le génotypage est réalisé sur peu de polymorphismes, les corrections

statistiques ne sont que peu stringentes. L’autre avantage de cette technique est que les

polymorphismes choisis sont généralement des polymorphismes fonctionnels qui modifient

l’expression ou l’activité de la protéine codée.

Cependant, son principal inconvénient réside dans le concept d’à priori de l’approche.

Les polymorphismes sont choisis dans des voies connues pour être impliquées dans la

maladie. Cela suppose que nos connaissances actuelles sur la maladie sont suffisantes pour

prédire les voies impliquées. Ainsi, de nouvelles voies intervenant dans l’étiologie de la

maladie ont peu de chance d’être mises en évidence par cette approche [Tabor et al., 2002]. Un

autre inconvénient lié à ce type d’approche est qu’il est difficile pour l’expérimentateur de

distinguer les véritables associations des faux positifs.

Ce type d’approche est généralement utilisé pour confirmer de nouveaux gènes trouvés

comme associés à une maladie dans des cohortes indépendantes.

Introduction

34

Figure 15 : Recouvrement des loci contenant les facteurs de risque génétique aux maladies communes

humaines. D’après Frazer et al., Nat. Rev. Gen., 2009.

b. Approche sans à priori par GWAS

L’approche par GWAS n’est possible que depuis quelques années. Les études par

GWAS permettent de génotyper 500 000 à 1 million de polymorphismes en même temps

chez un même individu. Cependant, avant qu’une telle approche ne devienne

possible, plusieurs conditions devaient être remplies:

(1) Il devait être créé une base de données accessible à l’ensemble de la communauté

scientifique et regroupant de très nombreux polymorphismes. En effet, pour pouvoir

génotyper 1 million de polymorphismes par GWAS, il est nécessaire de disposer d’une

base de données comprenant beaucoup plus que 1 million de polymorphismes qui

sont, si possible, répartis sur l’ensemble du génome. Ce travail de création d’une base

de données fut entrepris par le consortium international HapMap. L’objectif de ce

projet de grande ampleur était de répertorier la variabilité du génome humain. Le

premier rapport de ce projet contenait un peu plus de 1 million de SNPs dont la MAF

des allèles répertoriés était au moins égale à 5% [HapMap, 2005]. L’étude fut réalisée

sur l’ADN de 269 individus de différentes origines : Européenne, Africaine et

Asiatique. Ce premier rapport permit de dresser une carte des LD entre les différents

polymorphismes présents dans le génome. Plus récemment, la seconde phase du projet

référença plus de 3 millions de SNPs, ce qui correspond à environ 25-35% des SNPs

communs [HapMap, 2009]. Cette base de données est régulièrement étoffée par de

nombreuses études indépendantes. Si l’on considère les LD existant entre les SNPs, le

Introduction

35

génotypage de seulement 500 000 SNPs permettrait de connaître, en théorie, celui de

la majorité des SNPs ayant une MAF supérieure à 5% [Kruglyak et al., 2008].

(2) Les études d’association devaient disposer de cohortes de tailles très importantes à

cause de la correction des tests multiples. En effet, il est important d’obtenir des

valeurs statistiques très faibles afin d’éliminer au maximum les faux positifs. On peut

s’en rendre compte dans cet exemple : si on fixe le seuil de significativité à p = 0,05 (5

faux positifs tous les 100 tests), une puce génotypant 500 000 SNPs donnerait environ

25 000 faux positifs. Ainsi, une valeur statistique inférieure à 5x10-7, avant la

correction des tests multiples, semble indispensable pour assurer que les résultats

obtenus ont plus de chance d’être vrais que faux [Oksenberg et al., 2008]. Des études

proposèrent de déterminer la taille nécessaire à une cohorte pour identifier, par une

approche GWAS de 500 000 SNPs, l’association d’un allèle de MAF égale à 10% et

conférant un risque relatif de 1,5 à une maladie. Suivant un tel modèle, il faudrait une

cohorte cas-témoins composée de 2 000 - 3 000 individus dans chaque groupe afin

d’obtenir une puissance statistique de 80% conférant une détection d’association de

significativité p = 5x10-7. Si on voulait conserver une puissance statistique équivalente

mais identifier un risque relatif de 1,25 alors il faudrait agrandir la cohorte à 8 000 cas

et 8 000 témoins [Todd et al., 2006]. Ces résultats sont à rapprocher du fait que la

majorité des gènes de susceptibilité à la SEP confère un risque relatif de 1,15 - 1,5.

Cependant, le grand nombre de SNPs à génotyper ainsi que la nécessité d’une cohorte

de taille suffisante pour éliminer la majorité des faux positifs posent un problème de coût. En

effet, le prix des études par GWAS reste relativement élevé bien qu’il ait relativement baissé

ces derniers temps. Son coût en 2005 était de 0,5 US$ par génotype, à concilier avec les

500 000 polymorphismes et la taille de la cohorte [Hirschhorn et al., 2005]. Pour concilier ces

deux impératifs tout en gardant à l’esprit ce problème de financement, une stratégie fut

proposée (Figure 16). Cette approche est composée d’une succession de 2 ou 3 étapes de

génotypage qui permettent de réduire la taille de la cohorte tout en éliminant au mieux les

faux positifs [Lowe et al., 2004]. Tout d’abord, l’ensemble des polymorphismes sont génotypés

sur une première cohorte en fixant un seuil de significativité autorisant la détection de loci

conférant un risque relatif faible pour la maladie. Par cette approche, un nombre important

mais contrôlé de faux positifs passeront le seuil de significativité. Puis, l’ensemble des

marqueurs qui ont passé cette première étape de sélection sont alors re-testés sur une cohorte

Introduction

36

indépendante de taille similaire voire plus importante. Le seuil de significativité des deux

étapes de sélection doit être choisi de telle sorte que moins de 5% des marqueurs qui

franchissent ces deux étapes soient des faux positifs. Pour augmenter l’intransigeance du test,

une troisième étape avec une nouvelle cohorte peut être ajoutée.

Figure 16 : Approche GWAS en plusieurs étapes afin de réduire la taille des échantillons. D’après Hirschhorn et

al., Nat. Rev. Genet., 2005.

1.5.2. Configuration des cohortes utilisées en association génétique

Les études d’association génétique associent un polymorphisme à une maladie quand

le polymorphisme influence le risque de susceptibilité. Concrètement, l’allèle du gène

impliqué dans la maladie voit sa fréquence modifiée dans la population de patients par rapport

à la population témoin. Même si toutes les études génétiques reposent sur ce concept,

l’approche utilisée peut différer dans la structure des cohortes utilisées :

(1) L’approche cas-témoins : l’utilisation de telles cohortes dans des études génétiques

repose sur la comparaison de la fréquence allélique d’un gène dans une population de

patients par rapport à une population de témoins. Le principal intérêt de l’approche

cas-témoins est qu’il est très facile de réunir de larges cohortes composées de plusieurs

milliers d’individus. A l’heure actuelle, les consortia internationaux utilisent, dans les

études d’association génétique à la SEP, des cohortes comprenant plus de 2 000 cas et

plus de 3 000 témoins [ANZgene, 2009]. Cependant, le principal inconvénient conféré

par l’approche cas-témoins est le fort risque de détecter des faux positifs [Voight et al.,

2005]. La génération de faux positifs provient en général d’un biais dans le choix des

Introduction

37

individus composant les deux groupes (témoins et patients). Ce biais est une

hétérogénéité non liée au phénotype maladie [Risch et al., 2000]. En effet, la principale

cause d’hétérogénéité est la présence d’individus de différentes ethnies au sein de la

même cohorte. En fonction des ethnies, la fréquence d’un allèle peut varier

sensiblement jusqu’à parfois devenir significativement différente entre deux ethnies

[Morie et al., 2005]. De plus, l’inclusion par erreur de personnes apparentées dans une

même cohorte peut aussi conduire à des biais [Voight et al., 2005].

(2) L’approche famille nucléaire : cette approche repose soit sur l’utilisation de

familles trio (ou simplex), soit sur l’utilisation de familles multiplex. La différence

entre ces deux types de familles nucléaires est le nombre d’individus souffrant de la

maladie au sein de la famille. La structure classique d’une famille trio comprend 2

parents ne souffrant pas de la maladie et un enfant atteint, alors que la famille

multiplex comprend au moins 1 individu atteint de plus et peut inclure plusieurs frères

et sœurs. Les études génétiques utilisent généralement des familles trio car elles sont

plus faciles à réunir puisque plus féquentes. L’analyse des résultats de génotypage

consiste à réaliser un test de déséquilibre de transmission d’un allèle (TDT). Le

principe du TDT dépend de l’observation de la transmission d’un allèle des parents

vers les enfants souffrant de la maladie étudiée. Si la transmission s’éloigne d’une

transmission mendélienne alors la maladie est en liaison avec le locus analysé. Par

ailleurs, le TDT élimine de l’analyse tous les parents homozygotes pour l’allèle étudié

[Laird et al., 2006]. Originellement utilisé dans les tests de liaison de régions génomiques

à une maladie [Spielman et al., 1993], il fut par la suite étendu aux études d’association

génétique [Hirschhorn et al., 2005]. L’utilisation de cohortes de familles fournit une

approche robuste pour prévenir la présence de stratification au sein d’une cohorte.

Cependant, réunir une cohorte famille requiert plus de temps et d’argent que la

collecte d’individus composant les cohortes de cas-témoins [Laird et al., 2006]. L’autre

inconvénient important est la perte rapide de puissance statistique. En effet, tous les

parents homozygotes sont systématiquement retirés de l’étude, et l’absence du

génotype d’un enfant conduit à la perte de la famille trio entière.

Ces deux structures de cohortes présentent chacune des avantages et des

inconvénients. Ainsi plutôt que de les opposer, il est important de les voir comme

complémentaires [Laird et al., 2006]. A l’heure actuelle, les études génétiques « modernes »

utilisent de larges cohortes de cas-témoins en combinaison avec des collections de familles,

Introduction

38

plus modestes en taille. Combiner les deux structures de cohorte dans une même étude permet

de réduire sensiblement les risques de faux positifs.

II.1.6. Importance du complexe majeur d’histocompatibilité dans la susceptibilité

à la sclérose en plaques

Historiquement étudié pour son importance dans le rejet de greffes de tissus et

d’organes, le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH ) révéla par la suite son

importance dans le développement de maladies auto-immunes humaines via ses fonctions

dans la réponse immunitaire. Chez l’Homme, le domaine du CMH se localise sur le bras court

du chromosome 6 (6p21), où il s’étend sur un domaine de 3,5 mégabases. Un concept récent

étendit le domaine du CMH à 7,6 mégabases, lui faisant contenir pas moins de 252 gènes dont

ceux du CMH de classe I (CMH-I ) et de classe II (CMH-II ). Les gènes du CMH ont des

fonctions diverses impliquées dans l’activité du système immunitaire (développement,

maturation et fonction) [Horton et al., 2004]. Des études d’association révélèrent que plusieurs

allèles du CMH étaient associés à diverses maladies auto-immunes (diabète de type 1,

polyarthrite rhumatoïde, SEP…). La région du CMH est une région du génome humain qui

présente un fort LD, ce qui rend difficile la recherche du variant ou de l’haplotype

directement responsable de l’association avec une maladie comme la SEP par exemple

[Ramagopalan et al., 2009a].

1.6.1. Implication du CMH-II dans la susceptibilité à la sclérose en plaques

Dès 1972, une association entre le locus du CMH et la SEP fut détectée. Cette

association était le premier rapport d’une association génétique entre le CMH-II et une

maladie humaine. Bien que d’abord rattachée au CMH-I, l’association s’avéra par la suite être

sous la dépendance du CMH-II et en particulier de l’haplotype HLA-DR2 [Ramagopalan et al.,

2009a] (Figure 17). Par la suite, lorsque le typage du sérum fut possible, il apparu que le

déterminant DR2 incluait deux sous-types sérologiques : HLA-DR15 et HLA-DR16. Plus

tard, les gènes correspondant aux sous-types sérologiques furent clonés. Il fut démontré que

chaque sous-type pouvait également être séparé en deux : HLA-DRB1*1501 et 1502 pour

DR15, HLA-DRB1*1601 et 1602 pour HLA-DR16. Aujourd’hui, nous savons que le facteur

Introduction

39

critique dans l’association entre HLA-DR2 et la SEP est l’allèle HLA-DRB1*1501 [Svejgaard

et al., 2008].

Mais, en réalité, la situation est un peu plus compliquée que cette vision simpliste.

Cette situation est principalement due à un fort LD présent dans le domaine du CMH. En

effet, la chaîne bêta de HLA-DR est codée par deux loci HLA-DR qui contiennent chacun

plusieurs allèles. L’allèle HLA-DRB5*0101 est retrouvé en déséquilibre complet de liaison

avec l’allèle HLA-DRB1*1501. Ces deux allèles sont présents ensemble dans un même

haplotype associé à la SEP [Fogdell et al., 1995]. Un travail récent essaya de dissocier les effets

respectivement portés par les loci HLA-DRB1 et HLA-DRB5 [Caillier et ail., 2008]. Cette étude

suggéra que le locus HLA-DRB1 était le locus directement responsable de la susceptibilité à

la SEP alors que le locus HLA-DRB5 aurait, quant à lui, un rôle dans l’atténuation de la

sévérité de la SEP.

Deux allèles supplémentaires, localisés dans deux autres loci, sont en déséquilibre

complet de liaison avec les allèles HLA-DRB1*1501 et HLA-DRB5*0101. Il s’agit des

allèles HLA-DQA1*0102 et HLA-DQB1*0602. Bien que le LD soit complet entre l’allèle

HLA-DRB1*1501 et l’allèle HLA-DQB1*0602 chez les Européens, les personnes d’origine

africaine présentent une diversité haplotypique plus importante. Cette diversité accrue fait que

ces deux allèles ne sont pas toujours retrouvés dans le même haplotype. Caballero et al.

utilisèrent une population afro-brésilienne afin de dissocier les effets des loci HLA-DRB1 et

HLA-DQB1 [Caballero et al., 1999]. Dans cette population, l’allèle HLA-DQB1*0602 fut trouvé

comme associé à la SEP en l’absence de l’allèle HLA-DRB1*1501. L’allèle HLA-

DRB1*1501, peu présent dans cette population, était remplacé par l’allèle HLA-DRB*1503.

Oksenberg et al. réalisèrent un travail similaire dans une population d’afro-américains

[Oksenberg et al., 2004]. Dans cette seconde étude, le résultat obtenu allait en faveur d’un effet

du locus HLA-DRB1 associé à la susceptibilité à la SEP de manière indépendante de l’allèle

HLA-DQB1*0602. Enfin, une troisième étude associa l’allèle HLA-DQB1*0602 avec une

susceptibilité à la SEP chez les Brésiliens d’origine africaine, alors que l’allèle HLA-

DRB1*1501 fut associé à un risque augmenté de SEP dans la population brésilienne d’origine

européenne [Alves-Leon et al., 2007]. En conclusion, malgré des résultats parfois contradictoires,

on peut dire que l’allèle HLA-DRB1*1501 et/ou l’allèle HLA-DQB1*0602 sont presque

toujours associés à la susceptibilité à la SEP. De plus, il existe un effet dose visible pour

l’allèle HLA-DRB1*1501. Si on compare des personnes ne possédant pas d’allèle HLA-

DRB1*1501 à des personnes possédant une seule copie de cet allèle, on observe un risque

Introduction

40

relatif augmenté pour la SEP (OR = 2,7). Cependant, cette augmentation du risque est moins

importante que chez les personnes homozygotes pour HLA-DRB1*1501, avec une différence

de plus de 2 fois (OR = 6,7). Cet effet dose pourrait s’expliquer par une présentation plus

efficace de l’antigène chez les personnes homozygotes pour cet allèle, chez qui la protéine

serait deux fois plus présente [Barcellos et al., 2003].

Figure 17 : Allèles de l’haplotype du HLA-DR2 associés à la sclérose en plaques (l’implication des marqueurs

entre parenthèse semble due à un déséquilibre de liaison). D’après Svejgaard et al., Immunogenetics. 2008.

Cependant, il existe une exception au monopole de l’haplotype HLA-DR2 dans la

susceptibilité à la SEP. Dans la population sarde, l’association avec la maladie implique le

HLA-DR3 et le HLA-DR4. Les haplotypes respectifs sont les suivants : HLA-DRB1*0405

DQA1*0501 DQB1*0301 et HLA-DRB1*0301 DQA1*0501 DQB10201 [Marrosu et al., 1998].

Dans cette population, l’haplotype HLA-DR2 classiquement associé à la SEP (HLA-

DRB1*1501 et HLA-DQB1*0602) est plus rare (3%) que dans le reste de la population

européenne (15%) [Lernmark et al., 2002]. Par ailleurs, l’haplotype DR2 le plus fréquent contient

l’allèle HLA-DRB1*1601 ne prédisposant pas à la SEP.

En plus des allèles agissant seuls sur la susceptibilité à la SEP, il peut exister des

phénomènes d’épistasie entre les différents loci présents dans le domaine du CMH (Figure

18). En effet, certains allèles ont peu d’effet sur la susceptibilité à la SEP lorsqu’ils sont

retrouvés seuls, mais entraînent une modification du risque lorsqu’ils sont en combinaison

avec un autre allèle. Ces modèles d’épistasie peuvent avoir soit un effet de synergie

augmentant alors la susceptibilité à la SEP, soit à l’inverse un effet de dominant négatif sur le

risque [Ramagopalan et al., 2009b]. Par exemple, l’effet de synergie peut être retrouvé avec

l’allèle HLA-DRB1*08. En effet, cet allèle, lorsqu’il est seul, n’augmente que modestement

le risque de SEP (OR = 1,2). Cependant, lorsqu’il interagit avec l’allèle HLA-DRB1*1501

présent en trans, le risque est fortement augmenté. Le risque est presque doublé par rapport à

celui conféré par une seule copie de l’allèle HLA-DRB1*1501 (OR passant de 1,64 à 2,39)

[Dyment et al., 2005]. La situation inverse peut être démontrée avec l’effet dominant négatif

conféré par l’allèle protecteur HLA-DRB1*14 [Ramagopalan et al., 2007a]. La présence d’un

Introduction

41

allèle HLA-DRB1*14 en combinaison avec un allèle HLA-DRB1*15 diminue d’environ 3

fois le risque conféré par l’allèle HLA*DRB1*15.

Figure 18 : Risque génotypique relatif pour la sclérose en plaques en fonction des combinaisons d’allèles

contenues dans le locus HLA-DRB1 (le risque basal de valeur 1 est arbitrairement donné au génotype HLA-

DRB1*X/X). D’après Ramagopalan et al., Neurology, 2009b.

L’utilisation du modèle animal de la SEP, l’EAE démontra l’implication directe de

l’haplotype HLA-DR2 dans la susceptibilité à la maladie. Ceci fut démontré en utilisant des

souris humanisées exprimant le HLA-DRB1*1501 soit seul, soit en combinaison avec le

HLA-DRB5*0101, et possédant des lymphocytes spécifiques d’une protéine de la myéline (la

protéine MBP, pour protéine basique de la myéline) [Gregersen et al., 2006]. Les animaux

exprimant seulement l’allèle HLA-DRB1*1501 développaient une maladie spontanée très

sévère. Par contre, l’ajout de l’allèle HLA-DRB5*0101 en combinaison avec l’allèle HLA-

DRB1*1501 diminuait à la fois l’incidence et la sévérité de la maladie. Ces données

confirment les résultats d’association obtenus chez l’Homme. De plus, il fut suggéré que

l’effet de protection partielle conféré par l’allèle HLA-DRB5*0101 ne provenait pas d’une

tolérance centrale (élimination ou inactivation des cellules auto-réactives lors de leur

maturation dans le thymus), mais plutôt de leur délétion en périphérie. Par ailleurs, il fut

démontré qu’un TCR provenant d’une personne souffrant de SEP avait la capacité de

Introduction

42

reconnaître d’une part la MBP présentée par l’allèle HLA-DRB1*1501, d’autre part un

peptide du virus d’Epstein-Barr (EBV) présenté par l’allèle HLA-DRB5*0101 [Lang et al.,

2002]. Ces résultats laissent penser qu’une infection par l’EBV permettrait l’activation, via la

présentation de peptides viraux par HLA-DRB5*0101, de cellules réagissant contre la

protéine MBP présentée par le HLA-DRB1*1501. Cela pourrait conduire à une réaction auto-

immune [Svejgaard et al., 2008]. Nous reviendrons par la suite sur l’éventuelle existence d’une

association entre la SEP et l’EBV.

1.6.2. Implication du CMH-I dans la susceptibilité à la sclérose en plaques

Bien que l’importance du CMH-II dans la susceptibilité à la SEP soit aujourd’hui bien

établie, l’implication du CMH-I semble toutefois moins claire. Trente ans auparavant, une

association entre le CMH-I (les allèles HLA-A*03 et HLA-B*07) et la SEP fut identifiée

[Ramagopalan et al., 2009a]. Mais rapidement il apparut que le signal obtenu était dû à l’existence

d’un fort LD avec le CMH-II. Cependant, des études récentes suggérèrent que le CMH-I

pourrait avoir un rôle direct dans la susceptibilité à la SEP (Figure 19). En effet, même si

l’association entre HLA-B*07 et la SEP fut confirmée comme la résultante du LD avec HLA-

DR15, l’allèle HLA-A*03 semblait réellement associé à la maladie [Harbo et al., 2004 ; Burfoot et

al., 2008]. La présence de l’allèle HLA-A*03 conférait une augmentation du risque de

développer une SEP avec un risque relatif d’environ 2,8 [Burfoot et al., 2008]. Par ailleurs,

l’allèle HLA-A*03 augmentait le risque porté par l’haplotype HLA-DR15 lorsqu’ils étaient

combinés [Harbo et al., 2004]. Brynedal et al. associèrent négativement l’allèle HLA-A*02 du

CMH-I à la susceptibilité à la SEP. [Brynedal et al., 2007]. Le risque relatif obtenu (OR = 0,63)

n’était pas dû à un LD avec le CMH-II. La comparaison entre le génotype conférant le plus de

susceptibilité à la SEP (homozygote pour DRB1*15, mais sans A*02) et celui conférant le

plus de résistance (homozygote pour A*02, mais sans DRB1*15) révéla une différence de

susceptibilité à la maladie de 23 fois environ. Un autre allèle du CMH-I fut lui aussi associé

négativement avec la susceptibilité à la SEP [Yeo et al., 2007]. Là aussi, le risque relatif observé

(OR d’environ 0,55) porté par l’allèle HLA-C*05 n’était pas la conséquence d’un LD avec un

autre allèle du CHM-II. Comme pour le HLA-A*02, la comparaison entre le génotype

conférant le plus de susceptibilité à la SEP (homozygote pour DRB1*15, mais sans C*05) et

celui conférant le plus de résistance (homozygote pour C*05, mais sans DRB1*15) révéla une

différence de susceptibilité à la maladie d’environ 5 fois.

Introduction

43

Figure 19 : Association du HLA avec la sclérose en plaques. D’après Friese et al., Brain, 2005.

Les molécules de CMH-I sont des marqueurs de surface exprimés par la majorité des

cellules de l’organisme. Elles permettent la présentation des antigènes aux lymphocytes T

CD8+ cytotoxiques. Dans un premier temps, le rôle des lymphocytes T CD8+ dans la SEP fut

négligé face à la contribution majeure des lymphocytes T CD4+ dans la maladie. Puis, grâce à

l’étude de l’EAE l’importance de cette population cellulaire fut mise en évidence. Comme

observé chez les souris atteintes d’EAE, les lymphocytes T CD8+ sont majoritaires dans les

lésions de SEP comparé aux lymphocytes T CD4+ [Martin et al., 2008]. Une étude proposa alors

de confirmer l’implication directe du CMH-I dans l’EAE chez des souris doubles

transgéniques exprimant l’allèle HLA-A*03 ainsi que le TCR humain 2D1 spécifique de la

protéine de la gaine de myéline (PLP, pour protéine protéolipide de la myéline) présentée

par le HLA-A*03 et HLA-A*02 [Friese et al., 2008]. Une EAE spontanée se développa chez 4%

des souris doubles transgéniques. Après induction de l’EAE chez ces mêmes animaux

transgéniques, 71% d’entre eux furent malades. A l’opposé les souris contrôles simples

transgéniques (soit pour le CMH, soit pour le TCR) étaient totalement résistantes à l’EAE. De

plus, les données suggérèrent que les lymphocytes T CD8+ étaient suffisants pour initier la

première attaque du SNC, mais que les lymphocytes T CD4+ étaient essentiels pour la

progression de la maladie. Par ailleurs, l’étude confirma le pouvoir protecteur porté par

l’allèle HLA-A*02. En effet, l’introduction de l’allèle HLA-A*02 chez les souris doubles

transgéniques pour HLA-A*03 et le TCR-2D1 les protégeait de l’EAE spontanée ou induite.

De plus, si l’implication directe du locus HLA-C dans la SEP se confirmait, une

nouvelle voie dans la pathogénie de la maladie, montrant l’importance du système

immunitaire inné serait identifiée. Les molécules d’HLA-C chargées avec un peptide

interagissent avec les killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR ) [Rajagopalan et al.,

2005]. Les KIR sont des récepteurs membranaires qui ont des fonctions soit inhibitrices soit

activatrices chez les cellules NK et les lymphocytes T qui les expriment. Les différents allèles

retrouvés dans le HLA-C peuvent être répartis en deux groupes : le HLA-C1 et le HLA-C2.

Introduction

44

Ces deux groupes se lient à des récepteurs KIR non redondants. Cependant, l’association

observée entre HLA-C et la SEP ne semble pas dépendre d’un groupe particulier du HLA-C

mais serait plutôt due à l’effet d’un allèle. En effet, seul l’allèle HLA-C*05 est associé à la

SEP, ce qui semble indiquer que la susceptibilité à la SEP serait conférée par une fonction du

HLA-C indépendante de l’interaction avec les récepteurs KIR [Yeo et al., 2007].

I I.1.7. Les autres gènes associés à la susceptibilité à la sclérose en plaques

Bien que la région du CMH puisse revendiquer le titre d’être la seule région du

génome conférant un risque majeur dans le développement de la SEP, il est maintenant

reconnu que d’autres gènes non-CMH contribuent aussi au risque, mais avec un effet

moindre. Mis à part le CMH, au moins 16 gènes ont été identifiés comme associés à la SEP au

cours de ces deux dernières années (même si ce chiffre semble sous estimé ; Figure 20).

Cependant, beaucoup de ces gènes n’ont pas été confirmés génétiquement ou leur contribution

dans la maladie reste encore à comprendre. Ces gènes peuvent être classés en 3 catégories :

(1) gènes impliqués dans l’immunité, (2) gènes ayant un rôle neurologique et (3) gènes ayant

une fonction difficile à lier avec l’étiologie de la SEP [Fugger et al., 2009].

Introduction

45

Figure 20 : Les gènes associés au risque de développer une sclérose en plaques. D’après Fugger et al., Nat. Rev.

Immunol., 2009

1.7.1. Le récepteur à l’IL-7

Ce n’est que récemment qu’un gène n’appartenant pas à la famille du CMH fut associé

à la SEP. En 2007, un travail de grande ampleur (334 923 polymorphismes testés) mené sur

l’association de polymorphismes avec la susceptibilité à la SEP identifia un polymorphisme

du gène codant pour la chaîne alpha du récepteur à l’IL-7 (IL-7Rα) comme un facteur à risque

[Hafler et al., 2007]. Gregory et al. démontrèrent eux aussi qu’il existait une transmission

excessive de l’allèle C du polymorphisme rs6897932 des parents vers les enfants souffrant de

SEP [Gregory et al. 2007]. Ce polymorphisme est localisé dans l’exon 6 où il induit le

changement d’un tryptophane en isoleucine en position 244 de la protéine (changement

Introduction

46

T244I). Par ailleurs, ce polymorphisme révéla un effet indépendant de l’effet du CMH. Si le

pourcentage attribuable au CMH pour le risque de développer une SEP est de 40,1%, il est de

16,4% pour le génotype G/G du polymorphisme rs6897932 et de 49,6% pour la combinaison

des deux facteurs. Une autre équipe confirma simultanément l’association de ce

polymorphisme à la SEP [Lundmark et al., 2007]. Cette association fut par la suite répliquée dans

de nombreuses populations indépendantes [Weber et al., 2008]. Une méta-analyse reprenant les

données sur ce polymorphisme évalua le faible risque qu’il conférait à environ 1,2 [Harley et

al., 2007]. Par ailleurs, une étude démontra qu’un autre haplotype (dont certains

polymorphismes se situaient en région 5’UTR et 3’UTR) était fortement associé à une

diminution de l’expression du transcrit codant pour la forme soluble de l’IL-7R dans les

cellules immunitaires [McKay et al., 2008].

Le changement T244I, induit par le polymorphisme rs6897932, affecte le domaine

transmembraire de l’IL-7Rα. Ce domaine est soumis à un épissage alternatif ayant des

conséquences fonctionnelles importantes pour le récepteur. En effet, si le transcrit de l’IL-

7Rα possède l’exon 6, il codera pour la forme transmembranaire du récepteur présent à la

surface des cellules, alors que celui ne possédant pas cet exon codera pour la forme soluble de

la protéine [Harley et al., 2007]. Bien que Gregory et al. suggérèrent que ce polymorphisme

pouvait être responsable de l’augmentation de la forme soluble du récepteur, Lundmark et al.

démontrèrent une augmentation de l’IL-7R et de l’IL-7 dans le LCR de patients SEP par

rapport à des témoins. Le voie de l’IL-7 semble importante à la fois dans le développement

des lymphocytes T, mais aussi dans le maintien et l’activation des cellules immunitaires en

périphérie [Mazzucchelli et al., 2007]. Les polymorphismes touchant le gène de l’IL-7Rα

pourraient avoir des conséquences à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative.

Cependant, les conséquences exactes de ces polymorphismes sur la voie IL-7/IL-7R ainsi que

sur la susceptibilité à la SEP restent encore soumises à investigation.

1.7.2. Le récepteur à l’IL-2

L’équipe qui identifia l’association entre le polymorphisme de l’IL-7Rα et la SEP

démontra par ailleurs une association entre deux autres polymorphismes (rs12722489 et

rs2104286) et la maladie. Ces deux polymorphismes se localisent dans le gène codant pour la

chaîne α du récepteur à l’interleukine 2 (IL-2Rα) et présentent un fort LD [Hafler et al., 2007].

Comme pour l’IL-7Rα, le risque conféré par les deux polymorphismes de l’IL-2Rα est faible,

Introduction

47

avec des risques augmentés de 1,34 et 1,26, portés respectivement par les polymorphismes

rs12722489 et rs2104286. Par la suite, l’association de ces deux polymorphismes avec la SEP

fut confirmée par plusieurs travaux indépendants qui leur attribuèrent eux aussi des risques

faibles [Ramagopalan et al., 2007b ; Weber et al, 2008 ; ANZgene, 2009]. Une étude suggéra que le

risque était majoritairement porté par le polymorphisme rs2104286 [IMSGC, 2008].

Suite à une activation cellulaire, la molécule de surface IL-2Rα subit un clivage

enzymatique entraînant son détachement de la membrane [Rubin et al., 1990]. Chez les patients

SEP, la concentration sérique en IL-2Rα est augmentée par rapport à des témoins, avec des

concentrations respectives de 2,3 ng/ml et 2 ng/ml [Maier et al., 2009a]. Il fut par la suite

démontré que les deux polymorphismes associés à la SEP affectaient l’expression sérique de

l’IL-2R α à la fois chez les patients SEP et chez les personnes témoins [Maier et al., 2009a ; Maier

et al., 2009b]. Le génotype du polymorphisme rs12722489 explique à 15% la variance sérique

en IL-2Rα chez les témoins (2% chez les patients SEP), alors que le génotype du

polymorphisme rs2104286 compte pour 18% de la variance chez les patients SEP (5% chez

les patients SEP) [Maier et al., 2009a]. Un troisième polymorphisme se localisant dans la région

3’UTR du gène révéla une association avec la SEP. Mais cette association étant très faible (P

= 0,04), elle reste à confirmer [Matesanz et al., 2007]. Enfin, un quatrième polymorphisme déjà

associé au diabète de type 1 fut associé à la SEP. Il fut démontré que ce dernier

polymorphisme influençait lui aussi l’expression sérique de l’IL-2Rα [Maier et al., 2009b]. L’IL-

2Rα libre (non lié à la membrane) conserve la capacité de se lier à l’IL-2 ce qui empêche

l’interaction de la cytokine avec son récepteur membranaire. Ainsi, l’IL-2Rα libre agirait

comme un antagoniste de l’IL-2 [Maier et al., 2009a]. Cependant, des études complémentaires

sont encore nécessaires pour modéliser l’effet liant l’IL-2Rα avec la SEP. L’importance de ce

gène repose sur des à priori sur la fonction de la protéine. En effet, l’IL-2Rα est aussi mieux

connu sous le nom du marqueur de surface CD25. Les lymphocytes humains qui expriment de

façon constitutive le CD25 à leur membrane ont généralement des fonctions régulatrices. Ceci

est à mettre en relation avec le fait que les cellules régulatrices des patients souffrant de SEP

semblent avoir des fonctions immuno-modulatrices altérées par rapport à celles provenant de

personnes témoins [Viglietta et al., 2004].

Introduction

48

1.7.3. Le CD58

L’équipe qui identifia pour la première fois l’association des gènes de l’IL-2Rα et de

l’IL-7R α avec à la susceptibilité à la SEP identifia par ailleurs de nombreux autres gènes

potentiels. Si l’IL-2Rα et l’IL-7Rα faisaient partie des 2 premiers gènes non-CMH présentant

les meilleurs valeurs statistiques, le gène codant pour le CD58 sortait en 6ème position. Le

polymorphisme rs12044852 du gène CD58 confère un risque relatif de 1,24 [Hafler et al., 2007].

Par la suite, l’implication du CD58 dans la SEP fut confirmée par deux autres études

indépendantes qui associèrent deux autres polymorphismes aux risques relatifs comparables :

rs1335532 [ANZgene, 2009] et rs2300747 [De Jager et al., 2009a]. Il fut démontré que dans le LCR

des patients SEP, l’expression du CD58 était diminuée par rapport à des témoins [Brynedal et

al., 2009]. Bien que le CD58 soit exprimé à la surface de nombreux types cellulaires, De Jager

et al. suggérèrent que les conséquences fonctionnelles du polymorphisme rs2300747 seraient

d’altérer les fonctions du système immunitaire [De Jager et al., 2009a]. Ce polymorphisme, qui

localise dans le premier intron du CD58, est associé à une modification de l’expression du

CD58. En effet, l’allèle associé négativement à la SEP est également associé à une

augmentation de l’ARN messager du CD58 dans les cellules sanguines. Par ailleurs, les

patients présentant une rémission clinique de la SEP présentent une augmentation de l’ARN

messager du CD58 par rapport aux patients en phase de poussées. Le CD58, aussi connu sous

le nom de LFA-3, est une molécule de co-stimulation qui se lie au CD2. Cette interaction peut

augmenter le signal délivré par le TCR. Il fut démontré que l’engagement du CD2 exprimé à

la surface des lymphocytes T régulateurs augmentait l’expression de FOXP3, un récepteur

nucléaire fortement impliqué dans les fonctions régulatrices des cellules T. Ces données

suggèrent que l’effet protecteur du locus CD58 dans la SEP passe par les fonctions

régulatrices des lymphocytes T. Par ailleurs, le CD58, en plus de son implication dans la

signalisation, est une molécule d’adhésion. Ainsi, suggérer que le CD58 intervient dans la

susceptibilité à la SEP par cette seule voie biologique reste soumise à caution [De Jager et al.,

2009a].

1.7.4. La tyrosine kinase 2

Un récent GWAS associa la protéine tyrosine kinase 2 (TYK2) avec la susceptibilité

à la SEP [Ban et al., 2009]. L’allèle G majoritaire du polymorphisme rs34536443 présentait une

Introduction

49

fréquence augmentée chez les patients souffrant de SEP par rapport aux témoins, conférant un

risque relatif de 1,32. L’association du gène TYK2 à la SEP fut par la suite confirmée dans

une étude de GWAS indépendante. Mais ce second travail associa un autre polymorphisme

(rs8118449) de TYK2 à la SEP [ANZgene, 2009]. Cependant, aucune de ces deux études

n’apportèrent d’explication fonctionnelle sur les possibles rôles de TYK2 dans l’étiologie de

la SEP.

TYK2 est une protéine à activité tyrosine kinase qui interagit avec le domaine

intracellulaire de plusieurs récepteurs aux cytokines [Schindler et al., 2008]. Cette protéine est

activée par phosphorylation [Gauzzi et al., 1996]. La fonction kinase de TYK2 est requise pour la

transmission du signal à la suite de l’interaction d’une cytokine avec son récepteur [Ghoreschi

et al., 2009]. Bien qu’initialement découverte comme associée aux récepteurs aux interférons

de type 1 (IFNα et IFNβ), TYK2 fut récemment définie comme interagissant avec de

nombreux récepteurs aux cytokines : IL-12, IL-23, IL-10 et IL-6 (Figure 21) [Watford et al.,

2006]. Ainsi, des modifications de la fonction de TYK2 pourraient avoir des conséquences

multiples sur le système immunitaire. Des souris déficientes pour TYK2 ont permis de

démontrer l’importance de cette tyrosine kinase dans la fonction des cellules dendritiques

[Tokumasa et al., 2007], des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques [Simma et al., 2009] et des

lymphocytes T γδ [Nakamura et al., 2008]. De plus, cette souche de souris présente une résistance

à certains modèles de maladies auto-immunes comme l’EAE [Spach et al., 2009] ou l’arthrite

auto-immune induite par l’injection de collagène [Shaw et al., 2003]. Chez l’Homme, un seul cas

de déficience pour TYK2 fut décrit [Minegishi et al., 2006]. Le patient présentait un syndrome

d’hyper-IgE. De plus, les cellules immunitaires de ce patient présentaient des défauts de

réponse à de nombreuses cytokines (IFNβ, IL-6, IL-10, IL-12 et IL-23) ainsi qu’une

différenciation cellulaire favorisant la voie Th2. Bien que chez la souris et chez l’Homme la

déficience en TYK2 confère des phénotypes légèrement différents vis-à-vis de la réponse aux

cytokines, on retrouve toujours une modification dans la polarisation Th1/Th2 des cellules

immunitaires. La déficience en TYK2 défavoriserait la réponse Th1 en faveur d’une réponse

de type Th2 [Ghoreschi et al., 2009].

Le polymorphisme rs34536443, qui localise dans un exon, est responsable du

changement d’une proline en alanine en position 1104 de la protéine. Ce changement d’acide

aminé touche le domaine kinase de TYK2 et il pourrait donc avoir des conséquences

importantes sur la fonction de la protéine comme l’avait suggéré Kaminker et al. [Kaminker et

al., 2007]. Par ailleurs, il fut démontré que le changement de la proline en position 1104 par

Introduction

50

une valine (et non pas par une alanine comme induit par le polymorphisme rs34536443) avait

pour conséquence de diminuer la phosphorylation de TYK2 et par conséquent son état

d’activation [Tomasson et al., 2008]. Afin de comprendre l’importance de TYK2 dans l’étiologie

de la maladie, il serait important de confirmer que le polymorphisme rs34536443 modifie la

réponse immune.

Figure 21 : Récepteurs aux cytokines qui utilisent TYK2 dans leur voie de signalisation. D’après Watford et al.,

Immunity, 2006.

Parmi les nombreux gènes récemment identifiés comme associés à la susceptibilité à la

SEP, peu présentent une réplication positive dans une cohorte indépendante à celle utilisée

dans la première étude. De plus, même si l’association à la SEP est confirmée pour un gène,

une approche fonctionnelle est indispensable afin de mieux comprendre l’étiologie de la

maladie [Chanock et al., 2007]. En effet, cela permet de :

(1) Valider que le polymorphisme associé à la maladie est bien le polymorphisme

« fonctionnel ». En effet, le polymorphisme initialement découvert comme associé à la

maladie peut avoir un fort LD avec un autre polymorphisme réellement fonctionnel.

(2) Mieux comprendre la ou les voie(s) conduisant au développement de la SEP et de

découvrir de nouvelles voies jouant un rôle important dans la maladie.

L’identification certaine du gène conférant une susceptibilité accrue à la SEP ne signifie pas

que la voie de signalisation impliquée dans la maladie est clairement définie. En effet, certains

gènes ont des fonctions dans de nombreuses voies de signalisation. Suite à la découverte

d’une association génétique, des approches expérimentales complémentaires sont

indispensables afin d’étudier les effets, qualitatifs et quantitatifs, des variants sur le gène.

Elles permettent également de mieux comprendre comment ces variants affectent une voie de

signalisation ou des interactions cellulaires [Fugger et al., 2009].

Introduction

51

II.2. Les facteurs environnementaux

Dans la SEP, la composante génétique est importante car elle permet par exemple

d’expliquer l’augmentation du risque de développer la maladie dans les familles dont un des

membres en souffre. Cependant, si on pensait que la composante génétique était le seul

facteur impliqué, il serait alors impossible d’expliquer certaines particularités de cette maladie

comme : les variations de fréquence de la maladie en fonction de la géographie, mais aussi les

modifications du risque liées à la migration d’individus [Ascherio et al., 2007a ; Ascherio et al.,

2007b]. Par ailleurs, plusieurs études, dont celle d’Orton et al., reportent une rapide et récente

augmentation de l’incidence la maladie uniquement chez les femmes [Orton et al., 2006]. Une

augmentation si rapide pourrait être le reflet de changements environnementaux. Il est

important de faire la différence entre les facteurs micro-environnementaux qui agissent sur les

individus au sein d’une famille, et les facteurs environnementaux qui agissent sur une

population entière.

II.2.1. Les risques micro-environnementaux

L’identification de facteurs micro-environnementaux capables de déclencher le

développement de la SEP représenterait une avancée majeure dans la prévention de la

maladie. Il serait alors possible de prévenir l’exposition à ces facteurs et ainsi de diminuer le

nombre de personnes développant la SEP. L’hypothèse hygiéniste fut alors évoquée pour

expliquer l’augmentation de l’incidence des maladies auto-immunes, dont la SEP [Fleming et

al., 2006]. Cette hypothèse repose sur le concept que l’absence de contact avec certains agents

pathogènes durant l’enfance pourrait, plus tard dans la vie, expliquer une prédisposition de ces

individus aux maladies auto-immunes. Dans les pays développés, l’utilisation massive

d’antibiotiques et de vaccins, mais aussi la mise en place de périodes de quarantaine,

réduisent le contact avec des agents pathogènes durant l’enfance. Le résultat serait que le

système immunitaire échouerait dans son développement normal. Ces mêmes pathogènes,

lorsqu’ils solliciteraient plus tardivement le système immunitaire, pourraient conduire à

l’apparition d’une réponse auto-immune [Giovannoni et al., 2007]. En s’appuyant sur les grandes

lignes de ce concept hygiéniste, il fut proposé d’étudier si un enfant partageant son

environnement familial avec un autre enfant d’âge proche présentait une diminution du risque

de développer une SEP une fois adulte. Cela reposait sur l’idée que l’enfant cadet serait en

Introduction

52

contact avec plus (et plus tôt) de pathogènes responsables de maladies infantiles que des

enfants uniques ne le seraient. Cette exposition permettrait une meilleure éducation de leur

système immunitaire. Par ailleurs, l’enfant ainé verrait son système immunitaire

régulièrement restimulé par des infections. Un travail rapporta que le contact avec un enfant

de 2 ans son cadet durant les 6 premières années de sa vie suffisait à réduire le risque de

développer une SEP [Ponsonby et al., 2005a ; Ponsonby et al., 2005b]. Cependant, ces résultats furent

réfutés par d’autres études ne trouvant pas d’association entre la SEP et le nombre de frères et

sœurs, le fait d’être l’ainé ou le cadet, ou la différence d’âge entre les enfants [Sadovnick et al.,

2005 ; Bager et al., 2006]. Une étude se proposa d’étudier la relation qu’il existait entre la

prévalence de la SEP et la prévalence d’un parasite (Trichuris trichiura) choisi comme

marqueur de l’état sanitaire du lieu de vie et de l’infection par d’autres macro-parasites

[Fleming et al., 2006]. Il fut montré que la prévalence de la SEP chutait drastiquement chez les

populations humaines où les prévalences de ce parasite dépassaient le seuil des 10%.

Cependant, il est important de pondérer ce résultat car il ne montre aucune causalité directe

entre ces deux variables et qu’il pourrait n’être que le reflet d’autres facteurs

environnementaux ou sociaux.

Mais jusqu’à aujourd’hui, les approches d’épidémiologie utilisant des cohortes de

familles n’ont pas réussi à démontrer la transmission de facteurs non-génétiques. On peut

donc dire que l’environnement semble capable d’influencer le risque de SEP au niveau d’une

population et non pas au niveau d’un individu [Giovannoni et al., 2007].

I I.2.2. Les risques environnementaux

Il existe des différences dans le risque de SEP en fonction des régions du monde. La

maladie est plus rare dans les zones tropicales que dans les régions tempérées (Figure 22)

[Marrie et al, 2004]. Des variations de la prévalence de la SEP sont aussi visibles sur de relatives

courtes distances géographiques, ce qui reflète en partie l’influence de l’environnement sur

une même ethnie. De plus, l’influence d’un ou de plusieurs facteurs environnementaux sur la

susceptibilité à la SEP a été envisagée suite aux résultats obtenus par des études de migration

d’individus. Ces études suggèrent que l’exposition à des facteurs environnementaux, dont la

nature reste encore à déterminer, doit se faire tôt au cours de l’adolescence pour avoir un effet

sur la maladie [Marrie et al, 2004]. En effet, les individus migrant d’une région du globe vers

une autre, avant leur adolescence, présentent un risque de développer une SEP comparable à

Introduction

53

celui de leur lieu d’immigration. En comparaison, ceux qui migrent après leur adolescence

emportent avec eux l’incidence de SEP du pays d’où ils viennent. Des études réalisées sur

l’immigration au Royaume-Uni montrèrent que les immigrants pakistanais (zone de faible

risque) qui arrivaient avant l’âge de 15 ans avaient significativement plus de risque de

développer une SEP que les individus arrivant après l’âge de 15 ans [Dean et al., 1997]. Par

contre, les enfants nés au Royaume-Uni de cette première génération d’immigrants avaient un

risque de SEP du même ordre que la population générale du Royaume-Uni [Elian et al., 1990].

Figure 22 : Prévalence de la SEP dans le monde. D’après Compston et al., Lancet, 2008.

2.2.1. Les agents infectieux

Depuis longtemps les agents infectieux sont suspectés comme jouant un rôle dans la

SEP [Gilden et al., 2005]. Dans ce contexte, deux grandes théories s’affrontent. Cependant, elles

reposent sur un concept commun, à savoir que l’agent pathogène responsable de la SEP serait

largement répandu [Ascherio et al., 2007a]. La première hypothèse, appelée « hypothèse de la

poliomyélite », pose le postulat qu’il existerait un virus capable d’augmenter le risque de

développer une SEP lorsqu’il serait tardivement rencontré durant l’enfance ou à l’âge adulte.

Par contre, une infection par ce même virus durant l’enfance serait moins néfaste et pourrait

conférer une protection immunitaire. La deuxième hypothèse est « l’hypothèse de la

prévalence », qui suggère que la SEP est causée par un pathogène qui serait plus

communément répandu dans les zones de grande prévalence de la maladie. L’hypothèse

« poliomyélite » semble avoir gagné les faveurs de la communauté scientifique, bien qu’elle

Introduction

54

reprenne par beaucoup d’aspects une théorie plus ancienne, la théorie hygiéniste. Cette théorie

est intéressante car elle permettrait d’expliquer le gradient de latitude de la SEP mais surtout

l’apparente protection des personnes nées dans les zones de faible risque de SEP et qui

migreraient par la suite vers des zones de haut risque.

a. Le virus d’Epstein-Barr

L’EBV est un virus de la famille des herpès qui infecte les lymphocytes B. Il est

considéré comme une cause plausible dans le développement de la SEP car : (1) il infecte la

quasi-totalité de la population mondiale, (2) il persiste dans la cellule sous la forme de virus

dormant, mais peut se réactiver et donner lieu à la production de nouvelles particules virales

(3) il peut moduler le système immunitaire. Bien que la quasi-totalité de la population

mondiale soit infectée par l’EBV, si on compare des patients SEP à des personnes témoins, on

retrouve des différences entre les deux groupes. Presque 100% des patients SEP sont infectés

par le virus alors que « seulement » 90% des personnes saines pour la SEP sont séropositives

à l’EBV [Ascherio et al., 2007a]. Cette différence est encore plus marquée chez les enfants,

comme l’a montré une étude des formes infantiles de SEP [Pohl et al., 2006].

La mononucléose virale est la manifestation clinique d’une infection aigüe par l’EBV.

Cette manifestation est plus commune chez les adolescents et les adultes que chez les jeunes

enfants chez qui l’infection primaire par l’EBV est généralement cliniquement silencieuse. Il

est intéressant de noter que la SEP et la mononucléose virale partagent des distributions

géographiques de prévalence similaires : accroissement de la prévalence avec l’éloignement

de l’équateur [Ascherio et al., 2007a]. Une méta-analyse de l’association entre la SEP et la

mononucléose infectieuse révéla un risque relatif 2,3 fois plus élevé de développer la SEP

chez les personnes ayant eu une manifestation clinique, par rapport à des personnes infectées

de manière silencieuse par le virus [Thacker et al., 2006]. Une autre étude reproduisit ce résultat

avec un risque relatif comparable, et démontra que ce risque augmentait dans les 5 ans faisant

suite à la mononucléose virale, pour rester élevé même 30 ans après [Nielsen et al., 2007]. Si on

analyse ces résultats dans leur globalité, cela pose le problème d’un grand paradoxe avec

l’hypothèse de la poliomyélite : l’infection par le virus serait plutôt associée à une plus grande

susceptibilité à la SEP. Cependant, la proposition d’un modèle de relation entre l’infection par

l’EBV et la SEP permit de réconcilier les données avec l’hypothèse de la poliomyélite :

même si le risque de SEP est presque nul pour les personnes non infectées par le virus, le

risque est intermédiaire pour les personnes infectées par l’EBV durant leur enfance (infection

Introduction

55

silencieuse), mais surtout le risque augmente encore plus pour devenir un risque fort chez les

personnes infectées durant leur adolescence ou à l’âge adulte (manifestation de mononucléose

virale) (Figure 23) [Pohl et al., 2009].

De manière intéressante, une récente étude a montré la présence de lymphocytes B et

de plasmocytes infectés par l’EBV dans le cerveau de patients ayant souffert de SEP. De

telles cellules ne furent pas retrouvées dans le cerveau de personnes souffrant d’autres

maladies neurologiques inflammatoires [Serafini et al., 2007]. Cependant, ces résultats restent à

confirmer car certains patients souffrant de SEP avaient reçu des traitements

immunosuppresseurs et qu’il n’y avait que peu d’individus témoins souffrant d’une

inflammation chronique du SNC. Il est aussi possible de retrouver les traces d’une réaction

immunitaire dirigée contre l’EBV dans le SNC de patients souffrant de SEP. La présence

d’IgG intrathécales est le reflet d’une réponse inflammatoire localisée dans le SNC, car les Ig

ne peuvent pas passer la BBB. Une étude montra que certains anticorps contenus dans les

bandes oligoclonales d’IgG de patients atteints de SEP présentaient une spécificité dirigée

contre des protéines du virus de l’EBV. Qui plus est, leur quantité était significativement plus

importante chez les patients SEP que chez des témoins [Cepok et al., 2005]. Cependant, ce

résultat reste à confirmer car il est bien connu que les patients SEP développent une synthèse

intrathécale d’anticorps dirigés contre de nombreux pathogènes (herpes simplex, virus de la

varicelle…) [Pohl et al., 2009]. Dans le sang aussi, les anticorps dirigés contre l’EBV sont

davantage présents chez les patients SEP que chez des témoins, et cette augmentation a lieu

bien des années avant que les premiers signes de SEP apparaissent [Levin et al., 2005]. Un autre

indice soulignant l’éventuelle implication de l’EBV est la présence d’une réponse immunitaire

dirigée contre l’EBV impliquant les lymphocytes T CD4+ [Lünemann et al., 2006] et T CD8+

[Jilek et al., 2008] plus forte chez les patients SEP que chez des témoins. Une infection par

l’EBV pourrait initier une réponse auto-immune par une réactivité des lymphocytes T à la fois

contre les protéines du virus et contre des auto-antigènes. En effet, la reconnaissance croisée

des lymphocytes T pour les peptides de l’EBV et pour des protéines de la myéline a été

prouvée. Cependant, il a été aussi montré que la fréquence des lymphocytes T ayant une

double reconnaissance, à la fois des protéines du soi et des protéines virales, était similaire

entre les patients souffrant de SEP et les personnes saines [Lünemann et al., 2008].

Introduction

56

Figure 23 : Représentation schématique de l’incidence de la SEP en fonction de l’infection par le virus

d’Epstein-Barr. D’après Thacker et al., Ann. Neurol., 2006.

b. Les autres pathogènes suspectés

Bien que l’EBV soit l’agent pathogène privilégié dans l’hypothèse d’une implication

virale, d’autres pathogènes ne peuvent pas être exclus. Ces dernières années, l’éventuelle

implication de deux autres pathogènes fut également favorisée : Chlamydia pneumoniae et le

virus herpétique humain 6 (HHV6). La découverte de l’ADN de Chlamydia pneumoniae

dans le LCR d’un patient souffrant de SEP fit grand bruit [Sriram et al. 1998] mais cette

hypothétique association ne dura pas très longtemps par l’absence de confirmation sûre [Bagos

et al., 2006]. Au contraire, le rôle de HHV6, virus en partie neurotrope [Braun et al., 1997], est

encore fortement supposé comme influençant la susceptibilité à la SEP [Ascherio et al., 2007a].

Chez les patients SEP, l’ADN de HHV6 est plus fortement retrouvé au niveau du SNC

comparé à un individu sain. Par ailleurs, la présence de cet ADN viral est augmentée

localement au niveau des lésions inflammatoires par rapport à la substance blanche

environnante [Cermelli et al., 2003]. Cependant, ce virus est aussi capable d’infecter les cellules

immunitaires. Comme la nature des cellules infectées par HHV6 au niveau des lésions n’a pas

été caractérisée, on ne peut pas exclure que l’augmentation de l’ADN de HHV6 observée soit

le reflet d’un recrutement massif de cellules inflammatoires au niveau des lésions. Une autre

étude nota une activité virale de HHV6, avec la production d’ARN, confinée aux

oligodendrocytes à la fois chez les patients SEP et des personnes saines. Cependant, cette

Introduction

57

activité virale semblerait beaucoup plus importante dans le SNC des personnes souffrant de

SEP [Opsahl et al., 2005].

Il est qu’en même important de rappeler que malgré les troublantes associations

trouvées entre divers pathogènes et la SEP, on ne peut pas exclure que les changements

observés soient tout simplement la conséquence de changements biologiques mis en place lors

de l’apparition d’une SEP plutôt que les causes de la maladie.

2.2.2. L’exposition lumineuse et la vitamine D

L’augmentation de la prévalence de la SEP avec l’éloignement progressif hors des

régions équatoriales du globe [Kurtzke et al., 2000] a rapidement suggéré l’implication de

facteurs environnementaux. L’un des facteurs environnementaux directement associé avec cet

effet latitude fut l’exposition lumineuse. En effet, les régions équatoriales reçoivent une

intensité lumineuse plus importante et de plus longue durée que les régions australes. Dans ce

sens, une étude montra que l’intensité lumineuse d’une zone était inversement corrélée avec la

prévalence de la SEP [Van de Mei et al., 2001].

Le rôle possible de la vitamine D (VD) dans la susceptibilité à la SEP fut pointé du

doigt [Goldbers et al., 1974] lorsque les travaux de l’équipe du Dr Holick montrèrent que la

l’exposition au soleil était le principal élément régulant la concentration de cette vitamine

[Holick et al., 2008]. Pour beaucoup de personnes, l’exposition au soleil est la source majeure de

VD. Dans les régions de fortes latitudes, les radiations solaires en hiver sont trop faibles pour

permettre une synthèse suffisante de VD [Stewart et al., 2009]. Chez l’Homme, la production de

la forme active de la VD se fait au niveau de la peau à partir d’un dérivé du cholestérol. La

forme pré-VD nécessite un clivage par les rayons ultraviolets B du soleil pour devenir

biologiquement active (Figure 24) [Smolders et al., 2008]. Sans réellement le démontrer,

quelques rares et anciennes études essayèrent de montrer que les faibles taux de VD sériques

pouvaient favoriser une plus grande susceptibilité à la SEP. D’autres études montrèrent que

les patients souffrant de SEP présentaient un taux sérique en VD plus faible que des personnes

issues d’une population témoin [Ozgocmen et al., 2005 ; Orton et al., 2008 ; Correale et al., 2009].

Cependant, ces études furent contredites par d’autres, et ne purent jamais démontrer que le

faible taux en VD pouvait être la cause de la SEP et non une conséquence de la maladie

(problèmes ambulatoires ne favorisant pas les sorties à l’extérieur par exemple) [Van der Mei et

al., 2007]. Une étude pratiquée sur un très grand nombre de personnes vivant dans

Introduction

58

l’hémisphère Nord montra qu’il y avait significativement moins de personnes atteintes de SEP

nées au mois de Novembre, mais significativement plus lorsqu’elles étaient nées au mois

d’Avril. Cette observation que le mois de naissance et le risque de développer une SEP

pourraient être associés implique une interaction avec l’environnement. Une hypothèse serait

que « l’effet mois de naissance » est lié à la concentration sanguine en VD chez la mère, qui

varie au cours des saisons [Willer et al., 2004].

La VD peut aussi être absorbée via la nourriture. Sous cette forme, le clivage par

l’exposition au soleil n’est plus nécessaire. Cependant, son apport est limitée à la

consommation de rares aliments comme les poissons gras, les champignons de type shiitaké,

et le contenu de l’estomac des rennes, donc autant dire restreint aux poissons gras pour la

majorité d’entre nous [Ebers et al., 2008]. Chez l’animal, dans le modèle EAE, l’injection intra-

péritonéale quotidienne de la forme active de la VD [Muthian et al., 2006] ou la

complémentation de l’alimentation en VD [Spach et al., 2006] sont capables de diminuer

significativement les signes cliniques de la maladie. Une étude réalisée sur des souris délétées

pour le récepteur à la VD montra que ce récepteur était indispensable pour l’effet protecteur

de la VD dans l’EAE [Meehan et al., 2002]. Chez l’être humain, une étude américaine s’intéressa

à une cohorte de femmes supplémentées dans leur régime alimentaire avec un complément

multivitaminé, contenant de la VD. Cette cohorte présentait un risque 40% plus faible de

développer une SEP que les femmes non complémentées [Munger et al., 2004]. Cependant,

l’effet des autres vitamines contenues dans le complément alimentaire ne pouvait pas être

exclu. La même équipe suggéra plus tard l’effet réel de la VD seule, en démontrant qu’une

forte concentration sanguine en VD était associée à un risque moindre de développer une SEP

[Munger et al., 2006]. Des études pratiquées sur des populations dont l’alimentation comprenait

des aliments naturellement riches en VD (Finlandais, Inuits) suggèrent que cette hygiène

alimentaire pourrait expliquer la faible incidence de la SEP dans cette population [Ebers et al.,

2008].

Introduction

59

Pre-Vitamin D

1.25(OH) D

Vitamin D

UV-lightSkin

Diet

Active Metabolite

Pre-Vitamin D

1.25(OH) D

Vitamin D

UV-lightSkin

Diet

Active Metabolite

Figure 24 : Métabolisme de la vitamine D. D’après Smolders et al., J. Neuroimmunol., 2008.

Le récepteur de la VD fait partie de la superfamille des récepteurs aux stéroïdes. Une

fois lié à la forme active de la VD, il peut se fixer au niveau des éléments de réponse à la VD

en amont de nombreux gènes. La découverte de l’expression du récepteur à la VD dans les

monocytes, les cellules présentatrices de l’antigène (APC) et les lymphocytes activés

suggère un effet de la VD sur le système immunitaire [Veldman et al., 2000 ; Chen et al., 2007].

Plusieurs études mettent en évidence un modèle suivant lequel la VD serait capable d’orienter

la réponse immunitaire vers une réponse anti-inflammatoire [Smolders et al., 2008]. La VD

inhiberait la polarisation des lymphocytes T CD4+ vers un profil cytokinique Th1 (IFNγ et

TNFα) [Muthian et al., 2006] et favoriserait une polarisation vers un profil cytokinique Th2 (IL-

4, IL-5 et IL-13) [Boonstra et al., 2001]. Plus important, la VD pourrait induire des lymphocytes

T régulateurs produisant de l’IL-10 et du TGFβ [Dong et al., 2003].

2.2.3. La cigarette

Bien que la cigarette ne puisse pas expliquer le gradient de latitude observé dans la

SEP ainsi que la modification du risque de développer la maladie lors de migrations, cette

habitude sociale a souvent été testée comme un facteur de risque. Déjà en 1965, un article

présentait la cigarette comme un possible facteur de risque [Antonovsky et al., 1965]. Par la suite,

des études plus récentes démontrèrent aussi un risque augmenté de développer une SEP dans

la population de fumeurs comparé à une population de non-fumeurs [Hernan et al., 2005 ;

Introduction

60

Pekmezovic et al., 2006]. Le regroupement des données de plusieurs études prospectives rend

compte d’un risque relatif poolé 1,25 (P < 0,01) fois plus important chez les fumeurs que chez

les non-fumeurs [Hawkes et al., 2007]. Par ailleurs, la cigarette aggraverait les symptômes de

SEP et serait aussi capable d’accélérer le passage de la forme RR-MS vers la forme SP-MS

[Hernan et al., 2005]. La cigarette contient plus de 4 500 composés qui peuvent expliquer une

susceptibilité accrue à la SEP, mais aussi la progression plus rapide de la maladie chez les

fumeurs. Certains de ces composés sont connus pour avoir un effet neurotoxique : c’est le cas

de l’oxyde nitrique (NO). Il est connu que fumer augmente le niveau de NO plasmatique

[Zhou et al., 2000]. Il est raisonnable de penser que cette augmentation se fait aussi au niveau du

SNC et des lésions de démyélinisation. Dans le SNC, les neurones sont des cellules qui sont

très sensibles à la présence de NO [Kapoor et al., 2003]. Le NO peut ainsi conduire à une

dégénérescence axonale ou à un blocage du signal électrique. Enfin, la cigarette, de par son

grand nombre de composés, affecte le système immunitaire [Stämpfli et al., 2009], la

perméabilité de la BBB [Hawkes et al., 2007] et le risque de développer plus d’infections virales

et bactériennes [Stämpfli et al., 2009]. Cependant, les résultats d’association entre la cigarette et

la SEP doivent être interprétés avec beaucoup de précautions [Hawkes et al., 2005]. En effet,

cette association n’est pas retrouvée dans toutes les études [Warren et al., 1982 ; Casetta et al.,

1994]. Ces contradictions dans l’association peuvent être dépendantes de problèmes dans la

méthodologie, comme l’homogénéité des cohortes étudiées ou l’absence de corrections

statistiques. Ainsi l’effet de la cigarette sur le développement de la SEP, et l’effet possible du

tabagisme passif attendent toujours une confirmation [Sundström et al., 2008]. Enfin, une

association claire de la cigarette comme facteur impliqué dans la récente augmentation de

l’incidence de la maladie chez les femmes n’a toujours pas été démontrée.

II.3. Les facteurs épigénétiques

Si l’information génétique était l’unique facteur déterminant la susceptibilité à la SEP,

on pourrait penser que des jumeaux MZ, par définition génétiquement identiques, partagent le

même risque de développer la maladie et donc présentent un statut clinique concordant pour

la SEP. Or, ce n’est pas le cas puisque seulement 20 à 30% des jumeaux MZ sont concordants

pour la SEP [Willer et al., 2003 ; Hansen et al., 2005]. A défaut d’avoir d’autres causes pouvant

expliquer ces variations, on les attribuait habituellement à un effet de l’environnement [Wong

et al., 2005]. Cependant, l’environnement ne semble pas pouvoir expliquer pleinement de telles

Introduction

61

différences de statut clinique chez des jumeaux MZ. Ainsi, des clones animaux, qui possèdent

la même information génétique et partagent le même environnement, peuvent présenter des

phénotypes très différents (croissance aberrante, couleur du pelage, mort précoce…). Ces

divergences résulteraient d’un défaut dans la reprogrammation épigénétique lors de la

fécondation de l’œuf [Rideout et al., 2001]. Par ailleurs, de nombreuses études se proposèrent

d’évaluer l’importance de l’environnement chez l’Homme en comparant des jumeaux MZ

ayant partagé le même environnement durant l’enfance à des jumeaux MZ ayant grandi

séparément. Sur les différents traits testés, comme la personnalité [Bouchard et al., 2003] ou la

susceptibilité aux céphalées [Svensson et al., 2003], la corrélation obtenue pour des jumeaux MZ

ayant grandi séparément n’était pas plus mauvaise que celle obtenue pour des jumeaux MZ

ayant partagé le même environnement. Pour expliquer les discordances cliniques des jumeaux

MZ dans la SEP, l’implication d’une troisième composante fut alors suggérée : la composante

épigénétique. L’épigénétique permet de compléter l’équation suivante dans l’acquisition de la

susceptibilité à la SEP : P = G + E + EpiG (avec P : phénotype, G : génétique, E :

environnement et EpiG : épigénétique) [Petronis et al., 2006].

A l’origine, le terme épigénétique définissait les interactions des gènes avec

l’environnement qui conduisaient à l’expression d’un phénotype. Cette définition fut par la

suite améliorée en définissant l’épigénétique comme la modification de l’expression des gènes

sans que des changements visibles dans la séquence ADN n’aient lieu. Cette modification

d’expression est la conséquence de méthylations de l’ADN au niveau d’îlots CpG mais aussi

du remodelage de la chromatine (modification des histones) [Jirtle et al., 2007]. En effet, alors

que le génome de toutes les cellules somatiques d’un organisme complexe renferme

exactement les mêmes gènes, les facteurs épigénétiques permettent aux cellules de se

différencier en un lignage défini via l’expression ou l’inhibition spécifique de certains gènes

[Brena et al., 2006]. Dans le futur, cette définition pourrait encore être élargie avec la découverte

de nouveaux mécanismes épigénétiques [Cuzin et al. 2008]. De plus, certaines modifications

épigénétiques sont transmissibles au cours des divisions cellulaires, voire même de génération

en génération. Ainsi, le concept d’épigénétique rompt avec celui d’une transmission

mendélienne d’un phénotype. De plus, cela suggère que les gènes pourraient avoir une sorte

de mémoire de l’environnement. Se pose alors la question suivante : l’environnement et la

façon de vivre de mes ancêtres proches pourraient-ils directement influencer ma susceptibilité

à une maladie ? La réponse est oui car, du moins chez la souris, des phénotypes particuliers

sont transmissibles au cours des générations sans qu’il n’y ait présence d’une mutation

Introduction

62

génétique. Rassoulzadegan et al. démontrèrent qu’un trait phénotypique (le bout de queue

blanc de la souris), initialement dû à une mutation non-sens dans le gène Kit, était conservé

pendant au moins deux générations sans que la mutation responsable du phénotype ne soit

encore présente chez les souris présentant ce phénotype (Figure 25) [Rassoulzadegan et al., 2006].

Le mécanisme proposé fut que la mutation du gène Kit induisait à la synthèse d’un ARN

défectueux qui serait transmissible à la génération suivante via les spermatozoïdes. Cet ARN

inhiberait l’expression du gène Kit ce qui conduirait à l’expression du phénotype mutant,

même chez des souris sauvages [Soloway et al., 2006]. Par un mécanisme comparable, une autre

étude démontra qu’il était possible d’induire une hypertrophie cardiaque via l’introduction

d’un ARN inhibiteur exogène dans la première génération de souris. Cette pathologie

cardiaque est transmissible pendant au moins trois générations sans manipulation extérieure

des animaux [Wagner et al., 2008].

Figure 25 : Modèle pour la transmission d’un phénotype en l’absence de mutation du gène Kit proposé par

Rassoulzadegan et al. D’après Soloway et al., Nature, 2006.

Introduction

63

II.3.1. Influence de l’épigénétique dans la susceptibilité aux maladies auto-

immunes

Plusieurs médicaments, tel l’Hydralazide et la Procaïnamide, peuvent avoir des effets

indésirables graves chez des personnes génétiquement prédisposées. Dans certains cas, ils

peuvent conduire à l’apparition d’une maladie auto-immune dont les symptômes sont proches

de ceux du lupus. Le mode d’action de cette classe de médicaments repose sur la modification

des méthylations de l’ADN [Cornacchia et al., 1988]. Ces effets délétères causés par une

modification des méthylations du génome soulignent la possible implication des facteurs

épigénétiques dans la susceptibilité aux maladies auto-immunes. Une étude démontra que si

des jumeaux MZ étaient épigénétiquement indistinguables durant leurs premières années de

vie, des jumeaux MZ plus âgés présentaient de nombreuses différences à la fois quantitatives

et qualitatives dans leur profil épigénétique (distribution des méthylations sur le génome)

[Fraga et al., 2005]. On ignore encore si de tels changements épigénétiques s’accumulent sous la

pression de facteurs extérieurs (environnement, régime alimentaire…) ou/et de facteurs

internes ou stochastiques (division/différentiation cellulaire) [Poulsen et al., 2007]. Il a été

montré que des changements épigénétiques sont capables d’induire des changements

phénotypiques. La discordance des jumeaux MZ pour la SEP pourrait résulter de

modifications épigénétiques non similaires. Dans ce cas, la SEP serait une maladie à

composante épigénétique. Cependant, contrairement à d’autres maladies auto-immunes,

l’implication de la composante épigénétique dans la SEP n’a pas encore été étudiée

[Hewagama et al., 2009]. Mais en partant du postulat que les maladies auto-immunes partagent

une base commune, dont la dérégulation du système immunitaire, il est possible de faire le

rapprochement entre les découvertes faites dans d’autres maladies auto-immunes et la SEP.

II.3.2. Comment l’épigénétique pourrait modifier la susceptibilité à la sclérose en

plaques ?

La composante épigénétique pourrait au moins intervenir à 3 niveaux dans le

développement de la SEP : (1) en faisant apparaître des auto-antigènes capables d’activer une

réponse auto-immune, (2) en rendant la gaine de myéline plus susceptible aux agressions ou

en empêchant une remyélinisation correcte des axones, (3) en modifiant les cellules du

système immunitaire pour les rendre auto-réactives.

Introduction

64

3.2.1. Modification épigénétique du locus PAD2

Une modification du profil épigénétique est visible dans la substance blanche des

patients SEP. Il a été démontré que l’ADN de la substance blanche de ces patients contenait

environ 3 fois moins de cytosines méthylées comparé à des témoins [Mastronardi et al., 2007]. Ce

changement épigénétique observé serait le reflet d’une augmentation de l’activité

enzymatique des ADN-déméthylases chez les patients SEP [Mastronardi et al., 2007]. De plus

cette hypo-méthylation de l’ADN est spécifique au SNC puisqu’elle n’est pas retrouvée dans

d’autres tissus comme le thymus [Mastronardi et al., 2007].

Une des cibles de cette hypo-méthylation serait le locus PAD2 qui code pour une

enzyme à l’activité arginine déiminase [Moscarello et al., 2007]. La région promotrice du gène

PAD2 contient 74% de GC qui sont des résidus méthylables. Cette région est retrouvée

comme hypo-méthylée dans le cerveau des patients SEP comparé à des témoins [Mastronardi et

al., 2007]. La méthylation d’une région promotrice d’un gène est un phénomène épigénétique

qui permet de diminuer l’expression des gènes. Moscarello et al. démontrèrent que l’hypo-

méthylation du promoteur de PAD2 était associée à une quantité 3 fois plus importante de la

protéine dans la substance blanche des patients SEP par rapport aux témoins [Mastronardi et al.,

2007]. PAD2 est une enzyme impliquée dans la modification post-traductionnelle des

protéines. Elle transforme les acides aminés arginines en citrullines qui sont des acides aminés

non codés par le génome. Une des cibles de PAD2 est la MBP constituant la gaine de myéline

entourant les axones [Casaccia-Bonnefil et al., 2008]. Alors que la forme citrullinée de la MBP est

faiblement représentée chez les témoins (environ 20%), elle constitue environ 45% de la MBP

totale dans le cerveau des patients SEP [Moscarello et al., 1994]. Cette forme citrullinée de la

MBP se distingue de la MBP « classique » par la modification de 6 arginines en citrullines.

Pour chaque arginine perdue, la MBP perd une charge positive, ce qui la fait passer d’un état

électriquement neutre vers un état chargé négativement. Ce changement de la charge

électrique globale de la protéine a pour conséquence d’affecter son interaction avec les autres

composants de la gaine de myéline. La gaine de myéline est ainsi moins compacte et surtout

moins stable [Moscarello et al., 2007].

Pour expliquer le lien qu’il existe entre l’augmentation de la forme citrullinée de la

MBP dans le cerveau des patients SEP et le déclenchement d’une réponse immunitaire dirigée

contre le soi, deux mécanismes furent proposés (Figure 26) :

Introduction

65

(1) La citrullination de la MBP pourrait induire une sensibilité accrue de la protéine

aux clivages enzymatiques, créant ainsi plus de peptides immuno-dominants

capables de déclencher une réponse immunitaire. En effet, deux études

démontrèrent que la MBP des patients souffrant de SEP étaient plus facilement

dégradées par la cathepsine D [Cao et al., 1999] et par la métalloprotéase 3 [D’Souza

et al., 2006] que la MBP de témoins. Par ailleurs, il est important de rappeler que

ces deux enzymes sont généralement plus exprimées dans les lésions de patients

souffrant de SEP. Chacune de ces deux protéases est capable de cliver la MBP

générant ainsi des peptides immuno-dominants. Cette formation de peptides

immuno-dominants pourrait sensibiliser les lymphocytes T contre les antigènes du

soi et ainsi déclencher une réponse auto-immune [Casaccia-Bonnefil et al., 2008].

(2) Une autre mécanisme serait que la citrullination de la MBP, en changeant les

propriétés physico-chimiques de la protéine, pourrait modifier la localisation des

différentes protéines au sein de la gaine de myéline. Musse et al. démontrèrent que

la citrullination de la MBP entraînait des changements conformationnels de la

protéine capables de rendre accessible des néo-épitopes normalement cachés dans

la MBP « classique » [Musse et al., 2006]. Le concept actuel est que seuls des

épitopes enfouis dans la gaine de myéline, et donc normalement inaccessibles aux

cellules immunitaires, seraient capables de déclencher une réponse auto-immune.

La citrullination de la MBP pourrait donc induire une redistribution des

composants de la myéline faisant ainsi apparaitre des épitopes normalement

masqués [Casaccia-Bonnefil et al., 2008].

Par ces différents mécanismes la dérégulation épigénétique du gène PAD2 pourrait expliquer

la mise en place d’une réponse auto-immune au début du développement de la SEP.

Introduction

66

Figure 26 : Mécanisme proposé dans le développement de la SEP suite à une dérégulation épigénétique du gène

PAD2 conduisant à la surexpression de la protéine dans les oligodendrocytes. D’après Casaccia-Bonnefil et al.,

Prog. Neurobiol., 2008.

3.2.2. Impact de l’épigénétique sur la différenciation cellulaire

Certains mécanismes épigénétiques sont directement impliqués dans la maturation

cellulaire et le choix d’un lignage particulier. En effet, des mécanismes épigénétiques

reposant sur l’inactivation ciblée de gènes permettent de privilégier l’expression de certains

gènes par rapport à d’autres.

Nous avons vu précédemment que les épisodes de poussées cliniques associés à

l’apparition de lésions inflammatoires dans le SNC étaient encadrés dans le temps par des

phases de rémission caractérisées par une réparation du tissu. Cette cicatrisation du tissu

résulte de la migration de précurseurs des oligodendrocytes, présents dans le SNC, vers les

sites lésés [Chang et al., 2000] au niveau desquels ils se différencient en cellules matures.

L’efficacité de la remyélinisation est sous le contrôle étroit de la maturation des

oligodendrocytes. Cette maturation dépend de facteurs micro-environnementaux du SNC et

notamment de l’interaction entre les récepteurs membranaires Notch et Jagged1 [John et al.,

2002]. Cependant, l’efficacité du phénomène de remyélinisation spontanée est variable en

fonction des individus. Une cicatrisation incomplète des lésions peut être due à un défaut dans

la différenciation de précurseurs des oligodendrocytes [Brück et al., 2003]. La persistance de ces

précurseurs dans un état indifférencié pourrait être due à une régulation épigénétique

inappropriée de l’expression des gènes du développement [Casaccia-Bonnefil et al., 2008]. En

Introduction

67

effet, l’utilisation de drogues bloquant les histone-déacétylases empêche la différenciation en

oligodendrocytes matures [Marin-Husstege et al., 2002 ; Shen et al., 2005].

Les méthylations de l’ADN sont aussi essentielles pour maintenir les fonctions des

cellules T. De nombreuses études ont démontré qu’une défaillance dans le maintien d’un

certain profil de méthylation pouvait entraîner le développement de cellules T auto-réactives

in vitro et d’une auto-immunité in vivo [Richardson et al., 2003]. L’immunopathologie de la SEP

est caractérisée par la dominance d’une réponse de type Th1 associée à une production d’IFNγ

sur une réponse de type Th2 associée à une production d’IL-4. Des mécanismes épigénétiques

sont impliqués dans la différenciation des lymphocytes Th1 et Th2, mais aussi dans la

sécrétion de cytokines telles que l’IFNγ, l’IL-2, l’IL-4 et le TNFα [Makar et al., 2004 ; Wilson et

al., 2005]. En effet, chez les lymphocytes Th1, qui produisent beaucoup d’IFNγ, le promoteur

du gène de l’IFNγ est hypo-méthylé alors qu’il est fortement méthylé chez les lymphocytes

Th2, faibles producteurs de cette cytokine. Un traitement des lymphocytes Th2 par un

inhibiteur des méthylations convertit ces cellules en cellules productrices d’IFNγ [Young et al.

1994]. Les facteurs épigénétiques seraient donc capables de modifier la balance Th1/Th2 de la

réponse immunitaire et de l’orienter vers une réponse de type pro-inflammatoire favorable à

l’apparition d’une réponse auto-immune [Kürtüncü et al., 2008]. Par ailleurs, l’effet direct de la

composante épigénétique sur le développement de cellules auto-réactives a été démontré en

traitant des lymphocytes Th1 et Th2 avec un inhibiteur des méthylations. Les cellules T ainsi

traitées ont acquis la capacité à tuer les cellules du soi in vitro [Yung et al., 2001].

Le traitement de la SEP par des molécules modifiant des marqueurs épigénétiques est

donc soumis à caution. En effet, il est important de garder à l’esprit que ces modifications

épigénétiques peuvent avoir de nombreuses répercussions sur différents sous types cellulaires.

Par exemple, en pensant promouvoir la remyélinisation au niveau des lésions inflammatoires

du SNC via l’amélioration de la maturation des progéniteurs des oligodendrocytes, on peut

par la même occasion modifier la polarisation des lymphocytes T et orienter la réponse

immune vers une réponse pro-inflammatoire aux effets délétères.

3.2.3. L’inactivation du chromosome X

D’un point de vue cellulaire, les femmes se différencient des hommes par la présence

de 2 chromosomes X dans leur génome. Bien que les hommes possèdent un chromosome Y à

la place du deuxième chromosome X, seulement 54 gènes présents sur le chromosome Y sont

Introduction

68

partagés avec le chromosome X qui en possède environ 1100 [Migeon et al., 2007]. Afin

d’équilibrer l’expression des gènes présents sur le chromosome X entre les hommes et les

femmes, un des deux chromosomes X est inactivé chez ces dernières. En effet, les gènes

présents sur le chromosome X inactivé voient leur expression inhibée. Cependant, cela n’est

pas totalement vrai puisqu’il a été démontré que quelques gènes (environ 15%) pouvaient

maintenir leur expression malgré cette inactivation [Carrel et al., 2005]. Ces gènes contribuent à

l’existence de dimorphismes sexuels homme/femme. La possible implication de

l’ inactivation du chromosome X (XCI ) dans les maladies auto-immunes complexes fut

suggérée par l’hypothèse de Kast-Steward qui repose sur deux observations simples : (1) la

majorité des maladies auto-immunes touchent préférentiellement les femmes, (2) le XCI est

une régulation biologique fondamentale qui n’a lieu que chez les femmes [Ozcelik et al., 2008].

a. Mécanismes d’inactivation du chromosome X

Le XCI est un mécanisme qui a lieu très tôt au cours de l’embryogénèse. Durant

l’ontogénie des cellules germinales, l’unique chromosome X présent dans chaque cellule est

inactivé. Puis lorsque les gamètes sexuels se rencontrent, les deux chromosomes X perdent

leur état d’inactivation. C’est au stade blastocyste que chaque cellule somatique du fœtus

femelle choisit d’inactiver l’un des deux chromosome X sans prêter attention à l’origine de

celui-ci [Migeon et al., 2007]. Les femmes sont ainsi composées d’une « mosaïque » de cellules :

des cellules qui expriment le chromosome X d’origine maternelle et d’autres qui expriment le

chromosome X d’origine paternelle. Le procédé du XCI étant un phénomène aléatoire, la

majorité des femmes sans pathologie particulière ont une quantité environ égale des deux

populations cellulaires. Cependant, environ 5% des femmes présentent un très fort biais du

XCI, c’est à dire qu’au moins 90% de leurs cellules sanguines expriment un chromosome X

de même origine [Knudsen et al., 2009]. Nous reviendrons par la suite sur les causes et les

conséquences d’un tel biais du XCI. Par la suite, une fois que la cellule a fait son choix dans

le chromosome X à inactiver, elle maintiendra ce profil d’inactivation sans en changer. De

plus, le profil d’inactivation est maintenu au cours des mitoses ce qui fait que les cellules

provenant d’une cellule progénitrice présentent toutes le même chromosome X inactivé

[Migeon et al., 2007]. Dans le noyau de la cellule, le chromosome X alors inactif forme une

structure visible en microscopie que l’on appelle le corps chromatinien de Barr.

Introduction

69

Le mécanisme qui conduit à l’inactivation de l’un des deux chromosomes X est un

mécanisme complexe dont toutes les subtilités ne sont pas encore cernées [Thorvaldsen et al.,

2006]. Le XCI est composé de plusieurs grandes étapes qui sont les suivantes : (1) comptage

du nombre de chromosomes X présents dans la cellule (1 ou 2 ou même plus si la cellule est

anormale), (2) détermination du ratio « nombre de chromosomes X par rapport au nombre

d’autosomes », (3) choix du chromosome X à inactiver, (4) initiation de l’inactivation, (5)

extension progressive de l’inactivation sur toute la longueur du chromosome X, (6) maintien

de cet état d’inactivation. Le mécanisme du XCI est contrôlé par une région présente au sein

même du chromosome X. Cette région, appelée Xic pour X-inactivation center, contient 3

gènes/domaines importants : le gène Xist (X-inactive specific transcript), le gène Tsix et le

domaine Xce (X-controlling element) [Plath et al., 2002]. Les gènes Xist et Tsix codent pour

des ARNs nucléaires qui ne sont pas traduits en protéines. Xist, qui est exprimé uniquement

par le chromosome X inactivé, joue un rôle crucial dans l’inactivation du chromosome X par

son action en cis [Brow et al., 1991]. Son ARN va progressivement recouvrir le chromosome X

dans son intégralité. Cela permet de recruter des histones-déacétylases et des histone-

méthylases qui vont remodeler la structure de la chromatine rendant ainsi le chromosome

transcriptionnellement inactif. Le deuxième gène, Tsix, agissant également en cis, est

indispensable pour réprimer l’expression de Xist par le chromosome X activé. Le gène Tsix

code pour un ARN antisens du locus Xist [Sado et al., 2001]. L’expression de Tsix est

maintenue dans un premier temps afin d’inhiber la production d’un ARN stable du gène Xist,

et donc la réversion du chromosome X vers un état inactif. Par la suite, cette expression n’est

plus nécessaire lorsque l’état inactif du chromosome X devient irréversible [Wutz et al., 2000].

Tsix, qui ne code pas de protéine, agirait en modifiant la structure de la chromatine au niveau

du locus Xist ce qui conduirait à réprimer ce gène [Sado et al., 2005]. Enfin, le domaine Xce

influence la probabilité dans le choix du chromosome X à inactiver en altérant l’asymétrie

dans l’expression de Tsix. Le gène ou l’élément contenu dans le domaine Xce qui lui confère

cette propriété n’a pas encore été déterminé avec certitude. Cependant, une équipe suggéra

que la fonction du domaine Xce dépendait de la présence d’un élément de transcription

intergénique appelé Xite (X-inactivation intergenic transciption elements), placé

génétiquement en amont du gène Tsix [Ogawa et al., 2003]. Enfin, une nouvelle région du

domaine Xic fut récemment suggérée comme impliquée dans le phénomène de XCI. Cette

région appelée Xpr , pour X-pairing region, permettrait le rapprochement de deux

Introduction

70

chromosomes X. Ce rapprochement est une étape nécessaire à l’initiation du mécanisme du

XCI (Figure 27) [Augi et al., 2007].

Figure 27 : Modèle possible d’inactivation du chromosome X. D’après Augui et al., Science, 2007.

b. Implication de l’inactivation du chromosome X dans l’expression phénotypique

L’effet de l’inactivation du chromosome X sur l’expression phénotypique d’un trait fut

évoqué au cours d’études menées sur des maladies génétiques à transmission récessive liées

au chromosome X. Ces maladies monogéniques, dont le gène muté est porté par le

chromosome X, ne s’expriment normalement pas chez les femmes ne portant qu’une seule

copie du gène mutant. Or cela n’est pas toujours vrai. Deux études réalisées sur le syndrome

de l’X fragile (maladie responsable d’un retard mental héréditaire) [Kruyer et al., 1994] et sur le

daltonisme [Jørgensen et al., 1992] prouvèrent qu’il était possible d’observer chez des jumelles

MZ une discordance anormale dans l’expression clinique. Les auteurs suggérèrent que cette

discordance était la conséquence d’une différence dans le profil du XCI. Par la suite, plusieurs

travaux réalisés sur d’autres maladies génétiques récessives liées au chromosome X

démontrèrent qu’il pouvait exister une expression phénotypique de la maladie même chez des

femmes portant un allèle sauvage du gène [Parolini et al., 1998 ; Bicocchi et al., 2005]. Toutes ces

études mirent en évidence un fort biais du XCI. L’orientation de ce biais allait toujours vers

une inactivation préférentielle du chromosome X portant l’allèle sauvage du gène responsable

de la maladie.

L’implication d’un tel phénomène épigénétique dans le développement des maladies auto-

immunes complexes est plus difficile à évaluer. En effet, contrairement aux maladies

monogéniques précédemment citées, la susceptibilité aux maladies complexes repose d’une

part sur l’implication de plusieurs gènes et d’autre part sur des gènes dont la localisation

génomique est encore inconnue. Cependant, un travail réalisé sur une maladie auto-immune

complexe, la sclérodermie, démontra que la proportion de femmes présentant un fort biais du

XCI dans le sang était fortement augmentée dans le groupe des femmes souffrant de cette

Introduction

71

maladie comparé au groupe de témoins (64% vs 8%) [Ozbalkan et al., 2005]. Par la suite, cette

étude fut répliquée avec une différence moins marquée entre les deux groupes (34% vs 8%)

[Uz et al., 2008]. Un résultat similaire fut retrouvé dans la thyroïdite auto-immune avec un plus

grand nombre de femmes présentant dans les cellules sanguines un fort biais du XCI chez les

patients (34%) par rapport au groupe des témoins (8%) [Ozcelik et al., 2006]. Par ailleurs, chez

un même patient, le biais du XCI visible sur les cellules sanguines, était généralisable à

d’autres tissus comme la thyroïde ou la muqueuse buccale [Ozcelik et al., 2006]. Brix et al.

démontrèrent, chez des jumeaux discordants pour la thyroïdite auto-immune, que le jumeau

malade présentait un plus fort biais du XCI que son jumeau témoin [Brix et al., 2005]. Dans la

SEP, l’implication du XCI ne fut que peu évaluée. Une étude démontra que bien que la

proportion de personnes présentant un fort biais du XCI soit augmentée chez les patients SEP

par rapport aux témoins (17% vs 11%), cette différence n’était pas significative (P = 0,137)

[Knudsen et al., 2007]. Dans le contexte des maladies auto-immunes complexes, il est important

de rappeler que même si une proportion plus importante de femmes présente un fort biais du

XCI par rapport à des femmes témoins, cela ne signifie pas qu’à l’état d’individu, une femme

présentant un fort biais du XCI développera systématiquement une maladie auto-immune.

Dans les maladies auto-immunes précédemment citées comme associées à un fort biais du

XCI, ce biais est visible dans plusieurs tissus dont les cellules sanguines. Ozcelik et al.

émirent l’hypothèse excluant le fait que le biais du XCI soit la conséquence d’une

prolifération cellulaire due à la réaction auto-immune [Ozcelik et al., 2008].

c. Causes du biais dans l’inactivation du chromosome X

Même si la majorité des femmes présentent une inactivation aléatoire du chromosome

X, c'est-à-dire environ 50% des cellules sanguines exprimant un chromosome X d’origine

paternelle et 50% exprimant un chromosome X d’origine maternelle, il est possible d’observer

chez certaines femmes un fort biais du XCI. Ce biais peut être expliqué par plusieurs

mécanismes qui ont lieu de manière primaire ou secondaire (Figure 28):

Les mécanismes primaires responsables du biais dans le XCI sont tous les

mécanismes qui ont lieu lors du choix du chromosome X à inactiver [Minks et al., 2008].

Ce biais du XCI peut être la cause d’un phénomène totalement aléatoire. En effet, le

phénomène de XCI a lieu très précocement au cours de l’embryogenèse c'est-à-dire

quand un nombre limité de cellules sont présentes [Brown et al. 2000]. Bien que le

nombre exact de cellules au moment du mécanisme de XCI soit encore inconnu, des

Introduction

72

études l’estiment entre 10 et 20 [Monteiro et al., 1998]. Ainsi une inactivation légèrement

biaisée à l’initiation de l’inactivation peut avoir par la suite des conséquences

importantes sur le profil du XCI. De plus, nous avons vu que le domaine Xce modifie

la probabilité qu’un chromosome soit inactivé. Certains allèles du domaine Xce

pourraient donc avoir des effets très forts et être la cause d’un biais du XCI [Minks et al.,

2008]. Enfin, des mutations dans les gènes Xist et Tsix ou simplement différents allèles

de ces gènes pourrait également être la cause d’un biais du XCI [Brown et al., 2000].

Les mécanismes secondaires responsables du biais du XCI sont tous les phénomènes

qui apparaissent après que la sélection du chromosome X à inactiver ait eu lieu [Minks

et al., 2008]. Les mécanismes secondaires peuvent être perçus comme une sélection

préférentielle d’une population cellulaire. En effet, une mutation portée par un gène du

chromosome X peut avoir un effet sur la survie ou la prolifération des cellules

exprimant la mutation. C’est le cas de la mutation du gène FMR1 responsable du

syndrome de l’X fragile [Sun et al., 1999] ou de la mutation du facteur VIII dans les cas

de dyskératose congénitale [Devriendt et al., 1997], qui sont des mutations délétères pour

la survie. A l’inverse, la mutation portée par un gène du chromosome X peut conférer

un avantage sélectif à la population cellulaire qui l’exprime. C’est généralement le cas

dans les cancers où les cellules tumorales sont des clones d’une même cellule mère,

exprimant donc toutes un chromosome X de même origine [Braunstein et al., 2006].

Figure 28 : Mécanisme expliquant le biais dans l’inactivation du chromosome X. D’après Minks et al., J. Clin.

Invest., 2008.

Introduction

73

d. Conséquences de l’inactivation du chromosome X

Même si la corrélation entre certaines maladies auto-immunes et un fort biais du XCI

est clairement établie, le mécanisme qui les relie est encore inconnu. De nombreuses études

partent du principe que le biais du XCI est la cause de l’apparition de la maladie auto-immune

et non sa conséquence. Ainsi de nombreuses hypothèses ont été formulées dans ce sens.

Une hypothèse fut proposée par Stewart et al. pour expliquer la mise en place d’une

réponse auto-immune [Stewart et al., 1998]. Cette hypothèse peut être résumée en 3 événements

conduisant à la mise en place de l’auto-immunité : (1) le fort biais du XCI a aussi lieu dans le

thymus, (2) le thymus est un organe important dans l’éducation des lymphocytes T vis-à-vis

de la tolérance envers les antigènes du soi. Ainsi, les lymphocytes T pourraient être rendus

tolérants uniquement envers les allèles des gènes portés par le chromosome X

préférentiellement exprimé dans le thymus. (3) Les cellules T, après leur maturation, circulent

dans la totalité de l’organisme. Elles pourraient alors réagir contre des antigènes du soi codés

par les allèles des gènes portés par l’autre chromosome X, qui sont présentés par des cellules

périphériques. Cela pourrait conduire à l’apparition d’une réponse immune. Cette hypothèse

présume de l’existence d’antigènes codés par le chromosome X possédant des différences

alléliques. Par ailleurs, elle suppose qu’il existe des variations du profil du XCI au sein des

différents tissus d’un même individu. Dans le cas de la SEP, un gène répondant à tous ces

critères est le gène codant pour la PLP. La PLP est le composant principal de la gaine de

myéline. Elle existe sous deux isoformes obtenues par épissage alternatif : la forme longue

appelée PLP, la forme courte appelée DM20 et pour laquelle il manque une boucle de 35

acides aminés [Steinman et al., 2000]. Chez l’Homme, l’expression thymique de la PLP est

réduite à la forme DM20 [Klein et al., 2000]. Il existe de nombreux polymorphismes répartis sur

l’ensemble du gène codant pour la PLP. On peut donc imaginer que dans des situations de fort

biais du XCI, l’allèle exprimé majoritairement dans le thymus est incapable de rendre les

lymphocytes T tolérant vis-à-vis des épitopes de la PLP exprimée dans le SNC.

L’autre hypothèse repose sur le fait que le chromosome X contient de

nombreux gènes ayant une fonction dans le développement du système immunitaire ou la

mise en place d’une réponse immune. Des mutations contenues dans certains de ces gènes ont

déjà été directement impliquées dans le développement de maladies auto-immunes [Molina et

al., 2006]. C’est par exemple le cas du gène FOXP3 pour lequel des mutations peuvent

conduire à l’apparition de désordres auto-immuns tels l’IPEX [Gambineri et al., 2003]. Un autre

Introduction

74

exemple est le gène codant pour le ligand du CD40. Des mutations dans ce gène sont

associées à un syndrome d’hyper-IgM ou à des désordres auto-immuns [Gulino et al., 2003]. Des

forts biais du XCI forcent le système immunitaire à exprimer majoritairement un seul allèle

des gènes. L’hypothèse serait que certains allèles peuvent conduire à un système immunitaire

moins tolérant vis-à-vis des antigènes du soi, ce qui autoriserait le développement d’une

réponse auto-immune.

e. Monosomie ou perte du chromosome X

En plus du phénomène épigénétique du XCI, les cellules d’une femme peuvent

présenter une perte d’un des deux chromosomes X. On parle alors de monosomie du

chromosome X. Le chromosome X éliminé par la cellule n’est pas choisi au hasard car c’est

toujours le chromosome X inactif qui est éliminé [Miozoo et al., 2007]. Par ailleurs, le

pourcentage de cellules sanguines présentant une monosomie du chromosome X n’est pas

stable car il tend à augmenter lentement avec l’âge. Ainsi, alors que des femmes pré-pubères

possèdent dans leur sang 1,5 à 2,5% des cellules sanguines ayant un seul chromosome X, des

femmes plus âgées peuvent présenter une monosomie du chromosome X dans 5% de leurs

cellules sanguines [Guttenbach et al., 1995]. En 2004, pour la première fois, Invernizzi et al.

démontrèrent une augmentation significative de la proportion de cellules sanguines présentant

une monosomie du chromosome X chez les patients souffrant d’une maladie auto-immune, la

cirrhose biliaire primitive, comparé à des témoins (5% vs 2,8%) [Invernizzi et al., 2004]. Cette

monosomie du chromosome X n’était pas un artéfact reposant sur la présence de cellules

mâles contaminantes (micro-chimérisme présent dans le sang de femmes ayant accouché d’un

garçon) car aucun chromosome Y n’était détecté dans les cellules ne possédant qu’un seul

chromosome X [Invernizzi et al., 2004]. Par ailleurs, les cellules composant le système

immunitaire adaptatif semblaient plus affectées par cette monosomie du chromosome X que

les cellules du système immunitaire inné [Invernizzi et al., 2004]. Des résultats similaires furent

obtenus pour deux autres maladies auto-immunes connues pour présenter un biais dans le

XCI : la thyroïdite auto-immune et la sclérodermie. En effet, les cellules monosomiques pour

le chromosome X étaient plus nombreuses chez les femmes souffrant de l’une de ces maladies

(6,2% pour la thyroïdite auto-immune et 4,3% pour la sclérodermie) comparé à une

population témoin (2,9%) [Invernizzi et al., 2005]. Il fut retrouvé que les cellules du système

immunitaire adaptatif étaient plus touchées par la monosomie du chromosome X que les

Introduction

75

cellules du système immunitaire inné [Invernizzi et al., 2005]. Bien qu’une proportion plus

importante de cellules présentant une monosomie du chromosome X soit retrouvée dans le

sang de patients souffrant d’une de ces maladies, aucun mécanisme pouvant expliquer une

plus forte susceptibilité ne fut proposé ou testé. Les auteurs suggérèrent l’effet éventuel d’une

haplo-insuffisance des gènes portés par le chromosome X sur une susceptibilité accrue aux

maladies auto-immunes. Cependant, ce phénomène de monosomie du chromosome X ne peut

pas être généralisé à toutes les maladies auto-immunes puisque d’autres études démontrèrent

que ce phénomène n’était pas plus marqué chez les patients souffrant de lupus érythémateux

systémique [Invernizzi et al. 2007]. Jusqu’à aujourd’hui, l’implication du phénomène de délétion

du chromosome X dans la SEP n’a jamais été évaluée.

Introduction

76

Introduction

77

III. Traitement et pharmacogénétique de la sclérose en plaques

Avant 1995, aucune molécule n’avait reçu d’accréditation pour le traitement de la SEP

[Compston et al., 2008]. L’autorisation de mise sur le marché de la première molécule eu un

impact significatif sur le patient en améliorant sa qualité de vie. La première ligne de

traitement s’appuya tout d’abord sur des molécules immuno-modulatrices (IFNβ, acétate de

glatiramère) au spectre d’action large. Aujourd’hui encore, malgré une efficacité modérée, ces

molécules sont majoritairement utilisées dans le traitement de la SEP. Cela principalement à

cause d’une balance bénéfice/risque largement en leur faveur. Cependant, les connaissances

scientifiques actuelles sur les mécanismes impliqués dans la pathogénie de la maladie ont

permis d’envisager de nouvelles cibles biologiques. Ainsi, de nombreuses molécules

thérapeutiques à l’action plus restreinte et plus efficace sont actuellement en développement.

Le natalizumab fait partie de ces nouvelles molécules.

III.1. Les traitements de fond disponibles en 2009

A l’heure actuelle, 6 agents sont utilisés dans le traitement des formes RR-MS de SEP

: 3 préparations différentes d’IFNβ (Betaferon®, Avonex® et Rebif®), l’acétate de glatiramère

(Copaxone®), l’anticorps monoclonal natalizumab (Tysabri®) et enfin la mitoxantrone

(Elsep®).

I II.1.1. L’interféron bêta

L’IFNβ a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques. C’est en 1995

que cette molécule obtint une autorisation de mise sur le marché pour le traitement des formes

RR-MS de SEP. A l’heure actuelle, il existe 3 formulations différentes d’IFNβ qui sont les

suivantes : l’IFNβ-1b injecté en sous-cutané (Betaferon®), l’IFNβ-1a injecté en

intramusculaire (Avonex®) et l’IFNβ-1a injecté en sous-cutané (Rebif®).

Une étude multicentrique se proposa d’évaluer l’effet de l’injection sous-cutanée

d’IFNβ-1b à deux doses différentes (1,6 et 8 millions d’unités) comparé à un placebo [IFNβ MS

Study group,1995]. Les deux doses d’IFNβ-1a réduisèrent le nombre de poussées, avec un effet

plus prononcé pour le plus fort dosage (taux annuel moyen de poussées : 1,22 et 0,96 pour 1,6

Introduction

78

et 8 millions d’unités respectivement), par rapport au placebo (1,44) dès la première année, ce

qui correspond à une réduction de 33% pour la plus forte dose. Cette étude démontra ainsi un

effet dose de l’IFNβ dans le traitement de la maladie. Cet effet bénéfique sur l’évolution de la

maladie était maintenu jusqu’à la 5ème année mais sans atteindre une significativité statistique

(certainement dû à la forte diminution de l’effectif de patients ayant poursuivi l’étude). De

plus, une absence d’évolutivité des signes radiologiques de la maladie fut perçue suite à

l’administration d’IFNβ-1b. Enfin, la plus forte dose d’IFNβ-1b démontra un effet bénéfique

sur la progression du handicap, un effet n’atteignant toutefois pas la significativité statistique.

Une étude similaire fut conduite afin d’apprécier l’effet d’un traitement par l’IFNβ-1a

injecté en intramusculaire, chaque semaine, à 6 millions d’unités [Jacobs et al., 1996]. Ce travail

fut arrêté plus tôt que prévu car seulement 57% des patients complétèrent les 2 ans de suivi.

Cependant, une estimation du pourcentage de patients présentant une progression du handicap

suggéra un effet bénéfique de l’IFNβ-1a (21,9%) par rapport au placebo (34,9%). Par ailleurs,

il fut observé une baisse significative du nombre de poussées annuelles d’environ 20% pour

l’IFN β-1a par rapport au placebo (taux annuel moyen de poussées : 0,82 contre 0,67). Une

nouvelle analyse des données, réalisée avec des critères cliniques plus stricts, montra un effet

bénéfique robuste de l’IFNβ-1a sur la progression du handicap dans la SEP [Rudick et al., 1997].

Par ailleurs, le traitement par IFNβ-1a démontra une efficacité sur les lésions présentes dans

le SNC. En effet, il fut observé, par IRM, une réduction du nombre et du volume des lésions

inflammatoires dans le SNC des patients traités par IFNβ-1a comparé au placebo [Simon et al.,

1998].

Enfin, l’efficacité de la dernière formulation d’IFNβ fut étudiée sur deux ans. Le

traitement reposait sur une injection sous-cutanée, trois fois par semaine, d’IFNβ-1a à deux

doses, 6 et 12 millions d’unités [PRISM, 1998]. La plus forte dose d’IFNβ-1a réduisit de 33% le

nombre moyen de poussées par rapport au placebo (taux annuel moyen de poussées : 1,73

contre 2,56). De plus, des améliorations furent observées sur le plan radiologique suite à

l’administration d’IFNβ-1a comparé au placebo [Li et al., 1999]. Après deux ans de traitement,

le nombre de lésions actives était lui aussi diminué (réduction de 67% et 78% pour 6 et 12

millions d’unités respectivement).

Alors que l’efficacité de l’IFNβ dans le traitement des formes RR-MS de SEP est

largement démontrée, son efficacité dans les formes SP-MS semble beaucoup moins évidente

[Kappos et al., 2004]. Il semblerait que le traitement par l’IFNβ soit efficace uniquement au

Introduction

79

début de la conversion de la forme RR-MS vers la forme SP-MS, c'est-à-dire au moment où la

maladie présente encore une activité inflammatoire. L’utilité de l’IFNβ chez les patients ayant

une forme SP-MS ne présentant plus de poussées est encore incertaine [Kieseier et al., 2008].

Cependant, l’avantage du traitement par l’IFNβ est que cette molécule entraîne des effets

secondaires généralement peu importants et ne nécessitant pas l’arrêt du traitement. Les effets

secondaires majoritairement rencontrés sont des syndromes pseudo-grippaux et des réactions

inflammatoires au site d’injection. Nous reviendrons sur les mécanismes d’action de cette

molécule dans le traitement de la SEP au prochain chapître.

III.1.2. L’acétate de glatiramère

L’acétate de glatiramère (GA) est un polypeptide synthétique, de masse moléculaire

comprise entre 4 700 et 11 000 Da, composé d’une succession aléatoire de 4 acides aminés

(L-glutamate, L-lysine, L-alanine et L-tyrosine) au ratio moléculaire de 4,2 : 3,4 : 1,4 : 1,0

[Schrempf et al., 2007]. Ce copolymère fut découvert en 1960 lors d’études sur les propriétés

immunologiques de copolymères développés pour mimer la MBP. Le copolymère 1,

maintenant connu sous le nom de GA, n’induisait pas d’EAE chez l’animal. Au contraire, il

prévenait et diminuait la sévérité de la maladie. En 1991, la production du GA fut

standardisée et c’est en 1996 que la molécule fut approuvée par la FDA dans le traitement des

formes RR-MS de SEP. Le traitement de la SEP par le GA consiste en des injections sous-

cutanées quotidiennes de 20 mg de GA.

Une importante étude multicentrique suivit, pendant au moins 2 ans, des patients SEP

traités par du GA afin de comparer son effet à un placebo [Johnson et al., 1998]. Il fut alors

prouvé que le GA diminuait significativement le nombre de poussées (29%) mais n’avait que

peu d’effet sur la progression du handicap. Par ailleurs, cette amélioration clinique corrélait

avec une réduction de l’inflammation, évaluée par IRM, dans le SNC des patients [Comi et al.,

2001]. En effet, l’imagerie révéla une diminution plus importante du nombre de lésions chez

les patients traités au GA par rapport à ceux traités avec le placebo (diminution de 29%). Ceci

fut renforcé par l’observation d’une réduction de l’étendue des lésions et de leur émergence.

De manière intéressante, l’effet bénéfique conféré par le traitement au GA n’est pas détectable

dès la mise en place du traitement mais 6 mois après environ. Cet effet bénéfique du GA sur

lésions du SNC fut confirmé par une autre étude qui démontra que le changement d’un

traitement initial placebo par un traitement à base de GA réduisait les signes radiologiques de

Introduction

80

la maladie [Wolinsky et al., 2002]. Enfin, une équipe publia récement les résultats du suivi sur 22

ans de patients SEP traités au GA [Miller et al., 2008a]. Cette étude confirma que le traitement

par le GA diminuait la progression du handicap ainsi que le nombre de poussées. De plus, elle

permit d’apprécier la sureté du produit. Le GA est une molécule généralement bien supportée

par le patient entraînant toutefois des réactions au site d’injection (rougeur, gonflement).

Le traitement de la SEP par le GA est une approche thérapeutique basée sur

l’utilisation d’antigènes. Bien qu’aujourd’hui encore le mécanisme d’action du GA ne soit pas

très bien compris, cette molécule agit préférentiellement sur le système immunitaire à

plusieurs niveaux :

(1) Sur les APC. Le GA, initialement synthétisé pour mimer la MBP, entre en

compétition avec cette dernière pour la fixation au CMH à la surface des APC [Fridkis-

Hareli et al., 1994]. Cette compétition a pour conséquence d’empêcher l’activation des

lymphocytes auto-réactifs spécifiques de la MBP [Gran et al., 2000]. Cependant, le GA a

la capacité d’inhiber des maladies auto-immunes expérimentales autres que l’EAE ce

qui suggère l’existence de mécanismes d’action supplémentaires. Le GA peut

notamment moduler profondément la production de cytokines par les macrophages et

les cellules dendritiques [Jung et al., 2004]. Cette molécule, qui induit la sécrétion d’IL-

10, entraîne indirectement une suppression de la sécrétion du TNFα (molécule pro-

inflammatoire) par les macrophages et les cellules dendritiques. Cette modulation des

cytokines sécrétées peut orienter la réponse immunitaire vers une réponse anti-

inflammatoire bénéfique dans l’évolution de la SEP.

(2) Sur les lymphocytes T (Figure 29). Le GA favorise la différenciation des

lymphocytes T vers un profil Th2 et donc l’orientation vers une réponse anti-

inflammatoire [Duda et al., 2000]. Par ailleurs, 10% des lymphocytes spécifiques pour le

GA reconnaissent aussi la MBP. Les cellules spécifiques du GA, après reconnaissance

de la MBP, ne proliférèrent pas mais sécrètent de l’IL-4 ou de l’IFNγ en faible

quantité [Neuhaus et al., 2000]. L’hypothèse serait que les cellules spécifiques du GA

sont activées en périphérie puis migrent vers le SNC où elles entrent en contact avec la

MBP ce qui déclenche leur production de cytokines immuno-modulatrices. Par

ailleurs, une étude suggéra que le GA pouvait exercer un effet régulateur sur les

lymphocytes T périphériques par un mécanisme pro-apoptotique [Ruggieri et al., 2006].

En effet, un ratio Bax/Bcl-2 à orientation pro-apoptotique fut retrouvé dans les

PBMCs de patients SEP sous traitement GA. Ce mécanisme pourrait expliquer, du

Introduction

81

moins en partie, la déplétion en cellules Th1 pro-inflammatoires observée chez les

patients SEP traités par GA. Enfin, les cellules T réactives pour le GA peuvent

sécréter du BDNF (pour brain-derived neurotrophic factor ). Cette molécule,

appartenant à la famille des neurotrophines, confère aux cellules la produisant un rôle

neuroprotecteur [Aharoni et al., 2003]. Le BDNF sécrété peut empêcher la

dégénérescence neuronale mais aussi favoriser la remyélinisation et la croissance

axonale.

Figure 29 : Représentation schématique du mécanisme proposé pour expliquer l’effet immuno-modulateur de

l’acétate de glatiramère. D’après Blanchette et al., J. Neurol., 2008.

I II.1.3. L’anticorps monoclonal natalizumab

Le natalizumab fait partie de ces nouveaux traitements utilisés dans la SEP qui ont une

action très spécifique. Le natalizumab est un anticorps recombinant humanisé dirigé contre

une intégrine présente à la surface des leucocytes (Figure 30). Autorisé aux Etats-Unis en

novembre 2004, le natalizumab fut rapidement retiré du marché en février 2005 après que 2

patients aient développé une leucoencéphalopathie multifocale progressive (LEMP). En

2006, cet anticorps fut de nouveau autorisé aux Etats-Unis et en Europe dans le traitement des

formes RR-MS chez les patients ne tolérant pas les immuno-modulateurs traditionnels

[DeAngelis et al., 2008].

Le traitement par natalizumab consiste en des injections intraveineuses mensuelles de

l’anticorps. Deux études cliniques de phase III, l’étude AFFIRM [Polman et al., 2006] et l’étude

SENTINEL [Rudick et al., 2006], confirmèrent l’excellente efficacité du natalizumab dans le

Introduction

82

traitement des formes RR-MS. Le natalizumab diminuait significativement la progression du

handicap, mais aussi le taux annuel de poussées de 68%. Le nombre de patients n’ayant pas

présenté de poussées était plus important dans le groupe traité par le natalizumab que dans le

groupe traité avec le placebo (77% contre 56%). Par ailleurs, sur 2 ans, cet anticorps réduisait

de 83% l’apparition de nouvelles lésions dans le SNC et de 92% l’apparition de lésions

inflammatoires par rapport au placebo [Polman et al., 2006]. Des résultats cliniques et

radiologiques comparables furent obtenus avec la thérapie combinant l’IFNβ et le

natalizumab [Rudick et al., 2006]. Par ailleurs, il fut confirmé que la thérapie par ces deux agents

était plus efficace qu’une monothérapie par IFNβ.

Le natalizumab est dirigé contre la chaîne alpha 4 de l’intégrine α4β1, connue aussi

sous le nom de VLA-4 (pour Very Late Activating antigen-4) et exprimée à la surface de

tous les leucocytes (excepté les neutrophiles) [Rommer et al., 2008]. Cet anticorps n’est pas un

anticorps déplétant mais il empêche l’interaction de VLA-4 avec ses ligands. Les ligands

connus de VLA-4 sont VCAM-1 (pour Vascular Cell Adhesion Molecule-1) et la

fibronectine présents à la surface des vaisseaux sanguins. Ces molécules de surface

interviennent dans le mécanisme de sortie de la circulation sanguine des leucocytes. Ainsi,

dans la SEP, le natalizumab empêcherait la migration des leucocytes du sang périphérique

vers le SNC, via la BBB [Stüve et al., 2008]. En effet, une étude démontra une diminution du

nombre de leucocytes (lymphocytes T CD4+, T CD8+, lymphocytes B et plasmocytes) dans

le LCR de patients SEP traités par natalizumab par rapport à des patients SEP non traités

[Stüve et al., 2006]. Par ailleurs, il fut observé une augmentation du nombre de lymphocytes dans

le sang des patients traités, un nombre qui diminuait lentement au cours des mois suivant

l’arrêt du traitement.

Le traitement par natalizumab semble être relativement bien toléré puisque chez la

majorité des patients, peu d’effets délétères sont observés. Cependant, trois cas graves de

LEMP furent rapportés dans des études cliniques de phase III. Ces cas correspondaient à deux

patients SEP traités par l’immuno-modulateur IFNβ en combinaison avec le natalizumab

[Kleinschmidt et al., 2005 ; Langer-Gould et al., 2005], et à un patient souffrant de la maladie de

Crohn sous traitement par natalizumab en combinaison avec des immunosuppresseurs [Van

Assche et al., 2005]. Deux des trois cas de LEMP se révélèrent mortels. La LEMP est une

maladie rare causée par le virus JC appartenant à la famille des Polyomavirus. Cette maladie a

pour particularité de se développer chez des personnes immuno-déprimées, telles que des

personnes infectées par le VIH ou sous traitement immuno-suppresseur. L’apparition de cas

Introduction

83

de LEMP dans le traitement par natalizumab fut mise sur le compte d’une

immunosuppression locale du SNC conférée par l’anticorps. Cependant, cette association ne

put être clairement démontrée. A l’heure actuelle, 9 nouveaux cas de LEMP ont été rapportés

au cours d’un traitement de la SEP par natalizumab. On estime que le risque est de 1,2/10 000

patients traités.

Figure 30 : Les différents types d’anticorps monoclonaux utilisés en thérapie. La partie animale (noire)

composant l’anticorps passe de 100% (souris), à 25% (chimérique), puis à 3% (humanisé) et 0% (humain).

D’après Rommer et al., J. Neurol., 2008.

I II.1.4. La mitoxantrone

Initialement, la mitoxantrone (MTX ) était utilisée dans le traitement de divers

cancers (leucémies, lymphomes, cancers du sein…). Depuis 2000, la MTX est la seule

molécule approuvée aux Etats-Unis et dans certains pays européens comme traitement des

formes progressives de SEP (PP-MS et SP-MS) et des formes à poussées (RR-MS) évoluant

rapidement [Fox et al., 2006]. La MTX est un immunosuppresseur dérivé de l’anthracycline qui

s’insère dans l’ADN par des liaisons hydrogènes, ce qui a pour conséquence de conduire à des

repliements et à des cassures de l’ADN.

Plusieurs études cliniques, réalisées à différentes phases du processus d’autorisation de

la MTX comme traitement de la SEP, confirment son efficacité. Une étude de phase III,

réalisée sur une période de 2 ans, se proposa de tester l’efficacité de l’injection trimestrielle de

MTX, à la concentration de 5 ou 12 mg/m2, par rapport à un placebo [Hartung et al., 2002].

L’injection de MTX améliora sensiblement l’évolution globale de la SEP par rapport au

placebo. Une efficacité accrue fut observée pour la concentration de 12 mg/m2. Seul 8% des

patients traités par la MTX à 12 mg/m2 présentaient une augmentation d’au moins 1 point à

l’EDSS contre 25% chez les patients traités avec le placebo. De plus, 57% et 36% des patients

traités respectivement par la MTX à 12 mg/m2 ou par le placebo ne développaient pas de

poussées. L’observation radiologique indiqua que la MTX diminuait le nombre de lésions

Introduction

84

présentes dans le SNC par rapport au placebo [Krapf et al., 2005]. Par ailleurs, en fonction de

l’analyse pratiquée, il fut observé de manière significative ou non, une diminution du nombre

de lésions inflammatoires. L’efficacité de cette molécule fut prouvée à la fois dans le

traitement des formes RR-MS agressives, et dans celui des formes SP-MS. Il fut également

suggéré que l’effet bénéfique de la MTX persistait pendant 12 mois après l’arrêt du

traitement.

La MTX est un immunosuppresseur qui agit sur une longue période de temps. In vitro,

la MTX inhibe la maturation des cellules dendritiques et la prolifération des lymphocytes

activés. Ce mécanisme semble principalement être la conséquence de l’apoptose induite par la

MTX sur les cellules dendritiques, les lymphocytes T et les lymphocytes B [Neuhaus et al.,

2005]. Par ailleurs, un autre mécanisme d’action de la MTX serait d’inhiber les capacités

migratoires des lymphocytes T CD4+, des T CD8+ et des monocytes. Ainsi, la MTX

inhiberait l’expression de métalloprotéases par ces cellules inflammatoires ce qui empêcherait

leur entrée dans le SNC et leur migration à l’intérieur du tissu [Kopadze et al., 2006]..

Cependant, le traitement par la MTX n’est pas sans danger. En effet, cette molécule est

séquestrée dans les tissus profonds et s’y accumule. Bien qu’elle soit lentement relâchée dans

la circulation sanguine pendant la phase terminale de son élimination, la MTX est moins

concentrée dans le sang que dans les tissus [Fox et al., 2006]. L’utilisation de la MTX présente

des risques délétères cumulés tels que des risques d’infections et cardiaques augmentés. En

effet, des patients ayant reçu une dose cumulative de MTX inférieure à 100 mg/m2 ont moins

de risque d’avoir des dysfonctions cardiaques (mesuré par la fraction d’éjection ventriculaire)

que des patients ayant dépassé ce seuil (pourcentage de risque égal à 1,8% pour moins de 100

mg/m2 par rapport à 5% pour plus de 100 mg/m2) [Ghalie et al., 2002]. Même si, dans cette

étude, l’analyse statistique par régression ne démontra pas de relation significative entre la

quantité de MTX accumulée et l’incidence des dysfonctions cardiaques, il est aujourd’hui

conseillé de ne pas dépasser une dose cumulative de MTX équivalente à 140 mg/m2, ou une

durée de traitement supérieure à 3 ans [Fox et al., 2006]. Par ailleurs, cette molécule peut

entraîner l’apparition d’aménorrhées secondaires, souvent définitives, chez les femmes de

plus de 35 ans ainsi que l’apparition de leucémies.

Introduction

85

III.2. Comparaison de l’efficacité des thérapies actuelles

Jusqu’à récemment, il n’existait pas d’étude, réalisée sur au moins deux ans en

conditions strictes, qui comparait l’effet des 6 traitements actuels entre eux. Ce n’est que

dernièrement que deux études, REGARD et BECOME, ont fourni des données comparatives

entre l’efficacité de l’IFNβ et du GA.

L’étude REGARD compara l’efficacité de l’injection sous-cutanée d’IFNβ-1a par

rapport au traitement par GA dans le traitement des formes RR-MS [Mikol et al., 2008]. Sur le

plan clinique, il ne fut mis en évidence aucune différence significative d’efficacité entre les

deux traitements (délai avant la première poussée, pourcentage de patients sans poussées, taux

annuel de poussées et progression du handicap). Cependant, sur le plan radiologique, le

nombre moyen de lésions actives était supérieur chez les patients traités par le GA par rapport

à ceux traités à l’IFNβ-1a (avec des chiffres respectifs de 0,41 et 0,26). De même, le

pourcentage de patients ne présentant pas de lésions inflammatoires actives était plus

important chez les patients traités par l’IFNβ-1a par rapport aux patients traités par le GA

(81% et 67% respectivement). Enfin une mesure combinée des lésions actives (lésions

positives au gadolinium + nouvelles lésions visibles en séquence T2) démontra aussi une

efficacité supérieure de l’IFNβ-1a par rapport au GA. Cependant, tous les paramètres

radiologiques étudiés ne présentaient pas de différences significatives entre les deux

groupes tels que le nombre de lésions hypo-intenses en séquence T1 (0,23 contre 0,24 pour

l’IFN β-1a et le GA respectivement) et le nombre de lésions hyperintenses en séquence T2

(0,67 pour l’IFNβ-1a contre 0,82 pour le GA). Enfin, aucun des deux traitements ne semblait

mieux toléré que l’autre puisque le nombre et la sévérité des effets secondaires étaient

comparables.

La deuxième étude comparative, portant le nom de BECOME, compara l’efficacité de

l’IFN β-1b injecté par voie intramusculaire à celle du GA [Cadavid et al., 2009]. Cette étude

s’appuya principalement sur une analyse radiologique. Bien que l’étude REGARD identifia

une légère différence dans les mesures radiologiques en faveur de l’IFNβ, l’étude BECOME

ne parvint pas à mettre en évidence de différences significatives. En effet, l’analyse combinée

des lésions actives et des nouvelles lésions inflammatoires ne démontra pas une efficacité

supérieure d’un des deux traitements. Par ailleurs, sur des critères cliniques, l’IFNβ-1b et le

GA, ne présentèrent là aussi pas de différence d’efficacité avec un nombre moyen de poussées

annuelles comparable (0,37 pour l’IFNβ-1b et 0,33 pour le GA).

Introduction

86

On peut donc dire que les trois formulations d’IFNβ et le GA ont une efficacité

comparable avec une diminution du nombre de poussées annuelles de 30%. Ainsi, le choix

parmi la première ligne de molécules disponibles pour le traitement de la SEP devra se faire

en prenant en considération l’aspect pratique de chaque traitement (type et fréquence

d’injection) et les effets secondaires respectifs, sans tenir compte de la différence d’efficacité

qui, si elle existe, est vraiment très faible [Fox et al., 2009]. A l’opposé, le natalizumab et la

MTX sont des traitements beaucoup plus efficaces mais ayant des effets secondaires

sensiblement plus importants (pour le natalizumab et la MTX), voire incompatibles avec un

traitement de longue durée (pour la MTX). Cependant, bien que tous ces traitements

diminuent le nombre de poussées, ils sont peu efficaces sur la progression de la maladie à

cause d’au moins deux paramètres [Lopez-Diego et al., 2008] :

(1) ces molécules affectent les effecteurs inflammatoires du système immunitaire

adaptatif qui prédominent pendant la phase de poussées de la maladie. Cependant, leur

effet est limité sur la régulation des fonctions du système immunitaire inné.

(2) ces molécules n’ont pas d’effet significatif sur la neuro-dégénérescence qui touche

le SNC des patients SEP. Or, la neuro-dégénérescence est directement impliquée dans

l’apparition des handicaps fonctionnels qui se développent durant la phase progressive

de la maladie. Ainsi, ces molécules n’ont pas d’effet bénéfique dans le traitement des

formes PP-MS et SP-MS, où la maladie progresse non pas par inflammation mais par

une neuro-dégénérescence [Kieseier et al., 2008].

III.3. Optimisation des traitements existants

Avant la mise sur le marché du natalizumab, les praticiens ne disposaient pas de

molécules plus efficaces que les immuno-modulateurs pour le traitement de la SEP. La seule

approche pour améliorer les traitements consistait à modifier la prescription des thérapies

existantes. Cela se traduisit par des changements de posologie ou par des combinaisons de

plusieurs molécules.

Des chercheurs se proposèrent d’étudier l’influence de la dose sur l’efficacité du

traitement. Dans le traitement de la SEP par le GA, la dose quotidienne de 20 mg est la dose

actuellement préconisée pour sa sureté et son efficacité. Cohen et al.évaluèrent l’efficacité

conférée par l’injection du double de la dose préconisée, soit 40 mg [Cohen et al., 2007]. Ils

démontrèrent que l’efficacité du traitement était plus importante dans le groupe recevant la

Introduction

87

plus forte dose. Le pourcentage de patients sans poussées était augmenté dans le groupe « 40

mg » par rapport au groupe « 20 mg » (76,1% et 52,3% respectivement). Le délai d’apparition

de la première poussée était aussi retardé (213 jours contre 80 jours). Par ailleurs, le nombre

de lésions actives était, dès le 3ème mois, plus fortement diminué dans le groupe recevant 40

mg de GA.

Comme la SEP implique plusieurs processus biologiques hétérogènes, il fut proposé

d’associer plusieurs molécules dans un même traitement [Gold et al., 2008]. Pour espérer obtenir

un effet synergique ou additif, les molécules doivent avoir des mécanismes d’action uniques

[DeAngelis et al., 2008b]. L’approche par multi-thérapie fut suggérée pour traiter les formes très

agressives de SEP et/ou résistantes aux traitements couramment utilisés. Les deux immuno-

modulateurs, l’IFNβ et le GA, utilisés en première ligne dans le traitement de la SEP ont des

mécanismes d’action différents. Leur association dans une même thérapie parut donc

évidente. Cependant, une étude pratiquée sur le modèle animal de la SEP signala une

interaction délétère entre les deux molécules [Brod et al., 2000]. En effet, alors que la

monothérapie à base d’IFNs de type 1 ou de GA conférait une amélioration des signes

cliniques, la combinaison des deux molécules dans une même thérapie était beaucoup moins

efficace avec des scores cliniques presque deux fois plus mauvais. Par ailleurs, chez

l’Homme, une étude préliminaire réalisée sur un petit groupe de patients SEP montra que la

combinaison de l’IFNβ avec le GA n’était pas plus efficace qu’une monothérapie standard

[Ytterberg et al., 2007]. L’autre combinaison possible est d’associer l’IFNβ, ou le GA, avec la

MTX. La monothérapie par MTX ne peut pas être maintenue sur de longues périodes à cause

de sa cardio-toxicité. Ramtahal et al. évaluèrent l’effet d’un prétraitement par MTX, suivi

d’un traitement à base de GA introduit lorsque les patients ne présentaient plus de poussées ni

d’augmentation d’EDSS depuis 6 mois. Ces patients souffraient de formes RR-MS très

agressives [Ramtahal et al., 2006]. Il fut observé une réduction du nombre de poussées annuelles

(d’un nombre moyen de 2,7 avant traitement à un nombre de 0,16 après traitement) et une

stabilisation, voire une amélioration du handicap maintenue en moyenne 36 mois après le

début du traitement. En revanche, un autre travail ne parvint pas à prouver une meilleure

efficacité d’un traitement successif de MTX puis de GA par rapport à une monothérapie au

GA sur l’ensemble des critères cliniques et IRM [Vollmer et al., 2008]. Cependant, même si le

nombre moyen de poussées annuelles et l’évolution de l’EDSS étaient comparables entre les

deux groupes, il fut observé une meilleure évolution des lésions inflammatoires et des lésions

visibles en séquences T1 et T2 dans le groupe sous bithérapie [Arnold et al., 2008 ;Vollmer et al.,

Introduction

88

2008]. Une approche similaire consiste à prétraiter avec de la MTX puis à poursuivre le

traitement par de l’IFNβ. Un travail rétrospectif, mené sur les formes agressives de RR-MS,

démontra que la MTX, en prétraitement ou en combinaison avec l’IFNβ, avait un effet

bénéfique sur l’évolution du handicap et sur les poussées [Zaffaroni et al., 2008]. Par ailleurs, les

résultats d’une étude reposant sur le suivi de patients SEP pendant 3 ans allèrent dans le sens

d’une meilleure efficacité de l’IFNβ chez les patients prétraités par MTX par rapport à une

monothérapie par IFNβ (avec des nombres moyens de poussées annuelles respectifs de 0,44 et

1,14) [Edan et al., 2007 ; DeAngelis et al., 2008].

III.4. Les nouveaux traitements en cours de développement

Les avancées scientifiques et une meilleure compréhension de l’étiologie de la SEP

ont fourni des pistes dans le développement de nouvelles thérapies. Alors que les traitements

existants ont une action large sur le système immunitaire (mis à part le natalizumab) les

nouveaux traitements devraient avoir une action beaucoup plus ciblée. Ces nouvelles

molécules, encore en cours de développement pour la majorité d’entre elles, se proposent de

cibler divers mécanismes comme :

(1) La circulation des cellules immunitaires dans l’organisme. Les leucocytes dans

leur recherche d’agents pathogènes, contrôlent l’intégrité de l’organisme en circulant

dans l’ensemble des tissus. Ainsi, les poussées et l’apparition de nouvelles lésions

dans le SNC sont associées à une infiltration active de lymphocytes auto-réactifs et de

monocytes. Une approche thérapeutique dans la SEP serait de bloquer la circulation

des leucocytes ou la migration vers le SNC par franchisement de la BBB. C’est dans

cet objectif que le natalizumab, nouvel agent thérapeutique utilisé en clinique, a été

développé. Un immunosuppresseur oral est en cours de développement : le FTY720

ou fingolimod. Cet analogue synthétique est un agoniste du récepteur à la sphingosine

1 phosphate (S1P). Le S1PR est exprimé à la surface des lymphocytes et permet, en

interagissant avec le S1P, la sortie des lymphocytes T activés hors des tissus

lymphoïdes secondaires [Cyster et al., 2005]. Le fingolimod, en interagissant avec le

S1PR, conduit à son internalisation. Les lymphocytes sont donc séquestrés dans les

glanglions, ce qui entraîne une lymphopénie [Cyster et al., 2005]. Par ailleurs, cette

molécule semble être moins efficace dans la séquestration des lymphocytes T

régulateurs CD4+ CD25+, ce qui induit une augmentation du ratio des cellules

Introduction

89

régulatrices dans le sang. D’ailleurs une amélioration des fonctions régulatrices a été

observée [Sawicka et al., 2005 ; Daniel et al., 2007]. De plus cette molécule, en mimant

l’effet du S1P, pourrait avoir une action plus large notamment en activant les cellules

dendritiques de sorte à ce qu’elles orientent les lymphocytes T vers une polarisation

Th2 [Idzko et al., 2002]. Cette molécule pourrait aussi activer les cellules neurales

comme les astrocytes [Pebay et al., 2001]. Un essai clinique de phase II réalisé par

Kappos et al. démontra qu’une prise orale quotidienne de fingolimod avait un effet

positif dans le traitement des formes RR-MS [Kappos et al., 2006]. Après 6 mois de

traitement, il fut observé une diminution de l’inflammation du SNC chez les personnes

traitées (1 ou 3 lésions actives pour respectivement 1,25 mg et 5 mg de fingolimod)

par rapport au placebo (5 lésions), ainsi qu’une diminution du nombre moyen de

poussées annuelles (0,35 et 0,04 pour respectivement 1,25 mg et 5 mg de fingolimod,

contre 0,77 pour le placebo).

(2) Cibler spécifiquement les cellules immunitaires dans leurs fonctions ou leur

activation. Les lymphocytes sont les cellules majoritairement représentées dans les

lésions démyélinisantes actives. L’IL-2 est le principal facteur de croissance des

lymphocytes T activés. Cette cytokine stimule à la fois leur expansion et leur

maturation. Bien que le récepteur à l’IL-2 soit, à l’état basal, faiblement exprimé à la

surface des lymphocytes T, l’activation de ces cellules conduit à sa surexpression. Le

récepteur à l’IL-2 est composé de 3 sous-unités, dont la chaîne alpha (ou CD25) qui a

été retrouvée comme associée à la susceptibilité à la SEP [Hafler et al., 2007]. Un

anticorps humanisé dirigé contre l’IL2-Rα fut testé dans le traitement de la SEP

[Bielekova et al., 2004]. Cet anticorps, appelé daclizumab, démontra son efficacité chez

des patients souffrant d’une SEP particulièrement active et résistante à des traitements

à base d’IFNβ. Chez ces patients traités, il fut observé une diminution importante

(78%) de l’inflammation du SNC ainsi qu’une amélioration des signes cliniques.

Cependant, le mécanisme d’action du daclizumab ne semble pas être celui imaginé. En

effet, la molécule ne semble pas directement inhiber l’activation des lymphocytes T,

mais agirait plutôt sur des cellules NK exprimant fortement le récepteur CD56 à leur

surface [Bielekova et al., 2006]. Ce sont ces cellules NK qui inhiberaient les lymphocytes

T présents dans les lésions inflammatoires. Par ailleurs, les auteurs suggérèrent le

possible effet du daclizumab sur les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ sans le

démontrer. Un essai clinique de phase II est en cours pour tester les propriétés de cette

Introduction

90

molécule dans le traitement de la SEP. Les résultats préliminaires laissent penser que

ce traitement est efficace puisqu’il diminue l’apparition et la progression des lésions

inflammatoires actives du SNC [DeAngelis et al., 2008a]. Un certain nombre d’éléments

semblent impliquer les lymphocytes B dans la SEP. Cette implication est visible par la

présence de bandes oligoclonales d’IgG dans le LCR de patients souffrant de SEP.

Certaines de ces IgG sont dirigées contre des composants de la gaine de myéline

[O’Connor et al., 2005]. Un agent ciblant les lymphocytes B parait être une approche

raisonnable dans le traitement de la SEP. Un agent proposé est le rituximab qui est un

anticorps humanisé ciblant l’antigène CD20 exprimé à la surface des cellules pré-B et

des lymphocytes B matures [DeAngelis et al., 2008b]. Une étude clinique de phase II

démontra l’efficacité de cette molécule [Hauser et al., 2008]. En effet, les patients traités

présentaient une diminution significative du nombre total de lésions inflammatoires,

ainsi qu’une réduction d’apparition de nouvelles lésions. Par ailleurs, la proportion de

patients présentant des poussées était moins importante dans le groupe de patients

traités par rituximab que dans le groupe sous placebo.

(3) Cibler la neuro-dégénérescence du SNC. Une dégénérescence axonale, neuronale

et oligodendrocytaire est retrouvée dans les lésions mais aussi dans la substance

blanche d’apparence normale des patients souffrant de SEP. Cette neuro-

dégénérescence semble corréler avec la progression de la maladie, indépendamment

des événements inflammatoires [Lopez-Diego et al., 2008]. Le glutamate semble jouer un

rôle dans cette neuro-dégénérescence, en effet l’activation d’une voie de signalisation

par le glutamate est un mécanisme impliqué dans la neurotoxicité de certaines

pathologies du SNC, comme la SEP [Groom et al., 2003]. Tout d’abord, il fut démontré

une augmentation de la concentration en glutamate dans le LCR de patients SEP par

rapport à des témoins. Cette augmentation était majorée durant les périodes de

poussées de la maladie [Sarchielli et al., 2003]. Les macrophages et les cellules

microgliales, qui colocalisent avec les dommages axonaux, seraient impliquées dans la

forte production de glutamate au niveau des lésions [Werner et al., 2001]. De plus, une

trop forte concentration en glutamate entraîne un excès de signalisation ce qui conduit

à une mort neuronale et oligodendrocytaire. [Matute et al., 2006]. Or, dans la substance

blanche du SNC, les oligodendrocytes sont les cellules responsables de la

détoxification et du maintien d’une concentration sub-toxique en glutamate

extracellulaire. Chez les patients SEP, cette clairance du glutamate extracellulaire par

Introduction

91

les oligodendrocytes semble être défectueuse ce qui peut expliquer l’augmentation du

glutamate observée [Pitt et al., 2003]. La minocyline fut proposée comme agent

thérapeutique contre l’élévation de la concentration en glutamate dans le LCR des

patients SEP. Cette molécule dérivée de la tétracycline présente l’avantage de pouvoir

être administrée par voie orale. De plus cette molécule est sûre puisqu’elle est utilisée

sur de longues périodes pour traiter l’acné. La minocycline fut testée en combinaison

avec les immuno-modulateurs classiquement utilisés dans le traitement de la SEP.

Dans le modèle animal EAE, l’association de la minocycline avec l’IFNβ [Giuliani et

al., 2005a] ou le GA [Giuliani et al., 2005b] entraîna une amélioration significative des

symptômes de la maladie (inflammation moins importante du SNC et perte axonale

moins marquée) comparé à une monothérapie. Un essai clinique préliminaire fut

pratiqué chez l’Homme. Malgré l’inclusion de peu de patients et le suivi sur une

courte période, l’étude révéla que l’ingestion quotidienne de minocycline par voie

orale réduisait l’activité de la maladie chez les patients souffrant de la forme RR-MS

[Metz et al., 2004]. Un autre composé, le riluzole, agissant sur la concentration en

glutamate en empêchant sa libération synaptique, fut proposé dans le traitement de la

SEP. Cette molécule pourrait diminuer l’excitotoxicité ainsi que l’activation et la

transmigration des lymphocytes T activés par le glutamate. Chez l’animal, il a été

montré que la prophylaxie du riluzole sur l’EAE provenait d’une diminution de

l’inflammation du SNC et d’une atténuation de la démyélinisation et de la perte

axonale [Gilgun-Sherki et al., 2003]. Chez l’Homme, les résultats obtenus sur de petites

cohortes de patients sont plus mitigés [Kalkers, 2002 ; Killestein et al., 2005]. Cependant, les

patients choisis présentaient une forme PP-MS qui implique peu la réaction

inflammatoire. Dans ces études, même si l’apparition de « trous noirs » (régions de

forte démyélinisation) était diminuée, le nombre total de lésions visibles en séquence

T2 était inchangé. Ces résultats indiquent que le riluzole agit sur l’évolution de la

lésion et sur la perte axonale, mais ne semble pas avoir d’effet sur la formation de

nouvelles lésions.

Introduction

92

Figures 31 : Les cibles thérapeutiques possibles dans le traitement de la sclérose en plaques. D’après Lopez-

Diego et al., Nat. Rev. Drug. Discov., 2008.

Les avancées récentes dans la compréhension de la pathogénie de la SEP permettent

de cibler de nombreuses voies (Figure 31). Ainsi, devant l’explosion des nouvelles molécules

testées dans le traitement de la SEP, seule une infime partie a pu être traitée dans ce chapître.

De plus, de nouvelles approches non médicamenteuses sont maintenant envisagées. Ces

approches reposent sur l’utilisation de cellules souches qui permettraient soit de réparer les

dommages présents dans le SNC des patients SEP, soit d’éliminer l’ensemble du système

immunitaire du patient, dont les cellules auto-réactives, avant de le reconstituer [Lopez-Diego et

al., 2008].

Introduction

93

III.5. Définition de la réponse au traitement dans la sclérose en plaques

Depuis plusieurs années, il apparaît à la communauté scientifique qu’une seule

molécule n’est pas suffisante pour traiter l’ensemble des patients SEP. La forte hétérogénéité

de la maladie entraîne de fortes différences dans la réponse du patient au traitement. Ainsi, les

praticiens vont devoir progressivement passer de l’idée du traitement d’une maladie vers

l’idée du traitement d’un patient et devoir se tourner vers une médecine personnalisée [Miller et

al., 2008b]. En effet, même si l’IFNβ réduit de 30% en moyenne le nombre de poussées, cette

molécule est peu efficace chez 30% des patients que l’on considère comme mauvais

répondeurs [Tremlett et al., 2003]. A l’heure actuelle, il n’existe aucun moyen de prédire la

réponse du patient à priori. Une telle approche est un réel défi car on ne sait pas encore sur

quels critères cliniques et/ou radiologiques il faut s’appuyer pour caractériser un patient qui

répond bien à son traitement.

III.5.1. Traitement de la sclérose en plaques par une approche d’escalade

thérapeutique

La SEP est une maladie qui touche le jeune adulte et qui ne réduit que faiblement

l’espérance de vie. Ces paramètres sont importants dans le choix du traitement. En effet, il est

nécessaire pour le médecin de prescrire un agent efficace mais qui ne soit pas trop délétère

pour le patient par ses effets secondaires. Le traitement de la SEP par une approche d’escalade

thérapeutique est une stratégie où l’agent présentant le meilleur rapport bénéfice/risque est

préféré dans un premier temps. Puis dans un second temps, en raison d’une inefficacité ou

d’une intolérance au premier agent, des agents plus puissants mais aussi plus toxiques seront

successivement utilisés jusqu’à l’obtention du meilleur compromis d’efficacité [Zaffaroni et al.,

2006]. Dans le traitement de la SEP, sur les 6 agents dont dispose le praticien, tous ne sont pas

à mettre au même niveau [Rieckmann et al., 2009]. En effet, les trois préparations d’IFNβ et le

GA forme la première ligne thérapeutique car, même si ces molécules présentent une

efficacité modérée (une réduction moyenne des poussées de 30%), les effets secondaires sont

peu importants et la sécurité à moyen et long terme est excellente. La deuxième ligne

thérapeutique comprend le natalizumab dont l’efficacité sur la fréquence des poussées est 2

fois supérieure à celle des médicaments précédents. Cependant, les complications possibles à

moyen terme, comme les LEMP, constituent le problème majeur. Enfin, la troisième et

Introduction

94

dernière ligne de traitement contient la MTX. Si dans la SEP son effet sur la réduction des

signes cliniques et radiologiques est majeur, des complications importantes à court terme ne

sont pas à négliger (toxicité cardiaque et aménorrhées souvent définitives).

Le traitement de la SEP par une escalade thérapeutique nécessite d’utiliser un

protocole standardisé d’évaluation de la réponse afin de déterminer quand il devient impératif

de passer d’une ligne de traitement à une autre [Rieckmann et al., 2009]. Les facteurs pris en

compte dans la définition d’une réponse sub-optimale au traitement de la SEP sont de 3

ordres [Zaffaroni et al., 2005] :

(1) Données cliniques. Un des paramètres cliniques à prendre en compte est le nombre

de poussées annuelles. Un échec dans la réduction de ce nombre peut être perçu

comme une réponse sub-optimale. Cependant, il est important de ne pas négliger que

le nombre de poussées diminue naturellement avec l’avancée de la maladie.

L’examination de la progression du handicap via l’EDSS peut aussi être un moyen de

détecter une réponse sub-optimale. Cependant, ce score fluctue dans le temps

indépendamment de la SEP : la dépression, la maladie et la douleur modifient par

exemple le score EDSS, ce qui peut être une source d’erreur. Rio et al. définirent

l’augmentation de 1 point d’EDSS, confirmée à 6 mois, comme un critère spécifique

et sensible pour définir une mauvaise réponse au traitement [Rio et al., 2002].

(2) Données radiologiques. Les événements inflammatoires visibles en imagerie sont 5

à 10 fois plus fréquents que les poussées. Par ailleurs, les traitements à base d’IFNβ et

de GA ont démontré un effet sur l’apparition de nouvelles lésions. Toutefois, de

nombreuses informations radiologiques sont disponibles (nombre de lésions hypo-

intenses en séquence T1, prise de contraste au gadolinium, atrophie…) et aucune ne

peut être favorisée par rapport à une autre. Par ailleurs, l’apparition de nouvelles

lésions n’est pas forcément signe de mauvaise réponse, ce qui pose la question du seuil

à fixer.

(3) Données de tolérance à la molécule. Comme aucun traitement ne permet de guérir

la SEP, le patient devra être sous traitement toute sa vie. Il est donc impératif de

prescrire un traitement bien supporté par celui-ci.

Ainsi, avant la mise en place de tout traitement, il est indispensable pour le médecin

d’examiner le patient de manière exhaustive afin d’établir un « niveau de référence » sur la

base duquel l’efficacité du traitement pourra être jugée dans le futur. La mise en place du

traitement débute par un traitement de première ligne. Le patient doit être suivi tous les 3 mois

Introduction

95

durant la première année, puis tous les 6 mois afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Si la

maladie semble stable et que le traitement est bien supporté par le patient alors la première

ligne de traitement peut être poursuivie. Par contre, si une détérioration neurologique est

perçue au cours de deux consultations successives, ou si la fréquence des poussées n’est pas

réduite, ou encore si les effets secondaires sont jugés comme non tolérables par le patient, il

est impératif de changer de traitement [Rieckmann et al., 2009].

Cependant cette approche pose de nombreux problèmes :

(1) Elle suppose qu’un patient qui répond mal à un traitement de première ligne

répondra surement mieux à un traitement de deuxième ou troisième ligne. Or cela n’a

jamais été démontré dans la SEP.

(2) Actuellement on ignore si un patient qui répond bien à un traitement à court terme

(c'est-à-dire au cours des 2 premières années de traitement) restera un bon répondeur à

long terme [Miller et al., 2008].

(3) On fait le postulat qu’il existe seulement deux catégories de patients : les « bons

répondeurs » et les « non répondeurs ». Or, ce n’est pas le cas car il existe toute une

déclinaison de réponses entre ces deux cas extrêmes, ce qui rend d’autant plus délicate

l’interprétation de l’efficacité du traitement.

III.5.2. Prédiction de la réponse au traitement des patients sclérose en plaques en

vue d’une médecine personnalisée

Le principal inconvénient d’une approche par escalade thérapeutique est que le patient

doit tester généralement plusieurs traitements avant de trouver celui qui lui convient le mieux.

Cela implique plusieurs mois d’attente avant que le médecin confirme ou non l’efficacité du

traitement, ce qui retarde d’autant plus la mise en place d’un traitement adéquat. Ce délai a

toute son importance quand on sait qu’un retard de 2 ans dans la mise en place d’un traitement

efficace peut avoir un impact significatif sur la progression de la maladie, mais aussi sur la

conversion d’un événement neurologique isolé vers une SEP déclarée [DeAngelis et al., 2008a]. Il

est donc nécessaire de trouver des marqueurs permettant de déterminer plus rapidement la

réponse au traitement, voire de la prédire.

Introduction

96

5.2.1. Recherche de bio-marqueurs prédictifs de la réponse au traitement

La recherche d’un bio-marqueur est un véritable challenge car il doit être à la fois très

sensible et spécifique de l’activité de la SEP. De plus, ce marqueur doit être facilement

détectable dans les liquides biologiques, qui doivent eux-mêmes être facilement prélevables.

L’urine, le sang et la salive permettent aisément l’identification de molécules sécrétées, de

protéines plasmatiques ou sériques, d’ARN et de protéines exprimés par les cellules

sanguines. Par contre, l’utilisation du LCR n’est pas réaliste pour des diagnostics routiniers

[Miller et al., 2008].

Un des marqueurs corrélé avec une diminution de l’efficacité du traitement est

l’apparition dans le sang d’anticorps neutralisants (Nabs) dirigés contre la molécule

traitante [Rudick, et al., 2009]. Dans les traitements par IFNβ, jusqu’à 35% des patients traités

vont développer des Nabs. Ces derniers apparaissent généralement entre 6 et 24 mois après le

début du traitement [Noronha et al., 2007]. Cependant, il est important de noter que la présence

de Nabs n’est pas toujours très stable. En effet, plus de 30% des patients détectés positifs pour

les Nabs peuvent par la suite redevenir négatifs [Sorensen et al., 2005]. De nombreux travaux ont

indiqué que les Nabs réduisent, voire inhibent, l’efficacité du traitement par IFNβ. Une équipe

étudia l’influence des Nabs, présents dans le sérum de patients traités pendant 3 ans par

IFNβ, sur l’évolution de la SEP [Malucchi et al., 2008]. Si 55,8% des patients dépourvus de Nabs

n’avaient pas eu de poussées pendant 2 ans, seulement 17,6% des patients présentant des

Nabs se retrouvaient dans un cas similaire. D’autres traitements, comme le GA [Salama et al.,

2003] et le natalizumab [Calabresi et al., 2007], peuvent aussi induire l’apparition d’anticorps.

Cependant, l’effet des ces anticorps sur l’efficacité du traitement fut beaucoup moins étudié.

Environ 50% des patients traités par le GA développaient des anticorps dirigés contre la

molécule (33% avec des titres élevés et 14% avec des titres faibles). Salama et al.

démontrèrent que ces anticorps avaient la capacité d’inhiber, in vitro, l’activité biologique du

GA sur les cytokines sécrétées par les lymphocytes T. Dans le traitement par natalizumab, 6%

des patients traités développent de manière persistante des anticorps. La présence de ces

anticorps est associée à une réduction significative de l’efficacité du traitement. En effet, les

patients ayant des anticorps anti-natalizumab dans leur sérum présentent des signes cliniques

(nombre de poussées, évolution du handicap) et radiologiques (apparition de nouvelles

lésions, nombre de lésions inflammatoires) plus mauvais que les patients séronégatifs, mais

aussi une mauvaise tolérance au traitement.

Introduction

97

Des études suggérèrent l’existence d’autres bio-marqueurs comme prédictifs de la

réponse au traitement de la SEP. Ce fut notamment le cas du gène MxA (pour Myxovirus-

resistance-protein A) dont l’expression est activée par l’IFNβ (nous y reviendrons dans le

prochain chapître). Dans l’étude de Malucchi et al., l’expression de MxA par les cellules

sanguines semblait un meilleur biomarqueur que la présence de Nabs pour mesurer la réponse

au traitement par IFNβ [Malucchi et al., 2008]. Les patients considérés comme négatifs pour

l’expression de MxA présentaient en moyenne une poussée 7 mois après la mise en place du

traitement alors que les patients positifs avaient en moyenne un délai supérieur à 3 ans. En

outre, il y avait une plus forte proportion de patients ne présentant pas de poussées chez les

patients positifs pour l’expression de MxA que chez les patients négatifs (57,5% contre 21%).

A l’heure actuelle, la mesure de la présence de Nabs dirigés contre l’IFNβ est

recommandée lors du suivi du traitement du patient. Dans le futur, l’analyse d’autres

biomarqueurs plus précis, comme MxA, pourrait se développer afin d’évaluer la réponse du

patient face au traitement choisi.

5.2.2. Anticiper la réponse au traitement par analyse de l’expression génique

L’analyse de l’expression de gènes est une approche couramment utilisée en recherche

mais aussi en clinique. En cancérologie, la classification de l’expression des gènes permet de

fournir des informations cruciales quant au pronostic d’évolution du cancer et quant à la

stratégie thérapeutique à adopter [Cheang et al., 2008]. Ces dernières années, des kits

commerciaux reposant sur ce principe ont été développés afin d’établir un pronostic après une

chimiothérapie. Dans la SEP, la recherche de tels marqueurs est beaucoup moins avancée.

Des approches similaires sont en cours d’investigation afin d’établir un profil d’expression de

gènes qui permettraient de prédire la réponse au traitement. Par exemple, dans le cas d’un

traitement à base d’IFNβ, plusieurs centaines de gènes ayant leur expression modifiée par

l’IFN β sont susceptibles de fournir de tels renseignements. Cependant, les résultats obtenus

dans le traitement par l’IFNβ sont très variables d’une étude à l’autre [Baranzini et al., 2005 ; Van

Baarsen et al., 2008 ; Weinstock-Guttman et al., 2008]. Le manque de reproductibilité est certainement

attribuable au protocole expérimental (caractéristiques des patients inclus dans les cohortes),

au type d’analyse et surtout à la taille des échantillons [Rudick, et al., 2009]. A l’heure actuelle,

dans la SEP, il n’existe pas de profil d’expression de gènes qui permette de prédire la réponse

Introduction

98

à un traitement. Cependant, on peut espérer que dans le futur, comme en cancérologie, cette

approche soit accessible au neurologue [Miller et al., 2008].

5.2.3. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au traitement

Le concept d’utiliser l’information génétique d’un individu pour prédire sa réponse au

traitement afin de l’adapter au mieux est maintenant reconnu. Alors que les deux approches

précédentes permettaient d’estimer la réponse du patient après la mise en place du traitement,

l’approche génétique autorise une prédiction avant même la mise en place de celui-ci. Pour

certains traitements, comme les maladies cardio-vasculaires avec la warfarine [Takeuchi et al.,

2009] ou le clopidogrel [Collet et al., 2009 ; Mega et al., 2009], cette approche permet de prédire

l’efficacité du traitement. En effet, pour ces deux agents, la dose efficace à utiliser est très

variable d’un individu à un autre. Ainsi, une dose standard ne peut pas être fixée pour

l’ensemble des patients : si la dose est trop faible le traitement sera peu efficace, à l’inverse si

elle est trop forte on augmentera les risques d’effets secondaires indésirables. Dans la SEP, la

majorité des études de pharmacogénétique publiées reposent sur une approche gène candidat

et se basent sur le mécanisme d’action présumé de la molécule (par exemple l’étude de

polymorphismes contenus dans les gènes codant pour les récepteurs à l’IFNβ) [Cunningham et

al., 2005 ; Grossman et al., 2007]. Des travaux plus récents utilisent une approche GWAS qui

autorise la découverte de nouveaux effecteurs génétiques insoupçonnés impliqués dans la

réponse au traitement [Byun et al., 2008]. Cependant, l’ensemble des études d’associations

génétiques pour la réponse au traitement dans la SEP pose le problème d’une absence de

réplication des gènes impliqués [O’Doherty et al., 2007]. Cette non-réplication peut s’expliquer

par des tailles de cohortes trop faibles et par l’utilisation de critères hétérogènes pour la

définition de la réponse au traitement. Tout dernièrement, une étude confirma l’association

entre le locus GPC5 et la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ découverte par Byun et

al. [Cénit et al., 2009]. Ce locus code pour le glypicane 5 qui est un protéoglycane exprimé à la

surface des cellules. Cependant, le mécanisme d’action de ce protéoglycane dans la réponse

au traitement n’a pas encore été testé. Sans une confirmation forte d’une association entre un

polymorphisme et la réponse au traitement, on ne peut raisonnablement pas envisager la mise

en place d’une telle approche prédictive en clinique.

Introduction

99

IV. Les interférons de type 1

L’IFN β est un interféron de type 1 ayant des propriétés immuno-modulatrices. Il est

d’ailleurs prescrit en routine dans le traitement de la SEP. Cependant, bien qu’il ait été

découvert il y a plus de 50 ans, son mode d’action dans la thérapie de la maladie reste encore

mal compris [Borden et al., 2007]. De façon générale, on sait que les IFNs sont des protéines

sécrétées, à activité autocrine et paracrine, stimulant les réseaux intracellulaires et

intercellulaires impliqués dans la régulation de l’immunité et des infections virales.

IV.1. La voie de signalisation des interférons de type 1

Les IFNs sont classés en fonction du récepteur auquel ils se lient pour induire un

signal intracellulaire. Jusqu’à aujourd’hui, 3 classes d’IFNs ont été identifiées : les IFNs de

type 1, de type 2 et de type 3. Chez l’Homme, la classe des IFNs de type 1 comprend l’IFNβ,

l’IFN ω, l’IFNε, l’IFNκ et 13 sous types d’IFNα [Borden et al., 2007] ; chaque molécule étant

codée par un gène différent (soit 17 gènes codant pour les IFNs de type 1 au total).

Historiquement, les IFNs de type 1 ont été découverts grâce à leurs propriétés antivirales : il

fut observé que les cellules qui les exprimaient étaient résistantes à certaines infections virales

[Borden et al., 2007]. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont les cellules qui produisent la

plus grande quantité d’IFNs de type 1 [Coccia et al., 2004]. Tous les IFNs de type 1 activent le

même récepteur de surface, IFNAR, qui est exprimé de façon constitutive. Le récepteur

IFNAR est composé de 2 sous unités protéiques transmembranaires : IFNAR1 et IFNAR2.

Bien que ces deux chaînes soient indispensables à la transduction du signal, la molécule

d’IFN de type 1 se lie d’abord à la chaîne IFNAR2, chaîne pour laquelle il possède le plus

d’affinité, puis à la chaîne IFNAR1 [Theofilopoulos et al., 2005]. Aux domaines intracellulaires

d’IFNAR sont associées deux tyrosines kinases de la famille des Janus kinases (JAKs) :

TYK2 est liée à IFNAR1, JAK1 à IFNAR2. La liaison de l’IFN de type 1 à IFNAR induit un

rapprochement des deux chaînes du récepteur, ce qui autorise une trans-phosphorylation de

JAK1 et de TYK2 [Schindler et al., 2007]. Les deux JAKs alors activées vont phosphoryler des

domaines intracellulaires des sous-unités d’IFNAR, créant ainsi des sites de recrutement pour

les protéines STAT1 et STAT2. Une fois phosphorylé par les protéines TYK2 et JAK1,

l’hétérodimère STAT1/STAT2 se décroche du récepteur, s’associe à IRF9 et entre dans le

noyau. L’oligomère STAT1/STAT2/IRF9 forme un complexe appelé ISGF3 pour IFN-

Introduction

100

stimulated gene factor 3. Dans le noyau, ce complexe ISGF3 va se fixer sur le promoteur de

gènes possédant une séquence consensus appelée ISRE pour IFN-stimulated response

element afin d’induire leur expression (Figure 32) [Theofilopoulos et al., 2005].

De nombreux mécanismes peuvent inhiber cette voie de signalisation [Schindler et al.,

2007]. L’internalisation puis la dégradation des récepteurs IFNAR, la déphosphorylation des

JAKs et des STATs par des phosphatases ou encore l’induction de protéines SOCS en

constituent des exemples [Vlotides et al., 2004].

Figure 32 : La voie de signalisation des interférons de type 1. D’après Borden et al., Nat. Rev. Drug Discov.,

2007.

IV.2. Les protéines antivirales induites par les interférons de type 1

La liaison des IFNs de type 1 à leur récepteur initie une cascade de signalisation

induisant l’expression de plusieurs centaines de gènes possédant un élément de réponse aux

IFNs dans leur région promotrice [De Veer et al. 2001]. Ces gènes codent pour des protéines

impliquées dans divers mécanismes cellulaires : le remodellage du cytosquelette, l’apoptose

ou encore la régulation d’événements post-transcriptionnels ou des modifications post-

traductionnelles [Sadler et al., 2008]. De plus, certaines de ces protéines induites par les IFNs de

type 1, comme la GTPase MxA, le couple OAS/RNase L, la PKR et l’ISG15, ont démontré

des fonctions d’effecteurs antiviraux chez des souris délétées pour ces gènes.

Introduction

101

IV.2.1. La protéine MxA

Les protéines Mx font partie de la superfamille des grandes GTPases. Chez l’Homme,

seules deux GTPases Mx existent : MxA et MxB. Ces protéines sont exprimées par de

nombreuses cellules des tissus périphériques, comme les hépatocytes, les cellules

endothéliales ou les monocytes [Sadler et al., 2008 ; Fernández et al., 1999]. Chez l’Homme, MxA

et MxB sont toutes les deux cytoplasmiques, mais seule MxA possède une activité antivirale.

La protéine MxA est retrouvée à proximité du réticulum endoplasmique [Accola et al., 2002] où

elle forme de larges complexes oligomériques [Kochs et al., 2002]. Cette localisation sub-

cellulaire de MxA lui permet de surveiller les mécanismes d’exocytose et le trafic

vésiculaire : elle peut ainsi capturer des composants viraux essentiels [Kochs et al., 1999]. La

cible principale des protéines Mx semble être des composés viraux présentant une structure

homologue aux nucléocapsides [Kochs et al., 1999]. La protéine MxA possède deux domaines,

CID (pour central interacting domain) et LZ (pour leucine zipper), qui sont indispensables

pour la reconnaissance de certaines cibles virales et le blocage du transport intracellulaire

(Figure 33).

Figure 33 : Mécanisme d’action de la protéine MxA. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.

IV.2.2. La voie des OAS et de la RNaseL

Les 2’-5’oligoadénylate synthétases (OAS) sont des enzymes responsables de

l’inhibition de la synthèse protéique en présence d’ARNs doubles brins (ARNdb) viraux.

Introduction

102

Purifiées à partir de cellules traitées à l’IFN, les OAS démontrèrent la capacité de synthétiser

de petits oligomères d’adénylate liés en 2’-5’. Ces oligomères d’adénylate (trimériques ou de

plus grande taille) se lient à une endo-ribonucléase latente, la RNase L. Cette interaction

entraîne une dimérisation de la RNase L aboutissant à son activation. Il en résulte une

dégradation des ARNs viraux et cellulaires (Figure 34) [Hovanessian et al., 2007]. Les OAS sont

constitutivement exprimées par la cellule, à un faible niveau, et servent de senseurs aux

ARNdb viraux. Chez l’Homme, les gènes OAS qui ont été identifiés localisent sur le

chromosome 12 [Hovnanian et al., 1998]. Il existe 3 gènes codant pour les formes majeures

d’OAS : le gène OAS1 qui code pour les petites isoformes de 40-46 kDa, le gène OAS2 qui

code pour les isoformes moyennes de 69-71 kDa et le gène OAS3 qui code pour la grande

isoforme de 100 kDa. A côté de ces formes majeures, il existe un gène codant pour une OAS-

like (OASL) [Sarkar et al., 2004]. Pour chacun des gènes OAS des épissages alternatifs

produisent de nombreuses isoformes qui diffèrent par leurs extrémités C-terminales. De plus,

chaque isoforme d’OAS présente des caractéristiques propres qui font sa singularité

[Hovanessian et al., 2007] :

(1) Les gènes OAS1 et OASL ne possèdent qu’un seul domaine d’homologie OAS,

alors que les gènes OAS2 et OAS3 possèdent respectivement 2 et 3 domaines OAS.

(2) Seules les formes OAS1, OAS2 et OAS3 sont capables de synthétiser des

oligomères d’adénylate. Le domaine OAS de la forme OASL est quant à lui inactif.

(3) La protéine OASL est retrouvée sous forme monomérique, OAS1 sous forme

tétramérique, OAS2 sous forme dimèrique et OAS3 sous forme trimérique.

(4) La longueur des oligomères d’adénylate synthétisés varie en fonction des

isoformes [Marié et al., 1997]. Seuls les oligomères produits par les isoformes d’OAS1 et

d’OAS2 possèdent la capacité d’activer la RNase L.

(5) La forme OAS3 est plus sensible à l’activation par les ARNdb (1µg/ml) que les

formes OAS1 et OAS2 (100 µg/ml) [Marié et al., 1997].

(6) La localisation sub-cellulaire varie en fonction des isoformes d’OAS. Les

isoformes d’OAS3 sont majoritairement associées aux ribosomes, alors que les

isoformes d’OAS1 et d’OAS2 sont en plus retrouvées avec les mitochondries et les

fractions nucléaires [Besse et al., 1998 ; Hovnanian et al., 1998].

Plus récemment, un rôle non-enzymatique des OAS a été identifié. Le gène OAS1 code pour

3 isoformes : E16, E17 et E18. L’isoforme E17 serait impliqué dans des phénomènes

d’apoptose. Cette isoforme contient un domaine BH3 capable d’interagir avec les protéines

Introduction

103

anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. En effet, la forme E17 colocalise dans la cellule avec

Bcl-2, mais surtout co-immunoprécipite avec Bcl-2 et BclXL. De manière surprenante, cette

action pro-apoptotique de l’isoforme E17 ne nécessite pas d’oligomérisation, ni la présence

d’ARNdb, d’activité enzymatique ou de la RNase L [Ghosh et al., 2001].

Figure 34 : La voie antivirale OAS1-RNase L. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.

IV.2.3. La protéine kinase PKR

Comme les OAS, la protéine kinase régulée par les ARNs (PKR) est une protéine

qui inhibe de la synthèse protéique. Cette kinase cytoplasmique est constitutivement

exprimée, à un niveau basal, dans tous les tissus. Son expression est augmentée par les IFNs

de type 1 [Samuel et al., 2001]. En conditions « normales », la PKR est majoritairement

retrouvée sous une forme monomérique inactive repliée sur elle-même. La présence de

ligands activateurs, tels que des ARNdb viraux ou des molécules polyanioniques [Nanduri et al.,

2000], induit un changement conformationnel de la protéine qui expose alors son domaine

kinase situé en C-terminal [Gelev et al., 2006]. Une fois dépliée, la PKR s’homodimérise et

s’autophosphoryle sur plusieurs résidus [Devy et al., 2005]. C’est cet homodimère phosphorylé

qui constitue la forme active de la PKR.

Introduction

104

La PKR appartient à la famille des protéines kinases qui répondent aux stress

environnementaux en régulant la synthèse des protéines. La principale activité antivirale de la

PKR passe par la phosphorylation du facteur de transcription EIF2α [Devy et al., 2005], ce qui

entraîne la séquestration du facteur limitant EIF2β, un facteur d’échange de nucléotides

guanyliques. L’inhibition du recyclage du GDP a pour conséquence d’empêcher l’initiation de

la traduction [Sadler et al., 2008].

Figure 35 : Mécanisme d’action de la PKR. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.

IV.2.4. Le facteur ISG15

L’expression du gène codant pour l’ISG15 est aussi fortement activée par les IFNs de

type 1 lors d’une infection virale. Ce motif peptidique, qui est un homologue de l’ubiquitine,

intervient dans un phénomène appelé l’ISGylation (Figure 36) [Loeb et al., 7806]. Les

phénomènes d’ubiquitylation régulent de nombreux aspects de la réponse immune. Il n’est

donc pas surprenant de retrouver un motif peptidique, dont l’expression est régulée par les

IFNs, possèdant une fonction similaire à celle des ubiquitines [Liu et al., 2005]. Comme dans

les phénomènes d’ubiquitylation, plusieurs protéines interviennent au cours des processus

d’ISGylation. L’enzyme HBE1L à l’activité E1-like active l’ISG15. Puis, deux enzymes E2-

like, UBCH6 et UBCH8, servent de transporteurs pour les molécules d’ISG15 activées. Enfin,

HERC5 et TRIM25, homologues de l’E3 ubiquitin-ligase, vont coupler l’ISG15 aux protéines

Introduction

105

cibles [Sadler et al., 2008]. Au moins 158 protéines sont des cibles potentielles de l’ISGylation.

De plus, de nombreux substrats d’ISGylation possèdent des fonctions importantes dans la

réponse aux IFNs de type 1 (comme JAK1, STAT1, MxA, PKR, RNase L …) [Zhao et al.,

2005]. Contrairement à l’ubiquitylation, l’IGSylation n’entraîne pas une dégradation de la

protéine, mais mime une activation induite par l’ubiquitylation. En effet, l’IGSylation

prévient la dégradation d’IRF3 ce qui augmente l’induction de l’expression de l’IFNβ. Par

ailleurs, l’ISGylation peut moduler l’activité enzymatique soit positivement, soit

négativement.

Figure 36 : Mécanisme de l’ISGylation. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.

IV.3. Interférons de type 1 et sclérose en plaques

IV.3.1. Evidences de l’importance des interférons de type 1 dans la sclérose en

plaques

Déjà mise en évidence pour d’autres maladies auto-immunes, l’importance de l’IFNβ

dans la SEP fut montrée par de nombreux travaux [Theofilopoulos et al., 2005]. Des animaux

invalidés pour le gène codant pour l’IFNβ [Teige et al., 2003] ou pour le gène codant pour son

Introduction

106

récepteur (IFNAR1-/-) [Prinz et al., 2008] développaient une EAE aux signes cliniques plus

sévères que les animaux sauvages. De plus, les animaux déficients pour l’un de ces gènes

présentaient une inflammation et une démyélinisation excessive de leur SNC. Chez l’Homme,

des études génétiques sur la susceptibilité à la SEP soulignèrent l’association de certains

gènes de la voie des IFNs de type 1 (TYK2 et IFIH1) avec la maladie [Ban et al., 2009, Martínez

et al., 2008]. Cependant, ces associations ne furent pas toujours répliquées. Une récente étude

sur la susceptibilité à la SEP, réalisée par GWAS, associa le locus IRF8 à la maladie [De Jager

et al., 2009b]. L’allèle du gène IRF8 conférant une plus grande susceptibilité à la SEP était

associé à une plus forte expression de nombreux gènes appartenant à la voie de signalisation

des IFNs. Un autre travail montra que l’expression de plusieurs gènes induits par les IFNs de

type 1 était augmentée chez environ 50% des patients souffrant de la forme RR-MS. C’était

notamment le cas des gènes OAS1, OAS2, MxA, MxB et ADAR1 [Van Baarsen et al., 2006].

Cette augmentation de l’expression des gènes induits par les IFNs de type 1 est retrouvée dans

de nombreuses maladies auto-immunes dont le lupus érythémateux [Rönnblom et al., 2001] et le

diabète de type 1 [Devendra et al., 2004]. Chez les patients souffrant de lupus érythémateux,

l’activité de la maladie corrélait avec une augmentation de l’IFNα sérique [Bengtsson et al.,

2000]. Cependant, contrairement à ces deux dernières pathologies, l’injection d’IFNβ permet

de traiter les patients SEP [O’Doherty et al., 2007]. En effet, nous avons vu au chapître précédent

que cette molécule réduisait les signes cliniques de la SEP tout en améliorant les résultats

d’IRM des patients. La régulation de la SEP par l’IFNβ est un mécanisme complexe, dont

toutes les subtilités ne sont pas encore connues, car la molécule semble intervenir à de

nombreuses étapes de l’inflammation.

IV.3.2. Mécanisme d’action de l’IFNββββ dans le traitement de la sclérose en plaques

Le traitement des patients SEP par l’IFNβ a un effet complexe sur l’expression de

nombreux gènes appartenant à diverses voies métaboliques [Markowitz et al., 2007]. Une étude

montra que la majorité de ces gènes codaient pour des protéines ayant des fonctions

immunitaires et apoptotiques [Fernald et al., 2007]. Des travaux démontrèrent que l’effet

bénéfique de l’IFNβ dans le traitement de la SEP pouvait résulter de son effet sur la migration

des cellules immunitaires vers le SNC, l’activation et la polarisation des lymphocytes,

l’apoptose cellulaire [Billiau et al., 2004].

Introduction

107

3.2.1. Effet de l’IFNββββ sur la migration des cellules immunes

Afin de rejoindre le SNC, les lymphocytes doivent traverser la BBB. Les lymphocytes

circulent dans le sang en roulant à la surface des cellules endothéliales. Se roulement

s’effectue grâce à une interaction faible entre les sélectines des cellules endothéliales et leurs

ligands glycosylés exprimés à la surface des cellules immunitaires. Ce n’est qu’une fois

activés par des chimiokines que les lymphocytes vont adhérer fortement à la paroi vaculaire

par une interaction impliquant les intégrines. Ils peuvent alors sortir de la circulation sanguine

par une voie péricellulaire puis se retrouver dans l’espace périvasculaire, avant de pénétrer

dans le cerveau et rejoindre les sites d’inflammation. Les lymphocytes, les monocytes et les

macrophages produisent des métallo-protéases (MMP s). Ces MMPs sont indispensables au

passage des leucocytes à travers cet espace périvasculaire via la dégradation de la matrice

extracellulaire [Man et al., 2007]. L’IFNβ pourrait avoir un effet bénéfique sur l’évolution de la

SEP en intervenant à, au moins, 2 étapes clés de ce processus : l’adhésion aux cellules

endothéliales et le passage à travers l’espace périvasculaire.

a. Adhésion à la barrière hémato-encéphalique

La migration des lymphocytes depuis la circulation sanguine vers les tissus est

facilitée par l’interaction des intégrines VLA-4 et LFA-1, avec leurs ligands VCAM-1 et

ICAM-1, exprimés par les cellules endothéliales [Man et al., 2007]. De nombreux travaux

démontrèrent que le traitement par IFNβ avait pour conséquence de diminuer l’expression de

l’intégrine VLA-4 à la surface des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ [Jensen et al. 2007]. Cette

réduction était visible dès 1 mois par rapport à ces mêmes patients avant traitement, et dès 3

mois comparé à des témoins. Par ailleurs, Soilu-Hänninen et al. suggérèrent que la diminution

de l’expression de VLA-4 par les lymphocytes pouvait servir de marqueur pour estimer la

réponse à long terme du patient vis-à-vis du traitement par IFNβ [Soilu-Hänninen et al., 2005]. Il

est raisonnable de penser que l’effet bénéfique de l’IFNβ pourrait passer majoritairement par

l’inhibition de l’expression de VLA-4 à la surface des lymphocytes. En effet, l’utilisation du

natalizumab, qui est un anticorps dirigé contre cette intégrine, a clairement démontré son

efficacité dans la maladie.

Les travaux étudiant la protéine de surface endothéliale VCAM-1, le ligand de VLA-4,

ont aussi abouti à des résultats intéressants. Ils montrèrent que le traitement des patients par

Introduction

108

l’IFN β augmentait la concentration sérique de la forme soluble de VCAM-1[Graber et al., 2005 ;

Jensen et al. 2007]. Or, cette forme soluble est produite par un clivage protéolytique de la forme

membranaire de VCAM-1. Il fut alors émis l’hypothèse que la forme soluble de VCAM-1

pouvait interagir avec VLA-4, ce qui empêcherait la migration des leucocytes vers le SNC

[Graber et al., 2005]. Par ailleurs, dans le modèle animal de la SEP, il fut retrouvé une

diminution de la forme membranaire de VCAM-1 [Floris et al., 2002].

Il fut également observé une diminution de l’expression de l’ARNm LFA-1 chez les

patients traités par IFNβ, mais uniquement chez les patients considérés comme « bon

répondeurs » au traitement [Muraro et al., 2004]. Cependant, dans cette étude il ne fut pas

retrouvé d’effet sur l’expression de surface de la protéine. L’effet de l’IFNβ sur le ligand de

LFA-1, ICAM-1, fut lui aussi étudié par plusieurs équipes qui tirèrent des conclusions

opposées. Alors que Floris et al. démontrèrent que l’IFNβ avait pour effet de diminuer

l’expression d’ICAM-1 à la fois in vitro et in vivo [Floris et al., 2002], Kawanokuchi et al.

n’observèrent aucun effet de l’IFNβ sur l’expression de l’ARNm d’ICAM-1 par les

microglies [Kawanokuchi et al., 2004].

Nous avons vu que différents travaux suggèrent que l’IFNβ empêchait, par divers

mécanismes, l’entrée des leucocytes dans le SNC des patients souffrant de SEP. Une autre

étude suggèra que l’IFNβ pouvait aussi modifier la sortie des lymphocytes hors des organes

lymphoïdes secondaires [Shiow et al., 2006]. Il fut démontré que l’IFNβ, en induisant

l’expression de CD69 à la surface des lymphocytes, empêchait leur sortie des ganglions

lymphatiques. En effet, le CD69 a la capacité d’interagir avec le récepteur aux sphingosines,

S1PR, ce qui a pour conséquence d’inhiber son expression membranaire. Or, nous avons vu

précédemment que ce récepteur est important dans la sortie des lymphocytes depuis les

organes lymphoïdes vers la lymphe.

b. Migration à travers l’espace péri-vasculaire

Les leucocytes activés produisent une grande variété de MMPs dont, MMP-1, MMP-2,

MMP-9 et MMP-12, qui dégradent la matrice extracellulaire et facilitent ainsi la migration

cellulaire [Man et al., 2007]. En effet, il fut montré chez l’animal que l’activation de la MMP-9

était associée à une altération de la perméabilité de la BBB [Fujimura et al., 1999]. Plusieurs

études in vitro démontrèrent, que l’IFNβ diminuait l’effet de la MMP-9 en inhibant sa

sécrétion par les lymphocytes T [Stüve et al., 1996 ; Leppert et al., 1996]. Ces résultats furent

Introduction

109

confirmés in vivo puisque la concentration sérique en MMP-9 diminuait chez les patients SEP

suite au traitement à l’IFNβ [Yushchenko et al., 2003]. Par ailleurs, il fut démontré que cette

inhibition de MMP-9 était accompagnée d’une baisse de la migration des lymphocytes T à

travers une lame basale synthétique [Stüve et al., 1996 ; Uhm et al., 1999]. Il est donc raisonnable

de penser qu’un des mécanismes d’action de l’IFNβ serait de bloquer la pénétration des

leucocytes dans le SNC en inhibant leur sécrétion de MMPs.

3.2.2. Effet de l’IFNββββ sur l’activation et la polarisation des cellules immunes

L’effet de l’IFNβ sur l’activation et la sécrétion de cytokines par les cellules

immunitaires n’est pas un mécanisme simple. Les nombreuses publications sur le sujet

présentent des résultats parfois divergents. L’activation des cellules T requiert deux signaux

de la part des APCs: (1) l’interaction du TCR avec l’antigène présenté par les molécules de

CMH, (2) le signal non spécifique des molécules de co-stimulation. Les molécules de co-

stimulation, CD80 et CD86, présentes à la surface des APCs, interagissent avec le CD28 et

CTLA-4 présents à la surface des lymphocytes T. Si l’interaction CD28/CD86 est la

combinaison prédominante pour la co-stimulation, l’interaction CTLA-4/CD80 est impliquée

dans un signal de régulation négative [Bugeon et al., 2000].

Des expériences, pratiquées in vitro, démontrèrent une diminution de l’expression du

CMH-II à la surface des cellules traitées par l’IFNβ [Kawanokuchi et al., 2004 ; Lande et al., 2008].

Quant à l’effet de l’IFNβ sur l’expression des molécules de co-stimulation, les études

réalisées fournissent des résultats parfois contradictoires. Plusieurs travaux rapportèrent une

diminution de l’expression de CD80 au niveau ARN et protéique dans de nombreuses cellules

traitées par l’IFNβ telles que les microglies [Kawanokuchi et al., 2004], les monocytes [Shapiro et

al., 2003] et les lymphocytes B [Liu et al., 2001]. Cependant, d’autres études démontrèrent

l’inverse [Marckmann et al., 2004 ; Wiesemann et al., 2008]. L’effet de l’IFNβ sur l’expression de

CD86 n’est pas plus clair. En effet, il fut d’une part démontré que l’IFNβ ne modifiait pas

l’expression de CD86 à la surface des leucocytes de souris [O’Doherty et al., 2007] ni à la surface

des lymphocytes B de patients SEP traités [Liu et al., 2001]. D’autre part, des travaux

prouvèrent que l’expression de la molécule était augmentée à la surface des monocytes

[Marckmann et al., 2004, Wiesemann et al., 2008] et des microglies [Kawanokuchi et al., 2004]. Par

ailleurs, l’IFNβ ne semblait pas modifier l’expression de CD28 à la surface des lymphocytes

Introduction

110

T [Liu et al., 2001]. Enfin, il fut rapporté une augmentation de l’expression de CD40 à la surface

des monocytes traités par l’IFNβ [Shapiro et al., 2003 ; Wiesemann et al., 2008].

Si les résultats divergent concernant l’effet de l’IFNβ sur l’expression des molécules

de co-stimulation, c’est aussi le cas quant à son effet sur l’activation des lymphocytes par les

APCs. L’IFNβ est capable d’influencer la maturation des APCs. Un travail suggéra qu’un

défaut de maturation des APCs avait pour conséquence de diminuer leur capacité à induire la

prolifération des lymphocytes T [Lande et al., 2008]. De plus, l’IFNβ modifie la sécrétion

cytokinique des APCs. En effet, il fut démontré une augmentation de la sécrétion d’IL-10 par

les microglies [Kawanokuchi et al., 2003] et les monocytes [Liu et al., 2001] traités par l’IFNβ.

Cependant, pour l’IL-6 et le TNFα, les résultats varient en fonction du type cellulaire étudié

[Lande et al., 2008 ; Kawanokuchi et al., 2003]. Par ailleurs, les lymphocytes mis en présence

d’IFNβ, ou d’APCs pré-traitées par l’IFNβ, voient leur sécrétion cytokinique modifiée. Il fut

observé, par Liu et al., une augmentation de la sécrétion de l’IL-10, in vitro mais aussi ex vivo

chez des patients SEP sous traitement [Liu et al., 2001]. Toutefois Lande et al. démontrèrent

l’inverse [Lande et al., 2008]. Pour ce qui est de l’effet de l’IFNβ sur la polarisation Th1/Th2 des

lymphocytes T, là encore, les résultats obtenus par différentes équipes semblent se contredire.

Si certains montrèrent que l’IFNβ avait un effet pro-Th2 [Luca et al., 1999] ou encore anti-Th1

[Kawanokuchi et al., 2003], d’autres ne détectèrent aucun biais dans la polarisation lymphocytaire

[Lande et al., 2008].

En conclusion, l’IFNβ est capable de modifier l’activation et la sécrétion cytokinique

des APCs mais aussi des lymphocytes. Cependant, la forte divergence des résultats obtenus

par les travaux menés dans ce domaine peut s’expliquer par la diversité des protocoles mis en

place, mais aussi par l’utilisation de différents types cellulaires.

3.2.3. Effet de l’IFNββββ sur l’apoptose des cellules immunes

La pathogénie de la SEP pourrait s’expliquer par un échec du programme de mort, ou

apoptose, permettant d’éliminer les cellules potentiellement pathogéniques. En effet, les

lymphocytes T des patients SEP expriment plus fortement des inhibiteurs d’apoptose, tels que

IAP-1, IPA-2 et XIAP, comparé à des lymphocytes T de personnes témoins, ou souffrant

d’autres maladies neurologiques inflammatoires [Sharief et al., 2001a]. Par ailleurs, il fut prouvé

que la forte expression de ces inhibiteurs s’accompagnait d’une plus grande résistance à

l’apoptose. Un des mécanismes d’action de l’IFNβ dans le traitement de la SEP pourrait

Introduction

111

passer par une induction d’apoptose cellulaire. En effet, une équipe a mis en évidence que les

IFNs de type 1 étaient capables de modifier l’expression de gènes impliqués dans l’apoptose

[Chawla-Sarkar et al., 2003]. De plus, Sharief et al. démontrèrent que l’ajout d’IFNβ dans le

milieu de culture augmentait l’apoptose des lymphocytes T [Sharief et al., 2001b]. Cette

augmentation de l’apoptose corrélait avec une diminution de l’expression de la protéine anti-

apoptotique FLIP et avec l’induction de l’expression de la caspase-8. Par ailleurs,

l’importance des lymphocytes Th17 a été démontrée dans la pathogénie de l’EAE. De façon

interessante, chez l’Homme, les périodes actives de la maladie s’accompagnent d’une

augmentation du nombre de lymphocytes Th17 dans le sang [Durelli et al., 2009]. Durelli et al.

démontrèrent en outre que l’IFNβ réduisait le nombre de lymphocytes Th17 circulant dans le

sang, et que ces cellules présentaient in vitro une forte susceptibilité à l’apoptose induite par

l’IFN β. Une autre étude suggéra que les propriétés thérapeutiques de l’IFNβ passait par

l’induction de l’apoptose des cellules dendritiques matures via l’expression des caspases 3 et

11 [Yen et al., 2009]. Par ailleurs, les patients sous traitement IFNβ présentaient une forte

apoptose des cellules immunitaires périphériques [Gniadek et al., 2003]. Etrangement, cette

apoptose s’accompagnait d’une augmentation permanente de l’expression de la protéine anti-

apoptotique Bcl-2 et d’une augmentation transitoire de l’expression de la protéine anti-

apoptotique Bag-1. Les auteurs suggèrent que cette augmentation pourrait être un mécanisme

compensatoire de l’induction de l’apoptose induite par l’IFNβ. Ainsi, un des mécanismes

bénéfiques du traitement par l’IFNβ passerait par l’induction de la mort des cellules

pathogéniques, mais aussi des cellules dendritiques indispensables à la réactivation des

lymphocytes T au niveau du SNC [Miller et al., 2007].

Introduction

112

113

MM AATTEERRII EELL SS EETT

MM EETTHHOODDEESS

Matériels et méthodes

114

Matériels et méthodes

115

Cohortes de patients

Les patients SEP et les individus composant les familles trio françaises d’origine

caucasienne, composées d’un patient SEP et de ses deux parents (avec au moins 4 générations

précédentes d’origine européenne caucasienne), ont été recrutés lors d’une campagne

nationale. Le diagnostic de SEP est posé suivant les critères de Goodkin et al. [Goodkin et al.,

1991] et de Poser et al. [Poser et al.,1983]. Les individus témoins sont des donneurs de sang sains

ou des étudiants en médecine. Les jumelles saines ont été recrutées suite à un appel national à

la participation. Tous les sujets ont fourni leur consentement éclairé et le Comité Consultatif

de Protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale de Paris-Pitié-Salpêtriere a

approuvé l’étude.

Définition du statut de réponse au traitement de la SEP par l’IFNββββ

Les patients inclus dans la cohorte d’étude de la réponse au traitement de la SEP par

l’IFNβ présentent uniquement la forme RR-MS de la maladie. Le statut de réponse des

patients a été défini en utilisant les critères suivants :

(1) Patient répondeur : pas de poussée ni de progression du handicap suivant l’échelle

EDSS pendant les 2 ans après la mise en place du traitement.

(2) Patient non-répondeur : 2 poussées ou plus et/ou une progression du handicap d’au

moins 1 point sur l’échelle EDSS pendant les 2 ans après la mise en place du traitement.

(3) Patient intermédiaire : patient dont les poussées ou l’évolution du handicap se situe

entre les deux classes précédantes.

Les patients intermédiaires sont retirés de la cohorte afin de diminuer les risques de mauvaise

classification. Cela permet de ne conserver que les groupes extrêmes de réponse.

Extraction des ADNs/ARNs

L’ADN est extrait sur du sang frais prélevé en tubes EDTA à l’aide du QIamp DNA

Blood Maxi Kit (Qiagen®). Cette extraction est réalisée suivant les instructions préconisées

par le fabricant. Les ADNs extraits sont conservés à -20°C jusqu’à utilisation.

L’ARN est extrait sur du sang frais prélevé en tubes EDTA à l’aide du QIamp RNA

Blood Mini Kit (Qiagen®). L’extraction est réalisée suivant les instructions préconisées par le

fabricant. Comme suggéré dans le kit, la digestion de l’ADN génomique à la DNaseI

(Qiagen®) est systématiquement réalisée. Les ARNs extraits sont conservés à -80°C jusqu’à

utilisation.

Matériels et méthodes

116

L’ARN des lymphocytes amplifiés est extrait à l’aide du RNeasy Mini Kit (Qiagen®).

L’extraction est réalisée suivant les instructions préconisées par le fabricant, comprenant

l’étape additionnelle de digestion de l’ADN génomique à la DNaseI (Qiagen®). Les ARNs

extraits sont conservés à -80°C jusqu’à utilisation.

La concentration en ADN ou ARN extrait est évaluée par lecture de la DO260nm par

spectrophotomètrie.

Reverse transcription et quantification de l’expression par PCR

quantitative en Sybr Green

Les ARNs totaux sont reverse transcrits en ADNc en utilisant le kit RT SuperScript III

(Invitrogen®). L’hybridation est réalisée dans un volume de 10 µl contenant 1 µg d’ARNs

totaux, 1 µl de dNTPs (0,1 M), 1 µl d’hexamères oligonucléotidiques aléatoires (50 ng/µl), et

de l’eau complétant le volume à 10 µl. La réaction s’effectue à 65°C durant 5 min avant d’être

arrêtée sur glace. Sont ensuite ajoutés 10 µl d’une solution de synthèse d’ADNc (2 µl de RT

buffer 10X ; 4 µl MgCl2 25 mM ; 2 µl DTT 0,1 M ; 1 µl Rnase OUT 4U/µl ; 1 µl SuperScript

III RT 20U/µl). Afin d’assurer la polymérisation des brins d’ADNc, le mélange est incubé 10

min à 25°C, 50 min à 50°C, et 5 min à 85°C. Pour augmenter la sensibilité des PCR, une

étape de digestion des produits de RT à la RNase H (2U) est réalisée à 37°C durant 20 min.

Les solutions d’ADNc sont conservées à -20°C.

Le niveau d’expression des gènes est déterminé par PCR quantitative en temps réel à

l’aide du système de détection ABI PRISM 7000 Sequence detection system (Applied

Biosystems®). Tous les oligonucléotides, synthétisés chez Invitrogen®, localisent dans deux

exons différents (quand c’est possible) et sont ainsi spécifiques des ARNm. Les

oligonucléotides utilisés dans les études sont listés dans le tableau ci-dessous. 1,2 µl de la

réaction de RT sont mélangés avec une solution comprenant des concentrations finales de 1X

du réactif SYBR Green (Eurogentec®), 300 nM de primer sens (100 nM pour GAPDH), 300

nM de primer antisens (100 nM pour GAPDH) et de l’eau dans un volume final de 25 µl. Les

conditions de PCR sont les suivantes : 2 min à 50°C, 10 min à 95°C, suivies de 40 cycles de

15 s à 95°C et de 1 min à 60°C. Pour chaque gène étudié, les amplifications sont réalisées en

duplicat pour chacun des échantillons.

Matériels et méthodes

117

Gène amplifié Primers oligonucléotidiques sens Primers oligonucléotidiques antisens

GATA3 5’-CAGACCACCACAACCACAC-3’ 5’-TGCCTTCCTTCTTCATAGTCAG-3’

GAPDH 5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’ 5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’

IRF1 5’-CAAATCCCGGGGCTCAATCTGG-3’ 5’-CTGGCTCCTTTTCCCCTGCTTTGT-3’

MxA 5’-TTCAGCACCTGATGGCCTATC-3’ 5’-GTACGTCTGGAGCATGAAGAACTG-3’

MxB 5’-GCGTACTCATTCATTCTAAGG-3’ 5’-GCATGCTCTGATGCTGAGG-3’

OAS1 5’-TGCGCTCAGCTTCGTACTGA-3’ 5’-GGTGGAGAACTCGCCCTCTT-3’

OAS2 5’-GCTTTGATGTGCTTCCTGCCTT-3’ 5’-ACCCCTTTGGCTTCAGTTTCCTT-3’

OASL 5'-GGACCGTGGAGGAGTTTCTG-3' 5'-GAGCCCACCTTGACTACCTTC-3'

RORγt 5’-TGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3’ 5’-CCACAGATTTTGCAAGGGATCA-3’

SOCS3 5’-TGATCCGCGACAGCTCG-3’ 5’-TCCCAGACTGGGTCTTGACG-3’

T-bet 5’-CAGAATGCCGAGATTACTCAG-3’ 5’-GGTTGGGTAGGAGAGGAGAG-3’

Les données de PCR quantitative en temps réel sont représentées sous forme de

valeurs de Ct, où la valeur de Ct est définie comme le cycle de PCR seuil pour lequel le

produit amplifié est pour la première fois détecté. L’amplification de l’ARNm de la GAPDH

sert de contrôle interne. ∆Ct est la différence pour un même échantillon entre la valeur de Ct

du gène testé et la valeur de Ct de la GAPDH. ∆∆Ct représente la différence entre le ∆Ct de

l’échantillon à tester et le ∆Ct moyen de tous les échantillons. Le différentiel d’expression de

N fois pour l’échantillon étudié comparé à la moyenne de tous les échantillons est exprimé par

2-∆∆Ct.

Reverse transcription et quantification de l’expression par PCRarray

Les ARNs totaux sont reverse transcrits en ADNc en utilisant le kit de RT Reaction

Ready First Strand cDNA synthesis (SuperArray®). L’hybridation est réalisée avec 1 µg

d’ARNs totaux, 1 µl de tampon P2, et de l’eau complétant le volume à 10 µl. La réaction

s’effectue à 70°C durant 3 min avant d’être arrêtée sur glace. Sont ensuite ajoutés 10 µl d’une

solution de synthèse d’ADNc (4 µl de RT buffer 5X ; 4 µl d’eau ; 1 µl d’inhibiteur de RNase ;

1 µl d’enzyme de RT G38). Le mélange est incubé 1 h à 37°C puis 5 minutes à 95°C afin

Matériels et méthodes

118

d’assurer la polymérisation des brins d’ADNc. La solution d’ADNc est diluée dans 80 µl

d’eau avant d’être conservée à -20°C.

Le niveau d’expression des gènes étudiés est déterminé par plaque PCRarray

(SuperArray®) à l’aide du système de détection ABI PRISM 7000 Sequence detection system

(Applied Biosystems®). Une plaque de PCRarray permet de quantifier, simultanément par

PCR quantitative, l’expression de 96 gènes chez un même individu. La liste des gènes

amplifiés et la localisation des primers sur la plaque sont détaillées dans le chapitre

« Annexes » (Figure S1). 98 µl de la réaction de RT diluée sont mélangés avec une solution

comprenant 1225 µl de réactif MasterMix SYBR Green 2X (SuperArray®) et 1127 µl d’eau.

25 µl de ce mélange sont disposés dans l’ensemble des puits de la plaque de PCRarray,

excepté le puits H9 servant de contrôle de digestion dans lequel est placé 1 µl d’ARN initial

avec 12,5 µl SYBR Green 2X (SuperArray®) et 11,5 µl d’eau. Les conditions de PCR sont les

suivantes : 10 min à 95°C, suivies de 40 cycles de 15 s à 95°C et de 1 min à 60°C. Les

produits de transcription des gènes de la GAPDH, de la HPRT1 et de la RPL13A, considérés

comme « gène de ménage », sont amplifiés dans le but de normaliser les échantillons. Les

données de PCR quantitative en temps réel sont interprétées comme précédemment décrit.

Génotypage des polymorphismes par PCR TaqMan

L’ensemble des expériences de génotypages des polymorphismes par PCR TaqMan

ont été effectuées au sein de la plateforme Génopole (INRA, Toulouse). Les échantillons

d’ADNs, dilués à une concentration de 10 ng/µl, sont répartis sur des plaques 384 puits par un

robot pipeteur (Tecan®). A ces ADNs sont ajoutés 4 µl du mix pour PCR TaqMan composé

du Genotyping TaqMan MasterMix 1X (Applied Biosystems®) et des sondes TaqMan

spécifiques du polymorphisme étudié 1X (Applied Biosystems®). Chaque sonde spécifique

d’un allèle est couplée soit au fluorochrome FAM, soit au fluorochrome VIC. La réaction de

PCR est réalisée à l’aide d’un Thermocycleur 384 puits (Applied Biosystems®) dans les

conditions suivantes : 10 min à 95°C, suivies de 40 cycles de 15 s à 92°C et de 1 min à 60°C.

La lecture de la fluorescence FAM et VIC est réalisée en « lecture en point final » sur un ABI

Prism 7900 Sequence detection system (Applied Biosystems®) et les données analysées à

l’aide du logiciel SDS 2.2.2 (Applied Biosystems®).

Matériels et méthodes

119

Amplification des lymphocytes isolés du sang périphérique

Les cellules mononucléées humaines du sang périphérique ont été isolées à partir de

sang frais de donneurs en utilisant un gradient de FICOLL (Gibco®) selon les instructions

données par le fabricant. Les cellules isolées sont conservées dans du SVF (Invitrogen®)

contenant 10% de DMSO (Gibco®) et placées dans de l’azote liquide jusqu’à utilisation.

Les cellules sont rapidement décongelées et lavées, avant d’être mises en culture à

37°C et 5% de CO2, sur plaque 48 puits à une concentration de 106 cellules/ml dans 1 ml de

milieu complet (milieu RPMI 1640 (Gibco®) avec 10% de SVF (Biowest®), 2 mM de L-

glutamine (Gibco®) et 10 U/ml de pénycilline/streptomycine (Gibco®)). 75 µl de Dynabeads

CD3/CD28 T Cell Expander (Invitrogen®) sont ajoutés aux cellules pendant 3 jours. Puis au

3ème jour, de l’IL-2 recombinante humaine (AbCys®) est ajoutée à une concentration finale de

50 U/ml. Au 4ème jour, les cellules sont récupérées puis diluées à une concentration de

500 000 cellules/ml dans du milieu complet contenant de l’IL-2 recombinante humaine à une

concentration de 50 U/ml. Les cellules sont amplifiées entre 15 et 20 jours, en étant

régulièrement passées, jusqu’à leur utilisation pour des analyses fonctionnelles.

Quantification des protéines par Western-Blot

Les cellules sont lysées sur la glace dans du tampon de lyse (3,5 ml de tampon de lyse

2X ; 350 µl de NaF 1 M ; 70 µl de Na4VO4 100 mM ; 7 µl de DTT 1 M ; 3 ml d’eau ; 1

tablette mini d’inhibiteur de protéases (Roche®)). Le lysat cellulaire est laissé en agitation à

4°C pendant 20 min, puis centrifugé à 20 000 g pendant 20 min à 4°C. Le surnageant

contenant les protéines est conservé à -80°C jusqu’à utilisation.

50 µg d’extraits protéiques (quantifié par la méthode de BradFord) bouillis sont

séparés par électophorèse sur des gels 10% Bis-Tris Nu-PAGE (Invitrogen®) dans du tampon

de migration, puis transférés sur des membranes de nitrocellulose (Amersham Biosciences®).

Après saturation des membranes (tampon TBS-T contenant 5% de lait) pendant 1 h à

température ambiante, les membranes sont incubées sur la nuit, à 4°C, avec les anticorps

primaires (voir tableau ci-dessous). Les membranes sont ensuite lavées à plusieurs reprises

dans du tampon TBS-T, puis incubées pendant 1 h, à température ambiante dans l’obscurité,

avec les anticorps secondaires couplés à un fluorochrome : IRDye 680 IgG de mouton anti-

souris (Li-Cor Biosciences®) et IRDye 800CW IgG de mouton anti-lapin (Li-Cor

Bioscience®). L’acquisition de l’image la membrane et l’analyse quantitative sont réalisées en

utilisant le système Odyssey (Li-Cor Biosciences®). La quantification des protéines

Matériels et méthodes

120

phosphorylées est effectuée en mesurant l’intensité de fluorescence de la bande correspondant

à la proteine phosphorylée normalisée sur l’expression de l’actine β. En parallèle, sur une

autre membrane, la quantité totale de la protéine est déterminée par une approche similaire.

Protéine humaine détectée Dilution Produit chez Référence

anti-TYK2 1/500 souris #61073 (BD Biosciences®)

anti-P-TYK2 1/500 lapin #9321 (Cell Signaling®)

anti-STAT1 1/1000 lapin #9172 (Cell Signaling®)

anti-P-STAT1 1/1000 lapin #9171 (Cell Signaling®)

anti-STAT2 1/1000 lapin #4594 (Cell Signaling®)

anti-P-STAT2 1/1000 lapin #4441 (Cell Signaling®)

anti-actine β 1/1000 souris #612656 (BD Biosciences®)

Quantification de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine

tritiée et mesure de la sécrétion de cytokines par approche Luminex®

100 000 lymphocytes amplifiés sont mis en culture pendant 3 jours à 37°C avec 5% de

CO2 dans des plaques de 96 puits contenant 200 µl de milieu complet (milieu RPMI 1640

(Gibco®) avec 10% de SVF (Biowest®), 2 mM de L-glutamine (Gibco®) et 10 U/ml de

pénycilline/streptomycine (Gibco®)) et de l’IL-2 à une concentration finale de 50 U/ml. De la

[3H]thymidine (1 µCi/puit) est ensuite ajoutée pendant 1 jour. Après lyse des cellules et

plusieurs lavages, la radioactivité incorporée par les cellules est comptée. L’expérience est

réalisée en duplicat pour chacun des échantillons. Au nombre de coups comptés pour chaque

échantillon est retranché le bruit de fond (expérience réalisée avec du mileu de culture sans

cellule).

Avant l’ajout de la thymidine tritiée, 100 µl du surnageant cellulaire sont récupérés

afin de quantifier la sécrétion des cytokines suivantes : IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13,

IL-15, IL-17, IFNγ, IP-10 et TNFα. Les cytokines sont quantifiées à l’aide de la technique

Luminex® (Millipore®) par le service de phénotypage de la plateforme Anexplo de Toulouse.

Cette technique permet de mesurer des cytokines dans une gamme de concentration

s’étendant de 3,2 pg/ml à 10 ng/ml.

Matériels et méthodes

121

Mesure des cytokines intracellulaires par cytométrie en flux

Pour chaque individu, 1 million de lymphocytes amplifiés sont cultivés, pendant 4 h à

37°C, dans des plaques de 24 puits dans 400 µl de milieu composé de 200 µl de milieu

complet (milieu RPMI 1640 (Gibco®) avec 10% de SVF (Biowest®), 2 mM de L-glutamine

(Gibco®) et 10 U/ml de pénycilline/streptomycine (Gibco®)) et de 200 µl de milieu de

stimulation (milieu complet contenant 10/00 de GolgiSTOP (BD Biosciences®), 20/00

ionomycine (Sigma®) et 10/00 de PMA (Sigma®)). Après cette stimulation, les cellules sont

lavées au tampon FACS (PBS 1 X, 1% de BSA, 0,2 g/l d’azide de sodium) avant que les

récepteurs Fc ne soient saturés au Fc Block (BD Biosciences®). Les cellules sont de nouveau

lavées au tampon FACS avant de marquer le marqueur de surface CD8 à l’aide d’un anticorps

anti-CD8 couplé au Pacific Blue (BD Biosciences®) dilué au 1/50, pendant 20 min à 4°C dans

l’obscurité. Les cellules sont ensuite lavées et perméabilisées au cytofix/cytoperm (BD

Biosciences®) pendant 20 min à 4°C avant d’être lavées au Perm/Wash (BD Biosciences®).

L’IL-4 intracellulaire est marquée à l’aide d’un anticorps anti-IL-4 couplé PE (BD

Biosciences®) qui est mis à incubé 30 min à température ambiante dans l’obscurité. Après

marquage, les cellules sont lavées au Perm/Wash puis reprises dans du tampon FACS à 4°C

jusqu’à analyse. Les cellules sont passées en cytométrie en flux sur un LSRII (BD

Biosciences®) qui est localisé au sein de la plateforme de cytométrie de l’INSERM U563. Les

résultats sont analysés à l’aide du logiciel Diva (BD Biosciences®).

Mesure du profil du XCI

600 ng d’ADNs génomiques sont mis en présence de l’enzyme de digestion HhaI

(New England BioLabs®), ou du tampon seul, pendant 22h à 37°C. La digestion est réalisée

dans un volume final de 50µl. L’enzyme HhaI est inactivée à 65°C pendant 20 min. 2 µl de la

réaction de digestion sont mélangés à une solution de concentration finale de 1X de tampon

pour Taq polymérase sans MgCl2, 200 µM de dNTP, 800 nM d’oligonucléotide sens marqués

au fluorochrome FAM en 5’ (5’-FAM-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3’), 800 nM

d’oligonucléotide antisens (5’-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3’), 2U de Taq

polymérase (New England BioLabs®) et de l’eau complétant le volume final à 20 µL.

L’amplification est réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Eppendorf®) dans les

conditions suivantes : 94°C durant 15 min, suivi de 35 cycles de 20 s à 94°C, 30 s à 57°C et 1

min à 72°C avant de terminer par 3 min à 72°C. Les oligonucléotides sont spécifiques du gène

codant pour le récepteur aux androgènes. Le produit de réaction PCR est dilué au 1/10e dans

Matériels et méthodes

122

de l’eau puis 2,5 µl de cette dilution sont ajoutés à 10,5 µl de Formamide/GeneScan 500

(Applied Biosystems®). Le produit final est ensuite dénaturé pendant à 96°C pendant 3 min.

Les échantillons sont confiés à la plateforme de Génotypage et de Séquençage (CNRS,

Purpan) pour une migration sur micro-capillaires à l’aide du séquenceur ABI 3100 (Applied

Biosystems®).

La taille et l’intensité des amplicons de PCR sont analysées à l’aide du logiciel

GeneScan (Applied Biosystems®). La mesure du profil du XCI est obtenu par la formule

suivante : biais du XCI = [RN / (RN + 1)] X 100. Avec RN = RH / RM, pour lequel R(H ou N )

correspond au ratio de l’intensité de l’amplicon de grande taille / l’intensité de l’amplicon de

petite taille (RH réaction en présence de HhaI et RM réaction en présence du tampon de

digestion seul).

Le profil du XCI est calculé sur une moyenne de 3 expériences. Par ailleurs, un témoin

positif de digestion (ADN isolé à partir d’un homme) permet de contrôler la digestion totale

du chromosome X actif.

Détermination génétique de la zygotie

50 ng d’ADN sont mélangés à une solution de concentration finale de 1X de tampon

pour Taq polymérase avec MgCl2 (2 mM), 200 µM de dNTP, 250 nM d’oligonucléotide sens

marqué au fluorochrome FAM ou HEX en 5’, 250 nM d’oligonucléotide anti-sens, 1U de Taq

polymérase (New England BioLabs®) et de l’eau complétant le volume final à 20 µl.

L’amplification est réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Eppendorf®), dans les

conditions suivantes : 94°C durant 2 min, suivi de 35 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à (1) 55°C,

ou (2) 57°C, ou (3) 59°C et 30 s à 72°C avant de terminer par 5 min à 72°C.

Localisation chromosomique

Identification du microsatellite

Fluorochrome en 5’ Protocole PCR utilisé

Chr. 6 D6S1564 HEX 3

Chr. 6 D6S300 FAM 3

Chr. 7 D7S2496 HEX 1

Chr. 11 D11S1886 HEX 3

Chr. 11 D11S4108 FAM 3

Chr. 17 D17S802 HEX 3

Chr. 17 D17S1839 HEX 2

Chr. X DXS1003 FAM 3

Matériels et méthodes

123

400 ng d’ADN sont mélangés à une solution de concentration finale de 1X de tampon

pour Taq polymérase avec MgCl2 (2 mM), 200 µM de dNTP, 1 µl de la solution de primers

Linkage Mapping (Applied Biosystems®) 0,6U de Taq polymérase (New England BioLabs®)

et de l’eau complétant le volume final à 15 µl. L’amplification est réalisée dans un

thermocycleur (Mastercycler Eppendorf®), dans les conditions suivantes : 94°C durant 2 min,

suivi de 30 cycles de 15 s à 94°C, 15 s à 55°C et 30 s à 72°C avant de terminer par 5 min à

72°C.

Localisation chromosomique

Identification du microsatellite

Fluorochrome en 5’ Protocole PCR utilisé

Chr. 1 D1S450 FAM Linkage

Chr. 2 D2S140 FAM Linkage

Chr. 3 D3S1569 FAM Linkage

Chr. 14 D14S972 FAM Linkage

2,5 µl de ce produit de réaction PCR sont ajoutés à 10,5 µl de Formamide/GeneScan 500

(Applied Biosystems®) et dénaturé à 96°C pendant 3 min. Les échantillons sont confiés à la

plateforme de Génotypage et de Séquençage (CNRS, Purpan) pour une migration sur micro-

capillaires à l’aide du séquenceur ABI 3100 (Applied Biosystems®). La taille des amplicons

de PCR est analysée à l’aide du logiciel GeneScan (Applied Biosystems®) ce qui permet de

déterminer la zygotie d’une paire de jumelles par la présence de différences dans la taille des

microsatellites.

Mesure du pourcentage de monosomie

Les cellules mononuclées du sang sont mises en culture, à 37°C avec 5% de CO2, à

une concentration de 300 000 cellules/ml dans du milieu complet (milieu RPMI 1640

(Gibco®) avec 20% de sérum AB humain (Biowest®), 2 mM de L-glutamine (Gibco®) et 10

U/ml de pénycilline/streptomycine (Gibco®)). Afin de synchroniser les cellules, du FrDU (5

Fluoro 2’ DéoxyUridine ; Sigma®) à 10-7 M, de l’Uridine (Sigma®) à 4x10-6 M et de la PHA

(Phytohémagglutinine ; Sigma®) à 1 µg/ml sont ajoutés pendant 17 h. Après ces 17 h, de la

thymidine (Sigma®) est ajoutée à 10-5 M pendant 30 h. Enfin, de la colcémide (Roche

Diagnostics®) est ajoutée pendant 10 min à une concentration de 60 ng/ml. Les cellules sont

alors récupérées, culottées par centrifugation et soumises à un choc hypotonique de 18 min à

Matériels et méthodes

124

37°C par ajout d’une solution de KCl à 0,75 M. Après centrifugation, le culot cellulaire est

fixé dans une solution contenant 2 volumes d’acide acétique 100% (Sigma®) pour 3 volumes

de méthanol (Sigma®). Les cellules fixées sont conservées à 4°C jusqu’au marquage.

Une goute de la suspension de cellules fixées est étalée sur une lame de verre. Les

cellules sont ensuite progressivement déshydratées par des bains d’éthanol de concentrations

croissantes (70%, 80%, 90% et 100%). Puis, après ajout de 5 µl des sondes Poséidon

fluorescentes spécifiques soit du chromosome X, soit du chromosome Y (Kreatech

Diagnostics®), la lame est placée à 75°C pendant 5 min pour dénaturation. L’hybridation

s’effectue sur la lame couverte d’une lamelle placée à 37°C en chambre humide durant toute

une nuit. Enfin, la lame est lavée par deux bains successifs de 0,4X SSC / 0,3% Igepal (3 min

à 72°C, Kreatech Diagnostics®) puis de 2X SSC / 0,1% Igepal (3 min à 72°C, Kreatech

Diagnostics®) avant que les noyaux cellulaires ne soient marqués au DAPI. La lame

recouverte d’une lamelle est conservée à 4°C à l’abri de la lumière.

Les lamelles sont lues sur la plateforme d’imagerie de l’INSERM U563 à l’aide d’un

microscope à champ large. Les images prises sont ensuite analysées à l’aide du logiciel Image

J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Une moyenne de 750 noyaux sont analysés pour chaque individu.

Le pourcentage de monosomie pour le chromosome X correspond au nombre de noyaux ne

possédant qu’un seul chromosome X sur le nombre total de noyaux analysés multiplié par

cent. Une monosomie du chromosome X est constatée en l’absence d’un chromosome Y.

Analyse statistique des résultats

Les analyses statistiques sont réalisées à l’aide du logiciel d’analyse Graphpad Prism

v5 (www.graphpad.com). Pour les groupes dont les effectifs sont inférieurs à 20 échantillons,

un Mann-Whitney test est appliqué, ou un Wilcoxon matched pairs test en cas d’appariement

des groupes. Pour les groupes supérieurs à 20 échantillons, présentant une distribution

normale et des variances non significativement différentes, un t test est appliqué. La

classification des échantillons en fonction de leur expression d’ARNm et la représentation en

Heatmap a été faite à l’aide du logiciel d’analyse R (http://cran.r-project.org/). Les analyses

d’association génétiques et les tests TDT sont réalisés à l’aide du logiciel d’analyse

Haploview v4.1 (www.broad.mit.edu/mpg/haploview).

125

RREESSUULL TTAATTSS

Résultats

126

Résultats

127

FFAACCTTEEUURRSS GGEENNEETTII QQUUEESS EETT

SSUUSSCCEEPPTTII BBII LL II TTEE AA LL AA SSEEPP

Résultats

128

Résultats

129

I. Etude de l’effet d’un polymorphisme de TYK2, associé à la

susceptibilité à la SEP, sur la voie de signalisation de l’IFNββββ et sur

la polarisation lymphocytaire.

I.1. Objectifs

Le premier objectif de cette étude était de confirmer les résultats génétiques obtenus

par les travaux de Ban et al. sur l’association de TYK2 avec la susceptibilité à la SEP [Ban et

al., 2009]. Pour cette investigation, une population indépendante, d’origine française, composée

de cas-témoins SEP et de familles trio fut réunie.

Par ailleurs, une analyse fonctionnelle fut accomplie afin de comprendre les

conséquences fonctionnelles que le polymorphisme rs34536443 pouvait avoir. Dans ce but,

des cellules du sang périphérique furent isolées de patients SEP dont le génotype était connu

pour le polymorphisme rs34536443. Afin de disposer d’assez de matériel pour les différentes

approches analytiques, la population lymphocytaire fut amplifiée (cf chapitre « Matériels et

Méthodes »). Tout d’abord, il fut étudié si le polymorphisme rs34536443 pouvait modifier

l’intensité d’activation de la voie de signalisation des IFNs de type 1 lors d’une stimulation

par l’IFNβ. Cette activation fut quantifiée, à plusieurs étapes de la cascade de signalisation,

par différentes approches analytiques (RT-PCR et Western-blot). En outre, de nombreux

travaux ont montré une implication de TYK2 dans la balance lymphocytaire Th1/Th2

[Ghoreschi et al., 2009]. Une déficience de la protéine TYK2 conduit à un défaut de

différenciation des lymphocytes Th1 alors que la polarisation en Th2 est augmentée. Afin

déterminer si le polymorphisme rs34536443 influençait la polarisation du système

immunitaire, l’expression des facteurs de transcription T-bet [Szabo et al., 2000], GATA3 [Zheng

et al., 1997] et RORγt [Ivanov et al., 2006], respectivement spécifiques des lignées lymphocytaires

Th1, Th2 et Th17, fut évalué par RT-PCR quantitative sur des lymphocytes T amplifiés dans

des conditions « neutres » (non pro-Th1, non pro-Th2, et non pro-Th17). Par ailleurs, les

cytokines produites et sécrétées furent analysées par plusieurs approches.

Résultats

130

I.2. Résultats

I.2.1. TYK2 est associé à la suceptibilité à la SEP dans la population française.

Dans un effort de répliquer l’association de TYK2 avec la SEP, nous avons génotypé

une cohorte française de cas-témoins SEP pour le polymorphisme rs34536443. L’association

de l’allèle G du polymorphisme rs34536443 de TYK2 fut évaluée par une approche classique

pour une étude en cas-témoins. Il fut confirmé un enrichissement significatif de l’allèle G

chez les patients SEP comparé aux témoins (97% chez les patients SEP contre 95% chez les

témoins ; P = 0,003 ; Tableau II). Dans notre étude, le risque relatif obtenu pour l’allèle G est

un peu plus élevé que celui des études précédentes : RR = 1,92 (1,24-2,97). La faible taille de

la cohorte disponible pour cette étude pourrait certainement en être la cause. Par ailleurs, une

analyse en TDT fut pratiquée sur 640 familles trio SEP françaises. Cette analyse démontra

une sur-transmission de l’allèle G aux enfants souffrant de SEP (P = 0,013 ; Tableau III ).

L’ensemble de ces résultats confirment les conclusions de l’étude de Ban et al., associant le

gène TYK2 avec la susceptibilité à la SEP. L’allèle majoritaire G du polymorphisme

rs34536443 de TYK2 est donc un allèle de susceptibilité à la SEP alors que l’allèle

minoritaire C est associé à une protection contre cette maladie.

Tableau II : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP par une approche

en cas-témoins.

N No d’

allèles G Freq de

l’allèle G No d’

allèles C Freq de

l’allèle C RR (95% c.i.) χ2 P

Cas 703 1370 0,97 36 0,03 1,92 (1,24-2,97) 8,7 0,003

Témoins 511 973 0,95 49 0,05

N, nombre d’individus. « No d’allèles » fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR,

risque relatif. c.i., intervalle de confiance.

Tableau III : Analyse TDT du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP sur 640 familles trio

françaises.

Marqueur Allèle Fréquencea Tb Ub T/Ub P

rs34536443 G 0,967 54 34 1,59 0,013

aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U).

Résultats

131

I.2.2. Le polymorphisme rs34536443 conduisant au changement TYK2P1104A ne modifie par

l’expression de la protéine TYK2.

Le polymorphisme rs34536443 se localise dans l’exon 21 du gène codant pour TYK2.

Ce polymorphisme entraîne un changement d’acide aminé en position 1104 de la protéine.

Alors que l’allèle majoritaire G code pour une proline, l’allèle minoritaire C code pour une

alanine. Une des conséquences de la modification de la structure primaire de TYK2 pourrait

être d’affecter la stabilité de la protéine dans la cellule. Pour appréhender cela, nous avons

étudié l’expression de la protéine TYK2 dans deux groupes d’individus établis en fonction de

leur génotype pour le polymorphisme rs34536443. Ces deux groupes apparaîtront dans la

suite du travail sous la nomenclature suivante : TYK2GG et TYK2GC. Il fut pratiqué une

extraction protéique sur des lymphocytes amplifiés à partir de cellules mononucléées du sang

périphérique. Un western-blot permit de détecter la protéine TYK2 totale ainsi que l’actine β

(servant à la normalisation). Cette approche ne révéla pas de différence d’expression de la

protéine TYK2 entre les individus homozygotes pour l’allèle G et les individus hétérozygotes

(P = 0,91 ; Figure 37). Nous pouvons conclure des données obtenues que le changement

TYKP1104A ne modifie pas le niveau basal de la protéine TYK2 totale dans les lymphocytes, ce

qui suggère que ce polymorphisme n’affecte pas la stabilité de la protéine.

Figure 37 : Le polymorphisme rs34536443 ne modifie pas l’expression protéique de TYK2. (a) Les

protéines extraites de lymphocytes isolés d’individus TYK2GG et TYK2GC sont analysées en western-blot à l’aide

d’anticorps spécifiques de TYK2 et de l’actine β. (b) Quantification de la protéine TYK2 par western-blot.

Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 10 individus pour chacun des génotypes. L’expression relative

de TYK2 est calculée en normalisant sur l’expression de l’actine β. Le graphique est représentatif de deux

expériences indépendantes.

Résultats

132

I.2.3. Le polymorphisme TYK2P1104A influence le niveau d’activation de TYK2.

Le polymorphisme TYK2P1104A localise dans le domaine kinase de la protéine. Ce

domaine est à la fois important pour l’activation de la protéine via une auto- ou une trans-

phosphorylation de certains résidus (les tyrosines en position 1054 et 1055 de la protéine :

T1054 et T1055), mais aussi pour son activité kinase. Ainsi le polymorphisme rs34536443

pourrait avoir des conséquences sur l’état d’activation de TYK2 en présence d’une

stimulation par l’IFNβ. L’activation de TYK2 fut évaluée par western-blot en utilisant un

anticorps dirigé spécifiquement contre les T1054 et T1055 phosphorylées. Le niveau

d’activation de TYK2 fut exprimé par un ratio de l’expression relative de la forme

phosphorylée de TYK2 par rapport à l’expression relative de la protéine TYK2 totale. En

l’absence de stimulation par l’IFNβ, la protéine TYK2 n’était pas phosphorylée ce qui

confirma l’absence d’activation détectable de TYK2 dans des conditions basales. Après 15

minutes de stimulation par de l’IFNβ à 1 000 U/ml, une activation de TYK2 fut détectée dans

les deux groupes, quel que soit le génotype (Figure 38a). La quantification de la

phosphorylation de TYK2 démontra une activation plus importante de l’enzyme dans le

groupe TYK2GG par rapport au groupe TYK2GC (différence d’environ 2 fois ; P = 0,035 ;

Figure 38b). Ces résultats suggèrent que le polymorphisme rs34536443, en changeant la

séquence du domaine kinase de la protéine TYK2, modifierait l’état d’activation de la

protéine en présence d’une stimulation par l’IFNβ. L’allèle majoritaire G, codant pour une

proline en position 1104 et conférant une augmentation de la susceptibilité à la SEP, conduit à

une protéine TYK2 plus active que la forme codée par l’allèle minoritaire C possèdant une

alanine en position 1104.

Résultats

133

Figure 38 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de TYK2. (a) Détection spécifique

de phospho-TYK2 (P-TYK2) et de TYK2, par western-blot réalisé sur un extrait protéique de lymphocytes

amplifiés. Les cellules ont été stimulées par de l’IFNβ à 1 000 U/ml. L’absence de détection de P-TYK2 dans les

cellules avant stimulation suggère que TYK2 n’est pas activé en conditions basales. (b) Quantification du ratio

P-TYK2 / TYK2 total obtenu par western-blot. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 10 individus

pour le groupe TYK2GG et N = 9 pour le groupe TYK2GC. Les expressions relatives de TYK2 total et de P-TYK2

sont calculées en normalisant sur l’expression de l’actine β.

I.2.4. Le polymorphisme TYK2P1104A influence l’état d’activation de la voie de signalisation

de l’IFNβ.

La protéine kinase TYK2, associée au récepteur à l’IFNβ, intervient dans la

phosphorylation des protéines STAT1 et STAT2. Cette phosphorylation est indispensable à

l’hétérodimérisation de STAT1-STAT2, un complexe important dans la transmission du

signal de la voie de l’IFNβ. Ainsi, pour étudier l’effet du polymorphisme rs34536443 sur

l’activité kinase de TYK2, il fut évalué le niveau de phosphorylation de STAT1 (sur la

tyrosine en position 701) et STAT2 (sur la tyrosine en position 690), deux cibles directes de

TYK2. Le niveau de phosphorylation des STATs est exprimé en ratio de l’expression relative

de la forme phosphorylée de STAT par rapport à l’expression relative de la protéine STAT

totale. En l’absence de stimulation des cellules par l’IFNβ, ni STAT1 (Figure 39a), ni STAT2

(Figure 39c) ne furent retrouvés phosphorylés, indiquant l’absence d’activation de la voie de

signalisation de l’IFNβ en conditions basales. Par contre, après 15 minutes de stimulation par

de l’IFNβ à 1 000 U/ml, une phosphorylation de STAT1 et de STAT2 fut détectée dans les

deux groupes TYK2GG et TYK2GC (Figure 39a et 39c). Bien que cette différence ne soit pas

significative, il fut trouvé une tendance à une plus importante phosphorylation de STAT1

(différence d’environ 1,3 ; P = 0,60 ; Figure 39b) et de STAT2 (différence d’environ 2,2 ; P =

0,06 ; Figure 39d) dans le groupe TYK2GG. Ce résultat tend à confirmer que l’allèle C

Résultats

134

coderait pour une forme hypo-active de la protéine TYK2 par rapport à l’allèle G. L’absence

de significativité dans la comparaison des deux groupes pour la phosphorylation des STATs

peut s’expliquer par l’état transitoire de la forme phosphorylée de ces protéines. Une cinétique

après stimulation par l’IFNβ permettrait de capter la période où la différence entre les deux

groupes est la plus importante.

Figure 39 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de la voie de signalisation de

l’IFN ββββ. (a, c) Détection par western-blot de phospho-STAT1 (P-STAT1) et de STAT1 (a) ou de phospho-

STAT2 (P-STAT2) et de STAT2 (b) réalisé sur un extrait protéique de lymphocytes amplifiés. Les cellules ont

été stimulées par de l’IFNβ à 1 000 U/ml. L’absence de détection de P-STAT1 et de P-STAT2 dans les cellules

avant stimulation suggère que la voie de l’IFNβ n’est pas activée en conditions basales. (b, d) Quantification des

ratios P-STAT1 / STAT1 (b) et P-STAT2 / STAT2 (d) obtenus par western-blot. Chaque barre représente la

moyenne ± s.e.m. N = 10 individus pour le groupe TYK2GG et N = 9 pour le groupe TYK2GC. Les expressions

relatives de STAT1, STAT2, P-STAT1 et P-STAT2 sont calculées en normalisant sur l’expression de l’actine β.

Pour confirmer l’effet du polymorphisme rs34536443 sur l’activité kinase de TYK2,

l’expression de plusieurs gènes induits par l’IFNβ (MxA, MxB, OAS1, IRF1 et SOCS3) fut

évaluée par RT-PCR quantitative. Chacun de ces gènes posséde dans son promoteur une

séquence IRSE intervenant dans l’activation de leur expression par l’IFNβ. Les sondes

oligomériques utilisées sont spécifiques de la séquence de l’ARN messager du gène. Comme

il existe une expression basale faible de chacun de ces gènes, les résultats sont présentés sous

Résultats

135

la forme d’un ratio de l’expression du gène après stimulation par l’IFNβ (2 heures à une

concentration de 1 000 U/ml) sur son expression avant stimulation. En accord avec

l’observation d’une signalisation augmentée dans le groupe TYK2GG par rapport au groupe

TYK2GC, tous les gènes régulés par l’IFNβ, testés par RT-PCR quantitative, démontrèrent une

expression plus importante dans le groupe TYK2GG (d’un facteur allant de 1,6 à 2,2 ; Figure

40).

L’ensemble des résultats obtenus indique que l’allèle C est associé à une hypo-

activation de la kinase TYK2, ce qui conduit à une hypo-activation de la voie de signalisation

de l’IFNβ (phosphorylation des STATs moins importante et diminution de l’expression des

gènes induits par l’IFNβ).

Figure 40 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des gènes induits par l’IFNββββ.

Quantification par RT-PCR quantitative de l’expression de MxA (a), de MxB (b), d’OAS1 (c), d’IRF1 (d) et de

SOCS3 (e) réalisée sur des lymphocytes amplifiés. L’expression relative correspond au ratio de l’expression du

gène après stimulation à l’IFNβ (2 heures à une concentration de 1 000 U/ml) sur son expression avant

stimulation. L’expression relative est calculée sur la moyenne de duplicats normalisés sur le gène de ménage

GAPDH. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour

le groupe TYK2GC.

Résultats

136

I.2.5. Le polymorphisme TYK2P1104A influence la polarisation des lymphocytes T

Des travaux ont démontré, chez l’animal et chez l’Homme, l’importance de la kinase

TYK2 dans la polarisation des lymphocytes T. Il a été aussi prouvé que l’absence de cette

protéine conduit à une différenciation pro-Th2 des cellules immunitaires (lymphocytes T et

cellules dendritiques). Afin de comprendre comment l’allèle C codant pour une kinase hypo-

active pouvait protéger de la SEP, nous nous sommes intéressés à l’influence que le

polymorphisme TYKP1104A pouvait avoir sur la composante lymphocytaire du système

immunitaire. Pour cela, les lymphocytes furent isolés à partir d’individus dont le génotype

pour le polymorphisme étudié était connu puis amplifiés dans des conditions neutres, c'est-à-

dire sans pousser les cellules dans une voie pro-Th1, pro-Th2 ou pro-Th17.

Puis nous avons évalué par RT-PCR quantitative, en fonction du génotype pour le

polymorphisme rs34536443, l’expression de trois facteurs de transcription nucléaires : T-bet,

GATA3 et RORγt respectivement impliqués dans l’engagement vers des lignages Th1, Th2 et

Th17 (Figure 41). Il fut démontré une différence significative de l’expression de GATA3 (P

= 0,01), avec une plus forte expression dans le groupe TYK2GC par rapport au groupe

TYK2GG (facteur d’augmentation proche de 1,6). Par contre, aucune différence pour

l’expression de T-bet et RORγt ne fut démontrée entre les deux génotypes. L’augmentation de

l’expression du facteur de transcription nucléaire GATA3 dans le groupe TYK2GC par rapport

au groupe TYK2GG suggère une polarisation des lymphocytes en faveur d’une réponse Th2.

Figure 41 : Le polymorphisme rs34536443 influence l’expression des facteurs nucléaires impliqués dans

la polarisation lymphocytaire. Quantification par RT-PCR quantitative de l’expression de T-bet (a), de

GATA3 (b) et de RORγt (c) réalisée sur des lymphocytes amplifiés à l’aide de billes anti-CD3/CD28 et d’IL-2

(50 U/ml). L’expression relative est calculée sur la moyenne de duplicats normalisés sur le gène de ménage

GAPDH. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12

individus pour le groupe TYK2GC.

Résultats

137

NNous avons alors voulu savoir si le génotype pour le polymorphisme rs34536443 de

TYK2 avait une influence suffisante sur l’expression de T-bet, GATA3 et RORγt pour

permettre la classification des individus en deux groupes cohérents (Figure 42). Une

représentation graphique 3D, prenant en compte simultanément l’expression des trois facteurs

de transcription, fut donc réalisée. Elle suggèra qu’il était possible de séparer les deux

génotypes du polymorphisme rs34536443 suivant ces critères (Figure 42a). Il fut alors

entrepris une classification des données d’expression, centrées et réduites, dont les résultats

sont représentés sous la forme d’une carte « heatmap » (Figure 42b). Cette classification nous

permit de dégager deux groupes principaux, composés chacun de 10 individus. Cette

séparation des deux groupes reposait principalement sur une différence d’expression pour

GATA3 et RORγt. En effet, alors qu’un des groupes présentait une forte expression de

GATA3 et une faible expression de RORγt, l’autre démontrait à l’inverse une faible

expression de GATA3 et une forte expression de RORγt. Par ailleurs, les groupes obtenus

présentaient une bonne cohérence dans le génotype des individus les constituant, à savoir :

80% d’individus TYK2GC et 20% de TYK2GG dans le premier groupe, et inversement dans le

deuxième groupe.

Résultats

138

Figure 42 : L’expression des facteurs nucléaires impliqués dans polarisation lymphocytaire permet de

classer les individus en fonction de leur génotype pour le polymorphisme rs34536443. (a) Représentation en

3D de l’expression de T-bet, GATA3 et RORγt, quantifiée par RT-PCR sur des lymphocytes amplifiés à l’aide

de billes anti-CD3/CD28 et d’IL-2 (50 U/ml). Les individus du génotype TYK2GG sont représentés par des carrés

rouges alors que les individus du génotype TYK2GC sont représentés par des carrés noirs. (b) Classification des

échantillons en fonction de leur ressemblance dans l’expression ARN de T-bet, GATA3 et RORγt. La

classification est pratiquée sur des valeurs centrées réduites. Un code couleur arbitraire est donné pour

représenter l’expression des gènes (allant du vert pour une faible expression vers le rouge pour une expression

élevée). N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour le groupe TYK2GC.

Afin de confirmer l’influence du polymorphisme rs34536443 sur la polarisation

lymphocytaire, leur sécrétion de cytokines fut évaluée par une approche en Luminex® (Figure

43b-j). Cette approche nous permit de quantifier simultanément la sécrétion de 11 cytokines

dans le milieu de culture. Pour cela, une culture lymphocytaire de 3 jours fut réalisée en

présence d’IL-2 (50 U/ml) et de billes anti CD3/CD28. En parallèle, la prolifération

lymphocytaire fut testée par mesure de l’incorporation de thymidine tritiée (Figure 43a). Les

cellules démontrèrent une capacité à proliférer comparable, indépendamment de leur génotype

(P = 0,83). Ceci nous permit d’affirmer que les différences de sécrétions cytokiniques

observées n’étaient pas la conséquence d’une différence de prolifération. La présence d’IL-7

et d’IL-15 dans le milieu ne fut pas quantifiable car ces cytokines étaient présentes à des

concentrations situées hors de la gamme étalon (données non représentées). Par ailleurs, les

concentrations en IL-17 furent détectées à la limite de la sensibilité de la technique ce qui

Résultats

139

rendit les résultats peu interprétables. Les lymphocytes isolés à partir d’individus de génotype

TYK2GC démontrèrent une augmentation de la sécrétion de cytokines de type Th2, telles que

l’IL-4 (différence de 2,1 ; P = 0,006 ; Figure 43b) et l’IL-5 (différence 2,3 ; P = 0,04 ;

Figure 43c) mais pas l’IL-13 (P = 0,09 ; Figure 43f). Par contre, il ne fut pas observé de

différence dans la sécrétion d’IFNγ, molécule de type Th1 (P = 0,48 ; Figure 43i). Il fut par

ailleurs retrouvé une augmentation de la sécrétion de deux autres cytokines, l’IL-6 (différence

de 3 ; P = 0,002 ; Figure 43d) et l’IP-10 (différence de 3,1 ; P = 0,01 ; Figure 43h), dans le

groupe TYK2GC par rapport au groupe TYK2GG.

Figure 43 : Le polymorphisme rs34536443 influence la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T. (a)

Quantification de la prolifération lymphocytaire par incorporation de thymidine tritiée après 72h de culture en

présence de billes anti CD3/CD28 et d’IL-2 (50 U/ml). (b-j ) Quantification des cytokines présentes dans le

milieu après 72h de culture des lymphocytes en présence de billes anti CD3/CD28 et d’IL-2 (50 U/ml). La

concentation des cytokines est calculée sur une moyenne de duplicats. Chaque barre représente la moyenne ±

s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour le groupe TYK2GC.

Résultats

140

En parallèle de l’analyse de la sécrétion cytokinique en Luminex®, une étude

préliminaire par cytométrie en flux fut réalisée (Figure 44). Les lymphocytes amplifiés furent

stimulés à la PMA/ionomycine puis marqués pour le marqueur de surface CD8 et pour l’IL-4

intracellulaire. Bien que ces données ne soient que préliminaires, il fut observé un plus fort

pourcentage de cellules CD8+ productrices d’IL-4 dans le groupe TYK2GC que dans le groupe

TYK2GG. Ces résultats restent à confirmer par une analyse plus robuste et plus poussée des

cytokines produites par les différentes populations lymphocytaires.

Figure 44 : Etude par cytométrie de l’effet du polymorphisme rs34536443 sur la production de cytokines

par les lymphocytes. Le marquage a été réalisé sur des lymphocytes amplifiés, isolés de personnes dont le

génotype pour le polymorphisme rs34536443 était connu. Les cellules ont été stimulées pendant 4h à la

PMA/ionomycine en présence de GolgiSTOP (a) Représentation des données de cytométrie pour le marquage

intracellulaire de l’IL-4 au sein de la population lymphocytaire CD8+. Toutes les cellules contenues dans les

cadrans Q1 et Q2 sont considérées comme positives pour l’IL-4. (b) Quantification des cellules positives pour

l’IL-4 au sein de la population lymphocytaire CD8+. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 11

individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour le groupe TYK2GC.

L’ensemble de ces données suggère que l’allèle C du polymorphisme rs34536443 de

TYK2 modifie la balance Th1/Th2 en faveur d’une réponse pro-Th2, ce qui pourrait expliquer

la protection conférée par cet allèle dans la susceptibilité à la SEP. Par contre, aucune

différence dans la polarisation des lymphocytes T vers un profil Th1 ou Th17 n’a été observée

en séparant les patients suivant leur génotype pour le polymorphisme rs34536443.

Résultats

141

II. Le locus IFIH1-GCA-KCNH7 n’est pas associé à la

susceptibilité génétique à la SEP dans la population française.

II.1. Objectifs

En 2008, Martinez et al. publièrent un travail associant le locus IFIH1-GCA-KCNH7,

et plus précisément les polymorphismes rs1990760 et rs2068330, à la susceptibilité à la SEP

[Martínez et al., 2008]. Ces deux polymorphismes localisent dans deux gènes diffèrents, IFIH1 et

KCNH7 respectivement. Précédemment, le polymorphisme contenu dans le locus IFIH1 avait

été associé au diabète de type 1, une autre maladie auto-immune [Smyth et al., 2006]. Le gène

IFIH1, aussi connu sous le nom de MDA-5, fait partie des gènes dont l’expression est activée

par les IFNs. Il code pour une hélicase qui, grâce à son domaine de recrutement des caspases

en N-terminal, induit la mort des cellules infectées par des virus [Andrejeva et al., 2004]. Afin de

confirmer cette association du locus IFIH1-GCA-KCNH7 avec la SEP, une cohorte composée

de familles trio françaises fut génotypée pour ces deux polymorphismes par une approche en

PCR TaqMan.

II.2. Résultats

Ce travail de réplication de l’association du locus IFIH1-GCA-KCNH7 avec la

susceptibilité à la SEP a fait l’objet d’une publication en 2009 dans la revue European Journal

of Human Genetics. Les résultats sont présentés ci-dessous.

Résultats

142

Résultats

143

Résultats

144

Résultats

145

Résultats

146

Résultats

147

III. Les gènes de la famille des OAS et susceptibilité à la SEP

III.1. Objectifs

Ce travail avait pour objectif d’identifier de nouveaux gènes associés à une

augmentation de la susceptibilité à la SEP parmi les gènes codant pour des protéines de la

voie de signalisation des IFNs de type 1. En effet, cette voie est impliquée dans la pathogénie

de plusieurs maladies auto-immunes dont la SEP [Theofilopoulos et al., 2005].

Dans ce but, une cohorte cas-témoins, homogène en âge et en sexe, fut réunie. Bien

que modeste en taille (20 individus dans chaque groupe), cette cohorte présentait l’avantage

d’inclure des individus SEP recrutés au tout début de la maladie. Le sang des patients SEP fut

prélevé au moment du diagnostic, c’est-à-dire après la première ou la seconde poussée, et

avant la mise en place du moindre traitement (immuno-modulateur ou immuno-suppresseur).

III.2. Résultats

III.2.1. Modification de l’expression des gènes de la voie des IFNs de type 1 chez les patients

SEP

Afin d’identifier de nouveaux gènes associés à la susceptibilité à la SEP, nous avons

tout d’abord étudié l’expression de 92 gènes appartenant à la voie des IFNs de type 1 par une

approche en PCRarray (la liste des gènes étudiés est disponible dans le chapitre « Annexes »,

Figure S1). Cette analyse fut réalisée sur la cohorte cas-témoins comprenant les patients pris

précocement dans l’évolution de la SEP. Parmi l’ensemble des gènes présentant une

différence d’expression chez les patients SEP par rapport aux témoins, seuls MxB, OAS2 et

OASL démontrèrent une significativité statistique inférieure à P = 0,005 (Figure 45a). Ces 3

gènes avaient une expression augmentée chez les patients SEP par rapport aux témoins : MxB

démontra une différence d’expression de 1,7 (P = 0,0005 ; Figure 45c), OAS2 de 1,9 (P

= 0,002 ; Figure 45d) et OASL de 1,5 (P = 0,004 ; Figure 45e). Cependant, l’approche par

PCRarray pose le problème de la localisation inconnue des sondes et de la possible

amplification de l’ADN. Il était donc important de reproduire ces résultats par une approche

plus traditionnelle en RT-PCR quantitative. Les différences d’expression furent confirmées

Résultats

148

sur la même cohorte, par RT-PCR quantitative en utilisant des sondes spécifiques des ARNm

et de l’ensemble des isoformes (pour les gènes en codant plusieurs ; Figure 45b).

De ce travail, il ressortit que deux gènes de la famille des OAS présentaient une

différence significative d’expression entre les patients SEP et les témoins. Nous avons alors

choisi d’étudier si des polymorphismes présents dans OAS2 ou OASL pouvaient être associés

à la susceptibilité à la SEP.

Figure 45 : Comparaison de l’expression des gènes de la voie des IFNs de type 1 chez des patients SEP par

rapport à des témoins. (a) Résumé des résultats de quantification d’expression par PCRarray pour les gènes

présentant une différence statistique de P < 0,005. N = 17 pour les témoins et N = 17 pour les patients SEP. (b)

Validation de la quantification de l’expression de MxB, OAS2 et OASL par RT-PCR quantitative. N = 19 pour

les témoins et N = 19 pour les patients SEP. (c-e) Représentation graphique des résultats de quantification

obtenus en PCRarray pour (c) MxB, (d) OAS2 et (e) OASL. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. CTR :

témoins. SEP : patients SEP.

II I.2.2. Association du gène OASL avec la susceptibilité à la SEP dans la population française

Dans un effort d’identifier une possible association du gène OASL avec la

susceptibilité à la SEP, une cohorte composée de familles trio fut utilisée. Cinq

polymorphismes, répartis sur l’ensemble du gène codant pour la protéine OASL, ont été

génotypés par une approche en PCR TaqMan (Figure 46a). Puis, une analyse en TDT fut

pratiquée sur les 591 familles trio SEP françaises disponibles. Par cette analyse, aucun des

polymorphismes étudiés ne démontra une sur-transmission significative d’un des allèles aux

Résultats

149

enfants souffrant de SEP (Figure 46b). Ainsi, dans la population française, le gène OASL ne

semble pas être un gène de susceptibilité à la SEP.

Figure 46 : Le gène OASL n’est pas associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles trio françaises.

(a) Les polymorphismes étudiés sont représentés sur la carte génétique par des boules bleues numérotées. 1 :

rs4556628, 2 : rs10849832, 3 : rs3213545, 4 : rs3213546, 5 : rs12819210. Les triangles noirs représentent les

blocs de polymorphismes en déséquilibre de liaison. (b) Résultats du génotypage, par une approche en PCR

TaqMan, de 591 familles trio françaises pour 5 polymorphismes répartis sur l’ensemble du gène codant pour

OASL. aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission

(T/U).

III.2.3. Association du gène OAS2 avec la susceptibilité à la SEP dans la population française

La même approche que celle menée pour le gène OASL fut pratiquée pour le gène

OAS2. L’utilisation du procédé en PCR TaqMan permit de génotyper neuf polymorphismes

Résultats

150

répartis sur l’ensemble du gène OAS2 (Figure 47a). Les résultats du génotypage de 591

familles trio SEP françaises furent analysés en TDT. Cette analyse révéla une association

entre deux polymorphismes d’OAS2, rs12815666 et rs1298301, et la susceptibilité à la SEP

(Figure 47b). Le polymorphisme rs12815666 démontra une sur-transmission de l’allèle T aux

enfants souffrant de SEP (P = 0,016). Pour le polymorphisme rs1298301, c’était l’allèle G qui

était sur-transmis (P = 0,007). Pour augmenter la puissance statistique, 49 familles trio

supplémentaires furent génotypées pour ces deux polymorphismes, portant ainsi la cohorte

disponible pour cette étude à une taille de 640 familles. De cette extension, l’association du

polymorphisme rs12915666 ressortit renforcée (P = 0,008), alors que celle du polymorphisme

rs1298301 atteignit la limite de la significativité (P = 0,059).

Afin de valider ces résultats d’association d’OAS2 avec la susceptibilité à la SEP dans

la population française, les polymorphismes rs12815666 et rs1298301 furent génotypés dans

une cohorte cas-témoins (Tableau IV et Tableau V). Les résultats obtenus ne sont que

préliminaires à cause du faible nombre d’individus disponibles (environ 600 cas et 350

témoins). L’approche cas-témoins ne révéla pas d’association significative ni pour le

polymorphisme rs12815666 (P = 0,803 ; Tableau IV), ni pour le polymorphisme rs1298301

(P = 0,450 ; Tableau V).

Résultats

151

Figure 47 : Le gène OAS2 est associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles trio françaises. (a) Les

polymorphismes étudiés sont représentés sur la carte génétique par des boules bleues numérotées. 1 :

rs12815666, 2 : rs1298301, 3 : rs2072138, 4 : rs1293764, 5 : rs1293755, 6 : rs2239193, 7 : rs1293749, 8 :

rs1293747, 9 : rs15895. Les triangles noirs représentent les blocs de polymorphismes en déséquilibre de liaison.

(b) Résultat du génotypage, par une approche en PCR TaqMan, des familles trio françaises pour 9

polymorphismes répartis sur l’ensemble du gène codant pour OAS2. aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U). cRésultats du génotypage effectué sur 591

familles trio françaises. dRésultats du génotypage effectué sur 640 familles trio françaises.

Résultats

152

Tableau IV : Analyse d’association du polymorphisme rs12815666 d’OAS2 dans la SEP par une approche

en cas-témoins.

rs12815666 N No d’

allèles T

Freq de

l’allèle T

No d’

allèles C

Freq de

l’allèle C RR (95% c.i.) χ2 P

Cas 600 194 0,16 1006 0,84 1,03 (0,83-1,27) 0,059 0,803

Témoins 362 114 0,16 610 0,84

N, nombre d’individus. « No d’allèles » fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR,

risque relatif. c.i., intervalle de confiance

Tableau V : Analyse d’association du polymorphisme rs1298301 d’OAS2 dans la SEP par une approche

en cas-témoins.

rs1298301 N No d’

allèles G

Freq de

l’allèle G

No d’

allèles A

Freq de

l’allèle A RR (95% c.i.) χ2 P

Cas 588 990 0,84 186 0,16 0,98 (0,95-1,02) 0,572 0,450

Témoins 358 612 0,85 104 0,15

N, nombre d’individus. ‘No d’allèles’ fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR,

risque relatif. c.i., intervalle de confiance.

L’ensemble de ces résultats ne permet pas de conclure de manière certaine que le gène

OAS2 constitue un gène de susceptibilité à la SEP dans la population française. Le

génotypage d’autres cohortes, de taille plus importantes, permettrait de confirmer ou non les

données que nous avons obtenues.

Résultats

153

FFAACCTTEEUURRSS EEPPII GGEENNEETTII QQUUEESS EETT

SSUUSSCCEEPPTTII BBII LL II TTEE AA LL AA SSEEPP

Résultats

154

Résultats

155

I. Inactivation du chromosome X et susceptibilité à la SEP

I.1. Objectifs

Une des caractéristiques communes aux maladies auto-immunes est que les femmes

sont plus affectées que les hommes. Bien que cette différence de susceptibilité demeure

encore inexpliquée, plusieurs hypothèses furent proposées comme l’importance du système

hormonal. Une autre différence majeure entre les hommes et les femmes est le nombre de

chromosomes X présents dans chaque cellule et le mécanisme du XCI que cela implique.

Ainsi, les femmes sont composées de deux populations cellulaires en fonction de l’origine du

chromosome X exprimé, alors que les hommes n’en sont composés que d’une seule. Plusieurs

maladies auto-immunes, comme la sclérodermie et la thyroïdite auto-immune, présentent une

modification du profil du XCI. En effet, il fut démontré que dans les cohortes de patients

souffrant d’une de ces maladies, une plus grande proportion d’individus présentait un fort

biais du XCI (c'est-à-dire que l’expression du chromosome X paternel comparée à celle du

chromosome X maternel s’éloignait d’un ratio 50:50 dans les cellules sanguines) comparé à

une cohorte de témoins. L’objectif de notre travail était de déterminer si un tel phénomène

existait dans la SEP, et s’il pouvait expliquer la discordance de statut clinique pour la maladie

observée chez des jumelles MZ. Entre le début de cette étude et l’écriture de cette thèse une

autre équipe publia des résultats concernant l’importance du XCI dans la SEP [Knudsen et al.,

2007].

Le profil du XCI est mesuré par à une succession d’étapes de digestion et

d’amplification par PCR (Figure 48). L’ADN génomique est soumis ou non à une étape de

digestion par l’enzyme HhaI, qui est sensible aux méthylations. Le chromosome X inactif est

fortement méthylé ce qui empêche la digestion des sites reconnus par l’enzyme. Puis est

réalisé une amplification par PCR d’un gène localisé sur le chromosome X : le gène codant

pour le récepteur aux androgènes. Les oligomères nucléotidiques spécifiques de ce gène

encadrent un microsatellite ainsi qu’une séquence reconnue par l’enzyme de digestion HhaI.

Seul le gène présent sur le chromosome X inactif peut être amplifié par PCR après digestion

avec HhaI. Le profil d’inactivation du chromosome X est alors calculé en mesurant l’intensité

des fragments amplifiés après migration en microcapillaires.

Résultats

156

Figure 48 : Protocole expérimental permettant de mesurer le profil d’inactivation du chromosome X chez

une femme.

Ce profil du XCI est exprimé en pourcentage. 50% représente une inactivation

aléatoire du chromosome X, c’est à dire un nombre égal de cellules exprimant le chromosome

X d’origine parternelle et de cellules exprimant le chromosome X d’origine maternelle. Ce

profil peut s’échelonner de 50% à 100% s’il ne prend pas en compte l’origine du chromosome

X inactivé (ce qui est en général le cas pour les études menées sur des cohortes cas-témoins)

ou de 0% à 100% s’il en tient compte. 0% et 100% réprésentent alors des biais complets où

toutes les cellules expriment un chromosome X de même origine.

I.2. Résultats

I.2.1. L’immortalisation par l’EBV modifie le profil du XCI

Nous disposons au laboratoire d’une importante collection d’ADNs extraits à partir de

cellules issues de patients SEP et de témoins, immortalisées par l’EBV. Afin de savoir si ces

échantillons pouvaient être utilisés pour étudier l’importance du XCI dans la SEP, il fallu

déterminer si l’immortalisation des cellules par l’EBV modifiait le profil du XCI. Dans ce but,

Résultats

157

il fut extrait de l’ADN partir de sang frais de 10 individus puis à partir de cellules issues de

ces mêmes individus et immortalisées par l’EBV. Le profil de XCI fut mesuré sur les deux

types d’ADN pour chacun des individus (Figure 49). Le profil du XCI fut mesuré par

amplification du gène codant pour le récepteur aux androgènes. L’analyse de la corrélation

démontra que l’immortalisation des cellules avait pour conséquence de modifier leur profil de

XCI. En effet, sur les 10 individus testés, l’immortalisation modifia légèrement le profil de

XCI chez 2 individus et fortement chez 4 autres individus. L’immortalisation modifiant le

profil de XCI chez certains individus, nous avons décidé d’utiliser pour la suite de l’étude

uniquement de l’ADN extrait sur du sang frais.

Figure 49 : L’immortalisation des cellules immunitaires par l’EBV modifie leur profil de XCI. Corrélation

comparant le profil du XCI avant et après immortalisation des cellules immunitaires, pour chaque individu. Le

profil du XCI est calculé après amplification par PCR du gène codant pour le récepteur aux androgènes,

précédée ou non d’une digestion par l’enzyme HhaI. La ligne noire, de fonction Y=X, représente une corrélation

parfaite qui serait obtenue si l’immortalisation ne modifiait pas le profil du XCI. N = 10 individus, et chaque

rond correspond à un individu.

I.2.2. Les patientes SEP présentent un profil du XCI moins biaisé que les témoins

Afin de déterminer si une modification du profil du XCI pouvait expliquer la plus

grande susceptibilité des femmes à la SEP, une cohorte composée de 68 femmes témoins et de

74 patientes souffrant de SEP fut réunie. Le profil du XCI fut mesuré par une approche

standard utilisée pour ce genre d’étude (amplification du gène codant pour le récepteur aux

androgènes). Le profil du XCI évoluant lentement au cours de l’avancée dans la vie, il était

important que nos groupes de patientes SEP et de témoins soient homogènes concernant leur

âge. Ainsi, l’âge moyen calculé était de 33,2 ans pour les témoins et de 33,5 ans pour les

patientes SEP, ce qui ne représente pas une différence significative (P = 0,82).

Résultats

158

La mesure du profil du XCI permit de mettre en évidence une différence significative

entre les témoins et les patientes SEP (Figures 50b). En effet, les témoins présentaient en

moyenne un biais du XCI plus important (61%) que les patientes SEP (58,4% ; P = 0,02). De

plus, l’observation de la répartition des individus en fonction des classes du profil du XCI

démontra un plus fort pourcentage d’individus dans la classe de biais 50%-59% chez les

patientes SEP que chez les témoins, avec respectivement 73% des individus contre 57%

(Figure 50a). Cependant, pour les forts biais du profil du XCI (plus de 80% des cellules ayant

le même chromosome X actif), aucune différence significative ne fut démontrée en comparant

les deux groupes (P = 0,72 ; Figure 50b). Contrairement à d’autres maladies auto-immunes,

comme la thyroïdite auto-immune et la sclérodermie, dans lesquels les patientes présentaient

un biais augmenté du profil du XCI par rapport aux témoins, dans la SEP cela semble être

l’inverse. Le biais du XCI était plus faible chez les patientes que chez les témoins.

Figure 50 : Le profil du XCI diffère entre la population de patientes SEP et la population de témoins. Le

profil du XCI est calculé après amplification par PCR du gène codant pour le récepteur aux androgènes,

précédée ou non d’une digestion par l’enzyme HhaI. (a) Représentation graphique de la répartition des individus

en fonction du profil du XCI mesuré. Les barres blanches correspondent aux individus témoins et les barres

noires aux patientes SEP. (b) Tableau résumant l’ensemble des données comparant le profil du XCI mesuré chez

les témoins et chez les patientes SEP. N = 68 témoins (CTR) et N = 74 patientes SEP. c.i. intervalle de

confiance.

Résultats

159

I.2.3. Corrélation du profil du XCI au sein de cohortes de jumelles MZ, établie en fonction du

statut clinique pour la SEP

Afin de confirmer les données obtenues en cas-témoins et, plus largement, de valider

l’hypothèse qu’une modification du profil du XCI pouvait être associée à la susceptibilité à la

SEP, nous avons essayé de reproduire ces résultats sur des cohortes composées de jumelles

MZ. En effet, l’utilisation de telles cohortes présente des avantages non négligeables : la sœur

de l’individu malade sert de témoin idéal car il est possible de faire abstraction de

l’information génétique (partagée à 100% entre les deux individus MZ) et en grande partie de

l’environnement. Pour cela, nous avons réuni 29 paires de jumelles MZ saines toutes les deux,

servant de population témoin (CTR/CTR), 21 paires de jumelles MZ discordantes pour la SEP

(CTR/SEP) et 8 paires de jumelles concordantes pour la SEP (SEP/SEP) (Figure 51). La

monozygotie des individus fut confirmée génétiquement par l’analyse d’un panel de plusieurs

microsatellites répartis sur différents chromosomes. Les deux cohortes les plus importantes en

taille ne démontrèrent pas de différences significatives dans l’âge moyen des individus (35,3

ans pour la population CTR/CTR et 40,8 ans pour la population CTR/SEP, P = 0,24). Pour la

cohorte SEP/SEP, seul l’âge de 3 couples d’individus était connu, portant l’âge moyen à 51,7

ans. Cependant, il ne différait pas des 2 autres cohortes (P = 0,14 en comparant avec la

cohorte CTR/CTR et P = 0,18 en comparant avec la cohorte CTR/SEP).

Le profil du XCI fut mesuré par amplification du récepteur aux androgènes par PCR,

ce qui permit de connaître la corrélation qu’il existait pour ce profil entre les individus

composant chaque paire de jumelles (Figures 51a-c). Le coefficient de corrélation calculé

pour la cohorte CTR/SEP donna un r égal à 0,68 (P = 0,0002 ; Figure 51d). Afin de

déterminer si les différences observées du profil du XCI au sein des paires de la cohorte

CTR/SEP étaient associées à une discordance du statut clinique pour la SEP ou alors étaient

seulement le reflet d’événements stochastiques, le coefficient de corrélation fut calculé pour

les cohortes CTR/CTR et SEP/SEP dont les individus sont cliniquement concordants. Les

valeurs sont respectivement égales à r = 0,76 (P < 0,0001 ; Figure 51d) et r = 0,43 (valeur

exacte ; Figure 51d). Bien que la corrélation soit moins bonne dans la cohorte CTR/SEP par

rapport à la cohorte CTR/CTR, une analyse statistique ne permit pas de mettre en évidence

une différence significative entre les deux groupes (P = 0,59 ; Figure 51d). Ainsi, l’utilisation

de paires jumelles ne permit pas de confirmer l’association d’une modification du profil du

XCI avec le statut clinique pour la SEP. Cependant, la tendance à obtenir une corrélation plus

mauvaise au sein de la cohorte CTR/SEP comparé à la cohorte CTR/CTR laisse croire que

Résultats

160

l’absence de significativité pourrait être dûe à des tailles de cohortes trop restreintes. Cette

faible taille des échantillons ne nous permettrait pas d’obtenir une puissance statistique

suffisante pour détecter le faible effet de la modification du profil du XCI sur la susceptibilité

à la SEP.

Figure 51 : Comparaison du coefficient de corrélation pour le profil du XCI au sein de cohortes de

jumelles MZ, en fonction du statut clinique pour la SEP. Le profil du XCI est calculé après amplification par

PCR du gène codant pour le récepteur aux androgènes, précédée ou non d’une digestion par l’enzyme HhaI.

CTR : témoins, SEP : patientes SEP. (a-c) Représentation graphique de la corrélation intra-paire pour le profil du

XCI. La ligne noire représente la corrélation linéaire au sein de la cohorte. (a) Corrélation pour la cohorte

CTR/SEP. Jumelle a : CTR, jumelle b : SEP. N = 21 paires de jumelles. (b) Corrélation pour la cohorte

CTR/CTR. N = 29 paires de jumelles. (c) Corrélation pour la cohorte SEP/SEP. N = 8 paires de jumelles. (d)

Tableau résumant l’ensemble des données obtenues concernant les coefficients de corrélation du profil du XCI. aTest de rang de Spearman, bComparaison des coefficients de corrélation avec le groupe CTR/SEP par

transformation en Z de Fisher, cValeur exacte.

I.2.4. La monosomie du chromosome X dans la SEP

Des études réalisées chez les femmes ont montré que plusieurs maladies auto-

immunes, en plus d’être associées à une modification du profil du XCI, étaient associées à une

augmentation du pourcentage de cellules sanguines ayant perdu un de leur chromosome X.

Afin de déterminer si les patientes SEP présentaient une augmentation du pourcentage

de cellules sanguines ayant une monosomie pour le chromosome X, une cohorte de 10

jumelles MZ discordantes pour la SEP fut réunie. Les cellules du sang périphérique furent

Résultats

161

marquées par hybridation in situ à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques pour les

chromosomes X et Y (Figure 52a). Pour chaque individu, il fut compté dans chaque noyau

(pour une moyenne de 750 noyaux) le nombre de chromosomes X et éventuellement de

chromosome Y. La monosomie pour le chromosome X fut systématiquement confirmée par

l’absence de chromosome Y dans le noyau. Le pourcentage de cellules présentant une

monosomie du chromosome X était de à 4,1% chez les jumelles témoins contre 4,3% chez les

jumelles souffrant de SEP. La comparaison intra-paire ne permit pas de mettre en évidence de

différence dans la monosomie du chromosome X chez la jumelle souffrant de SEP par rapport

à sa sœur saine servant de témoin (P = 0,8 ; Figure 52b). Ainsi, une plus forte monosomie du

chromosome X ne semble pas être un phénomène associé à la SEP.

Figure 52 : Monosomie du chromosome X au sein de paires de jumelles MZ discordantes pour la SEP. (a)

Image obtenue en microscopie à champ large après marquage des chromosomes X et Y par hybridation in situ.

L’image de gauche provient du marquage de cellules du sang périphérique d’une femme. Une cellule présentant

une monosomie du chromosome X y est visible (flèche blanche). L’image de droite provient du marquage de

cellules du sang périphérique d’un homme. Le noyau des cellules, marqué au DAPI, apparaît en bleu. Les sondes

spécifiques des chromosomes X et Y apparaissent respectivement en vert et en rose. (b) Comparaison de la

monosomie du chromosome X au sein de chaque paire de jumelles MZ discordantes pour la SEP. Les lignes

noires relient chacune des sœurs d’une paire. N = 10 paires de jumelles MZ.

Résultats

162

Résultats

163

FFAACCTTEEUURRSS GGEENNEETTII QQUUEESS EETT

RREEPPOONNSSEE AAUU TTRRAAII TTEEMM EENNTT

Résultats

164

Résultats

165

I. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au

traitement de la SEP par l’IFNββββ

I.1. Objectifs

Bien que la molécule d’IFNβ soit utilisée depuis de nombreuses années dans le

traitement de la SEP, il n’existe à l’heure actuelle encore aucun marqueur (clinique,

radiologique, génétique…) prédictif de la réponse du patient au traitement. Sachant que

seulement 1/3 des patients traités répondent favorablement au traitement, il est urgent de

trouver rapidement de tels marqueurs. Cela permettrait d’une part d’améliorer la prise en

charge du malade et d’autre part d’éviter des dépenses de santé inutiles. Des travaux

antérieurs avaient déjà associés des polymorphismes contenus dans des gènes de la voie des

IFNs de type 1 avec la réponse au traitement de l’hépatite C par l’IFNα. C’est en s’appuyant

sur ces résultats que nous avons recherché des polymorphismes qui pouvaient présenter un

intérêt clinique dans la prédiction de l’efficacité de la thérapie par IFNβ dans la SEP

I.2. Résultats

I.2.1. Recherche de polymorphismes associés à la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ

Pour mener cette étude, une cohorte franco-espagnole de patients SEP traités par

l’IFN β fut réunie. Les critères cliniques disponibles pendant les deux premières années de

traitement permirent de classer les patients en deux groupes extrêmes de réponse : les patients

répondeurs et les patients non-répondeurs (critères de classification décrits dans le chapître

« Matériels et Méthodes »). Cette recherche préliminaire de polymorphismes permettant de

prédire la réponse au traitement par l’IFNβ dans la SEP s’appuya sur des données déjà

publiées. Ainsi, 13 polymorphismes localisés dans 8 gènes (CTLA-4, IL-10, IRF1, IRF4,

MAP3K3, MxA, OAS1 et TRAIL), connus pour influencer l’efficacité du traitement de

l’hépatite C par l’IFNα, furent génotypés par PCR TaqMan sur la cohorte. Sur l’ensemble des

polymorphismes génotypés, des associations significatives ou en étant proches furent trouvées

pour les gènes TRAIL (Figure 53) et OAS1 (Figure 53). Si l’étude par génotype du

polymorphisme rs1131532 localisé dans le gène TRAIL n’apporta pas de résultats

Résultats

166

significatifs (Figure 53a), l’analyse de la fréquence de portage de l’allèle A démontra un

enrichissement, proche de la significativité (P = 0,06), de l’allèle A chez les patients

répondeurs par rapport aux non-répondeurs (Figure 54b). Les porteurs de l’allèle A

présentaient un risque relatif de réponse au traitement augmenté de 1,5 fois par rapport aux

non-porteurs. De plus, l’analyse du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 démontra un

enrichissement significatif (P = 0,02) de l’allèle G chez les patients répondeurs par rapport

aux non-répondeurs (Figure 54c). Les porteurs de l’allèle G présentaient un risque relatif de

réponse au traitement augmenté de 1,42 fois. A l’opposé, il fut observé un enrichissement

proche de la significativité (P = 0,08) de l’allèle A chez les patients non-répondeurs par

rapport aux répondeurs (Figure 54b), conférant aux porteurs de l’allèle A un risque de non-

réponse augmenté de 1,12 fois. Ces travaux préliminaires suggèrent que les gènes TRAIL et

OAS1 pourraient être d’un intérêt clinique dans la prédiction de l’efficacité de la thérapie par

l’IFN β dans la SEP.

Figure 53 : Association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec la réponse au traitement de la

SEP par l’IFN ββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction du statut de réponse au traitement

par l’IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G (c) en fonction du

statut de réponse au traitement par l’IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients non-répondeurs au

traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus porteurs du génotype (a)

ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i., intervalle de confiance.

Résultats

167

Figure 54 : Association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la réponse au traitement de la SEP

par l’IFN ββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction du statut de réponse au traitement par

l’IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G (c) en fonction du statut de

réponse au traitement par l’IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients non-répondeurs au

traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus porteurs du génotype (a)

ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i., intervalle de confiance.

II.2.2. Confirmation des données d’association entre OAS1 et TRAIL dans la réponse au

traitement de la SEP

Afin de confirmer les résultats associant le polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL

et le polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec l’efficacité du traitement de la SEP par

l’IFN β, ces deux polymorphismes furent génotypés dans une nouvelle cohorte de taille plus

importante. Dans ce but, une cohorte regroupant des patients SEP français, espagnols et

allemands sous traitement par IFNβ fut réunie. Ces patients furent classés en fonction de leur

réponse au traitement en appliquant les mêmes critères que ceux utilisés dans l’étude

préliminaire. L’analyse du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL, par génotype (P =

0,49) ou par portage d’allèle (P = 1,00 et P = 0,32), ne permit pas de confirmer l’association

avec la réponse au traitement obtenue précédemment (Figure 55). De manière similaire,

l’analyse du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 s’accompagna d’une absence

d’association avec la réponse au traitement dans la SEP, quelle que soit l’approche analytique

utilisée (Figure 56). En s’appuyant sur cette seconde étape de confirmation des données

préliminaires, il nous a été impossible de confirmer que les 2 polymorphismes localisés dans

Résultats

168

les gènes TRAIL et OAS1 pouvaient être utilisés comme des marqueurs génétiques prédictifs

de la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.

Figure 55 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec la réponse au

traitement de la SEP par l’IFNββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction du statut de

réponse au traitement par l’IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G

(c) en fonction du statut de réponse au traitement par l’IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients

non-répondeurs au traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus

porteurs du génotype (a) ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i., intervalle

de confiance.

Résultats

169

Figure 56 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la réponse au

traitement de la SEP par l’IFNββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction au statut de

réponse au traitement par IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G

(c) en fonction du statut de réponse au traitement par IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients

non-répondeurs au traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus

porteurs du génotype (a) ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i. intervalle de

confiance.

Résultats

170

Résultats

171

II. Etude de l’effet d’un polymorphisme de TYK2 sur la réponse

au traitement de la SEP par l’IFNββββ.

I.1. Objectifs

Le gène TYK2 code pour une kinase indispensable à la transmission du signal dans la

voie des IFNs de type 1. Précédemment, nous avons démontré que le polymorphisme

rs34536443 du gène TYK2 avait pour conséquence d’influencer l’activité de l’enzyme en

fonction de l’allèle codé. Il était donc intéressant d’évaluer l’effet de ce polymorphisme dans

la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.

L’étude de l’effet du polymorphisme rs34536443 dans la réponse au traitement fut

réalisée par une approche fonctionnelle, en analysant les modifications de l’expression des

marqueurs nucléaires pro-Th1, pro-Th2 et pro-Th17, mais aussi en réunissant une cohorte

européenne de patients SEP traités par l’IFNβ et dont les données cliniques disponibles

permettaient de définir leur statut de réponse au traitement.

I.2. Résultats

I.2.1. Le polymorphisme rs34536443 modifie la polarisation lymphocytaire

Malgré l’obtention par différentes équipes de données contradictoires concernant les

mécanismes d’action de l’IFNβ, il semble que la molécule modifie la polarisation des

lymphocytes T. C’est pourquoi nous avons choisi d’étudier l’expression de T-bet, de GATA3

et de RORγt (trois facteurs nucléaires associés respectivement à une polarisation

lymphocytaire pro-Th1, pro-Th2 et pro-Th17) avant et après la mise en contact des

lymphocytes avec l’IFNβ. Indépendamment du génotype pour le polymorphisme rs34536443

de TYK2, l’ajout d’IFNβ dans la culture a pour effet d’augmenter significativement

l’expression de T-bet (Figure 57a) et de diminuer significativement l’expression de GATA3

et de RORγt (Figures 57b-c). Cependant, malgré cette tendance générale partagée par les

deux génotypes, il fut démontré que le génotype TYK2GG présentait une plus forte

augmentation d’expression de T-bet (4,2 fois) comparé au génotype TYK2GC (2,8 fois ; P =

0,01 ; Figure 57b). A l’inverse, la diminution d’expression de GATA3 et de RORγt était

Résultats

172

moins marquée pour le génotype TYK2GG (0,4 fois pour GATA3 et RORγt) que pour le

génotype TYK2GC (0,2 fois ; P = 0,0006 pour GATA3 ; Figure 57d ; 0,3 fois ; P= 0,02 pour

RORγt ; Figure 57f).

Figure 57 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des facteurs nucléaires de

polarisation lymphocytaire en présence d’IFNββββ. Quantification par RT-PCR quantitative de l’expression de

T-bet (a-b), de GATA3 (c-d) et de RORγt (e-f) réalisée sur des lymphocytes amplifiés. L’expression relative

correspond à l’évaluation de l’expression du gène avant (-IFNβ) et après stimulation (+IFNβ) par l’IFNβ. La

stimulation est réalisée pendant 2 heures (ou 4 heures pour GATA3) à 1 000 U/ml. L’expression relative est

calculée sur la moyenne des duplicats normalisés sur le gène de ménage GAPDH. Chaque barre représente la

moyenne ± s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 individus pour le groupe TYK2GC.

I.2.2. Association du polymorphisme rs34536443 avec la réponse au traitement de la SEP par

l’IFN β

Bien que le polymorphisme rs34536443 semblait contrôler la polarisation

lymphocytaire en présence d’IFNβ, il était indispensable de contrôler si ce polymorphisme

permettait de prédire la réponse des patients SEP au traitement par IFNβ. Dans ce but, il fut

Résultats

173

réuni une cohorte européenne (française, espagnole et allemande) de patients SEP dont le

statut de réponse au traitement était bien défini. Cette cohorte composée de 365 individus

(142 répondeurs et 223 non-répondeurs) ne comportait que des patients souffrant de la forme

RR-MS. Le génotypage des individus par la méthode de PCR TaqMan ne permit pas de

mettre en évidence une différence significative de la fréquence des allèles dans les deux

classes de réponse (P = 0,71 ; Tableau VI). Cependant, ce résultat négatif est à pondérer. En

effet, l’allèle C est un allèle rare (MAF égale à 3%) ce qui rend difficile l’étude d’une

association entre le polymorphisme rs34536443 et la réponse au traitement de la SEP par

l’IFN β dans des cohortes de taille réduite.

Tableau VI : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 avec la réponse au traitement

de la SEP par l’IFNββββ.

Statut de réponse à

l’IFN ββββ N

No d’

allèles G

Freq de

l’allèle G

No d’

allèles C

Freq de

l’allèle C RR (95% de c.i.) χχχχ2 P

R 142 275 0,93 9 0,03 1,86 (0,77-4,49) 0,14 0,71

NR 223 434 0,93 12 0,03

R, patients répondeurs au traitement. NR, patients non-répondeurs au traitement. N, nombre d’individus. « No

d’allèles » fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR, risque relatif. c.i., intervalle de

confiance.

Résultats

174

175

DDII SSCCUUSSSSII OONN

EETT

PPEERRSSPPEECCTTII VVEESS

Discussion et Perspectives

176

Discussion et Perspectives

177

I. Facteurs génétiques et susceptibilité à la SEP

I.1. Implication du gène TYK2 dans la susceptibilité génétique à la SEP

Les données de ce travail ont permis de confirmer les études génétiques précédentes

associant le polymorphisme rs34536443 du gène TYK2 avec la susceptibilité à la SEP [Ban et

al, 2009 ; ANZgene, 2009]. En effet, l’allèle G du polymorphisme rs34536443 augmente de 1,92

fois le risque de développer la maladie dans la population française. Ainsi, TYK2 est le 5ème

gène, n’appartenant pas à la famille du CMH, découvert comme associé à la pathogénie de la

SEP.

Ce polymorphisme localisé dans le domaine kinase de TYK2 conduit au changement

d’un acide aminé en position 1104 de la protéine [Kaminker et al., 2007]. Alors que l’allèle G

majoritaire dans la population caucasienne code pour une proline, l’allèle C minoritaire

conduit à son remplacement par une alanine. Les résultats obtenus au cours de ce travail

montrent pour la première fois que l’allèle C, associé à une moindre susceptibilité à la SEP

code pour une kinase TYK2 hypo-active. En effet, l’activation de TYK2 suite à l’engagement

du récepteur à l’IFNβ (IFNAR) conduit à une plus faible phosphorylation de TYK2 en

T1054/T1055 chez les individus TYK2GC comparés aux individus TYK2GG. Cette

phosphorylation est directement corrélable au niveau d’activation de TYK2. L’hypo-

activation de TYK2 chez les individus TYK2GC fut observée à toutes les étapes de

transduction du signal de la voie des IFNs de type 1 : une diminution de la phosphorylation de

STAT1 et STAT2 et une moins grande induction des gènes possédant une séquence ISRE

dans leur promoteur. L’ensemble de ces données permettent de conclure que l’allèle C du

polymorphisme rs34536443 associé à une diminution de la susceptibilité à la SEP serait

directement responsable d’une moindre activité de la kinase TYK2 suite au changement d’un

acide aminé dans le domaine kinase de la protéine. Ces résultats sont en accord avec les

données obtenues chez l’animal où une perte totale de l’activité kinase de TYK2 conduisait à

une résistance à l’induction de l’EAE, modèle de la SEP [Spach et al., 2009].

Bien qu’initialement découverte comme associée à la voie des IFNs de type 1, la

kinase TYK2 est en réalité impliquée dans de nombreuses voies de signalisation cytokiniques

comme la voie de l’IL-6, de l’IL-10, de l’IL-12 et de l’IL-23 [Watford et al, 2006]. Chez

l’Homme et chez l’animal, une perte totale de l’activité kinase de TYK2 conduit à une

modification de la polarisation lymphocytaire en favorisant une réponse anti-inflammatoire

Discussion et Perspectives

178

pro-Th2 [Ghoreschi et al., 2009]. Les résultats obtenus lors de cette étude montrent que l’allèle C

du polymorphisme rs34536443 modifie la polarisation des lymphocytes en favorisant une

réponse Th2. En effet, une augmentation d’expression du facteur nucléaire GATA3, marqueur

pro-Th2, a été observée chez les individus porteurs de l’allèle C comparé aux individus

homozygotes pour l’allèle G. Par ailleurs, corrélant avec l’étude d’expression, l’analyse des

cytokines produites par les lymphocytes démontra, chez les individus porteurs de l’allèle C,

une augmentation de la production d’IL-4 et d’IL-5 qui sont deux cytokines sécrétées par les

lymphocytes Th2. Cependant, pour l’IL-13, une autre cytokine de type Th2, aucune différence

n’apparut entre les deux génotypes du polymorphisme rs34536443. Bien que le

polymorphisme rs34536443 ait une influence sur la réponse Th2, il ne semble pas modifier les

réponses Th1 et Th17. En effet, aucune différence des facteurs pro-Th1 et pro-Th17 ne fut

observée. Ni l’expression des facteurs nucléaires T-bet et RORγt, ni la sécrétion d’IFNγ et

d’IL-17 ne présentèrent de différence après répartition des individus en fonction de leur

génotype pour le polymorphisme rs34536443. Cette étude préliminaire sur la sécrétion

cytokinique doit être renforcée par une analyse en cytométrie de flux. En effet, il est important

de déterminer si le polymorphisme rs34536443 influence la polarisation lymphocytaire à la

fois dans le compartiment T CD4+ et dans le compartiment T CD8+. Cette approche devrait

être prochainement menée dans notre laboratoire. De manière plus surprenante, les individus

porteurs de l’allèle C présentèrent une sécrétion augmentée d’IL-6 et d’IP-10. Bien que

l’association entre l’effet protecteur conféré par allèle C dans la SEP et une augmentation de

la sécrétion d’IL-6 et d’IP-10 puisse paraître paradoxale, plusieurs études ont démontré que

ces cytokines pouvaient avoir des effets protecteurs dans le développement de la SEP. L’IL-6

appartient à la famille des cytokines pro-inflammatoires [Kishimoto et al., 2005] et a un rôle

crucial durant la phase d’induction de l’EAE [Okuda et al., 1998]. De plus, le LCR des patients

SEP présente une concentration augmentée d’IL-6 par rapport à des individus sains

[Malmeström et al., 2006], alors que des cellules productrices d’IL-6 sont retrouvées dans les

lésions actives du SNC de ces patients [Maimone et al., 1997]. Cependant, le rôle de l’IL-6 dans

les pathologies neurologiques n’est pas encore bien cerné. En effet, l’injection d’IL-6 a un

effet bénéfique sur l’évolution de l’EAE induite par le virus de Theiler [Rodriguez et al., 1994],

alors qu’une augmentation transitoire de l’IL-6 serique chez les patients SEP ayant reçu une

injection d’IFNβ prédirait une réponse favorable au traitement [Nakatsuji et al., 2006]. L’IP-10

quant à elle, est une chimiokine qui joue un rôle majeur dans l’infiltration des monocytes dans

le SNC et dont le récepteur, CXCR3, est considéré comme une cible potentielle dans les

maladies impliquant un recrutement de cellules T inflammatoires [Fife et al., 2001].

Discussion et Perspectives

179

Paradoxalement, des souris invalidées pour le gène codant pour l’IP-10 développent une EAE

plus sévère que des animaux sauvages [Klein et al., 2004].

Au cours de cette étude, nous avons ainsi démontré que le polymorphisme rs34536443

associé à la susceptibilité à la SEP modifiait l’activité kinase de la protéine TYK2. L’allèle C,

qui est associé à une diminution de la susceptibilité à la SEP, code pour une kinase TYK2

hypo-active comparé à la forme codée par l’allèle G. Cette protection conférée par l’allèle C

du polymorphisme rs34536443 passerait par une réponse Th2 favorisée. L’ensemble de ces

résultats corroborent les données obtenues chez l’animal. Bien que la kinase TYK2 fut

initialement découverte comme impliquée dans la voie des IFNs de type 1, l’effet protecteur

du polymorphisme rs34536443 de TYK2 ne semble pas reposer exclusivement sur

l’implication de cette voie. En effet, chez l’animal, alors qu’une inhibition totale de la voie

des IFNs de type 1 induit une EAE exacerbée, l’inhibition totale de l’activité de TYK2

conduit au phénotype contraire c'est-à-dire à une résistance à la maladie. On peut donc

supposer que chez l’Homme, l’effet protecteur conféré par la diminution d’activité de TYK2,

codé par l’allèle C du polymorphisme rs34536443, implique majoritairement une voie

indépendante de la voie des IFNs de type 1. On peut espérer que, dans le futur, la découverte

de cette voie puisse permettre le développement de nouveaux traitements de la SEP.

I.2. Implication du locus IFIH1-GCA-KCNH7 dans la susceptibilité

génétique à la SEP

Les données de génétique obtenues par Martínez et al. [Martínez et al., 2008] associant

les polymorphismes rs1990760 et rs2068330, présents dans le locus IFIH1-GCA-KCNH7,

avec la susceptibilité à la SEP confirmaient la théorie du partage des loci de susceptibilité

entre les différentes maladies auto-immunes [Frazer et al., 2009]. Initialement découvert comme

associé à la susceptibilité au diabète de type 1 [Smyth et al., 2006] le polymorphisme rs1990760

du gène IFIH1 semblait aussi intervenir dans la pathogénie de la SEP. Afin de confirmer

l’association du locus IFIH1-GCA-KCNH7 avec la susceptibilité à la SEP dans la population

française, nous avons réalisé une approche similaire à celle menée par Martínez et al.

Cependant, l’absence de réplication dans notre étude ne permit pas de confirmer les travaux

précédents. Depuis la publication de notre étude, deux autres équipes se sont interessées à

l’implication du gène IFIH1 dans la susceptibilité à la SEP. Ces deux dernières études

obtinrent des résultats contradictoires. Alors qu’Enevold et al. montrèrent une association

Discussion et Perspectives

180

significative du polymorphisme rs1990760 du gène IFIH1 avec la SEP [Enevold et al., 2009], un

consortium international d’étude de la SEP s’appuyant sur de larges cohortes cas-témoins et

familles trio SEP ne parvint pas à mettre en évidence l’association d’IFIH1 avec la maladie

[IMSGC, 2009].

Ainsi à l’heure actuelle, à la vue des résultats obtenus par différentes équipes,

l’association du polymorphisme rs1990760 avec la SEP reste encore soumise à expectative.

Une analyse fonctionnelle menée sur l’effet du polymorphisme rs1990760 dans la SEP

permettrait d’affirmer ou non que le polymorphisme rs1990760 d’IFIH1 est directement

impliqué dans la pathogénie de la SEP. En effet, le polymorphisme rs1990760 d’IFIH1

conduit au remplacement d’une alanine en position 946 de la protéine par une thréonine. Un

travail réalisé sur le diabète de type 1 montra que l’allèle du polymorphisme rs1990760

d’IFIH1, associé avec une augmentation de la susceptibilité à la maladie, conduisait à une

augmentation de l’expression d’IFIH1 dans les cellules monucléées du sang périphérique [Liu

et al., 2009]. Par ailleurs, des travaux récents, visant à identifier des polymorphismes de

susceptibilité au diabète de type 1, ont identifié quatre nouveaux polymorphismes rares

associés à la maladie. Les allèles minoritaires de ces polymorphismes rares, qui présentent

une indépendance avec le polymorphisme rs1990760, confèrent une protection contre le

diabète de type 1. De plus, ils sont possiblement fonctionnels de par leur localisation dans le

gène IFIH1. En effet, deux se localisent dans des exons ce qui conduit à des changement

d’acides aminés et les deux autres se localisent dans des introns retrouvés dans des sites

impliqués dans l’épissage de l’ARNm [Nejentsev et al., 2009]. Il serait donc intéressant de

vérifier si ces nouveaux polymorphismes ne sont pas partagés avec la SEP.

I .3. Implication des gènes de la famille des OAS dans la susceptibilité à la

SEP

Afin de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans la pathogénie de la SEP, nous

avons étudié l’expression des gènes impliqués dans la voie des IFNs de type 1. Les patients

SEP pris précocement dans le développement de la maladie démontrèrent une activation de la

voie des IFNs de type 1. Cette activation de la voie était visible par l’augmentation de

l’expression des gènes portant des éléments de réponse aux IFNs dans leur promoteur. De

cette comparaison, parmi les 3 gènes présentant la différence d’expression la plus significative

Discussion et Perspectives

181

entre les patients SEP et les témoins, 2 appartenaient à la famille des OAS : OAS2 et OASL.

Chez l’Homme, les gènes de la famille des OAS sont retrouvés dans un locus localisé sur le

chromosome 12. Les gènes codant pour OAS1, OAS2 et OAS3 sont regroupés ensemble,

alors que le gène OASL se situe un peu plus loin sur le chromosome [Hovnanian et al., 1998].

Suite à ces résultats, nous avons voulu étudier la possible implication des gènes OAS2 et

OASL dans la pathogénie de la SEP. Alors que nos travaux démontrèrent une absence

d’association du gène OASL avec la SEP, il fut trouvé une association significative entre le

gène OAS2 et la maladie. Le polymorphisme rs12815666, qui présente le plus de

significativité (P = 0,008), se localise dans la région promotrice du gène OAS2. Le locus OAS

avait déjà été précédemment associé à une autre maladie auto-immune. En effet, Field et al.

associèrent un polymorphisme présent dans l’intron 6 du gène OAS1 avec le diabète de type

1 [Field et al., 2005]. Il avait été précédemment montré que ce polymorphisme influençait

l’activité enzymatique de la protéine OAS1 : l’allèle de susceptibilité au diabète de type 1

était celui qui codait pour une protéine OAS1 possédant une forte activité basale [Bonnevie-

Nielsen et al., 2005]. Par la suite, cette association fut confirmée par un autre travail suggérant

qu’un autre polymorphisme, en LD avec le précédent, devait être le polymorphisme

fonctionnel [Tessier et al., 2006]. Plus récemment, un travail réalisé en cohorte cas-témoins

associa un haplotype des deux polymorphismes déjà associés au diabète de type 1 avec la

susceptibilité à la SEP [Fedetz et al., 2006]. Cependant, aucune étude de confirmation ne fut

publiée par la suite. D’ailleurs, notre laboratoire ne parvint pas à confirmer cette association

au moyen d’une cohorte familles trio française (chapître « Annexes », Figures S2-S3).

I.4. Conclusion

Pendant de nombreuses années, les travaux visant à rechercher les facteurs génétiques

impliqués dans la pathogénie de la SEP ne parvinrent pas à identifier de nouveaux gènes,

autres que ceux du locus du CMH. Depuis peu, l’apparition de nouvelles techniques de

génotypage et la disponibilité de cohortes de taille très importante autorisent les études par

GWAS. Cette nouvelle approche a permis aux études d’association génétique d’acquérir une

certaine maturité et a rendu possible la découverte de nouveaux gènes ayant un faible effet (en

comparaison avec l’effet du CMH) sur la pathogénie de la SEP. Au cours de ce travail, nous

avons pu démontrer que le gène TYK2 était associé à la SEP via une modification

Discussion et Perspectives

182

fonctionnelle de son activité kinase conférée par le polymorphisme rs34536443. Les données

actuelles semblent de plus en plus supporter l’implication de la voie des IFNs de type 1 dans

la pathogénie de la SEP. En effet plusieurs travaux récents, de génétique et d’expression,

s’accordent à démontrer l’importance de cette voie [Ban et al., 2008, De Jager et al., 2009b, Van

Baarsen et al., 2006]. Si les résultats associant le gène OAS2 avec la susceptibilité à la SEP

venaient à être confirmés, alors il s’agirait du 3ème gène de la voie des IFNs de type 1 associé

à la maladie. Cependant, même si la voie des IFNs de type 1 semble fortement impliquée dans

la pathogénie de la SEP, il est important de confirmer les associations publiées, comme cela a

été le cas pour le locus IFIH1-GCA-KCNH7. En effet, les études génétiques réalisées sur

l’implication de gènes dans la maladie, en l’absence de démonstrations fonctionnelles, sont

soumises à de multiples biais pouvant conduire à une forte inflation des erreurs de type 1

(faux positifs).

Discussion et Perspectives

183

II. Facteurs épigénétiques et susceptibilité à la SEP

II.1. Inactivation du chromosome X et susceptibilité à la SEP

Bien que la SEP soit considérée comme une maladie auto-immune à forte composante

génétique dans sa pathogénie, la forte proportion de discordance clinique chez les jumeaux

MZ suggère que des facteurs environnementaux et épigénétiques sont aussi impliqués [Willer

et al., 2003]. Par ailleurs la SEP, comme d’autres maladies auto-immunes, affecte plus

fortement les femmes que les hommes. Bien que plusieurs hypothèses furent avancées pour

expliquer ce phénomène, aucune n’est entièrement satisfaisante. Récemment, des travaux ont

montré que le XCI, mécanisme épigénétique mis en place uniquement chez les femmes, était

associé à plusieurs maladies auto-immunes telles que la sclérodermie [Ozbalkan et al., 2005], la

thyroïdite auto-immune [Ozcelik et al., 2006] et tout dernièrement la polyarthrite rhumatoïde

[Chabchoub et al., 2009]. Notre travail sur le phénomène du XCI dans la SEP s’inscrit dans cette

recherche des maladies auto-immunes pour lesquelles ce phénomène épigénétique serait

impliqué. Par une étude en cas-témoins nous avons observé une modification significative du

profil du XCI chez les patientes SEP. Ces observations sont en contradiction avec celles

obtenues par une autre équipe pour qui le profil du XCI était inchangé dans la SEP [Knudsen et

al.2007]. Ces résultats discordants peuvent s’expliquer par la méthode de mesure du XCI

reposant sur des étapes de digestion et d’amplification PCR, toutes susceptibles d’induire des

biais dans les observations faites. De plus la SEP, par son hétérogénéité, peut faire que la

cohorte SEP de notre étude présente des différences cliniques comparé à celle incluse dans

l’étude de Knudsen et al. Afin d’éviter une possible hétérogénéité entre les patients et les

témoins, indépendante de la discordance clinique pour la SEP, nous avons choisi de

poursuivre notre travail en étudiant le phénomène du XCI chez des jumelles MZ discordantes

pour la maladie. Cette méthode présente l’avantage d’avoir une femme « saine » servant de

témoin apparié à sa jumelle souffrant de la maladie. Cependant, bien que les différences intra-

paire du profil du XCI soient plus marquées chez les jumelles MZ discordantes pour la SEP

(coefficient de corrélation égal à 0,68) que chez des jumelles MZ témoins (coefficient de

corrélation égal à 0,76), cette différence n’atteignit pas la significativité (P = 0,59). Le faible

poids d’un tel facteur épigénétique dans la pathogénie de la SEP, ainsi que la faible taille de la

cohorte de jumelles MZ disponible, pourrait expliquer cette absence de significativité. Si nos

données d’épigénétique se voyaient confirmées, la SEP serait la première maladie auto-

Discussion et Perspectives

184

immune pour laquelle le profil du XCI serait modifié, non pas vers un plus fort biais mais vers

un biais moyen moins important.

Bien que les travaux sur l’association du phénomène du XCI avec les maladies auto-

immunes émettent l’hypothèse qu’un fort biais du XCI est un facteur causal dans le

développement de la maladie [Stewart et al., 1998], il est important de garder à l’esprit que cette

causalité n’a jamais été formellement démontrée. En effet, même si le chromosome X héberge

de nombreux gènes de l’immunité (FOXP3, CD40L, la chaîne α de l’IL-2R) ou des gènes

codant pour des antigènes contre lesquels le système immunitaire peut se retourner (par

exemple la protéine PLP dans le cas de la SEP), le biais du XCI observé sur les cellules

sanguines pourrait être le simple reflet d’un dérèglement général du système immunitaire

favorisant l’expansion clonale d’une sous-population cellulaire. Afin de pouvoir considérer le

phénomène du XCI comme un facteur potentiellement responsable de la prédominance des

femmes dans les maladies auto-immunes, les futurs travaux devront étudier le phénomène

dans d’autres maladies auto-immunes, mais aussi mesurer le profil du XCI dans plusieurs

types de cellules, dont ceux localisés au niveau du tissu cible et non pas uniquement dans le

sang. En effet, l’observation d’un biais du XCI généralisé à l’ensemble des tissus d’un

organisme suggèrerait que ce biais est présent avant même le développement de la maladie.

Ce mécanisme épigénétique serait alors susceptible d’être responsable, par un mécanisme qui

reste à expliquer, de l’apparition de la maladie. A l’inverse si ce biais était observé

uniquement dans le sang, le phénomène pourrait être simplement une des conséquences du

développement de la maladie.

Par ailleurs, le phénomène épigénétique du XCI s’accompagne parfois d’une

élimination du chromosome X inactivé conduisant à une monosomie du chromosome X dans

la cellule. Pour deux maladies auto-immunes, la sclérodermie et la thyroïdite auto-immune,

l’augmentation du biais du XCI s’accompagne d’une augmentation de la monosomie du

chromosome X dans les cellules sanguines [Invernizzi et al., 2005]. L’étude de ce phénomène

dans la SEP au moyen de jumelles MZ discordantes pour la maladie ne permit pas de mettre

en évidence l’éventuelle implication de la monosomie du chromosome X dans la pathogénie

de la SEP.

Discussion et Perspectives

185

II.2. Conclusion

L’importante discordance des jumeaux MZ pour la SEP démontre que les facteurs

environnementaux et les facteurs épigénétiques ont un effet non négligeable dans la

pathogénie de la maladie. Certaines études réalisées sur le lupus érythémateux et la

polyarthrite rhumatoïde suggérèrent que les lymphocytes T des patients présentaient un défaut

d’activité d’une enzyme intervenant dans la méthylation de l’ADN. Dans la SEP peu d’études

se sont interessées à l’importance des facteurs épigénétiques dans le développement de la

maladie. Cela est principalement dû à la difficulté d’étudier les facteurs épigénétiques sur de

larges cohortes de patients. En effet, les facteurs épigénétiques modifient l’expression des

gènes sans pour autant modifier la séquence de l’ADN. L’étude de ces facteurs par des

approches d’association conventionnelles, reposant sur une amplification de l’ADN, est donc

impossible. Cependant, avec l’apparition de nouvelles techniques permettant d’étudier

l’épigénome d’un individu (principe comparable aux puces à polymorphismes mais pour les

modifications épigénétiques de l’ADN), on peut espérer que, dans le futur, des modifications

épigénétiques dans des gènes soient identifiées comme associées à une susceptibilité accrue à

la SEP.

Discussion et Perspectives

186

Discussion et Perspectives

187

III. Facteurs génétiques et réponse au traitement

I II.1. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au

traitement de la SEP par l’IFNββββ

L’utilisation de l’IFNβ dans le traitement de la SEP apporte une amélioration de

l’évolution de la maladie en réduisant la fréquence des poussées de 30% en moyenne [IFNβ MS

Study group,1995]. Cependant, ce chiffre représente la moyenne de l’effet de la molécule sur

l’ensemble des patients traités. Au niveau de l’individu, certains patients sont dits « bons

répondeurs » au traitement car ils démontrent une réduction de la fréquence des poussées bien

supérieure à la moyenne. A l’opposé, des patients peuvent être des « mauvais répondeurs »

avec une réduction de la fréquence des poussées inférieure à cette moyenne de 30%. Cette

variabilité dans la réponse au traitement peut s’expliquer par une variabilité génétique au sein

de la population de malades. En s’appuyant sur des travaux montrant l’influence de la

génétique dans la réponse au traitement de l’hépatite C par l’IFNα, nous avons choisi

d’étudier, par une approche gène candidat, l’effet de ces polymorphismes dans le traitement

de la SEP par l’IFNβ. De l’étude préliminaire réalisée sur une cohorte franco-espagnole, les

gènes OAS1 et TRAIL démontrèrent une association (significative ou proche) avec la réponse

au traitement. En effet, les premiers résultats indiquèrent que le génotype TRAILAA du

polymorphisme rs1131532 et le génotype OAS1GG du polymorphisme rs2660 étaient associés

à une augmentation de la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ d'environ 1,5 fois. Afin

de confirmer ces premiers résultats, une cohorte européenne de taille plus importante fut par

la suite constituée. Toutefois, le génotypage de ces deux polymorphismes ne permit pas de

confirmer cette association. Ces résultats divergents ne permettent pas d’envisager les

polymorphismes des gènes TRAIL et OAS1 comme des marqueurs génétiques prédictifs de la

réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.

III.2. Effet du polymorphisme de TYK2 sur la réponse au traitement de la

SEP par l’IFNββββ

Nous avons précédemment démontré que le polymorphisme rs34536443 du gène

TYK2 modifiait l’activité kinase de l’enzyme. La kinase TYK2 est impliquée dans plusieurs

Discussion et Perspectives

188

voies cytokiniques dont celle de l’IFNβ, qui est une molécule largement utilisée dans le

traitement de la SEP. Ainsi, nous avons choisi de tester si ce polymorphisme pouvait servir de

marqueur prédictif de la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ. L’ajout d’IFNβ dans le

milieu avait pour effet de modifier transitoirement l’expression des facteurs nucléaires pro-

Th1, pro-Th2 et pro-Th17. Ces résultats, en accord avec la littérature [Ramos et al., 2007 ; Guo et

al., 2008 ; Shinohara et al., 2008], démontrèrent une diminution de l’expression du facteur RORγt,

marqueur spécifique des lymphocytes Th17 qui sont, depuis peu, reconnus comme des

cellules importantes dans la pathogénie de la SEP [Langrish et al., 2005]. Par ailleurs,

l’amplitude du changement d’expression dépendait du génotype pour le polymorphisme de

TYK2.

Etant donné que le polymorphisme rs34536443 du gène TYK2 influence l’amplitude

de l’effet de l’IFNβ sur l’expression des facteurs nucléaires pro-Th1, pro-Th2 et pro-Th2,

nous avons testé ce polymorphisme comme facteur prédictif de la réponse au traitement de la

SEP par l’IFNβ. L’analyse du polymorphisme sur une cohorte européenne de patients SEP

traités à l’IFNβ ne permit pas de mettre en évidence une association entre TYK2 et la réponse

au traitement de la SEP par l’IFNβ. Même si le polymorphisme rs34536443 était un marqueur

de réponse au traitement, la faible puissance statistique conférée par le polymorphisme de

TYK2 dont la MAF est proche de 3%, rendrait difficile la détection d’une telle association.

III.3. Conclusion

L’information génétique, en plus d’influencer la susceptibilité de chacun d’entre nous

aux maladies, a un impact sur notre réponse au traitement de la maladie. Cette généralité est

maintenant acceptée avec l’apparition de la pharmacogénétique qui étudie l’influence du

profil génétique sur la réponse à un traitement. Par exemple, des données récemment obtenues

dans le domaine de la cardiologie ont montrée qu’un polymorphisme localisé dans le gène

CYP2C19 influençait la réponse au clopidogrel, médicament administré aux patients après un

infarctus du myocarde [Collet et al., 2009 ; Simon et al., 2009]. Dans le traitement de la SEP par

l’IFNβ, indépendamment de l’apparition de Nabs, il est possible d’observer des patients

répondant bien à la molécule, d’autres n’y répondant pas et enfin toute une palette de patient

présentant des réponses intermédiaires. Profitant des avancées techniques des études

génétiques sur la susceptibilité, une étude de pharmacogénétique en GWAS a récemment été

publiée [Byun et al., 2008]. Mais à l’heure actuelle les études de pharmacogénétique dans la SEP

Discussion et Perspectives

189

ne sont qu’à leurs balbutiements. En effet, la cohorte disponible pour l’étude GWAS ne

comptait que 206 individus (soit la moitié de la cohorte disponible au sein de notre

laboratoire) rendant difficile l’obtention de résultats fiables. De plus, la classification des

patients SEP en fonction de leur réponse au traitement est compliquée de par le choix des

marqueurs à utiliser. Contrairement à certaines maladies comme le diabète où la glycémie sert

de marqueur, il existe dans la SEP une multitude de marqueurs radiologiques et cliniques

possiblement utilisables pour cette classification. Or, les experts dans le domaine ne sont pas

d’accord sur les meilleurs critères de classification à utiliser. Cependant, grâce aux résultats

obtenus dans une étude de confirmation, le gène codant pour le glypicane 5 pourrait être le

premier gène identifié comme marqueur génétique de la réponse du traitement IFNβ dans la

SEP [Cénit et al, 2009].

190

191

AANNNNEEXXEESS

Annexes

192

Annexes

193

Tableau S1 : Liste et localisation sur la plaque de PCRarray des gènes amplifiés. Position sur la plaque Nom du gène Abréviation du nom

A1 Adenosine deaminase, RNA-specific ADAR

A2 ADP-ribosylation factor-like 5A ARL5A

A3 Activating transcription factor 5 ATF5

A4 Beta-2-microglobulin B2M

A5 BCL2-associated athanogene 3 BAG3

A6 Bone marrow stromal cell antigen 2 BST2

A7 Interferon-induced protein 44-like IFI44L

A8 Caspase 1, apoptosis-related cysteine peptidase (interleukin 1,

beta, convertase) CASP1

A9 Caveolin 1, caveolae protein, 22kDa CAV1

A10 Core-binding factor, beta subunit CBFB

A11 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) CDKN1B

A12 2',3'-cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase CNP

B1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 CXCL10

B2 Defender against cell death 1 DAD1

B3 Diablo homolog (Drosophila) DIABLO

B4 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 2 DNAJB2

B5 Interferon, alpha-inducible protein (clone IFI-15K) G1P2

B6 Interferon, alpha-inducible protein (clone IFI-6-16) G1P3

B7 Guanylate binding protein 1, interferon-inducible, 67kDa GBP1

B8 Guanylate binding protein 2, interferon-inducible GBP2

B9 GTP cyclohydrolase 1 (dopa-responsive dystonia) GCH1

B10 H19, imprinted maternally expressed untranslated mRNA H19

B11 Major histocompatibility complex, class I, A HLA-A

B12 Major histocompatibility complex, class I, B HLA-B

C1 Homeobox B2 HOXB2

C2 Heat shock 70kDa protein 6 (HSP70B') HSPA6

C3 Interferon, gamma-inducible protein 16 IFI16

C4 Interferon, alpha-inducible protein 27 IFI27

C5 Interferon, gamma-inducible protein 30 IFI30

C6 Interferon-induced protein 35 IFI35

C7 Interferon-induced protein 44 IFI44

C8 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 IFIT1

C9 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 IFIT2

C10 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3 IFIT3

C11 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5 IFIT5

Annexes

194

C12 Interferon induced transmembrane protein 1 (9-27) IFITM1

D1 Interferon induced transmembrane protein 2 (1-8D) IFITM2

D2 Interferon, alpha 1 IFNA1

D3 Interferon (alpha, beta and omega) receptor 1 IFNAR1

D4 Interferon (alpha, beta and omega) receptor 2 IFNAR2

D5 Interferon, beta 1, fibroblast IFNB1

D6 Interferon, gamma IFNG

D7 Interferon, omega 1 IFNW1

D8 Interferon-related developmental regulator 1 IFRD1

D9 Interferon-related developmental regulator 2 IFRD2

D10 Interleukin 2 receptor, beta IL2RB

D11 Interferon regulatory factor 1 IRF1

D12 Interferon regulatory factor 2 IRF2

E1 Interferon regulatory factor 3 IRF3

E2 Interferon regulatory factor 5 IRF5

E3 Interferon regulatory factor 7 IRF7

E4 Interferon stimulated exonuclease gene 20kDa ISG20

E5 Interferon-stimulated transcription factor 3, gamma 48kDa ISGF3G

E6 Inter-alpha (globulin) inhibitor H2 ITIH2

E7 Janus kinase 1 (a protein tyrosine kinase) JAK1

E8 Poly (ADP-ribose) polymerase family, member 14 PARP14

E9 Lysosomal-associated membrane protein 1 LAMP1

E10 Mal, T-cell differentiation protein MAL

E11 Mitogen-activated protein kinase kinase 1 MAP2K1

E12 Met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor) MET

F1 MAX binding protein MNT

F2 Myxovirus (influenza virus) resistance 1, interferon-inducible

protein p78 (mouse) MX1

F3 Myxovirus (influenza virus) resistance 2 (mouse) MX2

F4 V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) MYC

F5 Myeloid differentiation primary response gene (88) MYD88

F6 N-myc (and STAT) interactor NMI

F7 Neuregulin 1 NRG1

F8 2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa OAS1

F9 2'-5'-oligoadenylate synthetase 2, 69/71kDa OAS2

F10 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like OASL

F11 Phospholipase A2, group IB (pancreas) PLA2G1B

F12 Promyelocytic leukemia PML

Annexes

195

G1 Protein kinase C, zeta PRKCZ

G2 Protein kinase, interferon-inducible double stranded RNA

dependent activator PRKRA

G3 PRKR interacting protein 1 (IL11 inducible) PRKRIP1

G4 Proteasome (prosome, macropain) activator subunit 2 (PA28

beta) PSME2

G5 Pituitary tumor-transforming 1 PTTG1

G6 Regulator of chromosome condensation (RCC1) and BTB

(POZ) domain containing protein 1 RCBTB1

G7 SAM domain, SH3 domain and nuclear localisation signals, 1 SAMSN1

G8 SH2 domain protein 1A, Duncan's disease

(lymphoproliferative syndrome) SH2D1A

G9 Solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate

transporter), member 2 SLC1A2

G10 Suppressor of cytokine signaling 1 SOCS1

G11 Suppressor of cytokine signaling 3 SOCS3

G12 Signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa STAT1

H1 Signal transducer and activator of transcription 2, 113kDa STAT2

H2 Transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B

(MDR/TAP) TAP1

H3 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 TNFSF10

H4 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 7 TNFSF7

H5 Tripartite motif-containing 22 TRIM22

H6 Tripartite motif-containing 34 TRIM34

H7 Tyrosine kinase 2 TYK2

H8 Vascular endothelial growth factor VEGF

H9 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH

H10 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH

H11 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 HPRT1

H12 Ribosomal protein L13a RPL13A

Annexes

196

Les tableaux S2 et S3 présentent les résultats de génétique obtenus pour l’association

des polymorphismes rs3741981 et rs10774671 d’OAS1 avec la susceptibilité à la SEP. Pour

ces travaux les deux polymorphismes ont été génotypés sur une cohorte SEP composée de

familles trio françaises.

Tableau S2 : Analyse TDT des polymorphismes rs3741981 et rs10774671 d’OAS1 dans la SEP sur 591

familles trio françaises.

Marqueur Allèle Fréquencea Tb Ub T/Ub P

rs3741981 A 0,54 292 283 1,03 0,68

rs10774671 G 0,37 277 271 1,02 0,80 aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U).

Tableau S3 : Analyse TDT des haplotypes formés par des polymorphismes rs3741981 et rs10774671

d’OAS1 dans la SEP sur 591 familles trio françaises.

Haplotype

(rs3741981-rs10774671) Fréquencea Tb Ub T/Ub P

AA 0,54 291 281 1,04 0,68

GG 0,37 279 270 1,03 0,69

GA 0,09 84 103 0,81 0,16

aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U).

197

BBII BBLL II OOGGRRAAPPHHII EE

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