脑星形细胞肿瘤中 Survivin基因的表达及其病理意义

研究生 曹晓蕾

导 师 陈 莉

脑星形细胞肿瘤是中枢神经系统中最为常见的一类肿瘤，约占颅内肿瘤的 30% ，可发生于各个年龄期，尤以 30-40 岁为高峰发病年龄 [1] 。由于脑星形细胞肿瘤无论分化高低均呈浸润性生长，因此多数病人远期疗效较差，即使经过标准治疗（手术 + 放疗 + 全身化疗）后，仍难以达到根治。一般认为其中位生存期不足 1 年 [2], 是一类严重危害人类健康的疾病。

对肿瘤发生发展的机制研究中越来越多的证据显示细胞凋亡异常与细胞恶性增殖和分化受阻一样，在大多数恶性肿瘤的发病学上起重要作用，涉及到细胞凋亡信号途径的所有方面。其中，研究最深入、广泛的是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的异常。

凋亡蛋白抑制因子家族（ inhibitor of apoptosis proteins ， IAPs ）新成员 Survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。 Survivin mRNA 在大多数正常组织中无表达[3] , 广泛表达于人类各种肿瘤组织。其独特的结构，选择性的细胞内分布的特点，具有明显细胞周期性，只在 G2/M 期表达，自 1997 年被发现以来， Survivin 与肿瘤的关系已成为研究热点。

肿瘤的生长、局部浸润及转移依赖血管形成，因此，肿瘤组织内的微血管形态、分布、数量等对肿瘤的生长、治疗和预后至关重要。星形细胞肿瘤分化程度较低时，肿瘤常有出血、坏死。因而对星形细胞肿瘤中血管生成的研究更为重要。 CD34 作为一种公认的血管内皮标记物，可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究，因此可通过 CD34 的单克隆抗体标记星形细胞肿瘤中的微血管（ MV ），在镜下（ 10×20 倍）计算MVD, 以探究星形细胞肿瘤中血管形成的规律。

本实验将应用免疫组化和 RT-PCR 的方法检测 70 例脑星形细胞肿瘤中 Survivin 的表达，同时结合临床随访资料，探讨 Survivin 表达与脑星形细胞肿瘤的临床因素、肿瘤病理分级、 MVD 以及预后之间的关系。

一、材料与方法

㈠标本人脑星形细胞肿瘤标本 70 例，分别由南通医学院病理教研室、南通医学院附属医院病理科、常州市第一人民医院病理科提供，为 1996-2002 年常规外检的病理蜡块。其中男 48 例，女 22 例，年龄 20-77岁，平均年龄 49.3 岁。根据世界卫生组织的年龄分期标准以 44 岁为界，将本文病例分为青年组（≤ 44 岁）和中老年组（＞ 44 岁）两组。

标本均经过常规病理组织学检查，双盲法根据瘤细胞多形性、核分裂、肿瘤中出血坏死、肿瘤血管形成等按照WHO 标准进行分级：Ⅱ级 10 例，Ⅲ级 26 例，Ⅳ级 34 例。其中 26 例标本同时有新鲜肿瘤组织保存于－ 70℃低温冰箱（Ⅱ级 3 例，Ⅲ级7 例，Ⅳ级 16 例）。另取 1 例源于交通事故脑外伤手术患者的 100mg 脑新鲜组织、 5 例非正常死亡的人脑组织蜡块分别作为正常对照组，由南通医学院附属医院脑外科及南通医学院法医教研室提供。

㈡主要试剂

2.RT-PCR试剂

RT-PCR试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司，包括 Trizol 、 RT试剂盒、 PCR试剂盒、 Survivin 引物合成、 β-actin 引物合成。 DL2000 DNA Marker购于 TaKaRa 公司。

1. 免疫组化试剂

兔抗人 Survivin 多克隆抗体（ RAB-0536 ）、鼠抗人 CD34 单克隆抗体（ MAB-0034 ）、超敏 SP （鼠 /兔）试剂盒（ KIT-9710 ）、 DAB 显色试剂盒（ DAB-0031 ）均为即用型，购自福建迈新生物技术有限公司。

㈢方法1.RT-PCR检测 Survivin 基因的表达

⑴组织中总 RNA的提取①取保存于 -70℃冰箱中的人脑星形细胞肿瘤组织、正常人脑组织各约 50-100mg （相当于 1 到 2粒米粒大小），置于 1.5ml玻璃匀浆器中，加入 1mlTrizol充分匀浆。

②将匀浆液转至 1.5ml灭菌 EP 管中，室温静置 5 分钟。

③加入 0.2ml氯仿，震荡 15秒，静置 2 分钟。

④4℃离心， 12000g×15 分钟，取上清（ 100μl枪轻轻吸）。

⑤加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10 分钟。

⑥4℃离心， 12000g×15 分钟，弃上清。

⑦加入 1ml75%酒精，轻轻洗涤沉淀， 4℃离心，7500g×5 分钟，弃上清。

⑧晾干，根据提取的 RNA 量加入适量的 DEPC水溶解（ 65℃促溶 15 分钟）。

⑨使用蛋白核酸定量仪定量：实际 RNA浓度（ mg/ml ） = 测得的 RNA浓度 ×50/1000 。

⑩RNA变性胶电泳，电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察条带，判断组织中的 RNA 是否降解。

⑵ cDNA 第一链的合成（ 20ul体系）按以下次序将各成分加入一 0.5mlEP 管中

5×RT buffer 4.0ul

dNTP Mix （ 10mM ） 2.0ul

Oligo(dT)18Primer(0.5ug/ ul) 1.0ul

逆转录酶 1.0ul

酶抑制剂 0.5ul

DEPC水 9.5ul

模板链 RNA 2ul

总体积 20ul

42℃， 1 小时， 70℃， 10 分钟。

⑶PCR 操作步骤（ 20ul 反应体系） 按下列次序将各成分加入一 0.5ml 的离心管中

10×PCR Buffer 2.0ul

Mg2++ 1.5ul

dNTP mix （ 2mM ） 2.0ul

Survivin 特异性 primer （ 10pmol/ul ） 2.0ul

cDNA模板 2.0ul

双蒸水 8.1ul

TaqDNA聚合酶 0.4ul

94℃， 3 分钟 94℃， 45秒（变性）

↙37次↖

50 1℃ 分钟 72 1℃ 分钟 72℃， 5min 4℃保存

（褪火） （延伸） （总延伸）

于第 8 个循环 72℃、 35秒时按暂停，加入 2ulβ-actin 特异性引物。

β-actin目的基因产物为 495 bps ，

其序列：上游 5’AAGTACTCCGTGTGGATCGG3’

下游 5’ATGCTATCACCTCCCCTGTG3’

Survivin目的基因产物为 377bps ，

其序列：上游 5’TATCTGCCAGACGCTTCCTA3’

下游 5’ATGACCTCCAGAGGTTTCCA3’

⑷PCR 产物的检测和分析

取 PCR产物 5ul + 6×lodding 1ul混匀后加样 ,进行 1%琼脂糖凝胶电泳，同时加 4ulDL2000 DNA Marker 作为 PCR产物长度对照。电压 100V, 30 分后将胶板置于紫外灯下观察， Survivin 和 β-actin产物条带分别位于377bps 和 495bps处。 PCR产物条带的密度测定采用四星凝胶图像分析系统进行，以 Survivin 带亮度 (Ls) 、β-actin 带亮度 (Lβ) 分别与背景亮度 (Lb) 的差值之比表示该 Survivin 的相对表达量 , 用公式表示为 :

Survivin 的相对表达量 =(Ls-Lb)/(Lβ- Lb) 。

2.免疫组化染色 SP法Survivin 、 CD34 均需柠檬酸缓冲液高温修复。

免疫组化结果判断

①肿瘤实质细胞中 Survivin阳性反应定位于细胞质呈棕黄色。参照 Kawaski[4] 等采用半定量积分法判断结果 :

阳性细胞数＜ 5% 为 0 分， 6%-25% 为 1 分， 26%-50% 为 2 分， 51%-75% 为 3 分，＞ 75% 为 4 分；

阳性强度淡黄色为 1 分，黄色为 2 分，棕黄色为 3 分。

两积分相乘， 0 分为阴性（ - ）， 1-4 分为弱阳性（＋）， 5-8 分为中等阳性（＋＋）， 9-12 分为强阳性（＋＋＋）。

②CD34：肿瘤间质血管内皮细胞标记物 ,阳性部位位于内皮细胞胞膜和胞浆。以 CD34 标记 MV ， MV呈棕黄色。

③MVD观察与计数：以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管，只要结构不相连，其分枝结构也作为一个血管计数（管腔结构及内含红细胞并非计数所必须）。先在显微镜低倍视野（ 4×10 倍）下选定高 MVD处 ,再在高 MVD5 个高倍视野（ 20×10 倍）下，计数 MVD ，取其平均值作为该标本的MVD 。

㈣病例随访情况 对 30 例有确切地址的 2000 年底前进行手术的星形细胞肿瘤患者术后进行随访，随访至 2003 年 12月止，结果随访到 26 例，失访 4 例，随访率为 86.67% （ 26/30 ）。随访结果显示星形细胞肿瘤患者术后生存时间为 0-40 个月不等。

㈤统计学处理两样本均数比较用 t 检验；

多组数值变量资料间比较用单因素方差分析；

率的比较用 χ2 检验 ；

等级资料的比较采用秩和检验 ,两样本比较采用 Wilcoxon 法，多个样本比较采用 Kruskal-Wallis 法 , 多个样本两两比较采用 t 检验；

对随访资料的分析采用 Kaplan-Meier 法 ,两组生存率的比较用 Wilcoxon-Gehan 检验，多组生存率的比较用 log-rank 检验。

检验水准 α＝ 0.05 。

二、结果

㈠ RT-PCR 检测 Survivin 基因 mRNA 的表达1. 总 RNA 的提取与检测

随机取 3 例进行变性胶电泳检测 RNA 的质量，结果见图 1 ， 28S 、 18S条带清晰可见， 5S条带很弱，且 28S条带亮度远远大于 18S条带，说明提取的总 RNA完整，没有降解。三条泳道条带亮度基本一致，说明 RNA 上样量基本相同。

图 1 .RNA 变性胶电泳

2.RT-PCR 检测 Survivin 基因的表达与肿瘤临床病理因素的关系 ⑴RT-PCR检测 Survivin 基因的表达

Survivin 基因的 RT-PCR产物为 377 个碱基，

β-actin 的 RT-PCR产物为 495 个碱基。

26 例脑星形细胞肿瘤中 Survivin 基因的表达见图 2 、3 。

495bps

377bps

495bps

377bps

图 2 、 3 ， M： DL2000 DNA Marker ； N：正常脑组织； 1-26 为星形细胞肿瘤

由图 2 、 3 显示，本组脑星形细胞

肿瘤中 Survivin 基因的阳性检出率

为 65% （ 17/26 ），正常脑组织中未检测到 Survivin 的表达。

⑵Survivin 基因表达与脑星形细胞肿瘤临床病理

特征的关系

不同性别的患者， Survivin 基因表达的阳性率分别为：男性70% （ 14/20 ），女性 50% （ 3/6 ），不同性别间 Survivin基因表达无显著差异（ P＞ 0.05 ）。

不同年龄的患者， Survivin 基因表达的阳性率分别为：＞ 44岁 66.67% （ 12/18 ），≤ 44 岁 62.5% （ 5/8 ），不同年龄组间 Survivin 基因的表达无显著差异（ P＞ 0.05 ）。

不同病理分级的脑星形细胞肿瘤， Survivin 基因表达的阳性率分别为：Ⅱ级 66.67% （ 2/3 ），Ⅲ级 85.71% （ 6/7 ），Ⅳ级 56.25% （ 9/16 ），各病理级别间 Survivin 基因的表达无显著差异（ P＞ 0.05 ）。

3.Survivin 基因相对表达量与脑星形细胞肿瘤临床病理因素的关系根据公式 Survivin 基因的相对表达量 =(Ls-Lb)/(Lβ- Lb)

分别计算出各例的 Survivin 基因相对表达量，进一步

分析，本组有 17 例脑星形细胞肿瘤表达 Survivin 基因，Survivin 基因相对表达均量为 1.08±0.17 。

Survivin 基因相对表达量与脑星形细胞肿瘤病理分级的关系

病理分级 例数 Survivin相对表达量 P值

Ⅱ 2 0.855±0.007

Ⅲ 6 1.02±0.08 P=0.0233

Ⅳ 9 1.171±0.175

在脑星形细胞肿瘤的不同病理级别间 Survivin 基因相对

表达量存在显著差异（ P ＜ 0.05 ），

两两比较显示， Survivin 基因相对表达量在Ⅱ级与Ⅳ级

间（ P=0.039 ）存在显著差异，而在Ⅱ级与Ⅲ级间 （ P=0.384 ）、Ⅲ级与Ⅳ级间（ P=0.163 ）无显著差异。

㈡免疫组化染色结果

1.Survivin蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达

2.脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与

MVD的关系

3.脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与

术后生存时间的关系

⑴Survivin阳性染色均定位于肿瘤细胞的胞浆中，

棕黄色颗粒状 ( 见照片 1 、 2 、 3) ，阳性细胞呈弥漫或

局灶分布。

本组病例 Survivin 蛋白阳性表达率为 57.14% （ 40/70 ），

其中（ + ）为 12 例，（ ++ ）为 19 例，（ +++ ）为 9 例。

5 例相对正常脑组织中 Survivin 表达阴性。

Survivin 阳性染色定位于肿瘤细胞的胞浆中，

呈棕黄色颗粒状（免疫组化 SP 法 ×500 ）

Survivin 强阳性染色，肿瘤细胞的胞浆中可见

棕黄色颗粒（免疫组化 SP 法 ×500 ）

Survivin 强阳性染色，肿瘤细胞的胞浆中可见

棕黄色颗粒（免疫组化 SP 法 ×500 ）

不同病理分级、年龄、性别中 Survivin 蛋白的表达率

Ⅱ级阳性率为 10% （ 1/10 ），Ⅲ级阳性率为 53.85%（ 14/26 ），Ⅳ级阳性率为 73.53% （ 25/34 ）。

青年组阳性率为 45% （ 18/40 ），中老年组阳性率为73.33% （ 22/30 ）。

男性阳性率为 60.42% （ 29/48 ），女性阳性率为 50%（ 11/22 ）。

不同年龄组间、不同性别间 Survivin 表达无显著差异（分别进行 Wilcoxon两样本比较法，均 P＞ 0.05 ）。

Survivin 蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达率

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ⅱ 级 Ⅲ 级 Ⅳ级 青年组 中老年组 男性 女性

阴性率阳性率

⑵脑星形细胞肿瘤中不同病理分级间 Survivin 蛋白表达的比较

Survivin 蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达

病理分级 例数 Survivin 表达强度 H （ u ） P值

－ ＋ ＋＋ ＋＋＋

Ⅱ 10 9 1 0 0

Ⅲ 26 12 4 6 4 10.43 P＜ 0.05

Ⅳ 34 9 7 13 5

不同级别的脑星形细胞肿瘤间， Survivin 的表达有显著差别（ Kruskal-Wallis 法， P＜ 0.05 ）；

两两比较的秩和检验（ t 检验法）显示，脑星形细胞肿瘤Ⅱ级与Ⅲ级 (t=2.45 ， P ＜ 0.05) ，Ⅱ级与Ⅳ级 (t=3.45 ， P ＜ 0.05)Survivin 表达存在显著差异，而Ⅲ级与Ⅳ级间（ t=1.27 ， P＞0.05 ） Survivin 表达无显著差异。

⑴CD34阳性反应物为棕黄色颗粒，分布在血管内皮

细胞胞膜和胞浆 ( 见照片 4 、 5 、 6) 。以 CD34 标记 MV ，

MV 呈棕黄色，并计算 MVD 。

CD34 在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化 SP 法 ×150 ）

CD34 在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化 SP 法 ×250 ）

CD34 在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化 SP 法 ×500 ）

⑵脑星形细胞肿瘤中 MVD与 Survivin 蛋白表达强度的关系

脑星形细胞肿瘤中 MVD 与 Survivin 蛋白表达强度的关系

Survivin 表达强度 例数 微血管密度（ MVD ） P值

＋ 12 14.42±4.92

＋＋ 19 18.74±3.30 P=0.0000

＋＋＋ 9 25.31±4.81 (F=17.50)

MVD 在 Survivin 不同表达强度间存在显著差别 (P＜ 0.05),

Survivin （ +）与 Survivin （ ++）间（ P=0.028），

Survivin （ +）与 Survivin （ +++）间 (P=0.000)，

Survivin （ ++）与 Survivin （ +++）间 (P=0.002)均存在显著差异

经 Spearman 等级相关分析显示， Survivin 表达强度与 MVD 呈显著

正相关（ rs=0.6682， P ＜ 0.05）。

⑴本组病例有术后随访结果 26 例，术后存活时间为 0-40 个月不等。

Survivin 表达（－）组随访到 12 例，术后平均生存时间为 17±9.8个月；

Survivin 表达阳性组术后平均生存时间为 6.6±6.5 个月，其中 Survivin 表达（ + ）组随访到 4 例，术后平均生存时间 14.5±5.3 个月，

Survivin 表达（ ++ ）组随访到 5 例，术后平均生存时间 5.2±4.0个月，

Survivin 表达（ +++ ）组随访到 5 例，术后平均生存时间为 1.6±1.8 个月。

脑星形细胞肿瘤 Survivin 蛋白的表达与术后生存时间的关系

Group1： Survivin(-)； Group2： Survivin(+)；

Group3： Survivin(++)； Group4： Survivin(+++)

经 Log-rank 时序检验， Survivin 不同表达强度之间的生存率有显著差别（ =24.55 ， P＜ 0.05 ）。

进一步两两比较， Survivin 表达（－）组的生存率高于Survivin 表达（ ++ ）组（ P=0.0052 ）及 Survivin 表达（ +++ ）组（ P=0.0018 ）；

Survivin 表达（ + ）组的生存率高于 Survivin 表达（ ++ ）组（ P=0.0143 ）及 Survivin 表达（ +++ ）组（ P=0.0139 ）；

Survivin 表达（－）组与 Survivin 表达（ + ）组的生存率无显著差异（ P=0.7611 ）， Survivin 表达（ ++ ）组与 Survivin 表达（ +++ ）组的生存率无显著差异（ P=0.1693 ）。

⑵分别统计Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑星形细胞肿瘤中 Survivin阳性者与阴性者的术后生存时间。

Ⅱ级阳性者无随访资料，阴性者有 1 例随访资料，术后生存时间为 24 个月；

Ⅲ级随访到 14 例，阳性者为 7 例，术后平均生存时间为 9.7±6.6 个月，阴性者为 7 例，术后平均生存时间为18.1±10.2 个月；

Ⅳ级随访到 11 例，阳性者为 7 例，术后平均生存时间为 3.4±4.9 个月，阴性者为 4 例，术后平均生存时间为13.2±10.3 个月。

Ⅲ 级星形细胞肿瘤 Survivin 蛋白的表达与术后生存时间的关系

Group1： Survivin(-)； Group2： Survivin(+)

Ⅳ 级星形细胞肿瘤 Survivin 蛋白的表达与术后生存时间的关系

Group1： Survivin(-)； Group2： Survivin(+)

经 Wilcoxon-Gehan 检验显示，

Ⅲ 级中阴性者的生存率高于阳性者（ P=0.0472 ），

Ⅳ 级中阴性者的生存率也高于阳性者（ P=0.0462 ）。

㈢ RT-PCR 与免疫组化检测 Survivin 表达结果的比较1.比较 26 例同时进行 RT-PCR 和免疫组化检测 Survivin结果

RT-PCR 和免疫组化检测结果的比较

免疫组化检测 RT-PCR 检测 合计

+ －

+ 13 3 16

－ 4 6 10

合计 17 9 26

进行配对检验 ,P=1.000 ，提示两种检测方法无显著差异。

进一步做相关分析， rn=0.4218 ，提示两种方法呈正相关。

2.比较 17 例免疫组化 Survivin 不同表达强度与RT-PCR 结果为阳性 Survivin相对表达量的关系 Survivin 基因相对表达量与免疫组化表达强度间的关系

免疫组化表达强度 例数 Survivin 基因相对表达量 P值

－ 4 0.91±0.09

+ 3 1.02±0.07 P=0.0003

++ 6 1.06±0.12 （ F=13.44 ）

+++ 4 1.32±0.06

单因素方差分析显示， Survivin 基因相对表达量在免疫组化不同表达强度间存在显著差异（ P＜ 0.05 ），两两比较显示， Survivin 基因相对表达量在免疫组化表达为（ - ）、（ + ）、（ ++ ）分别与（ +++ ）间（分别 P=0.000 、 P=0.009 、 P=0.008 ）存在显著差异，而其他各组间 Survivin 相对表达量无显著差异（ P=0.547 、P=0.164 、 P=0.940 ）。经 Spearman 等级相关分析（ rs=0.7468 ， P=0.0034 ）提示 Survivin 基因在免疫组化表达强度与由 RT-PCR检测的该基因的相对表达量间存在正等级相关关系，即随着 Survivin 基因相对表达量的增高，免疫组化表达强度也相应的增强。

三、分析与讨论

凋亡蛋白抑制因子家族（ IAPs ， inhibitor of apoptosis proteins ）是抑制细胞凋亡的重要成分，该家族抑制细胞凋亡的作用远远大于 bcl-2 家族的作用 [5] 。 Survivin 是 1997 年由耶鲁大学的 Ambrosini 等首先发现 [3] 的一种新的 IAP 家族成员。该基因定位于人染色体 17q25.3区，基因全长 15kb ，由 4 个外显子和 3 个内含子组成，编码含有 142 个氨基酸，分子量为 16.5kd属于胞浆蛋白。

作为最强的凋亡抑制因子之一， Survivin主要通过以下方式，直接或间接抑制 caspase 活性而发挥抗凋亡作用：① Survivin粘附于活化的 caspase-3或 caspase-7；

②Survivin直接结合 caspase9;

③Survivin封闭辅助性线粒体源性 caspase 激活因子（ SMAC ）保护 IAPs 家族成员免受其抑制；

④ Survivin 增强 IAPs 家族其他成员功能，对抗 SMAC 的作用。

⑤Survivin还能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，间接抑制 caspase 对纺锤体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，使细胞逃避细胞周期 G2 /M 期检测点（ checkpoint ）的监控，抵抗因 DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致细胞异常分裂增殖 。

Survivin 还参与细胞增殖、分裂和细胞周期的调控。研究显示， Survivin 是调控细胞 G2/M 期的基因，它与周期素依赖蛋白激酶 Cdk4相互作用启动了细胞周期，导致大量细胞无限制增殖 [8] 。Survivin 的过表达，造成细胞增殖增加，凋亡减少，打破了两者间的平衡，导致肿瘤的发生。

Survivin 在血管形成过程中发挥了重要作用O’connor DS[9] 等用血管内皮生长因子（ VEGF ）和碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF ）诱导静止期的内皮细胞分裂，发现血管内皮细胞 Survivin 表达量升高了 16 倍，提示 Survivin 可能是血管形成中生长因子诱导的保护性基因。

Tran运用反义核苷酸阻断 Survivin 的表达后发现，由 VEGF介导的血管形成被明显抑制，提示 Survivin 抑制凋亡可能不仅局限对肿瘤细胞，对血管内皮细胞可能也存在着通过 VEGF 的介导进而抑制内皮细胞凋亡的作用 [10] 。

肿瘤血管生成在肿瘤发生、发展过程中至关重要，而 Survivin对内皮细胞凋亡的抑制在肿瘤血管形成中发挥了关键作用，因此拮抗 Survivin 有望成为抗肿瘤治疗的重要靶点。

Survivin 基因只表达于恶性肿瘤组织中，而在正常分化的成人组织中除胸腺和胎盘组织微弱表达外，其余组织无表达。

本研究结果指出，无论是应用 RT-PCR 对新鲜组织中Survivin 基因表达的研究还是应用免疫组化对固定保留组织中 Survivin 表达的研究，结果均显示 Survivin只表达于脑星形细胞肿瘤，而在正常脑组织中均无表达，说明 Survivin 表达是脑星形细胞肿瘤的特异性分子事件，该结果与文献报道一致。

本文应用免疫组化和 RT-PCR 法检测长期固定的石蜡组织中或是手术后－ 70℃保存的新鲜组织中 Survivin 的表达，结果显示，脑星形细胞肿瘤中 Survivin基因在新鲜组织的 RT-PCR 中的阳性检出率为 65% ；应用免疫组化检测 Survivin 蛋白的阳性表达率为 57.14% 。该比例稍高于同类研究，国内周逸鸣等用免疫组化 ABC 法检测脑星形细胞肿瘤中 Survivin 检出率为 37.9%[13] 。本组检测阳性率偏高的原因可能是本组样本中高级别的脑星形细胞肿瘤较多，或本组使用的迈新公司的 Survivin 抗体（即用型试剂）及 SP 试剂均较为敏感。

本实验中 RT-PCR 的研究结果显示， Survivin 基因的相对表达量在恶性程度高的Ⅳ级脑星形细胞肿瘤中显著高于Ⅱ级（ P＜ 0.05 ），而与患者的年龄、性别无明显关系。免疫组化结果显示，随着肿瘤级别的提高， Survivin阳性率也逐步上升，在Ⅱ级脑星形细胞肿瘤中 Survivin 表达的阳性率与表达强度均较低，在Ⅲ、Ⅳ级脑星形细胞肿瘤中 Survivin 表达的阳性率与表达强度增加，显著高于Ⅱ级，但高级别Ⅲ、Ⅳ级之间无显著差异。该结果与国外的同类研究相符 [14 、 15] 。

星形细胞肿瘤中表达 Survivin 的细胞常为生长旺盛的肿瘤细胞，阳性表达的细胞核大，核膜增厚，常染色质为主，常伴核仁，这些获得抗凋亡能力的肿瘤细胞获得了永生性（ immortality ），可造成肿瘤细胞增殖。肿瘤细胞增殖，又使 Survivin 过度表达，Survivin 与肿瘤细胞增殖互为因果。有研究表明，70% 的星形细胞肿瘤会向恶性程度高的方向转化，Survivin 表达阳性细胞对凋亡的进一步抵抗可能是这种转变中的重要一环。

免疫组化实验结果显示， Survivin 表达阳性的同一标本中，并非所有的肿瘤细胞均呈阳性染色，而同一级别的不同标本，阳性染色的细胞数也有差异。

这一现象可能与 Survivin 表达的细胞周期特异性有关。由于Survivin 只在 G2/M 期表达，而同一肿瘤组织内的肿瘤细胞处于不同的细胞周期，因此只有处于 G2/M 期的肿瘤细胞才可呈现阳性反应，那些处于 G1/S 期的肿瘤细胞则呈阴性反应。而同一级别的不同标本中，癌细胞总体动力周期不同，因此 Survivin阳性染色的细胞数有差别。

除此以外，肿瘤细胞本身的异质性也决定了并非所有细胞均同步同样表达 Survivin 。

由于存在一些 Survivin 表达阴性的肿瘤，故推测，除了 Survivin调控肿瘤凋亡抑制外，尚有其他因素调节肿瘤细胞的抗凋亡，尚有其他因素维持着肿瘤细胞的增生与永生化。

本研究以 CD34 标记血管内皮细胞来计算 MVD ，结果显示 MVD 在 Survivin 不同表达强度间存在显著差别，随着 Survivin 表达强度的增强， MVD 相应增高， Survivin 表达强度与 MVD 呈高度正相关。

该结果提示， Survivin 与星形细胞肿瘤的血管形成可能存在密切关系， Survivin 的高表达会增加肿瘤血管的形成，使肿瘤级别增加，因此，高级别星形细胞肿瘤常表现为高血管性，这些新生的血管可为肿瘤的生长提供营养，也可为肿瘤细胞侵袭进入循环系统提供良好的机会，从而促进肿瘤的恶性进展。

有报道指出，在结肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤等恶性肿瘤检测 Survivin mRNA或蛋白质表达对预测预后有一定的价值 [16-19] 。

本实验中，术后随访到 26 例，随访率为 86.67% （ 26/30 ）。免疫组化结果显示， Survivin 表达阳性者其术后存活时间显著低于 Survivin 表达阴性者，而且在相同级别的Ⅲ级和Ⅳ级星形细胞肿瘤中， Survivin 阳性者术后存活期同样短于阴性者。说明这些患者在常规进行化疗中， Survivin阳性表达细胞可能直接产生对化疗抵抗，使其术后疗效不佳，生存期较短。正如在对肺癌细胞的体外培养时发现， Survivin阳性的细胞株比阴性者具有更强的抵抗化疗的能力 [20] 。本组研究结果提示 Survivin 的高表达预示着星形细胞肿瘤患者预后不良。 Survivin 可成为一个有价值的评估星形细胞肿瘤预后的指标之一。

本实验分别采用了 RT-PCR 和免疫组化两种方法对 Survivin 的表达进行研究。对所获得的实验结果进行比较，显示两种方法间在检测 Survivin 表达率的差异无显著性，并且高度相关。逆转录 -聚合酶链反应（ reverse transcription-polymerase chain reaction ， RT-PCR ），该方法检测的灵敏性较高 [21] ，使组织中微量表达的基因通过扩增使其被定量分析成为可能，比较免疫组化方法阳性检出率高了近 10个百分点。但该方法需要新鲜组织，在新鲜组织保存中 RNA极易降解，使该方法应用于临床受到了限制。

用免疫组化技术在石蜡组织切片中检测 Survivin 基因表达，可以在肿瘤组织原位观察 Survivin 表达的定位及反应强度，较客观地反映了星形细胞肿瘤中 Survivin 蛋白表达，并可以直接与形态学改变进行比较分析。因免疫组化可用于石蜡切片中，所以可用于回顾性分析，亦不需要特殊设备来贮存组织，更方便于临床研究。本文将 RT-PCR 及免疫组化这两种技术结合在一起进行研究，可将两者的优势互补，从而对 Survivin 在脑星形细胞肿瘤中的表达有一个较全面的了解。

尽管 RT-PCR 和免疫组化检测 Survivin 表达的结果有高度的相关性，但用两种方法所检测的 Survivin 表达其意义有所不同。 RT-PCR 检测的 Survivin 表达主要是存在于组织中经转录加工后的 Survivin mRNA ，而免疫组化法检测出的是表达于细胞浆中存在的 Survivin 特异性抗原（即经 Survivin mRNA 转录、翻译的特异蛋白质）。 RT-PCR 检测率高于免疫组化，是因为免疫组化检测的蛋白质在 Survivin mRNA进一步翻译过程中的降解或由于翻译水平的调控发生了异常，导致该 mRNA未被翻译。

本实验中， 26 例同时使用 RT-PCR 及免疫组化的标本，有 3例免疫组化呈阳性反应，而 RT-PCR 结果为阴性，而且这 3 例免疫组化正是弱阳性灶性表达，是否取材进行 RT-PCR 的组织正好处于 Survivin阴性区域或是太少而 PCR 不足以扩增至电泳可以检测的强度？还是经 Survivin 基因转录的 mRNA 在细胞内发生了降解，但 mRNA降解前翻译的 Survivin 蛋白仍然存在？其机制还有待于进一步研究。

事实上 Survivin 基因在脑星形细胞肿瘤中的表达是通过转录、翻译两个层次上多种途径分别进行调控的。调控途径和方式上的差异由何种原因引起，又将产生何种细胞生物学效应，将有待深入研究。肿瘤细胞群体的特征是“异质性” ，它们是有各种特性的“亚克隆”组成， Survivin 阳性的抗凋亡亚克隆参与并促进脑星形细胞肿瘤的演进和进展。

本实验还对 Survivin 基因相对表达量与免疫组化表达强度间的关系进行了研究。结果显示，免疫组化表达强度越高， Survivin 基因相对表达量亦越高，有高度一致性，并在不同表达强度中 Survivin相对表达量有显著差异， Survivin 基因相对表达量与免疫组化表达强度间存在正等级相关关系，说明在临床研究中同时使用两种方法或单独使用其中一种方法都能较好的提供 Survivin 基因表达的信息，具有较好的临床意义。

四、结论

㈢ Survivin 的高表达预示着星形细胞肿瘤患者预后不良， Survivin 可成为一个有价值的评估该肿瘤预后的指标。

㈠ Survivin 只表达于脑星形细胞肿瘤中，不表达于正常脑组织中，提示 Survivin 表达在脑星形细胞肿瘤中是个常见的特异性分子事件。

㈡随着星形细胞肿瘤分化程度的降低， Survivin相对表达量、表达强度均显著增强；随着 Survivin 表达强度的增强， MVD也相应增高。提示， Survivin 表达在保持高级别肿瘤的高细胞性、高血管性、使肿瘤从低级别向高级别恶性转化中起到重要的作用。

㈣ RT-PCR 检测 Survivin 基因 mRNA 表达具有更高的敏感性，但免疫组化方法检测 Survivin 基因蛋白表达具有更好的客观定位性和组织结构的完整性，这两种方法不失为检测 Survivin 基因的好方法，两种方法相结合可优势互补，单独使用其中一种方法也能较好的提供肿瘤中 Survivin 的表达信息。

㈤除 Survivin 基因在脑星形细胞肿瘤中调控凋亡抑制外，还有其他因素调节肿瘤抗凋亡和增殖的作用。

致 谢

本课题是在导师陈莉教授的悉心指导下完成的。研究生期间，陈老师在科研、工作上给了我很多关心、帮助和支持。导师治学严谨、学识渊博，待人宽厚，为我今后的工作学习树立了榜样。在此谨向导师陈莉教授表示衷心的感谢 !

课题进行过程中，还得到谭湘陵老师、干振康老师、鄂群老师、吴克荣老师的热心指导和帮助，以及教研室其他老师、研究生的帮助和支持，在此一同深表感谢！

借此机会，我再次向所有给予我无私关心和帮助的人，特别是我的老师和父母，表示深深的敬意和由衷的感谢！我能够顺利完成硕士研究生的所有课程和论文，离不开他们的全力支持，谢谢！

本课题标本及资料的收集得到了常州市第一人民医院病理科的大力帮助和支持，在此表示感谢 !

衷心感谢研究生管理科各位老师的关心与指导！