1

Софийски Университет “Св. Климент Охридски” Катедра “Обща и Промишлена Микробиология”

Магистратура

“Клетъчна биология и патология”

Курс: Клетъчно култивиране

Доц. А. Куюмджиева

2010 г., София

2

Основни характеристики на клетъчни култури от дрожди Морфологични признаци

Дрождевите микроорганизми се отличават от бактериите по относително големите размери, отсъствие на подвижност, наличие на диференцирано ядро. Те представляват едноклетъчни еукариотни организми, вегетативно размножаващи се чрез пъпкуване или деление. Размножаването може да се осъществи и чрез полов процес (дрожди от отдели Ascomycota и Basidiomycota). Известни са и дрожди, които при определени условия образуват мицеларни структури.

Формата на вегетативната дрождева клетка е разнообразна: кръгла, овална, яйцевидна /Saccharomyces/, цилиндрична /Shizosaccharomyces/, апикулатна или лимоновидна /Saccharomycodes/. Дрождите, които нямат полово размножаване (отдел Deuteromycota) имат по-характерна форма, отличаваща ги от другите видове: стреловидна /Bretanomyces/, триъгълна /Trigonopsis/ сърповидна /Selenotila/ кълбовидна /Schizoblastosporion/. Дрождите от р. Candida и Тrichosporon, наред с кръглите и овални клетки, могат да образуват дълги псевдомицелни клетки.

Средният диаметър на дрождевите клетки, които намират приложение в хранителната промишленост, е 3-5 мкм и дължина 6-10 мкм. Формата и размерите на дрождевата клетка зависят от възрастта, хранителната среда, начина на култивиране.

За изучаване морфологията на дрождите те се култивират на стерилна бирена мъст 8 – 10 %, бирен агар, глюкозо - пептонна вода или агар в среда със същия състав. Култивират се 2-3 денонощия при 25 – 28оС. Бавно растящите дрожди се микроскопират след 1-2 седмици, а след това културата се оставя за 4 седмици.

Характеристика на вегетативните клетки

Морфология на вегетативните клетки, култивирани на течни и твърди среди - растеж на течни среди Като правило клетъчната морфология и начинът на размножаване на клетките се

изследва на течна култура. 3а тази цел се използват малцов екстракт или 2-4 % глюкозо-дрождев екстракт. Материал от млада, активно расла на полегат агар, култура се инокулира в 30 мл среда. Инкубира се при 28-30оС за 2-3 дни и културата се изследва.

Отбелязва се формата на клетките и начинът на размножаване. Отбелязва се дали клетките са единични или във верижки. Измерва се дължината и ширината на клетките. Културалната характеристика се отбелязва след 2-3 дни инкубиране при 25-28оС и културата се изследва. Отбелязва се формата на клетките и начинът на размножаване. Измерва се дължината и ширината на клетките. Културалната характеристика се отбелязва отново след 4 седмици. Дрождите, култивирани на течни среди, могат да образуват седимент /компактен, рехав, мукозен/ или пеликула. Пеликулата може да бъде дебела, набръчкана, образуваща се за 1-2 дни. Обратно, може да бъде слизеста и влажна, формираща се само при продължително култивиране.

- растеж на твърда среда /морфологичен агар/ Когато се използва твърда среда за изследване на морфологията и културалните

признаци, се използва т.нар. Dalmau плакова техника. За целта се използва активно расла култура

Когато културата се изследва на твърди среди, трябва да се следят следните характеристики:

1. Консистенция: дали растежът е мукозен или вискозен. Мукозният растеж най-често е свързан с капсулиране на клетките в резултат на продукция на екстрацелуларни

3

полизахаридни продукти. Кохерентният растеж обичайно е асоцииран с образуване на обилен псевдомицел и истински мицел.

2. Цвят – отбелязват се различни цветове - жълт, оранжев, червен. Растежът може да е пигментиран от продукцията на пигменти от някои видове дрожди. Присъствието на жълти, червени, оранжеви каротеноидни пигменти е характерно за родовете: Rhodotorula, Sporobolomyces, Phaffia, Rhodosporidium, Sporidiobolus и продукция на некаротеноидни пигменти – пулчеримин, който е характерен за някои дрожди Metchnikovia pulcherina и някои видове Kluyveromyces. По-голям брой дрожди продуцират бял или кремав до кафяв пигмент.

3. Повърхност – гладка, грапава, набръчкана, назъбена. Щамовете могат да имат гладка повърхност по време на изолирането, а след известно време могаг да станат набръчкани. Характерен е преход S - R форми.

Образуване на псевдомицел и на истински мицел

Образуване на псевдохифи Ако дрождите се размножават предимно чрез пъпкуване, то зрялата пъпка може

или да се отдели веднага, или да остане прикрепена към майчината клетка и да даде начало на грозд или на верига от клетки. Способността на някои дрожди да формират вериги от клетки води до образуването на псевдохифи или псевдомицел. Псевдохифите или псевдомицелът имат връзка с образуването на удължени клетки, които се появяват след пъпкуване.

Псевдохифите могат да бъдат рудиментарни и в този случай те се състоят от удължени клетки с повече или по-малко еднакви размери или може да се диференцират в удължени клетки. Клетките могат да произвеждат бластоспори с обикновена или специфична подредба. Съществуват няколко вида образуване на псевдомицели, които могат да се групират, както следва:

• "тип Mycotоrula": псевдохифи, които се състоят от компактни, почти сферични гроздове от бластоспори, групирани около удължена псевдохифална клетка;

• "тип Mycotoruloide": псевдохифи с бластоспори в разклонени вертицили; • "тип Candida": псевдохифи с вериги от бластоспори, които се появяват на

съединителната връзка на съседни псевдохифални клетки; • "тип Mycocandida": силно разклонени псевдохифи, често с една-единствена или

с две симетрично разположени бластоспори или с бластоспори, организирани в малки вертицили на съединителната връзка на съседните псевдохифиални клетки;

• "тип Blastodendrion": сталагмоидни бластоспори, организирани в една или повече Penicillium-подобни структури.

Често се наблюдава появата на междинен тип и формирането на псевдохифи може да бъде в значителна степен повлияно от условията на култивиране.

Понякога единичната филаментозна клетка може да бъде разклонена, но без формиране на разделителна преграда. Този псевдомицел се нарича blastese. Той е характерен за дрождите Bretanomyces.

Образуване на истински хифи Дрождите не се размножават единствено чрез формиране на хифи, много видове

при подходящите условия произвеждат истински, разделени, септирани, разклоняващи се хифи. Истинските хифи се размножават чрез непрекъснат растеж на хифиалния връх,

4

последван от формиране на разделителни прегради (септи). Разделянето се забавя, изоставайки след растежа на хифиалния връх до степен, при която връхната клетка, измерена от върха до първата преграда, често е по-дълга от предходната клетка, измерена от първата до втората преграда.

На практика е трудно да се различат истинската хифа, псевдохифата и междинните форми. За да разграничи тези три форми, Wickerhan (1951) прилага следните критерии, основавайки се на наблюдение на връхните клетки на хифиалната структура:

� Истинската хифа обикновено има рефракционни прави прегради, които могат да бъдат оразличени по своята плътност и рефракционност от краищата на вакуолите. Псевдохифата няма прегради, а добавените клетки са изкривени и не са рефрактивни. Междинните форми обикновено показват нисък процент на клетки, разделени от септи.

� При истинските хифи много от терминалните клетки са значително по-дълги от непосредствено предхождащите ги. В псевдохифите терминалната клетка по правило е по-къса или почти еднаква по-дължина със съседната клетка. В междинните форми се откриват малко на брой случаи, при които терминалната клетка е видимо по-дълга от съседната й.

� Истинската хифа показва слабо или не показва стеснение на преградите в точките, където по-късно ще се образуват преградите, докато псевдохифата показва много ясни стеснявания. Истински хифи и псевдохифи могат да се наблюдават и едновременно (напр. Saccharomycopsis, Trichosporon). Хифата може да се “счупи” или разчлени с образуване на артроспори или артроконидии.

За рутинно изследване на формирането на псевдохифи и истински хифи обикновено се използват царевичен агар, оризов или морфологичен агар. Техниката, която се прилага, е т.нар. процедура “странични култури” или техника “Dalmau плака”.

Размножаване 1. Вегетативно (безполово) размножаване Вегетативното или безполово размножаване се среща при дрождите под формата

на пъпкуване, просто делене или комбинация от тези два процеса. Внимателното наблюдение на конидиогенезата ни осигурява надеждна информация, която допринася в голяма степен за идентификацията на щамовете.

Пъпките могат да се появят или върху дрождевата клетка, или на хифата. Размножаването чрез пъпкуване започва с образуването на малки инвагинации или на пъпка върху повърхността на клетката. При последващото развитие клетката остава повече или по-малко непроменена по размер, докато пъпката или бластоспората (бластоконидия) увеличава своя размер, за да образува нова клетка, която след известно време се отделя от майчината. В зависимост от това по какъв начин е образувана пъпката в рамките на ултраструктурата на клетъчната стена, пъпкуването може да бъде холобластно или ентеробластно.

� Холобластно пъпкуване: всички слоеве на клетъчната стена на майчината клетка участват при формирането на пъпката. Делението на клетката става на тясна основа и остава белег, върху който не може повече да става пъпкуване. Това е типичен процес най-вече за Saccharomyces и техните анаморфни състояния.

� Ентеробластно пъпкуване: първата пъпка се повява от разкъсване в стената на майчината клетка, при което вътрешният слой клетъчната стена на майчината клетка инвагинира и най-накрая излиза, за да формира външният слой на пъпката, която се формира. След като известно количество пъпки са се появили от едно и също място на

5

майчината клетка, това място се обгръща с “яка”. Ентеробластното размножаване е характерно за базидиомицетните дрожди и свързаните с тях анаморфни състояния.

Пъпкуването може също да се охарактеризира според позицията на пъпкуващите места:

� Монополярно пъпкуване: пъпкуването е ограничено само в единия край на майчината клетка. Може да се срещне на доста широка основа.

� Биполярно пъпкуване: пъпките се формират изключително на дисталните краища на майчината клетка. Пъпките възникват на доста широка основа посредством формиране на напречна стена. Този процес е известен като “пъпкуване на широка основа”.

� Мултиполярно пъпкуване: пъпкуване на различни краища на майчината клетка. Пъпкуването може да бъде описано и чрез последователността на пъпките: � Симпоидално пъпкуване: процес, при който новите клетки се появяват

непосредствено зад и в съседство до мястото на предишната пъпка. � Акропетално пъпкуване: образуване на последователност от пъпки, които се

появяват под формата на вериги, като най-младата пъпка е на върха на веригата. � Базипетално пъпкуване: образуване на последователност от пъпки, които се

появяват под формата на вериги, в които най-зрялата пъпка е на върха на веригата.

Размножаване чрез просто делене Удвояването на вегетативна клетка се проявява чрез образуване на напречна

преграда, която разделя клетката по дължина. Новообразуваните от простото делене клетки са артроконидии (артроспори). Този процес е характерен за Schizosaccharomyces.

Вегетативното размножаване чрез формиране на конидии се среща сравнително рядко при дрождите. Този начин на размножаване включва появата върху майчината клетка на една или повече издутини, всяка от които слага началото на единична крайна конидия. След узряването си конидията се отделя чрез разделителна преграда в средния участък на издутината. Конидиите не се отделят. Среща се също вегетативно размножаване чрез формиране на отделени спори или балистоспори.

Дрождите могат да се размножават и чрез образуване на една или повече филаментозни структури, както и чрез псевдохифи или истински хифи.

2. Полово размножаване при дрождите При много дрожди съществува възможност за полово размножаване, включващо

смяна на поколенията с формиране на характерни клетки, при които се наблюдава редукционно делене.

� Аскогенни дрожди: тяхна характерна черта е формирането на аскус, при който хаплоидното поколение (аскоспорите) е вътрешно ограничено.

� Базидиомицетни дрожди: формира се базидиум, в който редукционното делене е ограничено и хаплоидната фаза е външно ограничена под формата на базидиоспори.

Аскусът и базидиумът са хомоложни структури. Тъй като дрождите се характеризират с формиране или на аскуси, или на базидии,

това тяхно състояние се определя като телеоморфно състояние. Дрождите, при които липсват половите етапи, се наричат анаморфни дрожди или такива, които са в анаморфно състояние. Комбинираните състояния се определят като холоморфни.

6

Аскогенните дрожди могат да бъдат или хомоталични, или хетероталични. Те могат да бъдат стабилизирани в хаплофаза или диплофаза, както и да съществуват като смес от двете. Може да съществува и по-висше състояние на плоидност. В зависимост от плоидното ниво на вегетативната фаза, аскусите могат да бъдат конюгирани или неконюгирани.

Аскогенни дрожди и формиране на аскус Формиране на конюгирани аскуси В този случай се наблюдава диплодизация. � Конюгация между майчината и дъщерната клетка (мейоза на пъпките) Някои специалисти твърдят, че този тип конюгация е най-примитивна и включва

хаплоидни вегетативни клетки, които биват подложени на митоза и формират пъпка. Пъпката остава прикрепена към майчината клетка, която се превръща в аскус, в който по правило са ограничени 1-4 спори.

Фиг. 1. Аскус, формиран от “конюгацията между майчината и дъщерната клетка”. Този феномен е характерен за р. Torulaspora, Debaromyces, Schvanniomyces,

Wingea и определени видове на р. Pichia и Hansenula. Процес, съответстващ на “конюгацията между майчина и дъщерна клетка”, вероятно действа в апикулатни дрожди от р. Nadsoniа.

� Сливане на две независими свободно-живеещи хаплоидни клетки. � Клетките могат да се слеят директно, слагайки начало на повече или по-малко

амебоидни свързани аскуси (Schizosaccharomyces). � Клетките могат да образуват удължен копулационен процес или тръби за

конюгация, които се сливат, образувайки свързани аскуси под формата на гира. (Debaromyces, Torulaspora, Zygosaccharomyces)

Фиг. 2. Конюгиран аскус. � В случаите, когато тръбите за конюгация не могат да извършат сливане,

клетките, които притежават такава дефектна конюгационна тръба, въпреки това могат да се превърнат в 1-2 спори.

7

Фиг. 3. Аскус с дефектна конюгационна тръба. Формиране на неконюгиран аскус. � При хомоталичните дрождеви щамове, които вегетативно са стабилизирани в

диплофазата, една-единствена диплоидна вегетативна клетка бива подложена на редукционно делене и се превръща директно в неконюгиран аскус.

Фиг. 4. Неконюгиран аскус Диплоидният статус бързо се възстановява или чрез конюгация на прорастващите

аскоспори в рамките на аскуса, или чрез автогамно сливане на дъщерните ядра в края на първото митотично делене в рамките на развиващата се аскоспора (автодиплоидизация). В този цикъл хаплоидната фаза е кратка и е ограничена до аскоспоралното ниво.

� При хетероталичните клетки диплофазата обикновено е хетерозиготна по гените за мейтинг типа и индивидуалните клетки са двуполови. Ако диплофазата се стабилизира, аскусите остават неконюгирани и се образуват еднополови хаплоидни аскоспори и от двата мейтинг типа. Аскоспорите от противоположен мейтинг тип могат да конюгират директно в аскуса (Saccharomycodes) или могат да се развият в хаплоидни вегетативни клетки от противоположен мейтинг тип. Обикновено диплофазата може да бъде инициирана, само ако се наблюдава конюгация на хаплоидни култури от противоположен мейтинг тип (Hansenula, Pichia). В този случай се получават конюгирани аскуси. При някои видове (напр. Pichia membranоfaciens, Pichia spartinae) щамовете могат да бъдат или хомоталични, или хетероталични. Хетеротализмът се свързва също с половата аглутинация (Hansenula canadensis).

Формата на аскуса е родова характеристика. Преходните аскуси са характерни за р. Dekkera, Kluyveromyces и някои видове на р. Pichia, Hanseniaspora и Hansenula.

По правило формирането на аскус се индуцира от условия, които се отразяват на вегетативното размножаване, и преди всичко се повлиява от фактори като хранителния статус на клетките, състава и рН на средата за спорулиране, към която се прехвърлят културите, температурата, степента на аерация.

Понякога е много трудно да се индуцира спорулацията при някои дрожди. От друга страна, много дрожди спорулират без никаква специална подготовка върху често

8

използвана среда за поддържане на културите, като дрождев/малцов агар и малцов екстракт агар.

Различни среди за спорулация са описани в научната литература: агарът на Городкова, ацетатен агар, 2% малцов екстракт и т.н. При повечето от тези среди концентрацията на наличния въглехидрат е ограничена, така че преносът на активно растящи клетки към тези среди ограничава тяхното вегетативно размножаване.

Температурата може да окаже значителен ефект върху формирането на аскус. При повечето от видовете оптималната температура обикновено е 20-25°С. Debromyces спорулира най-добре при температури от 20°С и по-ниски. Най-общо казано, стайната температура е подходяща за образуване на аскуси при повечето дрожди извън изброените.

Някои дрожди образуват по-бавно аскоспори и културите може да изискват 3-6 седмици развитие преди това да стане.

Във връзка с възможността за образуване на аскоспори като таксономичен критерий, щамът може само да бъде охарактеризиран като аскогенен или анаморфен, когато:

а) образува аскоспори върху множество среди; б) е установено, че той не представлява хаплоиден мейтинг тип на някой

хетероталичен щам. Трябва също така да се има предвид, че понякога дрождевите щамове влошават

способността си да спорулират, а могат и да загубят тази си способност. Аскоспорите, ограничени в рамките на аскуса, могат да варират по форма,

орнаментация, цвят размер и брой за аскус Броят на аскоспорите, ограничени в аскуса, може да варира значително. Стената на зрелите аскоспори има специален афинитет към определени основни и

киселинни багрила. Това е добре засвидетелствано от факта, че зрелите аскоспори, за разлика от вегетативните клетки, показват значителна възможност за оцветяване, което се носи в голяма степен и от хламидоспорите.

На фиг. 5 е представена опростена схема на жизнен цикъл при дрожди

Фиг. 5. Жизнен цикъл и смяна на ядрените фази при дрожди

9

Базидиомицетни дрожди и образуване на базидиоспори Базидиомицетните дрожди се наблюдават или като пъпкуваща хаплофаза,

дикариотна мицелна фаза, или като самоспорулираща диплофаза. Въпреки че септираният дикарионен мицел с връзки тип “клампа” по правило е характерен за телеоморфното състояние на базидиомицетните таксони, той не винаги се експресира.

Хранене и хранителни потребности при дрождите

Под хранене трябва да се разбира начинът по който дрождевата клетка приема

вода и основни органични и неорганични елементи от заобикалящата среда (хранителна среда) през клетъчната стена, мембрана и вътреклетъчно съдържимо. Мембранният транспорт е ключовият елемент в процеса на хранене при дрождите, като чрез него клетката взаимодейства с заобикалящата я среда. Храненето на клетката включва в себе си различни процеси на усвояване на важни хранителни източници както за анаболитните процеси, така и за катаболитнтите процеси, които осигуряват жизнеността и клетъчния растеж.

Изучаването на начинът на хранене и хранителните потребности на дрождевата клетка, както и регулацията на мембранният транспорт позволяват успешно култивиране на дрожди в лабораторни условия и оптимизиране на ферментационните процеси в индустриален мащаб.

Хранителни изисквания на дрождите При анализ на химичните елементи на 100 гр. дрожди от вида Saccharomyces

cerevisiae е установена следната емпирична формула C47H6.3O33N8P1.2Соли4.5 Тя показва относителното количество на всеки един от елемент в състава на

дрождевата клетка. Това отношение обаче силно варира и зависи от вида и щама дрожди, както и от физиологичното състояние и условията на култивиране. Въпреки това, както се вижда от формулата, дрождевата клетка е съставена от основните биогенни елементи – въглерод, водород, кислород, азот, фосфор и сяра, които изграждат макромолекулите – белтъци, полизахариди, нуклеинови киселини, липиди. Освен тях важно значение за правилното формиране и функциониране на различни ензими в дрождевата клетка значителна роля имат и микроелементи като К, Mg, Ca, Cu, Zn и др.

Много дрожди биха се развивали добре в проста по състав хранителна среда съдържаща вода, хексоза, амониева сол, различни минерали, микроелементи и витамини. Въпреки това, дрождите се различават съществено в своите хранителни изисквания, което зависи от типа на химичния източник за набавяне на основните хранителни елементи.

Източници за усвояване на основни хранителни вещества от дрождите Въглерод Дрождите са хемоорганотрофни организми. Те си набавят въглерод и енергия от

разграждането на химични връзки в състава на органични съединения, такива като захари, като глюкоза е сред най-често използваната хексоза от дрождите. Въпреки това, глюкозата не е сред най-ефективно метаболизираната захар. Освен това, макар че тя е

10

сред най-често използваните в лабораторната практика хексоза, тя не се среща в свободна форма в природата, тъй като е полимеризирана в състава на целулозата, нишестето и други полизахариди. Всъщност, глюкозата има и инхибиторен ефект за усвояването на други захари от дрождите.

В таблица 1 са представени различни въглеродни съединения, които могат да бъдат усвоявани от дрождите с различна степен на ефективност. Така например S. cerevisiae има относително ограничен брой захари, които може да ферментира – глюкоза, фруктоза, маноза, захароза, галактоза и малтоза, докато други въглерод-съдържащи субстрати (като етанол и ацетат) се използват аеробно само от този вид. Малка част от въглерода (5%) дрождевата клетка си набавя чрез CO2. Такава фиксация на СО2 е необходима за превръщането на дикарбоновите киселини в трикарбонови при процесите на биосинтеза на аминокиселини, както и при биосинтезата на мастни киселини, пурини и пирамидини.

Водород Водородът участва в състава на макромолекулите и клетките си го набавят от

въглеводородите и други органични субстрати. Водородните йони (протоните) са много важни за клетъчната физиология, тъй като разликите във вътреклетъчното и извънклетъчното рН може да окаже значително влияние върху растежа и метаболизма на дрождевата клетка. Така например, установено е че Н+ в концентрация 1 µМ (рН 6.0) и 10 µМ (рН 5.0) са оптималните за растежа и ферментацията на глюкозата от дрожди. Обикновено дрождите растат добре при стойности на рН между 4 – 6, въпреки че съществуват и видове, които растат в по-голям диапазон на рН между 2 – 8. Способността за растеж при ниски стойности на рН дава възможност на дрождите да населяват различни екологични ниши, както и развалящи се, кисели храни. Въпреки че дрождите не растат добре при алкално рН , някои морски дрожди са се адаптирали за живот в слабо алкални морски води. Всъщност, в хода на растеж и развитие на дрождевата култура, тя подкислява хранителната среда чрез усвояване на амониеви йони, отделяне на протони при транспорт на хранителни вещества, отделяне на органични киселини и освобождаване на СО2. Вътреклетъчното рН, което варира в относително тесни граници (5.25 за S. cerevisiae) и се регулира от действието на протонната АТР-аза, разположена в клетъчната мембрана, играе важна роля в процесите на клетъчно хранене и метаболизъм. Вариациите в извънклетъчното рН имат ограничено влияние върху цитозолното рН, освен ако хранителната среда не съдържа органични киселини като ацетат или сорбат.

Кислород Дрождите не могат растат добре при пълно отсъствие на кислород. Причината за

това е че кислородът се явява субстрат за ензимите от респираторния метаболизъм, както и е необходим за хидроксилирането в процесите на биосинтеза на стероли и ненаситени мастни киселини. В частност, дрождите се нуждаят от молекулен кислород за разнообразно-функционираща оксидаза, осъществяваща циклизацията на сквален 2,3- епоксид до ланостерол и за синтезата на ненаситени мастено киселинни ацил КоА естери. Кислородът може да бъде определен и като важен растежен фактор. Различните дрожди имат различни потребности за молекулен кислород и налягане, като чистият кислород в някои случай дори би имал силен инхибиторен ефект върху клетъчния растеж. Токсичният ефект на чистият кислород се определя и от фазата от клетъчния цикъл, в която се намира клетката в момента.

В повечето биотехнологични производства с участието на дрожди (такива като производството на хлебна мая и едноклетъчен протеин (SCP), когато оптимизацията на

11

растежа зависи от дишането, от съществено значение е количество кислород подавано към биореактора и то би трябвало да е задоволително. Кислородът е добре разтворим във водни разтвори. Усилията на биоинжинерите са насочени към повишаване на скоростта на абсорбция на кислорода от дрождевата клетка KLac, където KL е скоростта на преминаване на кислорода през повърхността на течността и от там в разтвора, а е площта от повърхността, а с е концентрацията на кислорода в хранителната среда. Така например, при пивопроизводството, което по принцип е анаеробен процес, първоначалните наличие на кислород в средата и аеробен растеж на дрождевата култура са от съществено значение за правилното протичане на процеса на ферментация в последствие.

Азот Около 10% от сухото вещество на дрождевата клетка представлява азот-

съдържащи съединения. Дрождите не притежават способността за азот-фиксация, но затова пък могат да усвояват голяма част от неорганичните азотни съединения, такива като амониевите соли. Амониевият сулфат е най-често използваният азотен източник при култивирането на дрожди (източник също така на сяра). Някои дрожди могат да усвояват и нитрати като източник на азот, като тези видове които притежават това свойство най-често могат в малка степен да асимилират и нитрити. Способността за асимилация на нитрати дълго време е била използвана като таксономичен белег при определянето на най-често срещаните дрождеви видове. Така например Hansenula spp. са нитрат-положителни, докато Pichia spp. са нитрат-отрицателни. Същото важи и за уреата като източник на азот – повечето базидиомицетни дрожди са уреазо-положителни, докато аскомицетните са уреазо-отрицателни.

Различни органични азот-съдържащи съединения, като аминокиселини, пептиди, пурини, пирамидини и амини, също се използват от дрождевата клетка като иточник на азот. Глутаминът и аспартатът лесно се дезаминира и затова служат като добри източници на азот. В състава на някои хранителни среди за ферментация в индустриални условия влиза пивна мъст, богата на аминокиселини, които дрождите лесно асимилират. В лабораторни условия аминокиселините също са от съществено значине за растежа на дрождевата клетка и са представени в състава на хранителните среди под формата на белтъчни хидролизати (напр. казеин). За осигуряването на добър растеж, някои видове дрожи, напр. S. cerevisiae, имат нужда от добавката на допълнителни аминокиселини (цистин, глицин, хистидин, лизин, пролин или треонин) към хранителната среда. Въпреки това, повечето дрождеви видове притежават способността да асимилират аминокиселини и нискомолекулни белтъци благодарение на секрецията на екзоклетъчни протеази.

Сяра Нуждите на дрождевата клетка от сяра се определят най-вече от използването й

в процесите на биосинтезата на сяро-съдържащи аминокиселини. Количеството на сярата в клетката представлява около 0.3 % от сухото тегло. Източници на сяра биха могли да бъдат различни органични и неорганични съединения, такива като сулфати, сулфити, тиосулфати, метионин и глутатион. Все пак, неорганичните сяро-съдържажи съединения и метионинът играят главна роля в серния метаболизъм на дрождевата клитка. Метионинът е най-ефективно използваната аминокиселини в хрането на дрождите. Всъщност, всички дрожди могат да си синтезират сяро-съдържащи аминокиселини като използват сулфат, най-окислената форма на неорганичната сяра. Поради тази причина сулфатите са най-често използваният източник на сяра в състава на хранителните среди за култивиране на дрожди.

12

Фосфор Фосфорът участва в молекулата на нуклеиновите киселини и фосфолипидите и

затова е необходим за всички дрожди. Фосфатите представляват 3-5 % от сухото вещество на дрождевата клетка, като голяма част от тях са ортофосфати. Ортофосфатът (H2PO4

-) и неорганичният фосфор са основните източници на фосфор в състава на хранителната среда при култивиране на дрожди. Ортофосфатът действа като субстрат и ефектор на много ензими, включително на тези участващи в енергетичния метаболизъм. Концентрацията на цитоплазмения фосфат е много ниска, около 0.2 % от сухото тегло, като тя варират в зависимост от типа на метаболизъм на захарите в клетката. Например, установено е че нивата на вътреклетъчен фосфат могат значително да се повишат по време на краткотрайно добавяне на глюкоза във висока концентрация, когато клетките проявяват т. нар. Крабтри ефект. Освен това, дрождевата клетка притежава способността да натрупва фосфати в органелите, като са установени 110 пъти по-високи нива на фосфати в вакуолите в сравнение с тези в цитоплазмата.

Микроелементи и макроелемети Необходимостта от микро- и макроелементи за дрождевата клетка не се

различават съществено от тези при другите еукариотни клетки. К и Mg се отнасят към така наречените макроелементи и за да се осигури нормална катйонна среда за клетката, тяхната концентрация в хранителната среда би трябвало да бъде около няколко милимола. Други елементи, чиято концентрация е от няколко микромола до няколко наномола се означават като микроелементи. Такива са Mn, Ca, Fe, Zn, Cu, Ni, Co и Mo. Наличието на елементи като Ag, As, Ba, Cs, Cd, Hg, Li и Pb в концентрация по-висока от 100 µМ оказва негативен, токсичен ефект върху растежа на дрождевата клетка.

Калият е абсолютно необходим за дрождевата клетка. Той е ко-фактор за множество ензими, участващи в процесите на окислително фосфорилиране, биосинтезата на белтъци и въглеводородният метаболизъм. Концентрацията на вътреклетъчен К варира в зависимост от физиологичното състояние на клетката, но се запазва в границите около 1 – 2 % от сухото тегло. Установено е че при хемостатни култури на Candida utilis ограничени по К, концентрацията на вътреклетъчен К е в линейна зависимост от скоростта на растеж.

Въпреки че някои дрожди растат добре в условия на повишена соленост на околната среда, няма доказателства че тези видове изискват наличие на натрий дори в ниски концентрации. Халотолерантни дрожди, такива като Debaromyces hansenii, Pichia miso и Zygosaccharomyces roxii притежават специфични осморегулаторни механизми за растеж при високи концентрации на NaCl.

Магнезият е абсолютно необходим за растежа на дрождите неговото количество в дрождевата клетка е около 0.3 % от сухото тегло, като изпълнява структурна и функционална роля. Например, нормалното функциониране на трансфосфорилиращите ензими, както и тези участващи в синтезата, експресията и транслацията на генетичната информация, зависят от концентрацията на Mg2+ в клетката.

Растежни фактори Съществуват органични съединения, които в ниски кнцентрации изпълняват

специфични каталитични или структурни функции, без да бъдат използвани като енергиини източници. Тези съединения се ознаават като растежни фактори и към тях се отнасят витамините, пурините и пирамидините, нуклеозидите и нуклеотидите, аминоиселините, мастните киселини, стеролити и др. Като се твърди, че дрождевата

13

култура има изисквания за растежни фактори, това означава че тази култура не може да си синтезира това съединение. Като резултат от това се забавят растежът и някои ключови метаболитни процеси. В някои случаи обаче, тези съединения не са задължителни, тъй като след добавянето на някои растежни фактори, растежът на дрождевата култура се стимулира. Това явление е известно като относителна необходимост от растежни фактори.

Витамините са необходими за дрождите като растежни фактори. Такива са биотинът (действа като ко-фактор за катализиранитеот карбоксилазата реакции), пантотеновата киселина (функционалната форма на която, коензим А, участвав реакциите на ацетилиране), никотиновата киселина (под формата на никотинамид, който участва в редокс-реакциите) и тиаминътили витамин В (под формата на тиамин пирофосфат, участващ в реакциите на декарбоксилиране).

Хранителни среди за култивиране на дрожди Дрождите са лесни за култивиране, тъй като имат относително прости

изисквания към хранителните среди. За култивиране на дрожди в лабораторни условия съществуват различни готови синтетични и комплексни хранителни среди. Освен това има и специфични хранителни среди, осигуряващи нормален растеж, спорулиране и полови процеси при Scchwanniomyces occidentalis, Kluyveromyces lactis, Picchia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Candida maltosa и Trichosporon cutaneum. За бърз растеж при дрожди най-често се използва бульон от малцов екстракт (или пивна мъст), която е комплексна среда, като освен това може да бъда използване и нейният агаризиран вариант след добавянето на 1 – 2 % агар. Дрождевият екстракт, получаван след автолиза или хидролиза на дрождеви клетки, представлява комплексна смес от полуразрушени дреждеви структури и макромолекули и с добавка на пептон и глюкоза (среда YEPD) може да бъде използван при рутинната лабораторна практика. Други среди, ширако използвани в лабораторната практика са среда на Сабуро (глюкоза + пептон) – за дрожди с медицинско значение, Wallerstein Laboratories Nutrient – за пивни дрожди. Примери за синтетични среди включват такива като Yeast Nitrogen Base (предлаган от фирма Difco, точният състав на тази и други среди е представен в Приложение 1), използвана за асимилационни и ферментационни тестове и съдържаща амониев сулфат и аспарагин като азотни източници, микро- и макроелементи, витамини и аминокиселините хистидин, метионин и триптофан. Въглеродният източник се избира то експериментатора и се добавя към средата обикновенно в крайна концентрация от 1 %. Yeast Carbon Base пък е среда без азотен източник (точният състав на средата е представен в Приложение 1). Други синтетични среди, като Edinburg Minimal Medium, са разработени за лабораторно култивиране на дрожди от вида Schizosaccharomyces pombe. За обогатяване на синтетичните среди, към тях се добавя дрождев екстракт и тогава те се наричат полу-синтетични.

В състава на селективните среди влизат още някои антибактериални, антигъбни и антидрождени вещества, с цел подтискането на растежа на тези микроорганизми и селекцията на желаният тип дрожди от проби, взети от околната среда. Например, подкислена агаризирана среда (рН 3.7) може да бъде използвана за подтискане на растежа на бактерии при изолацията на почвени дрожди. Кристал-виолет в комбинация с фусцин-сулфит се използва за отдиференцирането на диви дрожди от вида Saccharomyces в присъствието на пивни дрожди. Циклоксамидът е антибиотик, имащ селективно инхибиторно действие спрямо повечето дрожди и може да бъде използван за определяне на наличието на диви дрожди в проби от пивопроизводството. Среда със специфичен състав би могла да бъде използана и за селекцията на дрожди със

14

специфични хранителни изисквания. Например, среда с високо осмотично налягане се използва за изолиране на Zygosaccharomyces roxii в проби от храни и лизин (като единствен азотен източник) агар за селекцията на не-Sachharomyces диви дрожди в проби от пивоварната индустрия.

При ферментациите в промишлени условия се използват няколко основни хранителни среди. Техният състав е представен на таблица 1.

Таблица 1

Компоненти Меласа Пивна мъст Гроздова мъст Суроватка Въглеродни източници

Захароза Фруктоза Глюкоза Рафиноза

Малтоза Захароза Фруктоза Глюкоза Малтотриоза

Глюкоза Фруктоза Захароза (следи)

Лактоза

Азотни източници Неусвоими белтъци. Необходимо е да бъдат добавени азотсъдържащи вещества.

Нискомолекулни α-амини. Амониеви йони и различи аминокиселини.

Вариращи нива на амониеви йони, различи аминокиселини

Неусвоими глобулин и албумин. Ниски концентрации на амониеви йони и урея.

Макроелементи Наличие на Р, К, S. Високите концентрации на К+ са инхибиторни.

Наличие на Р, К, Mg и S.

Наличие на Р, К, Mg и S. често присъстват високи концентрации на сулфити.

Наличие на Р, К, Mg и S.

Витамини Ниски, но обикновенно достатъчни концентрации. Биотин не се среща в цвекловата меласа.

Достатъчни концентрации на витамини. Високо захарната пивна мъст може да бъде дефицитна по биотин.

Концентрацията на витамини е достатъчна.

Наличие на различни витамини.

Микроелементи Различни микроелементи, въпреки че концентрацията на Mn2+ може да бъде ниска.

Различни микроелементи, въпреки че концентрацията на Zn2+ може да бъде ниска.

Различни микроелементи в задоволителни концентрации

Наличие на Fe, Zn, Mn, Ca, Cu

Други компоненти Неферментируеми захари (2 – 4 %) органични киселини, восъщи, пигменти, пестицидни остатъци, карамелизирани компненти, бетаин.

Неферментируеми малцодекстрини, пиразини, хмелови вещества

Неферментируеми пентози, тартарове и яблъчна киселина. Деканоиновата и октаноиновата киселини могат да бъдат инхибиторни. Може да бъде дефицитна по стероли и ненаситени мастни киселини.

Липиди, NaCl. Млечна и лимонена киселини.

При конструирането на хранителни среди за култивиране на дрожди трябва да се

имат предвид следните особености. Първо средите използвани за намножаване на

15

дрождевата култура могат да не са подходящи за протичане на процеса на ферментация. Това се обяснява чрез сравняване на използването на меласата както за натрупване на биомаса, така и за продукция на етанол. В конкретният случай, концентрацията на захарите трябва да се поддържа на ниски нива, чрез контролирано подаване на хранителната среда (полу-непрекъснато култивиране) за намаляване на глюкозната репресия и спомагане на респираторния метаболизъм. В случаите, когато е необходимо ферментативният метаболизъм да е преобладаващ, тогава концентрацията на захари може да остане висока. Тъй като концентрацията на захари в меласата е висока, то е необходимо да се определи ролята на другите елементи в нейният състав. Така например концентрациите на азот и фосфор в меласата са ниски, което налага да бъдат допълнително добавяни към хранителната среда. Концентрацията на необходимите за растежа катйони, такива като Mg2+, също би моглd да бъде под оптималната за нормалния растеж и метаболизъм на дрождевата клетка. Понякога, в резултат на различни химични процеси, като хелатиране, утаяване или свързване, протичащи между средата и някои соли, концентрациите на микро- и макроелементите би могла да бъде понижена допълнително. Това налага тези соли да бъдат предварително автоклавирани отделно, след което да бъдат прибавени към хранителната среда. От друга страна пък, някои среди като меласа и пивна мъст могат да хелатират йоните на тежките метали. При използването на меласа за култивиране на дрожди е необходимо и допълнително прибавяне на някои витамини, като биотин.

За стимулиране на ферментационния процес към хранителните среди биха могли да бъдат добавени и някои допълнителни вещества, като дрождев екстракт, амониеви йони, фосфати и някои йони (Zn2+). Например, въпреки че се счита че пивната мъст, като комплексна среда, е готова и подходяща за протичане на процесите на ферментация при производството на пиво, добавянето на някои допълнителни хранителни елементи води до допълнителното й балансиране по време на ферментацията. Добавянето на малки количества (до 40 mg/l) на подбрани аминокиселини, нискомолекулни белтъци, минерали и витамини осигурява постоянна активност на метаболизма на дрождевата клетка по време на ферментацията и като резултат, понижаване на вариациите в аромата на крайният продукт – пивото.

Някои среди за промишлено производство могат да съдържат в ниски концентрации вещества, които да оказват инхибиторен или токсичен ефект върху дрождевата клетка. Тези вещества могат да са резултат от предварителната обработка на средата (авколавиране или пастьоризация). Например, продължителната стерилизация при висока температура на меласата води до нежелано карамелизиране на продуктте с последваща кондензация между молекулите на захарите и тези на амино-съдържащите азотни съединения (кондензация на Maillard). Също така високата температура разрушава витамините и другите растежни фактори необходими за растежа на дрождевата клетка.

Физиологичен отговор на дрождевата клетка спрямо хранителната среда В зависимост от хранителните си потребности дрождите биха могли да бъдат

разделени на следните групи: 1. повсеместни дрожди, обитаващи различни екологични ниши, където

хранителните вещества са комплексни и най-често в течна фаза. Такива са растенията и водните басейни.

2. компетентни дрожди – усвояват широк спектър от хранителни вещества. Към тях се отнасят „политрофни” дрожди от родовете Rodotorulla и Cryptococcus открити върху плодове, нектар и др. някои дрожди са се специализирали да усвояват и обитават

16

места с висока концентрация на захарите като например гниещи плодове и дървесен сок.

3. олиготрофни дрожди – такова като Kloeckera и Pichia усвояват ограничен брой хранителни вещества и притежават свойства даващи им предимство при конкуренцията с други видове, за определен субстрат. Олиготрофните хабитати са бедни откъм хранителни вещества. Такива са повърхността на листата и не-ризосферната почва. Вероятно CO2-фиксацията е един от механизмите осигуряващ нормален растеж на олиготрофните дрожди.

Дрождите са неподвижни, сапрофитни (понякога паразитни), хемоорганотрофни микрофунги. Все пак те взаимодействат активно със заобикалящата ги среда. Например, много дрожди (включително вида S. cerevisiae) могат да бъдат определени като полиморфни, тъй като формата и големината на клетките им зависи от средата за култивиране. Филаментозният растеж, наблюдаван в периферията на дрождева колония върху агар също би могъл да бъде обяснен по този начин. В зависимост от условията на култивиране и съставът на хранителната среда се наблюдават и промени в метаболизма на дрождевата клетка. Дрождите притежават свойството да отделят различни хидролитични ензими, разграждащи трудно-усвоими полимери. Например такива като: полизахариди (амилолитични и инулинолитични дрожди), хидрокарбонати (биоемулсифициращи дрожди), белтъци (протеолитични дрожди), пектини (полигалактуронидаза-секретиращи дрожди), и липиди (липолитични дрожди). В случаите, когато концентрацията на Fe в околната среда е много ниска (ограничени хранителни вещества в околната среда), дрождите отделят т. нар.сидерофори. Други вещества, които могат да бъдат отделяни в резултат от въздействието с околната среда, това са етанола и някои органични киселини, които подтискат растежа на други конкурентни микроорганизми. Краен случай на конкуренция за хранителни вещества е отделянето на токсични вещества.

Друг физиологичен отговор на клетката спрямо условията на околната среда се наблюдава в условия на „гладуване” на културата, когато концентрациите на въглеродния, азотния, фосфорния и др. субстрати са много ниски . Тогава се наблюдават „почиващи” клетки във фаза G0, а при полово размножаващите се дрожди се индуцира спорулацията като механизъм за преживяване на неблагоприятните условия. В клетки от култура на S. cerevisiae подложена на азотно гладуване (ниски концентрации на амониеви йони) се наблюдава намаляване на съдържанието на РНК, белтъци, трехалоза и гликоген и други.

Транспорт на хранителни вещества Роля на клетъчната стена При преминаването на хранителните вещества от околната среда по посока

клетката, съществуват няколко бариери, а именно – капсулата, клетъчната стена, периплазмата, клетъчната мембрана и вътреклетъчни (органелни) мембрани. Въпреки че клетъчната стена не притежава функцията избирателна пропускливост както клетъчната мембрана, не бива да се приема че тя свободно пропуска различните субстрати. Клетъчната стена пропуска молекули с молекулно тегло между 300 Da и 700 Da. Въпреки това някои молекули с големина 200 kDa и дори 400 kDa могат свободно а преминават през интактна клетъчна стена. Подобно на други дрождеви органели, клетъчната стена е динамична система по отношение на нейната структура. Така например, степента на пропускливост на клетъчната стена на S. cerevisiae различна през различните фази на растеж. Максимална пропускливост е регистрирана по време на нарастване на пъпката, когато клетъчната стена е най-пластична, както и във фазата на

17

усилен растеж спрямо тази в стационарната фаза. Освен това, в условия на стрес, например при висока температура, клетъчната стена става по-неустойчива и еластична и това позволява навлизането на големи молекули каквато е екзогенната ДНК.

Роля на клетъчната мембрана Клетъчната мембрана представлява своеобразна бариера отделяща клетката от

заобикалящата я среда. Тя е структурата, притежаваща свойството избирателна пропуксливост, което позволява в клетката да навлизат точно определени вещества и да бъдат отделяни други. Разглеждайки механизма на транспортиране на вещества в клетката на ниво клетъчна мембрана, то тя е структурата, определяща скоростта на метаболитните реакции, растежа и развитието на клетката.

Преди да бъдат разгледани различните механизми на преминаване на хранителните вещества през клетъчната мембрана, трябва да бъде отбелязано че дрождевата клетка, подобно на животинската клетка може да приема макромолекули чрез механизмите на ендоцитозата. Например, феромонът α-фактор при S. cerevisiae може да бъде включен в клетката чрез инвагинация на клетъчната мембрана в посока навътре, при което се образува ендозома. Използването на ендоцитозни мутанти при дрожди би могло да даде ценна информация за изучаването на мембранния транспорт при еукариотната клетка.

Съществуват четири основни типа на пасивен и активен транспорт на хранителни вещества на ниво клетъчна мембрана, а именно – свободна дифузия, облекчена дифузия, дифузионни канали и активен транспорт. Схематично различните видове транспортиране на хранителните вещества са предствени на фигура 6.

Фигура 6. Механизми на приемане на хранителните вещества от дрождевата

клетка

пасивна дифузия облекчена дифузия дифузионни канали активен транспорт

Пасивната дифузия е най-простият и най-бавен начин на преминаване на хранителните вещества в клетката. Той се изразява в пасивно преминаване на липидо-разтворими вещества през клетъчната мембрана. Веществата се придвижват в посока от висока екстрацелуларна концентрация към ниска интрацелуларна концентрация. Чрез този тип транспорт се усвояват недисоцииращи се органични киселини, (бензоат, сорбат), късоверижни алкани и дълговерижни мастни киселини, както и се изнасят извън клетката етанол и газообразни вещества.

Облекчената дифузия е по-бърз механизъм на транспортиране в сравнение със пасивната дифузия. При нея хранителното вещество се намира в област с по-нисък концентрационен градиент и при транспортирането му участват ензими, наречени

18

пермеази, или преносвачи, които „пробождат” мембраната и притежават стереоспецифичност към транспортираното вещество. Както и при пасивната дифузия, преносът на веществото продължава до тогава, докато концентрацията му в клетката не се изравни с тази извън клетката. По този механизъм се транспортират захарите, например глюкозата при S. cerevisiae.

Дифузионните канали осъществяват транспорта на някои йони по посока на концентрационния градиент. Тези белтъчни канали нормално са затворени под действие на отрицателния мембранен потенциал в почиващите клетки и се отварят под действието на положителния мембранен потенциал. Например, каналите на К+-помпа при S. cerevisiae се активират при мембранна деполяризация. К+ канали се срещат най-често клетъчната мембрана на дрождите, но също така и в мембраните на митохондриалните и вакуолите. Дифузионните канали осигуряват и преминаването на вода и алкохоли, като например посредством FPS1 белтъка в клетки на S. cerevisiae при хипоосмотичен стрес, се осъществява транспорта на глицерол.

Активният траспорт е енергозависим механизъм, базиращ се на хемоосмотичните принципи, които са отговорни за усвояванетона голяма част от хронителните вещества от дрождевата клетка. Основната движеща сила за транспортиране на хранителните вещества срещу концентрационният градиент са мембранният потенциал и трансмембранният електрохимичен протонен градиент, генериран от мембранната Н+ - АТФаза. Последната контролира вътреклетъчното рН чрез отделяне на протони, използвайки освободената енергия от хидролизата на АТФ и се явява ключов ензим за хрането и растежа на клетката. Преносът на протони през плазмената мембрана не е променлив процес. Протонната движеща сила позволява да се пренасят вещества по посока на протонната помпа – симпорт, или в посока противоположно на протонната помпа – антипорт. При много дрожди, усвояването на захарите се осъществява чрез протонен симпорт. По този механизъм се секретират и различни метаболити от дрождевата клетка.

Специфични пермеази, които биват конституивни или индуцируеми, улесняват транспортирането на различни хранителни вещества чрез едновременно движение на протони през клетъчната мембрана. Терминът “преносвачи” най-добре описва функцията на тези молекули, тъй като те не функционират по смисъла на ензими пермеази. Те пронизват клетъчната мембрана и осигуряват преноса на хранителни вещества като използват енергията отделена от протонния градиент.

Вътреклетъчна трансформация на хранителните вещества След като хранителните вещества бъдат транспортирани в клетъчната плазма те

могат да бъдат или бързо метаболизирани (катаболитно или анаболитно) или да бъдат натрупани като резервни вещества. Неорганините йони могат да бъдат ограничени от вътреклетъчните хелатори в цитозола или да бъдат включени в някои органели (вакуоли). Всъщност вътреклетъчното ограничаване или включване на йоните в оранели представлява механизъм за запазване на клетъчната йонна хомеостаза. Например, клетката регулира концентрацията на цитоплазмен ортофосфат чрез транспортирането му във вакуолите, където се полимеризира до полифосфати. Използането на тези полифосфати зависи от наличието на фосфати в хранителната среда и метаболитната активност на клетката. Концентрацията на фосфатите във вакуолите на S. cerevisiae е до 100 пъти по-висока от тази в цитозола. Вакуолите се явяват основно място за натрупване на хранителни вещества. В тях се натрупват неорганични йони (Mg2+, Mn2+, Ca2+ и Zn2+), аминокиселини(предимно аргинин, но също така и някои други аминокиселини) и трикарбонови деривати (цитрат, малат, α-

19

кетоглутарат). Основният механизъм за транспорт на веществата през мембраната на вакуолите е протонният антипорт.

Физиологични и биохимични характеристики Физиологичните свойства служат основно за описание, диференциация и

идентификация на дрождевите щамове. Използват се и при описанието, характеризирането и диференциацията на видовете и, в по-малка степен, на родовете. Характеристиките, които са най-подходящи за целите на рутинната идентификация, са онези, които са свързани с усвояването на въглеродни и азотни източници, с изискванията за фактори на растежа, с растежа при повишени температури и върху среда с високо съдържание на захар или натриев хлорид, с образуването на типичните характеристични метаболити и с чувствителността на дрождите към антибиотици.

Тестване на различните физиологични характеристики трябва да се извършва само на свежи култури, култивирани при оптимални хранителни условия.

Използване на въглеродните съединения

Дрожди, култивирани на въглехидрати, могат да ги усвояват ферментативно или чрез респирация. Установено е, с някои малки изключения, че когато дрождевият щам усвоява въглехидратите ферментативно, той също така е в състояние да ги метаболизира и окислително. Обратното обаче не е валидно.

А. Ферментация на въглехидрати Дрождите се различават по способността си да ферментират захарите. Например,

за р. Kluyveromyces, Saccharomyces, Torulaspora и Zygosaccharomyces е характерно, че силно ферментират поне глюкозата, докато други родове (напр. Zygomyces и Sterigmatomyces) са задължително неферментативни. При други родове пък се наблюдава цялото многообразие – от видове, които са неферментативни, до видове, които са силно ферментативни.

Способността за ферментация на захари се демонстрира най-вече чрез присъствието или липсата на CO2. В затворените системи трябва да се използват големи инокулуми, тъй като наличието на кислород е лимитирано и клетъчната пролиферация също е ограничена. За обикновени цели най-подходящи са епруветкина Дюрам, съдържащи 2% (w/v) захарен разтвор.

Основната среда, в която се разтварят въглехидратите, е точно определена. За целите на идентификацията обикновено се изследва способността на дрождите

да ферментират глюкоза, галактоза, захароза, малтоза, лактоза и рафиноза. Ферментацията на другите въглехидрати, включително трехлоза, мелибиоза и инулин, се изследва по-рядко.

Ако се наблюдава ферментация, то глюкозата винаги се ферментира. Смята се, че способността да се ферментира глюкоза се свързва винаги с

ферментацията както на фруктоза, така и на маноза. Определени осмофилни дрожди могат да ферментират фруктозата главно в смес

от глюкоза и фруктоза (това не се използва при рутинна идентификация). Дрождите, които ферментират фруктоза, с някои малки изключения, ферментират също и рафиноза. Способността за ферментиране на лактоза се свързва винаги с ферментацията на галактоза. Дрождите, които ферментират лактоза, с малки изключения, не ферментират малтоза.

20

Съществуват данни, които показват, че стабилността на ферментационния модел е твърдо правило при всички случаи. Т.нар. нестабилност на ферментационния процес може да се дължи на мутационни промени, както и на удължен период на поддържане на дрождите върху малцов агар и т.н.

B. Усвояване на въглеродни съединения Основната среда е YNB (Yeast Nitrogen Base). Глюкозата се усвоява от всички дрожди и винаги се включва като стандарт за

сравнение на скоростта, при която се използват другите въглеродни източници. Важно е също така да се покаже способността на щамовете да растат в минимална среда.

Респираторният и ферментативният метаболизъм на захари при дрождите показват ранообразни модели на генериране на енергия.

Фиг. 7. Обобщение на основните последовтелности от реакции в двата главни катаболитни пътя на захарта.

Таблица 2. Групи дрожди по отношение на относителния дял на дишането и

ферментацията в продукцията на АТФ. Условия Тип метаболизъм Периодичноа култура Аеробна растежна фаза 1 - лимитирана по С - лимитирана по О2 Аеробна растежна фаза 2 Анаеробен растеж

Респиро-ферментативен Респиро-ферментативен Асимилация на етанол Ферментативен

Непрекъсната култура Аеробен растеж при ниски скорости на разреждане - лимитирана по С

Респираторен

21

- лимитирана по О2 Аеробен растеж при високи скорости на разреждане - лимитирана по С - лимитирана по О2

Анаеробен растеж

Респиро-ферментативен Респиро-ферментативен Ферментативен

Метаболизъм на не-хексозните въглеродни източници Разглежда се също метаболизмът на няколко не-хексозни (неконвенционални)

въглеродни източници. Тези съединенията са биополимери, пентози, алкохоли, полиоли, въглеводороди, мастни киселини и органични киселини.

Въпреки че под въглероден метаболизъм се разбира най-вече метаболизмът на глюкоза, трябва да се подчертае, че свободната глюкоза в много от естествените продукти се среща рядко, включително в някои среди за ферментация на дрожди, получени от растения (напр. меласа) и такива с животински произход (напр. суроватка). Въпреки това, останалите захариди могат да бъдат катаболизирани от дрождите по гликолитичния обменен път. Например, на схемите по-долу е показано включването на друга хексоза (галактоза, маноза или фруктоза) в пътя. Някои от останалите дизахариди също могат да се влеят в гликолизата, следвайки хидролизата на своите монозахаридни компоненти.

Метаболизъм на биополимери Повечето дрожди обикновено изискват естествено получените полимери да бъдат

хидролизирани извънклетъчно от не-дрождеви ензими преди употребата им като въглеродни и енергийни източници. Например:

малтоза

транспорт, вътреклетъчна хидролиза (малтоза) Saccharomyces cerevisiae

глюкоза+глюкоза (гликолиза)

захароза извънклетъчна хидролиза, транспорт (инвертаза)

глюкоза+фруктоза (гликолиза)

мелибиоза

извънклетъчна хидролиза (галактопиранозидаза), транспорт

Saccharomyces cerevisiae

глюкоза+галактоза (гликолиза)

лактоза

транспорт, вътреклетъчна хидролиза (β- галактозидаза)

Kluyveromyces marxianus глюкоза +галактоза (гликолиза)

целобиоза извънклетъчна хидролиза (глюкозидаза)

Bretanomyces claussenii глюкоза+глюкоза (гликолиза)

Saccharomyces cerevisiae

22

киселини мастнилипиди

иниаминокиселпротеини

киселина овагалактуронпектин

глюкоза ксилоза,захемицелуло

глюкозацелулоза

фруктозаинулин

глюкозанишесте

липази

протеинази

пектинази

ксиланаза зи,хемицелула

целулаза

инулиназа

зиглюкоамила амилази,

→

→

→

→

→

→

→

Олигозахаридите, съдръжащи глюкоза, (напр. малцов декстрин, извлечен от

нишесте) и полизахариди (напр. нишесте), обикновено трябва да бъдат хидролизирани извънклетъчно от не-дрождеви ензими преди гликолизата, въпреки че са познати и някои амилолитични дрожди. Всъщност, известни са и няколко по-специфични дрождеви видове, които имат способността да метаболизират разнообразни биополимери директно, както е показано в таблицата.

Много от тези дрожди имат значение в производството при технологията за преработка на биомаса като източник на хидролитични ензими или като източник на подходящи гени за трансфер към други организми (включително други дрожди) чрез технология с рекомбинантна ДНК.

Регулаторни феномени при въглеродния катаболизъм на дрожди: Ефект на Пастьор – ефект на инхибиране на ферментативния захарен

метаболизъм от кислорода Ефект на Къстърс – феномен, при който ферментацията се инхибира от отсъствие

на кислород Ефект на Кребтри – ферментативен метаболизъм в присъствие на кислород при

високи концентрации на захари. Ефект на Клюйвер – някои дрожди могат да утилизират отделни дизахариди

аеробно, въпреки че същите дрожди могат да използват един или повече от компонентите, съставящи ги, анаеробино

С. Усвояване на азотни съединения Един от най-важните критерий при диагностицирането на дрождите е дали те са

способни или не да използват азота. Много родове се характеризират с невъзможността си да усвояват нитрати (напр. Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Debaromyces), докато при други, като Hansenula, Pachisolen, Citeromyces, всичките им видове използват нитратите. Сред т.нар. имперфектни (несъвършени) родове се наблюдават и нитрат-позитивни, и нитрат-негативни (напр. Candida и Trichosporon). С някои малки изключения, утилизацията на нитрат остава стабилна, най-малкото в рамките на вида.

23

Видовете, които утилизират нитрати, са в състояние да усвояват и нитрити, но обратното не винаги е валидно: например определени видове на р. Debaromyces и Pichia утилизират нитрити, но не и нитрати.

Най-общо казано, дрождите могат да усвояват поредица от различни неорганични

и органични източници на азот, с цел включването им в структурните и

функционалните азотни компоненти на клетката.

Цитология на дрождевата клетка

Структура и функция на дрождевата клетка

1. Основни характеристики на дрождевите клетки.

Дрождевите клетки, проявяват изключително разнообразие по отношение на размерите на клетката, нейната форма и цвят. Хетерогенност по отношение на цвят и морфология могат да имат дори клетки, принадлежащи към един и същи щам. Различията най – често се дължат на промяна във физичните и химичните условия на средата. Размерът на клетките варира значително при различните дрождеви видове. При анализ на дрождевата клетка се взима предвид S. cerevisiae. Детайлно описание и анализ на цитологията на S. cerevisiae е дадено от [Walker, 1998].

Клетките на S. cerevisiae са основно с елипсовидна форма с големина, варираща от 5 до 10 µm в по големия диаметър и от 1 до 7 µm в по малкия диаметър. Клетъчният обем е около 29 µm 3 при хаплоидните клетки и около 55 µm 3 при диплоидните. Размерът на клетката се увеличава с възрастта.

По отношение на макромолекулния състав в дрождевата клетка се включват белтъци, гликопротеини, полизахариди, полифосфати, липиди и нуклеинови киселини (Таблица 3).

Таблица 3. Класове молекули изучени в дрождевата клетка

Клас макромолекули Функции Основни компоненти

Актин

Тубулин (цитоскелет)

Хистони (Н2А, Н2В, Н3, Н4)

Структурни

Рибозомални белтъци

Хормони α и а феромони

Белтъци

Ензими Асимилация и дисимилация на органични съединения

24

Компоненти на клетъчната стена Манопротеини

(белтъци към които са прикачени голям брой манозни групи)

Гликопротеини

Ензими Специфични ензими (инвертаза)

Компоненти на клетъчната стена Глюкан, манан, хитин

Компоненти на капсулата

Полизахариди

Резервни вещества Гликоген, трехалоза

Полифосфати Резервни вещества Полифосфати във вакуолата

Структурни Свободни стероли в мембраните

Резервни вещества Липидни частици (стеролни естери и триглицериди)

Липиди

Функционални Фосфоглицеридни деривати, свободни мастни киселини

ДНК Геномна ДНК (80%), митохондриална ДНК (10 – 20%)

Нуклеинови киселини

РНК рРНК (80%), мРНК (5% цитозол, Ендоплазматичен ретикулум, митохондрии), тРНК, мяРНК

2. Цитологични методи

Неоцветена, дрождевата клетка трудно се наблюдава под светлинен микроскоп. При увеличение 1000 пъти е възможно да се наблюдават дрождевите вакуоли и цитозолни включения. При фазово – контрастна микроскопия приложена с подходяща техника за оцветяване могат да се разграничат някои клетъчни структури. Флуоро – хромни багрила в комбинация с флуоресцентна микроскопия, могат да се използват за визуализация на клетъчните структури, както и на клетъчната повърхност [Pringle et al., 1991]

Удобна методика за локализация и проследяване на транспорта на белтъци в дрождевата клетка е използването на “зелен” флуоресцентен белтък („green” fluorescent protein (GFP) извлечен от медуза (Aequorea victoria). Белтъкът изпълнява ролята на репортерна молекула, като негови производни притежават флуоресцентен спектър изместен към различна дължина на вълната. Фузията на таргетни гени с GFP ген (N – или C – терминален) позволява да се проследи експресията и функцията на свързаните белтъци посредством флуоресцентна микроскопия [Niedenthal et al., 1996].

Съществени характеристики на дрождевата клетка, могат да се проследят, чрез използване на специфични моноклонални антитела срещу структурни белтъци свързани с флуоресцентни багрила като флуоресцин изотиоцианин (fluorescein isothiocyanate (FITC) или Родамин B.

25

Таблица 4. Структурно специфични багрила използвани при изучаване на дрождевата клетка.

Багрило Структури, които се наблюдават Коментар

Метиленово синьо Цялата клетка Мъртвите клетки се оцветяват в синьо

Аминоакридин Клетъчна стена Индикатор за наличие на повърхностен потенциал

F – C Con A

(конкавалин А)

Клетъчна стена Свързва се специфично към манана

Калкофлуор Бяло Белези от пъпкуване Хитина в белега флуоресцира

DAPI (4,6, - диамидино – 2 – фенилиндол) (4,6-diamidino-2-phenylindole)

Ядро ДНК флуоресцира (Фиг.1)

Неутрално червено Вакуоли Вакуолите се багрят в пурпурно червено

Йодин Гликогенови депа Гликогена се оцветява в кафеникаво – червено

DAPI Митохондрии Митохондриите флуоресцират в белезникаво – розово

Родамин Митохондрии Митохондриите флуоресцират в жълто – зеленикаво

Фигура 8. DAPI-оцветяване на дрождева клетка.

26

За изучаване на дрождевата клетка, често се прилага методът течна цитометрия. Чрез използване на флоуресцентно – активирано клетъчно сортиране (fluorescence-activated cell-sorting (FACS), може да се наблюдава развитието на клетъчния цикъл, след като клетката е белязана с Конканавалин А, свързан с флуоресцин изотиоцианин и клетъчни белтъци, белязани с тетраметилродамин изотиоцианат (tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). Тези маркери, позволяват да се получи количествена информация за важни свойства на индивидуалната дрождева клетка по време на клетъчния растеж през клетъчния жизнен цикъл.

Ултраструктурата на клетъчните органели, както и макроколекулния състав на дрождевата клетка се изучават посредством електронна микроскопия. Електронната микроскопия, представлява сканираща технология за изучаване на клетъчната топология, докато методът на ултратънките срезове е съществен за трансмисионната електронна микроскопия, чрез която се визуализират малки вътреклетъчни структури. Атомно силовата микроскопия се използва успешно за визуализиране на клетъчните повърхности на клетки от различни дрождеви щамове или на клетки , развиващи се при различни условия, нефиксирани такива, както и клетки, при които не се е състояла плазмолиза.

3. Клетъчни компартменти и органели в дрождевата клетка.

Фигура 9. Тънък срез на дрождева клетка

В идеализиран модел на дрождева клетка (Фиг. 9), се наблюдават следните ултраструктурни елементи (фиг. 9): клетъчна стена, периплазма, плазмена мембрана, инвагинации, белези от пъпкуване, цитозол, ядро, митохондрии, ендоплазматичен ретикулум, апарат на Голджи, секреторни везикули, вакуоли, пероксизоми. Дрождевата клетка притежава повечето структурни и функционални компоненти на висшите еукариоти, което я прави идеален модел за изучаване на клетъчната биология на еукариотите. За разлика от клетките на бозайниците, дрождевите клетки за обвити от здрава клетъчна стена, по която след клетъчното делене се наблюдават родилни белези. Дрождевите вакуоли изпълняват функциите на лизоми при висшите клетки. На таблица 5 са представени маркерни ензими, използвани за специфично идентифициране на дрождеви структури.

27

Таблица 5. Клетъчни органели и компартменти в дрождевата клетка.

Органел / клетъчен участък Маркерен ензим

Периплазма Инвертаза Клетъчна стена

Секреторна Кисела фосфатаза

Плазмена мембрана Ванадат чувствителна АТФаза

Цитозол Глюкозо – 6 фосфат дехидрогеназа (Г – 6 – ФДХ)

Нуклеоплазма РНК полимераза Ядро

Ядрена обвивка Трансмисионна ЕМ

Ендоплазматичeн ретикулум Светла микрозомална фракция НАДФН цитохром с оксидоредуктаза

Мембрана α Манозидаза Вакуоли

Сок Протеаза А и В

Апарат на Голджи β Глюкан синтаза

Манозил трансфераза

Матрикс Аконитаза, фумараза

Междумембранно пространство Цитохром с пероксидаза

Вътрешна мембрана Цитохром с оксидаза

Митохондрии

Външна мембрана Кийнуренин хидролаза

Пероксизоми Пероксизомален матрикс Каталаза, изоцитратлиаза, флавин оксидаза

Субклетъчни структури от дрождеви клетки, могат да бъдат изолирани протопласт или от цяла клетка, посредством разрушаване на клетъчната стена предшествано от диференциално центрофугиране.

28

Фигура 10. Схема на органели и компартменти в дрождевата клетка.

3.1. Клетъчна обвивка

Дрождевата клетъчна обвивка, представлява защитна капсула, изградена от три основни компонента (от вътре на вън): плазмена мембрана, периплазматично пространство и клетъчна стена. При S. cerevisiae, клетъчната обвивка заема 15 % от тоталния клетъчен обем и има решаваща роля в контрола на осмотичните свойства на клетката, както и на клетъчния пермеабилитет.

Дебелината на плазмената мембрана е 7 nm, наблюдават се инвагинации в цитозола. Подобно на всички останали мембрани се състои от липиден бислой с потопени (трансмембранни) или разположени по него белтъци. Най – разпространени компоненти на дрождевите липиди са фосфатидилхолин и фосфатидилетаноламин, доказано е наличие на малки количества фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин или фосфатидил глицерол, както и стероли – ергостероли и зимостероли. Белтъците по дрождевата мембрана се разделят в няколко категории в зависимост от функцията си:

• цитоскелетни опорни

• ензими за синтез на клетъчната стена

• белтъци за трансмембранна сигнална трансдукция

• белтъци преносители на разтворени вещества (пермеази, канални берлтъци, АТФази)

Основната функция на клетъчната мембрана е избирателната пропускливост. Това свойство на мембраната позволява контрол на транспортираните вещества в двете посоки - към клетката и извън нея. Ролята на мембранните белтъци е силно изявена в процеса на регулацията на храненето при дрождите, като приемане на въглехидрати и азотни съединения и йони, както и при изхвърляне от клетката на вредни за развитието и молекули. Други важни свойства на мембраната са нейното участие в процесите на ендо и екзоцитоза на молекули, отговор при стрес и спорулация.

Дебелината на дрождевата периплазма е 35 – 45 Ǻ. Участъкът от периплазмата асоцииран с клетъчната стена се приема за външен, а този с плазмената мембрана – вътрешен. Периплазмата се състои главно от белтъци – манопротеини, които не могат да проникнат през клетъчната стена, но изпълняват съществена функция при

29

хидролизата на субстрати, които не могат да преминат през плазмената мембрана: инвертазата превръща захарозата в глюкоза и фруктоза, киселата фосфатаза освобождава свободен фосфор от органични съединения.

3.2. Клетъчна стена

Клетъчната стена при дрождевите клетки е относително дебела обвивка (от 100 до 200 nm) (Фиг. 11 и 12), представляваща около 15 - 25% от сухата маса в клетката. Основните структурни елементи на клетъчната стена са полизахаридите (80 - 90%), представени главно от глюкани и манани и в много малко количество хитин. Глюканите (представени са ß-2,6 и ß-1,3 – свързани глюкани) обезпечаван здравината на клетъчната стена, образувайки мрежа от микрофибрили. Мананите са α -1,6 свързани с α -1,2- и α -1,3 разклонени вериги. Хитинът е полимер на N – ацетилглюкозамин и съдържанието му е около 2 – 4 % от клетъчната стена, като се наблюдава предимно в областта на белезите от пъпкуване. При някои дрожди с филаментозен растеж като Candida albicans хитинът се среща в по – високи концентрации, докато при други дрождеви видове, отсъства. Други компоненти на клетъчната стена са: белтъци, представени с различни концентрации, липиди и неорганични фосфати. Препарати от клетъчна стена са описани от Zinser и Daum през 1995.

Фиг.11. Архитектура на клетъчната стена при дрожди

Таблица 6. Лекарства третиращи системни микози Съединение Ефект Амфотерцин Образува комплекси с мембранните стероли (ергостероли), което води до

30

разрушаване на клетката Флуконазол Нарушава синтезата на ергостерол (блокира Р450 – зависимото

диметилатион стъпало), което води до акумулиране на ланостерол Дезаминиран до 5 – Флуороурацил се инкорпорира в РНК и инхибира белтъчния синтез

5 – Флуороцитозин

Преобразуван в 5 – Флуородеоксиуридилат се инкорпорира в ДНК и инхибира синтезата на тимидилат

Белезите от пъпкуване представляват специализирани издутини с овална форма, които остават по повърхността на майчината клетка на пъпкуващите дрожди след клетъчното делене и отделянето на дъщерната клетка (Фиг. 13). По повърхността на дъщерната клетка след пъпкуването, остава вдлъбнатина, наречена родилен белег.

Фигура 12. Структура на клетъчната стена при дрожди

Фигура 13. Пъпкуване при дрожди

При третиране на клетките с литични ензими (напр. Хеликаза, изолирана от храносмилателен сок на охлюв, Зимолиаза или Литиказа с микробен произход) и добавяне на осмотичен стабилизатор, клетъчната стена се отстранява и се формират сферобласти, които при микроскопско наблюдение изглеждат като глобуларни структури. Сферобластите, притежават свойството да регенерират клетъчната стена (Фиг. 14)

31

Фиг. 14. Микрография на регенериращ дрождеви протопласт

Флокулация (безполова клетъчна агрегация) представлява важен феномен с изключителен интерес за пивоварната промишленост, тъй като пивните дрожди, притежават склонност към агрегиране. Дрождите разположени по дъното, обикновено се използват за масова обща ферментация демонстрират висока степен на флокулация (формират микроскопични флокули от клетъчни струпвания), за разлика от повърхностно разположените клетки, използвани за производство на специализирани видове бира. Предполага се, че флокулацията е резултат от експресията на флокулини, представляващи манозо специфични лектини при дрождите, които взаимодействат с манозните рецептори по клетъчната стена на съседните клетки.

3.3. Цитозол и цитоскелет

Дрождевата цитоплазма, представлява кисела колоидна течност с рН 5.25, съдържаща йони, органични съединения с ниска, или средна молекулна маса, и разтворими макромолекули (ензими, белтъци, белтъчни фактори, гликоген). Цитозолните дрождеви ензими, включват такива от :

• гликоитчичния път

• комплекса за синтез на мастни киселини

• някои ензими, ангажирани в белтъчната биосинтеза

Цитоскелетът представлява своеобразна мрежа, обезпечаваща вътрешната стабилност на клетката и осигуряваща, нейната структурна организация. Състои се от микротубули и микрофиламенти, които представляват динамични структурни организации, които изпълняват своите функции посредством изграждане и разрушаване на индивидуални белтъчни субединици. Микротубулите са изградени от α и ß тубулинови мономери, които полимеризират до хетерополимери, микрофиламентите се съставени от двойно верижни микрофиламенти F – актин, изградени от полимеризирали глобуларни мономери G – актин. Микротубулите и микрофиламентите са отговорни за осъществяване на динамичните процеси в клетката по време на мейозата, митозата, клетъчното делене и движението на органелите.

32

В дрождевата цитоплазма са разположени специфични микротелца, със структура, различна от тази на клетъчните органели:

• свободно разположени 80S рибозоми (различни от асоциираните с Ендоплазматичния ретикулум и митохондриите 60S рибозоми)

• липидни частици, с резервна функция, които могат да вземат участие в биосинтеза на клетъчните мембрани

• протеазоми – комплекси от множество субединици, участващи в програмираната белтъчна протеолиза или в белтъчния транспорт и деградация. Поради изключителната важност на убиквитин – протеозомния път за клетъчния метаболизъм и регулация, той е разгледан отделно.

3.4. Ядро и извънхромозомни елементи

Ядрото на дрождевата клетка, представлява кръгла, нагъната структура с диаметър около 1.5 µm. Нуклеоплазмата е отделена от цитозола посредством двойна мембрана с пори с диаметър между 50 и 100 nm. На двата срещуположни полюси са разположени вретеновидни полярни телца (spindle pole bodies (SPBs)), свързани помежду си посредством непрекъснати вътреядрени микротубули както и известно количество прекъснати микротубули. Вретеновидните полярни телца са свързани с микротубулите на цитозола. Тези структурни елементи играят важна роля по време на клетъчното делене, цитокинезата и пъпкуването. За разлика от други еукариотни клетки, по време на митозата ядрената мембрана не се разгражда

Фигура 15. Електронно микроскопска снимка на дрождеви хромозоми.

В ядрото се наблюдава плътен регион, който отговаря на нуклеолите, изчезващи по време на митозата и образуващи се наново по време на интерфазата. Основна част от нуклеоплазмата е съставена от геномна ДНК, която заедно с хистоновите и нехистонови белтъци е организирана в хроматин. Дрождевите хромозоми се формират и удвояват по време на митозата (или мейозата), но остават невидими при микроскопско наблюдение (Фиг. 15). Подходяща техника за разделяне на хромозомите и кариотипизиране е пулсовата гел електрофореза (Фиг. 16).

33

Фигура 16. Разделяне на дрождеви хромозоми чрез пулсова гел електрофореза.

В допълнение към генетичния материал, в ядрото се включват механизми за ДНК репликация, ДНК поправка, транскрипция и РНК процесинг, както и необходимите субстрати и регулаторни фактори, за получаване на прекурсорни продукти, в точно определени пропорции с дрождевите протеозоми

В ядрото на дрождевата клетка може да са представени някои нехромозомни генетични елементи [Wickner, 1995].

• 2 µm ДНК – представлява стабилен кръгов ДНК-ов плазмид, който се реплицира веднъж по време на S фазата. Тези кръгови елементи са представени в множество копия и се използват при конструиране на вектори за клониране в дрождевите рекомбинантни ДНК технологии. До този момент, не са открити функциите на четирите гена разположени в 2 µm ДНК.

• Двойноверижна РНК е открита в някой дрождеви щамове “убийци”. В двойноверижната РНК са разположени гени за токсини, които застрашават щамовете “жертви”

• Tу-елементи – единствен клас ретротранспозони открит в дрождите. 3.5. Секреторна система и вакуоли

Дрождевата клетка, подобно на висшите еукариотни клетки притежава система от мембранно ограничени компартменти, участващи в транспорта на белтъци, към, вътре и навън от клетката. Дрождевата клетка се приема като подходяща моделна система за процесите, осъщаствяващи се в еукариотната клетка, както и за структурите ангажирани в тях. [Pelham et al., 1995].

Ендоплазматичния ретикулум (ЕР) е място за биосинтеза и модификация на белтъци, които се изнасят от клетката. Преди синтеза на ЕР – асоциирани полизоми,

34

разположени по повърхността на ЕР мембрана, се осъществява транслокация на прекурсорни белтъци в лумена на ЕР, където с участието на чаперони, прекурсорите нагъват и гликозилират. От ЕР, белтъците се насочват към Апарата на Голджи (АГ) чрез везикули, които фузират през цис края и се пренасят през АГ до транс края. В АГ, белтъците се модифицират посредством прибавяне на странични въглехидратни вериги и манозилиране. Ретроградния транспорт на белтъци от АГ към ЕР, е част от системата за качествен контрол на белтъците за експорт от клетката.

Белтъците от АГ се насочват към различни клетъчни звена или към външната среда с помощта на секреторни везикули. Клетъчните звена могат да бъдат:

• Вакуоли

• Района на пъпкуване по време на митозата, подчинен на актин зависим транспорт

• Плазмената мембрана

• Периплазма.

Обикновено, малко количество предимно еднообразни белтъци се изнасят към периплазмата. Въпреки това, сигнални секвенции от тези белтъци фузират в рекомбинантни хетероложни белтъци с терапевтична стойност, секретирани от дрождеви клетки.

Вакуолата е ключовия органел в дрождевата клетка ангажиран във вътреклетъчния транспорт на белтъци. Вакуолата може да се наблюдава като интегрална структура включена във вътремембранната клетъчна система. Основната функция на тази подобна на лизозома структура е неспецифичното протеолитично разграждане на белтъци, под действието на вътревакуолни литични ензими: ендопептидази, аминопептидази и карбоксипептидази. Други съществени функции на дрождевите вакуоли са: депа складиране на основни амино киселини, фосфати и някои метални йони, осигуряване на цитоплазмената хомеостаза посредством регулация на концентрацията на йони, поддържане на осморегулацията.

Внасянето на белтъци в дрождевата клетка по пътя на ендоцитозата се осъществява чрез мембранно свързани везикули (ендоцитозни везикули), които пренасят белтъците до вакуолите, в които се разграждат протеолитично. [Riezman, 1993].

3.6. Пероксизоми

Пероксизомите в еукариотната клетка изпълняват разнообразно метаболитни функции. В дрождевите пероксизоми са открити оксидазни ензими, които участват в оксидативното усвояване на специфични въглеродни и азотни източници (Фиг. 17). Органелите се развиват в клетките, култивирани на глюкозна среда от малки пероксизомни мехурчета, които в последствие се изпълват с пероксизомални ензими – каталаза и алкохол оксидаза. Внасянето на допълнително компоненти в пероксизомите е разгледано в глава Транспорт. Голяма част от гените отговорни за пероксизомалната биогенеза при S. cerevisiae, (PEX гени) са открити. В дрождевата клетка β –

35

окислението не се извършва в митохондриите. Пероксизомите са мястото за разграждане на мастите киселини. (Фиг. 18)

Фигура 17. Микрография на дрождеви пероксизоми

Фигура 18. Функция на дрождевите пероксизоми: При дрождите не се наблюдава ß-окисление в митохондриите. Ацетил-CoA, НАДH и НАДФH се синтезират в пероксизомите.

36

3.7. Митохондрии

Митохондриите в дрождевите клетки наподобяват в структурно отношение митохондриите открити във висшите еукариотни клетки. Поради тази причина дрождевите митохондрии представляват подходящ модел за изучаване на митохондриалната структура, функция и биогенеза. [Glick and Pon, 1995]. Също така, дрождевите митохондрии притежават някои важни допълнителни функции, които липсват в митохондриите на висшите еукариотни клетки (предимно тези на бозайниците).

Структурата (Фиг. 19) на митохондриите включва:

• Външна мембрана – в мембраната се синтезират ензими, отговорни за метаболизма на липидите

• Междумембранно пространство

• Вътрешна мембрана – в нея се синтезират НАДН и сукцинат дехидрогеназа, които са компоненти на дихателната верига, както и АТФ синтетазата, и различни мембранно свързани интегрални транспортни белтъци

• Митохондриален матрикс – в него се синтезират ензими, отговорни за окислението на мастните киселини, ензими от цикъла на лимонената киселина, митохондриална ДНК и системи за транскрипция и синтеза на белтъци (в това число митохондриална 60S и митохондриални тРНКи)

Фигура 19. Микрография на тънък срез на дрождеви митохондрии.

Дрождевите митохондрии са динамични структури, чиито размери, форма и брой варират в зависимост от щамовата специфичност, фазата от клетъчния цикъл и условията за развитие на клетките. Други важни фактори са концентрацията на кислород и глюкоза, наличие на неферментируеми субстрати, наличие на стероли и мастни киселини, както и наличие на специфични метални йони (Mg++) (Таблица 5).

37

Таблица 7: Влияние на въглеродния източник в хранителната среда върху дрождевите митохондрии

Субстрат Концентрация Кислород Дишане Морфология

Глюкоза Излишък + Потискане Няколко, големи

Етанол Излишък + Активиране Много, малки

Глюкоза Излишък - Потискане Няколко, големи

Глюкоза Лимитиране - Потискане Няколко, големи

Глюкоза Лимитиране + Активиране Много, малки

При аеробни условия, дрождевите митохондрии са отговорни за синтеза на АТФ и за окислителното фосфорилиране. Активността на Цикъла на лимонената киселина както и на дихателните вериги, зависят от вида на дрождите и от експресията на ефекта на Крабтри. Ефектът на Крабтри, представлява феномен, който отчита концентрацията на глюкоза в средата и наличие на специфични катаболитни пътища характерни за глюкозо чувствителни клетки, при които въпреки наличието на кислород, преобладава ферментацията. При аеробни условия, при липса на кислородно дишане, митохондриите изглеждат “излишни”. Съществуват така наречени ρ° „petite” мутанти, при които изцяло липсват функционални митохондрии. Въпреки това, дори в анаеробни условия, митохондриите изпълняват специфични функции от клетъчната физиология, като имат отношение към цялостния клетъчен метаболизъм в анаеробни условия:

• Синтез и разграждане на мастни киселини и липиди

• Биосинтеза на ергостероли

• Отговор и адаптиране при стрес

• Ензими за синтеза на специфични амино киселини, дикарбоксилни киселини, пиримидинови и пуринови бази, порфирин и птеридини

• Мобилизация на гликоген

• Продукция на ароматни съединения

Значимостта на дрождевите митохондрии се доказва от факта, че между 8 и 10 % от ядрените дрождеви гени са свързани с митохондриалната биогенеза и поддържане на функцията на тези органели. Голяма част от тези белтъци се синтезират от цитоплазмените рибозоми и се транспортират до митохондриите, където се синтезират 12 различни белтъка (цитохромоксидазни субединици, цитохром b, шест субединирнкици от НАДН дехидрогеназа, сплайсинг фактори). Също така се синтезира митохондриални рРНКи (15S и 26S субединици) и митохондриални тРНКи. Митохондриалната биогенеза, включваща ядрени и митохондриални гени, е изучена

38

подробно при S. cerevisiae. Тези знания биха могли да се приложат на практика при изучаване на мутации при този микроорганизъм. На фигура 20 са представени някои свойства на дрождевите митохондрии.

Фигура 20. Свойства на дрождевите митохондрии

Популационен растеж на дрожди

1. Периодично култивиране 1.1. Растеж на твърди хранителни среди Морфологичните особености на дрожди, култивирани върху твърди хранителни

среди, са много разнообразни с вариации в цвета, текстурата и геометрията (периферия, контури) на гигантските колонии.

Отделните клетки в дрождевата колония също показват хетерогенност в зависимост от възрастта, растежната кинетика, морфологията и метаболизма. Например, видове дрожди като Saccharomyces. cerevisae и Kluyveromyces. marxianus, които обикновено растат като пъпкуващи клетки в течна среда, образуват псевдомицел, когато растат върху агар. Такива форми на филаментозен растеж, често се наблюдават както в периферния ръб на колонията, така и под повърхността, където псевдомицелът прониква в агара. Диморфизмът на дрождевите колонии се смята, че представлява гладуващи клетки, удължаващи водещия ръб на колонията в търсене на хранителни вещества. В действителност, липсата на хранителни вещества (глюкоза) и кислород, заедно с усвояването на токсични за дрождите метаболити (етанол), се смятат определящи за особеностите в растежа на индивидуалните клетки в колонията.

Освен диморфизъм при растеж върху агар, за някои дрожди е известно, че развиват папили или “тумори” върху колонията в резултат от адаптивни мутации. Например Rojas Vondrejs (1995) описват агресивно растящи папили в rad6 мутанти на S. cerevisae, които са способни да се разрастват върху съседните колонии.

39

Kamath и Bungay правят подробни изследвания на кинетиката на растежа на дрождевата колония. Както скоростта на радиалния растеж, така и скоростта на увеличаване на височината на колониите на Candida utilis, показват по-скоро линейно, отколкото експоненциално увеличаване. Тъй като растежът е ограничен в периферията, линейното нарастване на радиалния растеж на дрождевата колонията може да се изрази като:

rt = K rt + r0, където Кr е константа на радиален растеж, r е радиусът на колонията по време t, a

r0 е радиусът в нулевият момент. Фигура 21 описва зоните на нарастване на дрождевата колония и разграничените

4 фази в зависимост от височината на колонията. Фаза 1 (h = d): когато височината на колонията е по-малка от дълбочината на

проникване на кислорода (d), цялата колония расте експоненциално тъй като глюкозата и кислородът са достъпни за цялата колония (Фигура 21А).

Фаза 2 (d<h=hg): когато височината на колонията надвиши d и докато достигне hg. Глюкозата е достъпна за цялата колония, а кислородът е достъпен само на повърхността, в резултат на което се наблюдава пръстеновиден участък с постоянна дебелина, който е зоната на растеж в тази фаза (Фигура 21В).

Фаза 3 (hg<h<hg + d): когато височината на колонията надвиши hg, има участъци в колонията (на върха) при които има недостиг на глюкоза, както и такива, в които

40

кислородът не може да дифундира. Тази фаза води до зона на растеж под формата на пресечени пръстеновидни сферични сегменти (Фигура 21С).

Фаза 4 (h = hg + d): в тази фаза височината на колонията остава с постоянна стойност (hg + d). Тук само външният периферен участък с постоянна дебелина d и постоянна височина hg в зоната на растеж (Фигура 21D).

По-особена форма на растеж на дрожди на твърда среда е наблюдавана при диморфните патогенни дрожди, Candida albicans. Gow и колегите му забелязват, че когато клетките на тези дрожди се култивират на мембранни филтри поставени върху агар съдържащ серум, хифите растат върху мембранната повърхност и през порите на мембраната. (Фигура 22).

Фигура 21. Фази на растеж на дрождева колония. А = растеж в колонията без лимитация; В =

липсва растеж в участъците, отдалечени от въздуха; С = растеж на горната част, лимитирана по глюкоза; D= растеж само в периферията; покриване на лимитацията; Е = по-сериозна лимитация по глюкоза, когато не се доставя непрекъснато; F = глюкозата не се доставя непрекъснато, съвпадение на лимитацията. d = дълбочина на проникване на кислорода в колонията; h = височина на колонията; g-височината до която глюкозата от твърдата среда може да проникне в колонията.

41

Доказано е, че хифите на Candida albicans също следват прореза и ръбовете на

вътрешните повърхности и такива отговори на растежа се дължат на явлението тигмотропизъм (контактно медиирано усещане и следване на контура), свързано с трофичното движение на клетките в зависимост от промените в субстратната топография. Хемотропизмът се изключва поради факта, че хифите от долната страна на мембранните филтри растат в порите далеч от хранителния агар. Тигморопизмът при Candida albicans, заедно с типичния спирален или повърхностен растеж на тези дрожди, може да улесни проникването на хифите в отслабените епителни клетъчни повърхности по време на патогенезиса в тъканите на гостоприемника.

Колонизацията на дрождите върху твърди материали също възниква, когато клетките са имобилизирани. Имобилизирането на клетките във вътрешни носители има много предимства пред свободната клетъчна суспендирана култура в индустриалните процеси и биотехнологичните приложения. Дрождевите клетки могат успешно да се имобилизират чрез включване, агрегиране, прикрепване или утаяване. Таблица 8 обобщава някои материали, използвани за имобилизиране на дрождеви клетки с прилагането на тези методи.

Фигура 22. Тигмотропизъм на Candida albicans. Снимка от сканиращ електронен микроскоп на хифи от Candida albicans, растящи в порите на нуклеопорьозна мембрана, поставена в серум съдържащ агар. (а) горната повърхност на мембраната с няколко хифи навлезли в порите. (b) долна част на мембраната с полепнали фрагменти от агарни частици; хифи появяващи се от долу, растящи по повърхността между мембрана и агара. (с) Горната част на мембраната показваща хифа излизаща от по-ниската повърхност и навлизаща в пората.

42

Някои от важните физиологични и метаболитни промени, които настъпват в клетките, когато те са имобилизирани следва да бъдат описани накратко. Знанията за физиологичните особености на имобилизираните дрожди се смята, че са определящи за успешните биотехнологични приложения с имобилизирани биореактори. Отчитайки първо особеностите на растежа на имобилизираните клетки, няколко изследвания показват, че клетъчната морфология, начина на пъпкуване и скоростите на растеж се влияят от имобилизацията. Например, Maschelein et al., разглеждат начина на растеж на включени в гел клетки на Saccharomyces cerevisae, който се оказва, че е много по-различен от растежа на свободна клетъчна суспензия. Имобилизираните дрождеви клетки показват четири типични фази на растеж: � Логаритмична фаза � Линейна фаза I � Линейна фаза II � Псевдостационарна фаза

През първата, експоненциална фаза, специфичната скорост на растеж е подобна на тази на свободно суспендираните клетки, но линейните фази (I, бърза, II по-бавна) се характеризират с намаляване на проникването на хранителните вещества в матрикса на гела. Протичането на последната псевдостационарна фаза зависи от имобилизирания матрикс, който определя нивото на дрождевата биомаса развита в материала за имобилизация. Растежът на включените в гела дрожди е изследван от Parascondola и de Alteris (1996), при което е доказано, че съществува лимитация по хранителните вещества, в резултат на което възниква градиент на биомасата в перлите на гела. Ето защо, в повечето случаи растежът на дрождите възниква в подповърхностните участъци на гела в резултат на адхерентен биофилм на повърхността на гела. Doran и Baily (1986) отбелязват също свързаните с растежа промени на включени в гел клетки на S. cerevisiae, асоциирани най-вече с настъпването на цикъла на клетъчно разделяне. Резултатите предполагат, че имобилизацията забавя пъпкуването на дъщерните клетки, но позволява протичането на ДНК репликацията и биосинтезата на полизахаридите на клетъчната стена.

По отношение на метаболитната активност, след имобилизация на дрожди, Norton и D’Amore (1994) преразглеждат промяната в транспорта на хранителните вещества, енергийният метаболизъм, съхраняването и структурната полизахаридна синтеза и плоидните промени в имобилизирани клетки на S. cerevisiae.

Дрождевият биофилм представлява естествена форма на клетъчна имобилизация в резултат на прикрепване на дрожди към твърди поддържащи материали. Биофилмите от дрожди имат няколко практически приложения във ферментационната биотехнология, а също имат значение в медицината при колонизацията на човешки тъкани в случаите с патогенни дрожди. Като използват гореспоменатото, Kunduru и Pometto (1996) създават метод за ферментация на дрожди, прикрепени към пластмасова подложка и реактори с биофилм. За непрекъснатото получаване на етанол, биофилмовите ферментации значително надминават клетъчно суспендираните биореактори. При по-традиционните ферментации, могат да се развият много дебели биофилми от дрожди ако хидрофобни щамове S cerevisiae се издигнат на повърхността на ферментора и се включат на височината на пяната. Такова поведение е типично за горно-ферментиращите дрожди, използвани при производството на бира. Особеностите на флотацията на дрождевите клетки и корелацията им с повърхностната хидрофобност са подробно изследвани от Palmieri et al., (1996). Щамовете S. cerevisiae, склонни към флотация, не образуват агрегати клетка-клетка, за разлика от слепващите се щамове. Фигура 23 показва слепващ се щам S. cerevisiae, прикрепен към малко въздушно балонче.

43

По отношение на биофилмите с патогенни дрожди, Douglas et al. показват, че Candida albicans се прикрепя към хирургични инструменти, като пейсмейкъри на сърцето и катетри, човешки епителни клетки и зъбен акрил. Фигура 24 показва развитието на биофилм от C. albicans върху катетри от PVC дискове.

Такова прикрепване предизвиква сериозни проблеми за клиничните миколози, особено поради факта, че биофилмите от C. albicans са устойчиви на антигъбни агенти.

Фигура 23. Поведение на флотация на клетки от S. cerevisae. Микрофотографията показва

афинитета на дрождевите клетки към въздушното мехурче. Една капка пяна се поставя на стъкло по такъв начин, че малките балончета се задържат (фазова микроскопия, х 600). Няма агрегация клетка-клетка между свободните клетки или клетките свързани с балона.

Таблица 8. Материали и методи за имобилизация на дрожди.

Методи за имобилизация Материали за имобилизация Агрегация клетка-клетка Включване в полимери

Биомаса от дрожди Калциев алгинат Карагенан Омрежен желатин

Ковалентно свързване Хидроксиалкил метакрилен гел Прикрепване и адсорбция в определени носители

Порьозно стъкло и керамични микросфери Гранулирана DEAE целулоза Синтетична гъба Жица от неръждаваема стомана

Задържане зад бариера Хидродинамично утаяване

Ултрафилтрация или микропорьозни мембрани (листи или надупчени нишки Керамични (каолитни) микросфери

44

Фигура 24. Образуване на био-филм от Candida albicans. Фигурата показва сканираща електронна микр-фотография на образуване на биофилм от Candida albicans GDH2346 върху PVC катетърни дискове в среда съдържаща 500 мМ галактоза на 1 (А). 3 (B), 6 (C). 18 (D), 24 (E) и 48 (E) час. Стрелките показват наличието на извънклетъчни полимерни материали.

2. Популационен растеж на дрожди 2. Популационен растеж на дрожди 2.1 Периодичен растеж на дрожди 1.2. Дълбочинен растеж Когато дрождеви клетки се инокулират в подходяща течна хранителна среда и се

инкубират при оптимални физични условия на растеж, ще се получи типична периодична крива на растеж, когато живата популация от клетки се екстраполира срещу времето (Фигура 25).

Кривата на растеж на дрожди, получена при периодично култивиране, се състои от типична лаг, експоненциална и стационарна фаза. Лаг фазата представлява периодът на нулев растеж (специфична скорост на растеж, µ=0) и се проявява, когато инокулираните клетки се поставят при промяна на хранителния статус или промени във физическите условия на растеж (напр. температура, осмотичност). Прецизното протичане на лаг фазата зависи не само от условията на растеж, но също така и от плътността на инокулума и неговата подготовка. Лаг фазата отразява времето, необходимо на инокулираните дрождеви клетки да се адаптират към новата за тях физична и химична среда чрез синтезата на рибозоми и ензими, необходими за постигане на растеж при по-висока скорост. След като клетките преминат през лаг фазата и започне активно клетъчно делене, те навлизат в засилена фаза преди експоненциалния растеж. Скоростта на нарастване (dx/dt) на дрождевата биомаса (x) при време (t) през тази фаза се изразява като

x

dt

dx µ=

45

със стойности на специфичната скорост на (µ), вариращи между 0 (лаг фаза) и µmax (експоненциална фаза). Забележително е, че това преминаване не е рязко нарастване. Обаче точката, когато завърши лаг фазата може да се изчисли чрез екстраполация към абсцисата в отрязъка на линията на началната лаг фаза и броят на клетките в началото на лаг фазата (отбелязано с L на Фигура 25).

Фигура 25. Типична крива на растеж при дрожди. Фигурата показва фазите на растеж на дрожди в периодична култура. µmax е максималната специфична скорост на растеж, а tD е времето за удвояване.

Експоненциалната фаза представлява период на логаритмично удвояване на клетките и константата максимална специфична скорост на растеж (µmax). Прецизната стойност на µmax (в дименсия реципрочно време; ч-1) зависи от вида на дрождите и предишните условия на растеж. Ако растежа е оптимален и клетките се удвояват логаритмично, тогава

dx

----- = µmax x

dt

което след интегриране дава

lnx – lnx0 = µmax t,

където х0 е първоначалната клетъчна маса

или

x = xo e (µmax t),

46

което е фундаменталното уравнение за експоненциален периодичен растеж. Според тази кинетика изразяването на графиката на lnx срещу времето е линейна с наклон µmax. Често е много удобно за биотехнологията на дрожди да се изчисли времето на удвояване (td) на културата, ако се знае µmax.

То може да се получи от

ln 2 0.693

td = ----------- = -----------

µmax

µmax

Разбира се, експоненциалният растеж при дрожди е ограничен, но един подход за удължаване на експоненциалната фаза е прилагането на непрекъснатото култивиране. То се състои в непрекъснато подхранване с хранителни вещества на порции по време на растежа на дрождите и най-често се използва за получаване на хлебна мая.

Дори при най-често използваното периодично култивиране, дрождите могат внезапно да навлязат във втора фаза на експоненциален растеж наречена диауксия. Това явление може да се наблюдава когато дрождите се култивират на два различни въглеродни субстрати, които се използват последователно. Например, диауксичен растеж на S. cerevisiae се наблюдава, когато при аеробно култивирани клетки се изчерпи глюкозата. След това, много ензими се дерепресират, за да осигурят преимущественото използване на втория субстрат, а именно етанол. Диауксичният растеж в този случай се дължи първо на непълното окисление на глюкозата, и второ поради окислението и използването на етанола.

При периодичното култивиране, експоненциалната фаза е относително кратка, поради изчерпването на хранителните вещества, натрупването на инхибиторни метаболити на растежа, нарастването на клетъчната флокуация. След експоненциалната фаза, клетъчният растеж навлиза в забавена фаза преди клетките да преминат в период на нулева скорост на растеж (стационарна фаза). След като растежът се ограничи през забавената фаза, нарастването на клетките за единица време ще се определи като по-ниска специфична скорост на растеж от µmax. Когато растежът на дрождите е лимитиран от концентрацията на един субстрат (S) (както в забавената фаза), връзката между µ и (S) може да се дефинира с уравнението на Моно:

[S]

µ = µmax ------------

[S] + Ks

където Кs (константа на насищане) е стойността на S, която ограничава скоростта на растеж до ½ µmax.

В стационарната фаза натрупаната дрождева биомаса остава относително постоянна и специфичната скорост на растеж (µ) е равна на нула. След продължителен

47

период в стационарна фаза, дрождите могат да умрат или да автолизират. Отмирането е експоненциално и може да се изрази като

където k представлява скоростта на отмиране.

През последните години физиологичната природа на клетките в стационарна фаза при S. cerevisiae се изследват усилено.

Стационарната фаза се определя като способността на дрождите да оцеляват при продължителни периоди (т.е месеци) без добавяне на хранителни вещества. Типът на хранителния глад е важен при определяне на влизането в стационарната фаза. Например, когато S. cerevisiаe се лимитира по въглерод, навлиза в стационарна фаза, но когато липса азот, клетките могат да претърпят мейоза и спорулация (ако са диплоидни) или могат да развият псевдомицел. Преминаването в стационарна фаза се регулира по пътя на cАМP сигнална трансдукция, чрез който може да се проследи достъпността на глюкозата. След като глюкозата се ограничи, се инициира каскадната система (аналогична на пътя на феромонния отговор), който причинява навлизането на клетките в състояние на пролиферационен покой.

Клетките, лимитирани по други освен въглерод субстрати, не могат да останат жизнеспособни при такова състояние на покой. Клетки, лимитирани по въглерод, претърпяват физиологични промени, които включват забавяне на метаболизма и превключване на способността им да оцеляват за дълъг период от време без добавяне на субстрати. Репролиферацията от този етап е двуетапен процес. По време на първата фаза, метаболитната активност се възстановява и клетките се подготвят за активен растеж. Втората фаза е напускане на състоянието на покой G0 и завръщане към митотичния клетъчен цикъл.

В допълнение към хранителната лимитация, други физиологични причини могат да предизвикат навлизането на дрождевите клетки в стационарна фаза. Те включват: токсичните метаболити (особено етанол), ниското рН, високият CO2, промяната на О2 и високата температура. Някои от тези аспекти влияят върху растежа на дрождите в индустриалните ферментации и имат значително практическо значение за изследване на ролята на външните фактори при контролиране на навлизането във, и напускането на състоянието на стационарната фаза при дрождевите клетки.

Полу-непрекъснато култивиране 1. Въведение Съществуват разнообразни техники за дълбочинно култивиране на

микроорганизми. Периодичното и полу-непрекъснатото култивиране са част от приложението на ферментациите, които се използват от древността и до наши дни за повечето промишлени производства. Непрекъснатото култивиране е сравнително нова техника и все още има ограничено промишлено приложение, но е безценна като инструмент в лабораторните изследвания.

kxdt

dx =−

48

Съществуват няколко описания в литературата на методологии за дълбочинно култивиране, вероятно поради разнообразието от ферментации и огромният асортимент от апаратура на пазара. Тук ще бъдат разгледани някои от основните аспекти на организацията и протичането на полу-непрекъснатата и непрекъсната култура в сравнителен аспект с най-простата периодична култура.

2. Същност на полу-непрекъснатото култивиране Полу-непрекъснатото култивиране по същество е периодична култура, която се

похранва със свежи хранителни вещества, като например лимитиращи растежа субстрати, или добавки, като прекурсори на продукти. Термините продължително култивиране и полу-периодично култивиране също се използват за да се опише този тип техника на култивиране.

Първоначално техниката на полу-непрекъснатото култивиране се въвежда от производителите на дрожди в началото на ХХ век за регулиране растежа на периодична култура от Saccharomyces cerevisiae (хлебни дрожди) на субстрат малц. Производителите на мая се сблъскали с два проблема: първо, ако концентрацията на малц в културалната среда е много висока, тогава дрождите вместо да произвеждат биомаса, натрупват етанол. Второ, ако концентрацията на малц се поддържа минимална, тогава растежът на дрождите намалява. Проблемът бил решен чрез контролиран подхранващ режим (обикновено с часови добавки), така че растежът на дрождите да зависи от лимитиращия субстрат.

Последвало успешно приложение на техниката на полу-непрекъснатото култивиране, през 40те години на ХХ век за производството на глицерол, бутанол, ацетон и органични киселини с по-висок добив на продукт и по-пълно усвояване на компонентите на средата.

В последните години техниките на полу-непрекъсното кутивиране се използват за получаване на антибиотици (например пеницилин G) витамини, аминокиселини, ензими и растежни хормони.

2.1. Техники за контрол на полу-непрекъсната култура Създадени са няколко техники за контрол на полу-непрекъсната култура. За леснота

те се класифицират в две главни групи: такива с контрол от тип “обратна връзка” и такива без подобен контрол. Тези две групи по-нататък се подразделят (Таблица 9).

Таблица 9. Класификация на техниките за полу-непрекъснато култивиране

Техника

Пример

Статус Метод Контролен параметър

Субстрат/добавка

Продукт

Контрол тип “обратна връзка”

Непряк Пряк

Респираторен коефициент Етанол

Меласа Етанол

Дрожди SCP

Без контрол тип “обратна връзка”

Периодични или увеличаващи добавки Постоянна скорост на добавяне Експоненциална скорост на добавяне

Няма Няма Няма

Фенилоцетна киселина β-Галактозидаза Етанол

Пеницилин Глицерол SCP

49

Непрекият метод на контрол на принципа на обратната връзка включва мониторинг на параметрите на култивиране, които не са пряко свързани със субстрата, който пък може да е лимитиращ или нелимитиращ, например разтворен кислород, респираторен коефициент (напр. отношението CO2/O2) и стойностите на рН. Директният контрол от типа “обратна връзка” включва пряк мониторинг на концентрацията на субстрата в културалната среда. Също така субстратът може да се поддържа на постоянно ниво или може да варира и да се поддържа в оптимална концентрация. Двата вида контрол с обратна връзка могат да се прилагат ръчно (отворена система) или автоматично (затворена система). В системите без контрол от типа “обратна връзка” средата може да се добавя с постоянна скорост (т.е. при определени стойности, зададени на помпата), с експоненциална скорост в зависимост от увеличаването на биомасата, или просто на порции (т.е. почасово).

2.2 Предимства на полу-непрекъснатото култивиране (1) Усвояване на субстрати, които инхибират растежа ако присъстват във високи

концентрации (напр. етанол, метанол, оцетна киселина и ароматни съединения); (2) увеличаване на продукцията на биомаса (например при периодично

култивиране на дрожди биомасата достига 5-10 г/л, докато при полу-непрекъснатото култивиране продукцията на биомаса може да надвиши десет пъти тези стойности). Този аспект е много ценен при получаване на продукти свързани с растежа;

(3) получаване на вторични метаболити, които не са свързани с растежа (т.е. тези, които се получават когато организмът е навлязъл в стационарна фаза). В този случай скоростта на разреждане може да се контролира така, че първоначално да се натрупа много биомаса, и когато организмите навлизат в стационарна фаза, растежът да се забави така, че накрая да се получи толкова субстрат, колкото да се осигури енергията за поддържане, докато започне образуването на продукт;

(4) преодолява се катаболитната репресия; (5) намалява се вискозитета на средата (напр. продукцията на декстран и

ксантанова смола); (6) преодолява се проблема с контаминацията, мутациите и нестабилността на

плазмидите, наблюдавани при непрекъснатото култивиране. 2.3. Недостатъци на полу-непрекъснатото култивиране (1) Допълнителното оборудване за контрол на принципа на обратната връзка може

да е скъпо; (2) В системи без контрол по обратна връзка, където средата се добавя по

предварително определена схема, е трудно да се реагира на отклонения от предвидената схема на растеж на организма (т.е. процесът не винаги следва очакваните резултати);

(3) Изисква значителен опит на оператора.

50

2.4. Реализиране на полу-непрекъснат процес на култивиране

Постановката на типичният полу-непрекъснат процес е показан на Фигура 26.

Фигура 26. Схематично представяне на система за полу-непрекъснато култивиране. (i) Подхранващ резервоар, (ii) устройство за измерване на потока, (iii) перисталтична помпа, (iv) ферментор с бъркалки.

Полу-непрекъснатото култивиране започва просто като периодично култивиране. Инокулумът за периодичното култивиране може да се приготви с колби на клатачка, който е един от най-простите методи за култивиране на организми. Тази техника е всъщност малка периодична култура с типична лаг, експоненциална и стационарна фаза. Лаг фазата в основната периодична култура трябва да се поддържа на минимума, и ето защо физиологичното състояние на клетките в инокулума е от първостепенно значение. В повечето случаи инокулумът трябва да се култивира в среда, която е подобна на тази в основната култура. Физичните условия трябва също да са близки (т.е. температура и рН). Инокулумът не трябва да се прехвърля в главния съд докато клетките растат в експоненциална фаза (това отнема приблизително 12 часа). След това посевният материал се прехвърля в стерилни условия чрез свързващите съдове, изтласкан с помощта на перисталтична помпа (Wastson-Marlow или еквивалент) в съда за основната ферментация. Посяват се 10 обемни процента от инокулума. За полунепрекъснатото култивиране, периодичната култура е обикновено половината от крайният обем.

Особено внимание трябва да се обърне в началото на полу-непрекъснатата култура, най-вече когато процесът е лимитиран по субстрат и се контролира на принципа на обратната връзка. В този случай подхранването трябва да започне веднага след като всичкият субстрат в периодичната култура е изчерпан, иначе процесът се контролира трудно. Проблеми, свързани с контрола, могат да възникнат ако културата “гладува” преди да започне подхранването, което удължава лаг фазата, докато клетките превключат метаболитното си състояние.

Най-общо, подхранването започва когато се забележи рязък скок в концентрацията на разтворения кислород.

51

2.5. Определяне на скоростта на проток

Следното уравнение може да се използва, за да се изчисли скоростта на проток за лимитиран по субстрат полунепрекъснат процес:

FS0 = Y

Χµ

В това уравнение F е скоростта на проток (литър/час), S0 е концентрацията на лимитиращия субстрат в средата (грам/литър), µ е специфичната скорост на растеж (час –1), X е концентрацията на биомасата (грам/литър), а Y е добив клетки за субстрат (грам биомаса за грам субстрат).

2.6.. Калибриране на помпата По принцип, за да се поддържа прецизен контрол на скоростта на проток, се налага

честа проверка на стойностите й. Това е така особено при употребата на перисталтични помпи, тъй като тръбичките в главата на помпата се износват при продължително действие, в резултат на което се получават неточни скорости на проток.

За определяне на скоростите на проток могат да се инсталират вътрешни датчици на протока. Най-простият такъв датчик се прави от 10 мл градуирана пипета (вж. Фигура 1). При нормални работни условия, тръбата към датчика на потока е защипана със скоба на изхода. За да се калибрира помпата, просто се отваря скобата и позволява на пипетата да се напълни (трябва да е разположена под нивото на течността в резервоара със средата), след което скобата се затваря, за да се изолира подхранващия резервоар. След изолирането му скоростта на проток може да се определи чрез измерване на нивото на течността в пипетата за определен интервал от време.

Непрекъснати дрождеви kултури

Растежът на клетките и образуването на продукти на биосинтеза провеждано периодично, представлява процес, който винаги завършва след определено време, което е относително кратко.

През 1949 г. Моно модифицира процеса на периодично култивиране чрез непрекъснато въвеждане в добре развита култура на свежа хранителна среда при едновременно отделяне от системата на еквивалентно количество културална течност със съдържащите се в нея микробни клетки и продукти на биосинтеза.

Теорията за култивирането на микроорганизмите се е развивала изключително бавно в сравнение с теоретическите основи на физиката, химията или икономиката, всяка от които, благодарение на огромното число крупни изследователи още от 1900 г. прераства в самостоятелна област от знания.

Такова изоставане в развитието на теорията на култивирането се обяснява с факта, че реакцията на клетките на условията на средата (както мигновена, така и продължителна) не е представлявала интерес. Изучаването на откритите системи, сред които най-важна е хемостатната система, открива от 1950 год. нови хоризонти както за теоретическо развитие на тези въпроси, така и за експерименталната проверка на теорията.

52

В продължение на повече от половин век се е обсъждала възможността за продължаване живота на микробната популация с помощта на непрекъснато подаване на свежа хранителна среда и постоянното отнемане на образувания продукт. Предложени са два типа непрекъснати култури - култура с пълен проток и хемостат.

В идеалната култура с пълен проток не протича никакво разбъркване при движението на културата през тръба или канал. Хемостатната култура, напротив представлява суспензия от биомаса с непрекъснато разбъркване, в която с постоянна скорост се подава среда и със същата скорост се отнема култура, т.е. общият обем на културата остава постоянен.

Фигура 27. Схематично устройство на хемостат 1 dx ln2

µ= -----------.---------- = ------- x dt td 0,3010x

td= ------------- log a – log b Специфичната скорост на растеж µ зависи от S. Тази зависимост емпирично е

обяснена от Моно (1950) със следното уравнение: µmax. S

µ= -------------- Ks + S Ks – константа на насищане µ = 1/2 µ max

µmax . S

Dc = ------------------, Ks + S

където: Dc – критична скорост на разреждане

53

Контролът на процеса се осъществява с помощта на датчици и регулатори на рН

и температурата. Културалната течност се аерира при постоянна скорост на въздушния поток.

Обемът на средата се поддържа постоянен. Средата се съставя така, че с изключение на един компонент, останалите хранителни вещества да присъстват в излишък, в сравнение с количествата, необходими за синтез на клетки в необходимата концентрация. Оставащият в недостиг единствен компонент на средата контролира големината на клетъчната популация при установено състояние. Названието „хемостат" създава постоянство на химическите характеристики и установеното състояние на средата, в която се намират клетките. Като лимитиращо вещество може да се използува всеки един необходим за растежа компонент. Това позволява да се регулира физиологията на растящите клетки чрез промяна на средата за култивиране.

Хемостатът предлага възможности, които отсъстват при всяка затворена система. При batch процесите микроорганизмите непрекъснато променят своята външна среда. Микроорганизмите, поставени при непрекъснато променящи се външни условия се адаптират и дават бърз отговор на тези промени и следователно морфологичните и метаболитни свойства на клетките, култивирани в batch култури, са способни за промяна по време на периода на растеж. Това може да се намали чрез честа смяна на хранителната среда. Клетките, култивирани по такъв начин растат с максимална скорост. При хемостатните култури, клетките растат при субмаксимална скорост, така както те обикновено растат при естествени условия. Тези клетки могат да растат при steady state при цялата гама от скорости. Единствен фактор, определящ скоростта на растеж е концентрацията на лимитиращия субстрат.

Системата с пълен проток моделира периодичната култура и не дава никакви данни по отношение контрола на окръжаващата среда. Фундаменталното значение на хемостата става очевидно едва след създаването на основната теория за хемостата от Моно, Новик и Сцилард. Хемостатната култура открива нови хоризонти във физиологията на микроорганизмите, a историята показва колко е важно появяването на стройна теория, предшестваща експеримента. Методът е приложим към всички типове микроорганизми и клетки от различните растения и животни, които могат да растат в хомогенно разбъркана култура.

1. Теория на хемостата Хемостатът представлява сам по себе си култура, в която с постоянна скорост се

подава свежа среда, а обемът на културата се поддържа на постоянно ниво, чрез непрекъснато отнемане на част от културата. В хемостата разбъркването трябва да бъде пълно, т.е капките, постъпващи в съда със средата, трябва веднага хомогенно да се разпределят в цялата култура. На практика, това означава, че времето, необходимо за разбъркване на неголям обем среда в културата, трябва да бъде значително по–малко от времето за замяна.

Да разгледаме една култура, в която растежът на биомасата е лимитиран по количеството на един от субстратите, а всички останали компоненти на средата се намират в излишък. Да предположим, че в началото няма добавяне на среда и растежът на биомасата протича, както при периодична култура. След като започне подаването на среда, растежът на културата ще протече в съответствие с една от трите възможности, изобразени на фиг. 28.

54

Фигура 28. Три възможни резултата при хемостатна култура

Първата възможност се състои в следното: Скоростта на измиване на биомасата се оказва по–голяма от скоростта на растеж

и концентрацията на биомасата в резултат, на което ще намалява, а концентрацията на лимитиращия субстрат ще се увеличава до стойност 3.

Втора възможност: Началната скорост на измиване е точно равна на скоростта на растеж. В този

случай ще се установи стационарно състояние, при което концентрацията на биомасата и на лимитиращия субстрат ще остават постоянни. Това не може да бъде устойчиво стационарно състояние, дотолкова, доколкото всяко временно изменение на условията ще влияе на концентрацията на биомасата и субстрата и ще води до непрекъснато изменение на тези концентрации.

Третата възможност се осъществява, ако скоростта на измиване на биомасата от самото начало е по-малка от максималната скорост на растеж. Тогава концентрацията на биомасата непрекъснато ще се увеличава. Само че, съответстващото намаляване на концентрацията на лимитиращия растежа субстрат ще доведе до това, че специфичната скорост на растеж на биомасата непрекъснато ще намалява до момента, докато скоростта на растеж на биомасата не стане равна на скоростта на измиване. По-нататъшни изменения в концентрацията на биомасата и лимитиращия субстрат не може да има. В този случай специфичната скорост на растеж на биомасата ще бъде по-ниска и ще се определя от скоростта на потока на средата. Такова стационарно състояние е саморегулиращо се.

1.1. Изменения в стационарното състояние във времето. Намаляването концентрацията на биомасата ще доведе до увеличение

концентрацията на остатъчния субстрат, това от своя страна ще предизвика повишаване на скоростта на растеж и ще възстанови условията за стационарно състояние. Увеличаването на концентрацията на биомасата ще доведе до противоположен ефект (фиг. 29).

55

Фигура 29. Временни изменения в стационарното състояние на хемостата 2. Отклонения от теорията на хемостата Отклонения от елементарната теория се наблюдават в много системи и

изучаването на тези отклонения представлява само по себе си основен метод за определяне реакцията на биомасата на окръжаващата я среда.

В някои случаи отклоненията могат да бъдат предизвикани от присъствие на инхибитори или стимулатори на растежа. Често наблюдавано отклонение е, че икономическият коефициент представлява сам по себе си непостоянна величина и зависи от скоростта на растеж. Някои от отклоненията от подобен род се обуславят от енергетическите загуби за поддържане на жизнеспособността, a други отклонения отразяват ролята на различните източници на хранене.

2.1. Влияние на недостатъчното разбъркване Доброто разбъркване в хемостата означава, че при добавянето на малък обем

материал времето, необходимо за хомогенното му разпределение в цялата култура, трябва да е минимално. В лабораторни условия със съдове за култивиране в неголеми обеми действително може да се получи пълно смесване при нормално разбъркване. Това може да се осъществи при условие, че съдът няма джобове, затрудняващи разбъркването, водещо до прилепване на биомаса към стените на съда и когато културата не е с повишен вискозитет.

2.2. Пристенен растеж Много микроорганизми имат способността да прилепват към повърхността на

стъклото и метала. В непрекъсната култура при продължително култивиране може да се наблюдава така наречения пристенен растеж, който може да бъде от тънък филм биомаса до масивно обрастване на повърхността на съда.

За да се поддържат в хемостата действително хомогенни условия, пристенният растеж трябва да се сведе до минимум. Енергичното разбъркване често предотвратява пристенния растеж, но протичащото при това разбъркване разпръскване на културалната течност може да доведе до изкуствено повдигане нивото на биомасата. Прилепването на биомасата към стената може временно да се предотврати чрез силикониране повърхността на съда. Биомасата не прилепва и на тефлон, но ползването на съдове от тефлон или такива обвивки засега е ограничено.

56

3. Разработка на хемостата Развитието на хемостатния метод увеличи възможностите за управление на

културата, особено при екстремални условия, в частност при скорости на растеж близки до максималната или при силно разредени субстрати.

Брайсън изобретява турбидостата – система, подобна на хемостат, снабдена с фотоелектричен елемент, чувствителен на мътността на културата. Измерването на мътността по метода на турбидостата има ограничена област на приложение, т.е. само за култури от едноклетъчни микроорганизми.

3.1. Средства за контрол Турбидостатният контрол може да бъде осъществен по няколко начина:

чувствителност към продукта, образуващ се в процеса на растеж на микроорганизмите, например - СО2 или киселина или към потребление на субстрата, използван за растеж (фиг. 30).

Фигура 30. Турбидостат (схема) Турбидостатът се използва като средство за поддържане на културата в течение

на много генерации при излишък на субстрат и постоянни условия на средата. Системата селекционира по-бързо растящите организми, тъй като скоростта на растеж в системата не е фиксирана. Брейсън пръв използва този метод за автоматична селекция на микроорганизми. Турбидостатният контрол може също да се използва при стабилизиране на хемостатната култура по отношение на инхибиращи субстрати.

4 .Модификация на основния тип хемостат 4.1. Хемостат с рециркулация на биомасата Това е хемостат, снабден със специално устройство за увеличаване

концентрацията на биомасата. Концентрирането на биомасата се постига по различни начини (Фиг. 31).

57

Фигура 31. Различни системи за рециркулация на биомасата в хемостата А: потокът от културална течност или разредена биомаса се отделя през филтьр, а за концентрираната биомаса има съответен изход; Б: културата се разделя на две зони: първа зова е с хомогенно разбъркване долу, където протича растежа и втора зона, отделена от първата с преграда, наречена седиментационна зона (rope). B тази зона фактически растеж няма, биомасата се седиментира и връща в зоната на разбъркване. В: биомасата се концентрира с помощта на филтрация или седиментация на изхода на потока, при което за концентрираната биомаса остава в съда. Г: биомасата се концентрира извън ферментора.

4.1.1. Преимущества на системата с рециркулация на биомасата. Използването на тази система дава възможност да се повиши

производителността на биомасата и продуктите в хемостата с дадена среда. Това е полезно, когато се използва разреден лимитиращ субстрат, както например при пивопроизводството или при очистката на отпадни води. Системата с рециркулация на биомасата има преимущества също и в тези случаи, когато трябва да се ограничи концентрацията на лимитиращия растежа субстрат, поради образуването на инхибиращи продукти.

4.2. Батерия от хемостати Това е съединяване на два или повече хемостата в една поредица. Тя дава

възможност да се създадат многостадийни процеси, като на всеки стадий могат да се създадат различни условия (фиг. 32)

Фигура 32. Батерия от хемостати

58

5. Основни предназначения на хемостатната култура 1. Хемостатът дава възможност да се изменя скоростта на растеж на биомасата,

без да се правят някакви изменения в окръжаващата среда, освен изменение концентрацията на лимитиращия фактор (субстрат). В простата периодична култура изменението на скоростта на растеж може да бъде предизвикано само от качествени изменения в състава на хранителната среда или количествени изменения на физико-химичните условия като рН или температура. Тези методи за изменение на скоростта на растеж внасят допълнителни ефекти и маскират действителната скорост на растежа. Така например, изменението на температурата действува независимо и на скоростта на растеж и на съдържанието на РНК при бактериите.

2. Хемостатьт може да се използва и с противоположна цел, а именно да се фиксира скоростта на растеж с изменение на окръжаващите условия. Това е много важно в случаите, когато е необходимо да се отдиференцират влиянието на изменението на окръжаващата среда и влиянието на скоростта на растеж.

3. Хемостатът освен това може да се използва за поддържане на постоянна скорост на растеж при лимитираща концентрация на субстрата. В периодичната култура растеж, лимитиран no субстрат може да се получи кратковременно, при което това се съпровожда с изменение на скоростта на растеж. Тази особеност на хемостата разширява възможностите за изучаване на окръжаващите условия и позволява изследвания не само при излишък или изтощение на културата по отношение на лимитиращия растежа субстрат, но и всички междинни състояния.

6. Преимущества на непрекъснатото култивиране 1. Постоянен режим, изключващ влиянието на времето. Културата може

продължително да се намира в определена фаза на растеж, а следователно в съответното физиологическо състояние, необходимо за синтезата на определения продукт. Това позволява да се определи влиянието на хранителните вещества, температурата, рН, скоростта на разбъркване, аерацията и другите условия на култивиране много по-детайлно, отколкото в обикновената статична култура, където условията постоянно се изменят.

2. Относителната еднородност на културата, т.е. на микробната популация и нейните продукти.

3. Математическото описание на кинетиката на отделните реакции, а от там и на целия процес е значително по-просто.

4. Възможна е ефективна и насочена регулация чрез използването на съответната апаратура за култивиране и прилагането на физични и физикохимични и други средства.

5. Възможностите за автоматизация на процеса са много по-големи от тези на периодичното култивиране.

6. Методът е икономичен и като правило ефективен, тъй като размерите на апаратурата могат да бъдат намалени при същите мощности; изключва се загубата на време между отделните цикли, което е неизбежно при периодичното култивиране; културата се развива в най-ефективното си физиологично състояние.

7. Стойността на оборудването е няколко пъти по-висока, отколкото при периодичния процес, но тава се компенсира с непрекъснатата работа на системата.

8. Приготвянето на средите и процеса на отделяне на продукта са ефективни и икономични благодарение на непрекъснатостта.

7. Приложение на непрекъснатото култивиране в производството.

59

Непрекъснатото култивиране на микроорганимите се използва при

винопроизводството, спиртната и ацетон-бутиловата промишлености, при производството на хранителни дрожди и оцетна киселина. Разработен и усвоен е процесът на непрекъснато култивиране в пивоварната промишленост. Изследват се възможностите за приложението на този метод при производството на хлебопекарски дрожди, лимонена киселина и млечна киселина. Производството на антибиотици с метода на непрекъснатото култивиране още не е осъществено. Изследванията в това направление не излизат от рамките на крупномащабните лабораторни експерименти. Най-подробно е изучено непрекъснатото култивиране на P. chrysogenum с цел получаване на пеницилин. Изследват се възможностите за получаване на редица ензими: протеази и глюкоамилази, пектолитични ензими и др.

7. Едностъпален хемостат Едностъпалният хемостат е основа при разглеждането на по-сложни системи за

непрекъснато култивиране. 8. Материален баланс по отношение на клетките За охарактеризиране на установеното състояние при хемостата е необходимо да

се изведе уравнение, свързващо концентрацията на клетките и лимитиращите хранителни вещества с най-важния независим променлив фактор - скоростта на поток на средата F. Това ще бъде направено, изхождайки от уравнението на материалния баланс. To ce изразява с У-ние 1:

dx/dt = (F/V) xo - (F/V) x + µx = αx, (1)

натрупване клетки в клетки, излизащи растеж гибел на на клетки системата от системата клетки

Където: х0 и х ca масата на клетките, които влизат в системата с хранителните вещества и

във ферментора, съответно; F - скорост на поток на средата (л/ч) V - обем на ферментора (л) µ и α –специфична скорост на растеж и гибел (ч-1) При едностъпален хемостат влизащият в системата приток на хранителни

вещества е стерилен, затова х0 = 0. Освен това, за болшинството непрекъснати култури, специфичната скорост на растеж много превишава скоростта на отмиране (µ >> α) и затова горното уравнение може да бъде опростено:

(-F/V) х + µ х = dx/dt (2) В следствие на това, при установеното състояние, т.е. при dx/dt = 0 следва, че: µ = F/V (3)

60

По такъв начин специфичният растеж се характеризира със скоростта на поток на средата, разделена на обема на културата. Това съотношение се определя като скорост на разреждане D (ч-1).

D = F/V (4) При равновесно състояние специфичната скорост на растеж е равна на скоростта

на разреждане. 9. Материален баланс по лимитиращия субстрат

Материалният баланс може да се запише и по лимитиращия растежа субстрат (У-ние 5)

(F/V) So - (F/V) S - µ x / Y - m x - qp x / Yp/s = - ds/dt (5) хр. в-ва хр. в-ва извън хр. в-ва хр. в-ва за хр.в-ва за в с-мата с-мата за растеж поддържане продукт

Където: Y - добивен коефициент клетки по лимитиращо хр. в-во (г кл/г субстрат) S0 и S - концентрация на хр. в-во на вход и изход (г) m - използване на хр. в-во за поддържане на биомаса qp - специфична скорост на образуване на продукт (г продукт/г кл. за час) Yp/s - коефициент на превръщане на субстрата в целеви продукт (добив) Често използването на хранителните вещества за поддържане на биомасата се

оказва значително по-ниско от растежа (mх << µх), a образуването на целеви продукт може да се пренебрегне, тъй като загубите на субстрат за синтез на продукт са много малки. Тогава при равновесното състояние на културата ds/dt = 0 и горното уравнение придобива вида:

D (So - S ) = µx / Y (6) Като се има предвид, че µ = D, то х = Y (S0 - S) (У-ние 7) и Y = х / (S0 - S). При

използването на това уравнение са направени няколко допускания: 1. Добивът на клетки не зависи от растежа или скоростта на разреждане. В

същото време, когато при много работни условия такова допускане е напълно възможно, толкова по-малко е необходимо да се съблюдава известно внимание, тъй като добивът при широко вариране на скоростта на разреждане може да се изменя.

2. Второто допускане се състои в това, че абсолютно значение на концентрацията на клетките Х не зависи от всички намиращи се в средата хранителни вещества с изключение на едно, лимитиращо растежа.

3. Трето допускане е свързано с предположението за това, че добивът от клетки спрямо лимитиращото хранително вещество при разглежданите условия, зависи само от това хранително вещество.

Двете последни допускания се оказват валидни в случаите, когато хемостатът функционира в излишък на всички хранителни вещества с изключение на едно лимитиращо растежа и при постоянство на другите фактори на окръжаващата среда (рН, Т°, разтворен кислород).

61

10. Модел на растежа Уравнения 4 и 7 определят равновесното състояние на непрекъсната култура. За

да се свърже х със скоростта на разреждане е необходим модел, изразяващ скоростта на растеж като функция на лимитиращия субстрат. Най – често се използва моделът, предложен от Моно.

S µ = µmax ------------ (8) Ks + S Ks - константа на насищане, равна на онази концентрация на субстрата, при

която µ = l/2 µ мах. Този модел описва скоростта на растеж като функция само на концентрацията на

лимитиращия фактор и не допуска зависимост на растежа от концентрацията на други вещества или други фактори на средата. Ако уравнение 8 се приложи за непрекъснати култури, то приема вида:

S D = Dc -------------- (9) Ks + S Където: Dc - критична скорост на разреждане, представляваща максималната скорост на

разреждане, при която хемостатът може да функционира. С малки изключения Dc обичайно съответства на µ мах при периодична култура. Решаването на уравнение 9 по отношение на S като функция на D води до уравнението за концентрацията на лимитиращото хранително вещество при равновесното състояние.

S = D Кs / (Dc - D) (10) Като се постави У-ние 10 в У-ние 7 се получава израз, свързващ концентрацията

на клетките със скоростта на разреждане:

x = Y [S0 - D Кs / (Dc - D)] (11) При използване на У-ния 10 и 11 може теоретически да се опише характера на

работата при хемостата.

62

D

Фигура 33. Зависимост между X, S, Р и D.

Моделът на Моно е резултат от емпирично наблюдение на това, че зависимостта

на скоростта на растеж от концентрацията на субстрата е подобна на зависимостта, отбелязана при наситена мономолекулярна адсорбция, описана от изотермата на Лангмюир. Доколкото този модел теоритично не е строг, са се появили и много други модели, описващи растежа.

Реалното поведение на хемостата не винаги е идеално. Ето защо е необходимо да се съблюдава известна осторожност при прилагането на различни модели.

11. Продуктивност при непрекъснатите система Процесът на ферментация се оценява по коефициента на превръщане или

общата продуктивност. В непрекъснатата култура продуктивността Р (г/л/ч) се определя от израза:

Р = D x (г/л/ч) Това уравнение позволява графически да се изобрази продуктивността при

непрекъснати системи като функция от скоростта на разреждане (фиг. 34).

63

Фигура 34. Зависимост между продуктивността (Р) и скоростта на рареждане (D)

при непрекъснато култивиране. 12. Образуване на микробни продукти Аналогичен подход може да се приложи и за сравнение на продуктивността при

получаване на микробни продукти (антибиотици, органични киселини) по периодичен и непрекъснат начин. Обаче, когато тези промени се сравняват не от позиция на култивирането, а от позиция на образуването на съответни продукти, важно е да се разгледа не само продуктивността, но и крайната концентрация на образуваните продукти в културалната течност, излизаща от системата и постъпваща в устройствата за отделяне на продуктите. Стойността на процеса на отделяне на продукта от културалната течност е пропорционална на количеството, подлежаща на обработване течност и обратно пропорционална на концентрацията на продукта.

Ето защо даже ако продуктивността на непрекъснатия процес е по-висока от тази на периодичния, да се отдава предпочитание на първия от тях от икономична гледна точка ще бъде неоправдано дотогава, докато концентрацията на продукта е съизмерима.

Важно е да се отбележи, че в болшинството случаи стадият на промишлено отделяне и очистка на продуктите се отличава с висока стойност. Именно загубите при тези стадии, а не стойността на самата ферментация диктува икономическата политика на фирмите.

Ако образуването на продукт е асоциирано с растежа на продуцента, то в сила е зависимостта, описана в предходната таблица. Ако образуването на продукт не съвпада по време с растежа, сравнението на продуктивността при периодичен и непрекъснат начин се усложнява и е добре да се анализира във всеки конкретен случай.

13. Аномални състояния на хемостата До този момент бе разгледано идеалното поведение на хемостата. На практика

системите на непрекъснато култивиране не винаги работят идеално. “Аномалното” в сравнение с теоретичното или прогнозирано поведение на непрекъснатите култури е показано по-долу (Фиг. 35, 36, 37).

13.1. Хемостати, ограничени от въглероден източник Най-характерната аномалия на непрекъснатата култура в условия на

ограничаване на процеса от въглеродния източник е показана на Фиг. 35.

P

D (h-1)

64

Фигура 35. Изменение на добивния коефициент (Y) и биомасата (Х) спрямо

скоростта на разреждане (D) При ниски (по-малко от 25% от критичната) скорости на разреждане,

концентрацията на клетките с намаляване на скоростта на разреждане се понижава. Добивният коефициент Y също се понижава. Такова отклонение от теорията се получава вследствие на това, че част от хранителните вещества се изразходват за поддържане. Необходимостта от поддържане на жизнената дейност на клетките се обуславя от необходимостта за осъществяване на активен транспорт на хранителните вещества, поддържане структурата на всички клетъчни компоненти и клетъчни белтъци и удовлетворяване нуждите от движение.

Количеството на въглерода и енергията, необходими за поддържане на клетките е постоянно и не зависи от скоростта на растеж. То може да представлява само 5-10% от общата потребност от енергия, ако клетките се култивират с максимална скорост. Обаче, поради общото понижение на скоростта на растеж, частта на общото количество въглерод и енергия за поддържане на биомасата се увеличава и става преобладаваща в общите загуби. В резултат на синтеза на нова клетъчна маса се изразходва по-малка част от източника на въглерод и енергия и добивът на клетки се намалява.

При високи скорости на растеж обичайно също се наблюдава понижаване на клетъчния добив. Това явление се съпровожда с продуциране и натрупване в културалната течност на различни междинни продукти на метаболизма като ацетат, пируват, етанол. Причините за подобно изчерпване на източника на въглерод и енергия в болшинството случаи остават неясни. Обаче общата характеристика на явлението и по-точно понижаването на клетъчния добив е на лице.

13.2. Хемостати, ограничени от източника на азот и сяра Вторият тип аномално поведение на хемостата често се наблюдава при растеж,

лимитиран от азот и сяра.

65

Фигура 36. Изменение на добивния коефициент (Y) и биомасата (Х) спрямо

скоростта на разреждане (D)

Когато скоростта на разреждане намалява, концентрацията на клетките (г/л) се увеличава и клетките започват да натрупват въглеродни съединения, които съхраняват енергия. Към тях могат да се отнесат полизахариди, липиди или полихидрокси маслена киселина. Натрупването на подобни вещества води до увеличаване размера на клетките. При съответните измервания станалото явление се разглежда като увеличение на добива клетки. При изразяване концентрацията на клетките в грамове клетки/белтък или кл. азот/л, експерименталните данни корелират с теоритично построените криви.

13.3. Хемостати, ограничени от калий, магнезий, фосфати При ограничаване на растежа от K, Mg или РО4 се наблюдава трети тип

аномално поведение на хемостата (Фиг. 37.)

Фигура 37. Изменение на добивният коефициент (Y) и биомасата (Х) спрямо скоростта на разреждане (D)

При лимитиране на растежа от К, Mg или PO4 се наблюдава на пръв поглед

явление, идентично с наблюдаваното в предходния случай. И тук концентрацията на клетките се увеличава при намаляване скоростта на разреждане. Обаче причината за това е друга. Клетките, култивирани при условия на специфично ограничаване от хранителни вещества, съдържат минимално количество отделни вещества, необходими за растежа на клетките. Тази връзка се изразява строго стехиометрично. Клетките, растящи бавно изискват по-малко РНК, отколкото бързо растящите и при понижаване на скоростта на разреждане постоянното количество на K, Mg и РО4 ще бъде достатъчно за поддържане растежа на клетките. Ако концентрацията на клетките се

66

изрази графично в зависимост от съдържанието на РНК или всички нуклеинови киселини, се получава тази крива, която се очаква (пунктир).

14. Непрекъснати култури от нехемостатен тип Аномалният ход на това култивиране е показан на следваща графика (фиг. 38).

Фигура 38. Изменение на биомасата (Х) спрямо скоростта на разреждане (D) при

непрекъснати култури от нехемостатен тип. Тя показва как изменението на клетъчния състав се отразява на потребностите

на културата по отношение на всяко едно от незаменимите хранителни вещества. От тук възниква необходимостта за обсъждане на четвърти тип аномално

поведение, което се наблюдава в култури, култивирани на комплексни и често неопределени по състав хранителни среди. В такива случаи е трудно, ако не и невъзможно точно да се определи природата на лимитиращия фактор от хранителната среда. Освен това, в следствие на изменение на потребностите на клетките от хранителни вещества съобразно изменението на скоростта на растежа им, фактически лимитиращите растежа хранителни вещества вероятно също се изменят.

В резултат на увеличаване на скоростта на разреждане концентрацията на клетките непрекъснато се изменя. Подобен тип култура носи названието нехемостатна непрекъсната култура.

Интерпретацията на поведението на такава култура е трудно, доколкото лимитиращият компонент е неизвестен. В същото време е добре известно, че клетките се държат различно, ако техния растеж се ограничава от различни хранителни вещества.

Независимо от това, че теорията на непрекъснатите култури не позволява точно да се предскаже поведението на много системи, самият метод на непрекъснатото култивиране не става по-малко пригоден като средство за изследване. Важно е това, че изследователите могат чрез него да се ориентират във възможното аномално поведение на непрекъснатата култура и са длъжни внимателно да оценяват наблюдаваното явление.

В бъдеще, за задълбочено разбиране на процесите на култивиране е важно да се знае не поведението на културата при едни или други условия, а това как избраните ограничения на хранителните вещества ще повлияят на състава на клетките. Такъв подход ще позволи също по-дълбоко да е изследвана реакцията на клетките на изменението на факторите на външната среда.

67

15. Селекция при непрекъснати култури Микроорганизмите са навсякъде. Сред множеството микробни видове се

намират микроорганизми хетеро- и автотрофи, мезофили и термофили, фотосинтезиращи и азотфиксиращи облигатни аероби и анаероби, а също и микроорганизми, способни да метаболизират почти всички класове органични съединения.

Непрекъснатата култура позволява във висша степен да се получат селективни условия в културалната течност за отбор на различни типове микроорганизми и обогатяване с тях. Така, ако е необходимо да се отделят микроорганизми, способни да утилизират метанол като специфичен източник на С и енергия, трябва да се използва нестерилна непрекъсната култура с внасяне на хранителна среда, съдържаща метанол. Скоростта на разреждане D се избира така, че да обезпечи непрекъснатото обогатяване на културата с нужните микроорганизми, а така също и за упражняване на селективно въздействие. Тези ограничения трябва да позволят да се селекционират само организми, способни да растат със скорост, превишаваща установената скорост на разреждане. Ако е желателно от широката гама микроорганизми да се отберат дрожди, следва рН на културата да се поддържа на ниво 3-4 или да се добавят антибиотици. Ако е необходимо да се отделят термофилите от мезофилите, температурата на култивиране трябва да бъде 55 - 60оС.

От тези примери става ясно, че при непрекъснато култивиране могат да се налагат едновременно множество направляващи ограничения и следователно да се прави селекция във висша степен.

16. Проблеми свързани с непрекъснатото култивиране 1) Контаминация и генетична нестабилност. Контаминацията и генетичната

нестабилност (последното е резултат от спонтанни мутации) в културата могат да бъдат сериозен проблем, особено при тези култури, при които се цели по-дълготрайно култивиране. Като аргументи контаминацията и мутантите трябва да се третират еднакво, защото имат същата скорост на растеж като и оригиналния организъм.

Има три възможни изхода, в съответствие с връзката между скоростта на растеж между оригиналният “естествен” организъм и мутанта/контаминиращия организъм (те са обобщени в Таблица 10).

Таблица 10. Резултати от връзката между скоростите на растеж на популациите от

контаминант/мутант (µc) и естествената популация (µn) в непрекъсната култура

Връзка между скоростите на растеж

Резултати

µс.> µп Популацията от мутанти расте с

експоненциална скорост и евентуално измества естествената популация

µс = µп Популацията от мутанти расте с

постоянна скорост µс < µп Популацията от мутанти представлява

постоянна величина В първия пример, специфичната скорост на растеж на контаминиращия/мутиралия

организъм е по висока от тази на ‘естественият’ организъм и тогава

68

контаминанта/мутанта ще надделява в експоненциален порядък. Това е проблем особено при ниски скорости на разреждане. Във втория пример, ако специфичната скорост на растеж на контаминанта/мутанта е равна на тази на ‘естествения’ организъм, тогава новата популация ще расте с постоянна скорост равна на скоростта на нейното внасяне. Контаминацията с такъв организъм може да не е сериозна ако скоростта на внасяне на контаминанта или скоростта на мутиране могат да се поддържат пренебрежимо ниски. В третия случай, ако скоростта на растеж на контаминанта/мутанта е по-ниска отколкото на ‘естествения’ организъм, тогава тя се приема за констатнта и представлява сериозен проблем, само ако стойността й е висока. Понякога средите могат да се създадат така, че да намалят скоростта на растеж на потенциални контаминанти (напр. ниско рН); но все пак е трудно да се регулира появата на спонтанни мутанти.

2) Плазмидна нестабилност. Плазмидът е самореплициращ се генетичен елемент,

придаващ отличителни черти, несъществени за растежа на микроорганизмите. Плазмидите могат изкуствено да бъдат конструирани за експресия на чужди протеини в чуждата клетка гостоприемник (напр. бактерии като Escherichia coli може да се трансформира така, че да произвежда инсулин). Съхраняването на плазмида в популацията зависи от способността му да се реплицира в клетката гостоприемник и съответно да се предава на дъщерните клетки. Ако този процес не се осъществява, тогава броят на клетките без плазмид бързо ще нахвърли броя на плазмидосъдържащите клетки.

Плазмидната нестабилност може да се контролира чрез осигуряване на клетката гостоприемник на селективно предимство. Това може да се направи например, чрез внасяне на ген за устойчивост към антибиотик в плазмида, така че само клетки съдържащи плазмид ще оцелеят в култура, съдържаща антибиотик. Вторият метод е да се премахне ген от клетката гостоприемник, който определя експресията на съществен клетъчен компонент. Този ген след това се внася в плазмида и съответно само клетки, носещи плазмид, оцеляват.

Чисти култури дрожди и стратегии за поддържане

По отношение на чистите култури дрожди, трябва да се знаят първоначалните стратегии, развити през миналия век от Emil Christian Hansen. Той разработва методи за изолиране на единични клетки от пивни дрожди и за изследване на ферментацията на селектирани стартерни култури при по-голям мащаб. Стриктните микробиологични процедури, развити от лабораторията до индустриалния завод, осигуряват постоянно качество на продукта. Техниките на Hansеn позволяват селекцията на подходящи клонове дрожди и тяхното поддържане без контаминиращи микроорганизми. Разбира се, правилата постулирани от Hansen за работа, съхранение и размножаване на култури дрожди, все още са актуални за съвременните учени и технолози.

Успешното поддържане на чисти култури от дрожди изисква клетките да са в състояние на висока жизненост и без риск от вредни генетични промени. Таблица 11 обобщава някои от общите стратегии за съхранение и поддържане на култури дрожди.

69

Таблица 11. Методи за съхранение и поддържане на дрождеви култури

Метод Описание Коментар

Серийно препосяване

Препосяване върху хранителна среда с полегат агар и съхранение при 0-40С. Заливане с минерално масло, което създава анаеробност за поддържане на по-ниски скорости на растеж.

Често прилаган метод за поддържане на растящи култури, но е неподходящ за някои видове (Brettanomyces). Могат да се селекционират мутанти и нарастват шансовете за клетъчна спорулация.

Сушене Изсушаване на културите върху филтърна хартия, силикагел и др.

Прост метод при който се поддържа генетичната стабилност

L - сушене При вакуум директно се премахва водата от течната фаза на клетъчната суспензия.

Повечето дрожди могат успешно да се запазят чрез този метод, освен филаментозните, нетолерантните към различни фактори на средата или психрофилните, които са много чувствителни

Лиофилизация Изсушаване под вакуум на замразени клетки. Необходим е подходящ криопротектор.

Често се използва за продължително съхранение. Някои дрожди показват висока смъртност и процента преживяемост е нисък. Възможни са генетични увреждания с мутации, вероятно индуцирани от процеса на изсушаване

Криоконсервация Дълбоко замразени клетки при –20 -800С

Ултразамразени клетки в течен азот, при –1960С. Криопротектор (напр. 5-20%) глицерол е необходим за минимизиране на уврежданията причинени от ледените кристали

Метаболитната активност е намалена, но съществува жизнеспособност. Процесите на замразяване-размразяване могат да причинят генетични увреждания. съществува риск от механично нараняване

Висока преживяемост на поддържаните култури и минимален риск от генетични повреди. Първоначално вложените капитали са високи и изпаряването на течния азот изисква редовна подмяна

Оценка на жизнеността и жизнеспособността при дрожди

В биотехнологията на дрожди, физиологичната и генетична стабилност на сток културите от посетите дрожди, е от съществено значение за успеха на последващите

70

ферментации. Физиологичната стабилност е свързана с поддържането на клетъчната жизнеспособност и жизненост при дълго съхранение и тези параметри могат да се оценяват с голям набор от методи. Такива оценки на физиологичното състояние на дрождевите клетки не са просто подходящи за протокола на съхранение, но са също полезни за предсказване и контролиране на активността на дрождите по време на индустриалния процес. Таблица 12 и 13 обобщават някои от методите използвани за количествено установяване на жизнеспособността и жизнеността на дрождите.

Таблица 12. Методи за оценка на клетъчната жизнеспособност

Метод Описание/коментар

Броене на петрита Броене на колонии на твърда хранителна среда в петрита. Неточности възникват поради флокуацията/адхезията на дрождите

Броене под микроскоп

Преброяване на микроколонии след 18 часа върху филм или хранителен агар на микроскопско стъкло. По-надежден от оцветяване при ниска клетъчна жизненост

Витално оцветяване Основава се на мембранната пропуслкивост и вътреклетъчна модификация на два типа оцветяване:

• Оцветяване в светло поле като Метиленово синьо или Кристал виолет

• Флуорохромно оцветяване като Примулин жълто, Родамин 123, Карбокси флуорисцин Mg ANS (1-анилино-8-нафтален сулфонова киселина), Тетразолиум багрила (MTT, XTT)

Клетъчни компоненти

Гликоген, трахелоза

Вътреклетъчно рН Спектрофлуориметрия

Диелектрична пропускливост

Измерване на капацитета

Жизнеспособността се отнася към измерване на живите клетки дрожди, докато жизнеността се измерва чрез дрождевата метаболитна активност. Общо схващане е, че дрождевите клетки се смятат за мъртви, когато са загубили необратимо способността си да се размножават. Обаче, клетки неспособни на делене може би все още са способни на активен метаболизъм, така че трябва напълно да се преразгледат възгледите за клетъчна смърт при дрожди и тяхната метаболитна активност. Възникват неминуеми несъответствия за оценка на жизнеспособността, когато се извършва чрез броене на петрита и оцветяване за жизненост, тъй като критериите за смъртта са различни за всеки метод. Тъй като няма абсолютен метод за измерване на клетъчната жизнеспособност на популация дрожди, при оценяването трябва винаги да се прави справка за конкретния използван метод. Дрождевата жизнеспособност може да се определи директно чрез определяне на загубата на клетъчна репродукция (напр. чрез броене на петрита) и индиректно чрез оценяване на клетъчните повреди (чрез витално оцветяване) или загуба на метаболитна активност (АТФ, НАДН). По-точни измервания на дрождевата жизнеспособност осигуряват методите на изтощаващата култура и щриховия посев. Оцветяващите процедури са по-точни, но обикновено не са прецизни, с изключение на използването на определени флуориметри. Електросензорите намират все по-широко приложение особено поради факта, че могат да бъдат внедрени в индустриални заводи (като пивоварни) за автоматично своевременно отчитане на

71

клетъчната жизнеспособност на дрожди. Други съвременни разработки включват непрекъснато измерване на флуоресценция чрез проточна цитометрия, с което може лесно да се анализира клетъчната жизнеспособност, както и други аспекти на физиологията на дрождите, включително и отговора на стрес.

Таблица 13. Методи за оценка на жизнеността на дрожди

Метод Описание

Метаболитна активност Чрез биолуминисценция определяне на АТФ съдържанието и коефициента на аденозиновите нуклеотиди (аденилат енергиен заряд)

Редокс индикатор (колориметрия)

Редокс индикатор (хемолуминисценция)

НАДН концентрация чрез флуориметрия

Клетъчни компоненти Съдържание на гликоген и стерол

Разпределение на протеините чрез FITC и цитометрия на потока

Освобождаване на Mg йони Освобождаване на Mg (определя се колориметрично) и може да предскаже ферментативната способност

Капацитет за ферментация Отделяне на СО2, ферментации в ограничен мащаб

Сила на подкисляване

(Мембранен потенциал)

Извънклетъчно рН

Вътреклетъчно рН

Усвояване на кислород Респираторен коефициент

Скорост на усвояване на кислород

Големина на клетките Клетъчната морфология (чрез анализ на образа) корелира със силата на подкисляване

Жизнеността на дрождите се определя по-трудно, но обикновено се свързва с тургура на културата. Може индиректно да се оцени, чрез измерване на метаболитната/ферментативна активност, клетъчните молекули за съхранение, вътреклетъчно/извънклетъчно рН и коефициента на газова обмяна като RQ (виж Таблица 13). Тези техники обикновено показват варираща степен на корелация с протичането на ферментацията, и не съществува универсална техника за предсказване на точността на физиологичната активност на дрождевата проба. В промишлеността при ферментации с дрожди, единственият истински индикатор за клетъчната жизненост вероятно се получава чрез отнемащата време операция на пилотния биореактор, който симулира условията на продукция в завода.

72

Изследване на метаболитната активност на хемостатни култури чрез ДНК-микрочип анализ

Съвременното бързо развитие на ДНК-микрочип технологията има силно

въздействие върху изследванията с дрождите S. cerevisiae – важен индустриален микроорганизъм и моделен еукариот. Чрез възможността за изучаване на транскриптомната експресия на целия геном чрез единичен микрочип, става възможно получаването на онлайн транскриптомна база данни от различни мутанти и при широк набор от условия на култивиране.

Транскриптомните профили съдържат богата информация, която може да се приложи по няколко начина за фундаментални и приложни изследвания. Когато съществува ясна корелация между условията на култивиране и транскрипционните суб-мрежи от гени, такава корелация може да се използва за провеждане на функционален анализ на гени, които имат неизвестна биологична функция. Освен това, може да се прилага корелация на данните от експеримента с последователността от позитивните регулаторни елементи, за да се разкрие вътрешната зависимост в мрежата на транскрипционната регулация.

В индустриалната биотехнология, едно от ключовите приложения на ДНК-микрочип техниката е диагностиката на ферментационните процеси. Ако транскрипционните отговори могат да се свържат директно с важни параметри като хранителния статус на индустриалните микроорганизми или със стресовите фактори, на които те са изложени при индустриалните процеси, транскрипционният анализ може да даде ценна информация за процесите на оптимизация. За такива диагностични цели е за предпочитане да се конструират малки, подходящи и ефективни по цена микрочипове, които съдържат ограничен брой от сигнални транскрипти. Такива значими транскрипти трябва да отговарят специфично на един химичен или физичен параметър, който е типичен (значим) за изучавания индустриален процес. Този подход е идентичен с приложението на малки диагностични чипове, използвани при клиничните изследвания за бърза диагностика на тумори.

Повечето транскриптомни изследвания със S. cerevisiae са направени с култури, получени при култивиране в колби. При такива култури не е възможно контролирането на голям брой важни условия за протичането на процеса на култивиране (разтворен кислород (в %), метаболитна концентрация, рН и др.). Следователно, периодичната култура в колби по дефиниция включва непрекъснато променяща се външна среда и интерпретирането на транскриптомните данни от този тип култивиране е усложнено поради разликите в специфичната скорост на растеж, С-катаболитна репресия, N-катаболитна репресия, натрупването на продукти, понижаването на рН и др.

Хемостатното култивиране предлага голям брой преимущества за изучаване с ДНК-микрочип техниката, поради факта, че позволява култивиране на микроорганизмите при строго дефинирани условия на външната среда. При хемостата, културалната течност (включително биомасата) непрекъснато се измества от свежа хранителна среда с определена скорост на разреждане (D, h-1). Когато скоростта на разреждане е по-ниска от максималната специфична скорост на растеж (µmax, h-1), се установява „steady state” състояние (µ = D). При такова „steady state” състояние на хемостатната култура, µ се контролира от (ниската) остатъчна концентрация на едно единствено растеж-лимитиращо вещество. Възможността за точен контрол и промяна на отделните химични и физични параметри (включително състава на средата, природата на растеж-лимитиращия субстрат, рН, Тº, µ) при „steady state” състояние прави хемостата отличен инструмент за изучаване на транскрипционната регулация на

73

генно ниво. Получените резултати от прилагането на микрочип техниката при хемостатни култури показа, че натрупаните база данни са с много по-висока възпроизводимост в сравнение с използването на периодични култури.

Експериментален дизайн и физиология на S. cerevisiae при аеробни и анаеробни

условия на хемостатна култура За да се изследва влиянието на кръстосаната транскрипционна регулация върху

определянето на „сигналните транскрипти” е приложен двумерен експериментален подход (Фиг. 39). Изследвани са четири режима на хранителна лимитация (C, N, S, P). Проведени са две серии от експерименти. В първата серия, четирите режима на хранителна лимитация са изучавани при аеробни хемостатни култури; при втората серия са изследвани същите режими, но при анаеробни условия. Получените данни от осемте режима на ферментация, всеки анализиран в 3 независими експеримента, позволяват идентифицирането на гените със специфичен транскрипционен отговор само към един параметър (индуциран при анаеробни условия, независимо от режима на хранителна лимитация). Освен това, идентифицирани са гени които отговарят транскрипционно за голям брой параметри (например такива, които се индуцират при анаеробни условия при въглеродна лимитация). За да се намали (избегне) експерименталния фон, съставът на хранителната среда е подбран така, че остатъчната концентрация на елементите, които не играят роля на лимитиращ фактор да бъде еднакъв за всички хемостатни култури (Таблица 14а). Възможността за контролиране на steady state концентрациите на лимитиращите вещества и тези в излишък е уникална характеристика на хемостатната култура, приложена при този двудименсионален ДНК-микрочип подход.

Фигура 39. Експериментален дизайн на двудименсиален транскриптомен анализ

74

Таблица 14а. Хемостатни култури – основни хранителни компоненти

Остатъчна концентрация Лимитация по Глюкоза (g/l) NH4

+ (mM) PO43- (mM SO4

2- (mM) въглерод ПРС1 58.2 +1.3 19.8 + 0.6 38.6 + 0.1 азот 16.7 + 1.0 ПРС 18.6 + 1.0 40.7 + 1.0 фосфор 18.1 + 1.0 54.3 + 0.0 ПРС 47.5 + 1.0

+ O2

сяра 17.4 + 0.6 53.7 + 2.4 18.4 + 0.2 ПРС въглерод ПРС 68.6 + 2.8 22.3 + 0.6 42.4 + 1.6 азот 16.2 + 0.6 ПРС 21.9 + 0.4 39.1 + 0.8 фосфор 19.1 + 2.2 60.2 + 2.6 ПРС 50.9 + 0.9

- O2

сяра 21.2 + 0.2 61.1 + 1.3 21.5 + 0.2 ПРС

1 – Под Разделителната Способност Таблица 14б. Хемостатни култури – основни физиологични параметри

Лимитация

по Yglu

1 qglu2 qeth

3 qO24 qCO2

5 RQ (qCO2/qO2)

въглерод 0.49 1.1 + 0.0 0.0 + 0.0 2.8 + 0.3 2.8 + 0.3 1.0 + 0.0 азот 0.09 5.8 + 0.1 8.0 + 0.1 2.7 + 0.1 12.1 + 0.2 4.5 + 0.2 фосфор 0.09 6.1 + 0.2 7.8 + 0.1 4.0 + 0.1 13.5 + 0.2 3.4 + 0.0

+ O2

сяра 0.14 3.8 + 0.1 4.4 + 0.1 3.0 + 0.0 8.0 + 0.8 2.7 + 0.2 въглерод 0.09+0.0 6.0 + 0.0 9.6 + 0.1 - 10.3+0.4 - азот 0.07+0.0 8.4 + 0.0 13.5+0.6 - 14.8+ 0.3 - фосфор 0.06+0.0 8.7 + 0.2 13.9+0.6 - 15.8+0.7 -

- O2

сяра 0.07+0.0 7.9 + 0.2 11.9+0.4 - 13.6+0.8 -

1 – (g/g); 2 – mmol консумирана глюкоза / g биомаса / час; 3 - mmol образуван етанол / g биомаса / час; 4 - mmol консумиран кислород / g биомаса / час; 5 - - mmol отделен СО2 / g биомаса / час.

Физиологичните параметри, характеризиращи осемте режима на изследване, са

описани в Таблица 14б. При аеробни условия само глюкозо-лимитираните култури показват напълно окислителен глюкозен метаболизъм, без продукция на етанол. Това води до респираторен коефициент (RQ) близък до единица. Обратно, аеробните култури, които не са лимитирани от глюкоза показват респираторно-ферментативен метаболизъм с едновременна биосинтеза на етанол и консумация на кислород (RQ > 1). При анаеробни хемостатни култури алкохолната ферментация е единственият начин на усвояване на глюкозата, тъй като кислород липсва. Добивът на АТФ е значително по-нисък, което се отразява в по-ниския добив на биомаса. Добивният коефициент по отношение на глюкоза при С-лимитация е по-висок, отколкото при други такива лимитации (Таблица 14а и б).

При аеробни условия, това може частично да се обясни чрез настъпването на алкохолна ферментация.

При анаеробни условия налице е също намаляване на YX/C при лимитация по N, P и S (Таблица 14а и б). Това вероятно е свързано с индукцията на енергетично-зависими транспортни системи по време на N-, P- и S-лимитиран растеж.

75

Възпроизводимост на микрочип резултатите. Глобален транскриптомен отговор и анализ на данните

За да се получат статистически верни и повторяеми транскриптомни бази данни,

са направени независими трикратни хемостатни опита и подготвени олигонуклеотидни ДНК-микрочипове за всяка една от сериите на осемте експеримента. Средният коефициент на вариране за трикратните транскриптомни анализа за всяко от осемте условия на култивиране e по-нисък от 0,21, освен за анаеробния глюкозо-лимитиран хемостат (cv = 0,27). Нивото на АСТ1 транскрипта, общовалиден стандарт за конвенционален Нодърн анализ, варира, но по-малко от 13% за един режим.

Осемте различни хемостатни режима по принцип разрешават 56 различни сравнения по двойки. В настоящото изследване анализите са ограничени до сравнение между условията за култивиране, които се различават само по един параметър на култивиране. Четири от тях са сравнения на аеробни и анаеробни култури, култивирани при едни и същи условия на хранителна лимитация (Фиг. 39, вертикалните стрелки). Следващите 24 сравнения по двойки включват всички възможни комбинации на четирите режима на лимитация по макроелементи при анаеробни и аеробни условия (Фиг. 39, хоризонталните стрелки).

Всяко сравнение по двойки дефинира набор от гени, които са значимо положително или негативно регулирани (грешка около 1%).

Сумарно: 3169 гена (52 %) от генома показват значително различаващо се транскрипционно ниво в поне 1 от 28-те сравнения по двойки. 2542 гена (42 %) от генома не показват значителни различия в транскрипционното ниво. 373 транскрипти (6 %) от генома остават с по-ниско ниво на детекция при всички 28 случая на изследване.

Транскриптите, показващи значителни различия при анаеробни и аеробни условия при всичките четири лимитации по макроелементи, са определени чрез комбиниране на четири свързани сравнения по двойки (Фиг. 39, вертикални стрелки). Тази поредица от гени, отговарящи на кислородните условия на живот, съдържа 155 гени (2,6 % от генома; Фиг. 40А). За да се изследва транскрипционния отговор при лимитация по макроелементи, първоначално са идентифицирани транскриптите, отговарящи на единичен лимитиращ фактор при аеробни или анаеробни условия (Фиг. 40В, набор І и V). Комбинация на мрежи I и V за всеки от четирите режима на лимитация по макроелементи дава мрежа от транскрипти, които предоставят състоятелен отговор на лимитацията по макроелементи, независимо от наличието на кислород (Фиг. 40В, набор III, 152 гена). Освен това, това сравнение дава две мрежи от гени, които само показват транскрипционен отговор за едно от четирите условия на хранителна лимитация при аеробни (Фиг. 40В, набор II, 333 гена) или анаеробни условия (Фиг. 40В, набор IV, 302 гена).

Анализът на данните описан по-горе позволява да се направи дисекция на генома на S. cerevisiae и генните клъстери, които или показват силен отговор по отношение на наличието на кислород или хранителната лимитация към макроелементите в хранителната среда, или алтернативно показват по-комплексна, двояка транскрипционна регулация.

76

Фигура. 40. Стратегия за обобщение и интерпретация на данните за

транскриптомен отговор в условия на хранителна лимитация и наличие на кислород. А: Диаграма на Вен на «сигналните» анаеробни гени. Червените и зелени цифри

съответстват на броя положително и негативно регулирани гени при анаеробни условия. Всеки един от четирите кръга съответства на клъстер от гени, които дават транскрипционен отговор на наличието на кислород в условия на хранителна лимитация по един от четирите изследвани варианта. Препокриващите се части на кръговете показват гените, които дават отговор на наличието на кислород, независимо от хранителната лимитация.

В: Диаграма на Вен на гените, които дават отговор при хранителна лимитация.

Показани са сравнения по двойки на траскриптомите при всеки тип лимитация както в аеробни (горната част), така и в анаеробни условия (долната част). Всеки кръг е клъстер от положително (в червено) и негативно( в зелено) регулирани гени при съответната

77

хранителна лимитация. Наборите от І до V представляват гените, които показват отговор на всеки един от хранителните режими в аеробни и анаеробни условия. Комбинацията от набор І и V дава три под-набора от гени, които отговарят на хранителна лимитация. Набор ІІІ показва «сигналните» гени за всеки един от режимите на лимитация, които дават отговор при аеробни и анаеробни условия. Набори ІІ и ІV представляват гените, чийто транскрипционен отговор на един лимитиращ фактор е специфичен за аеробни или анаеробни условия, съответно.

„Сигнални” гени със съответен транскрипционен отговор на аеробната среда

и хранителна лимитация по макроелементи Идентифицирани са десет генни клъстера, които показват специфичен и

значителен отговор на анаеробиозата, глюкозната, азотната, фосфорната и серната лимитация (Фиг. 41). В пет от тези клъстери транскрипционният отговор се дефинира като „up-regulated”, т.е. положителен отговор при посочените условия, а при другите пет клъстера, транскрипционният отговор се отчита като „негативно регулиран” (down regulated). Терминологията „положителна” и „негативна” регулация не показва конкретен механизъм на регулация. Например, негативната регулация при хранителна лимитация може механично да представлява положителна регулация при излишък от хранителни вещества. В този примерен казус „значимите отговори” се дискутират само по отношение на детайлния анализ на анаеробно-положително регулирани гени и някои специфични наблюдения върху гените, отговорни при хранителна лимитация с макроелементи от хранителната среда.

Анаеробно-положително регулирани гени Въз основа на статистически значим двумерен транскриптомен анализ на

глюкозо-лимитирана хемостатна култура на S. cerevisiae, са идентифицирани 877 транскрипти, които са диференциално експресирани при аеробни и анаеробни условия. Тези гени са разпределени в 133 анаеробно-положително регулирани и 744 анаеробно-отрицателно (негативно) регулирани гени. При двудименсиалния подход, транскрипционният отговор при наличие на кислород се определя от 722 гени (82 %), които зависят от вида на хранителната лимитация и само 155 показват съответен отговор на анаеробиозата при всички четири типа хранителна лимитация (65 положително- и 90 негативно–регулирани) (Фиг. 40А). От 65-те анаеробно-положително регулирани гени, 20 са слабо дефинирани и са с неясна биологична функция, а 45 гени с известна функция са разпределени във следните функционални категории, съгласно MIPS база данни (Фиг. 41):

- за метаболизъм и енергия – 21 гени, - транспортни – 4 гени, - клетъчна защита – 11 гени, - белтъчна биосинтеза – 3 гени, - организация на клетъчната стена – 6 гени.

78

Фигура 41. «Сигнални» гени, които отговарят на единична промяна на даден

параметър на околната среда. Зелените (с относително ниска експресия) и червените (с относително висока експресия) квадрати се използват за визуализиране на транскрипционните профили на гените, които търпят специфична промяна.

Тези данни показват биосинтетична роля на молекулярния кислород при S.

cerevisiae. При анаеробни условия, S. cerevisiae не може да синтезира de novo стероли и ненаситени мастни киселини, а тези компоненти са необходими като растежни фактори при тези условия. Въпреки че анаеробните хемостатни култури в експеримента се подхранват с ергостерол и олеат, 22 от гените, свързани със стероловия или липиден метаболизъм, са с положителна регулация при анаеробни условия. Сред тях са гени, кодиращи фактори на транскрипцията, мембранни транспортерни белтъци, белтъци участващи в изграждането на клетъчната стена и отговорни за нейния пермеабилитет.

Освен гените, участващи в стероловия и мастно-киселинния метаболизъм гените СОХ5В и НЕМ13 показват значителна стимулация при всички анаеробни култури. Първият кодира аноксигенната субединица на ензима цитохром С оксидаза, за която се

79

смята, че участва в кислородното сигнализиране. Вторият кодира ензима купропорфириноген III оксидаза, катализиращ първото и скорост-определящо, зависимо от молекулярен кислород, стъпало при биосинтезата на хема.

Като допълнителен подход за оценка на биологичното значение на транскрипционните отговори, идентифицирани чрез двумерния подход, е анализирано обогатяването с регулаторни мотиви в промоторната последователност на кислород-зависимите гени (Фиг. 40А, и В). Четири силно представени последователности са открити на 65 анаеробно положително регулирани промоторни региона на гените. Тези последователности са подобни на свързващото място (CGTTT) за транскрипционен фактор Upс2p, чийто структурен ген е значително стимулиран при анаеробни култури. Седемнадесет гени (26 %) споделят елемент от 7 нуклеотида, който е известно свързващо място за анаеробния транскрипционен фактор Rox1p. Идентифициран е и нов мотив от 6 нуклеотида в този генен клъстер, за който не е открит все още ДНК-свързващ белтък. Седемдесет процента от промоторната последователност на гените, които са значително позитивно повлияни в анаеробни култури съдържат поне един от трите елемента дискутирани по-горе.

Транскрипционни отговори на хранителна лимитация по макроелементи:

позитивна регулация на гени при фосфатна лимитация

Четири клъстера от гени, които са значително повлияни (както при анаеробни, така и при аеробни условия) в отговор на лимитация на растежа от единичен макроелемент в хранителната среда, споделят някои устойчиви черти. Те включват:

- индукция на високо-афинитетна транспортна система за лимитиращия макроелемент,

- секреция на ензими, отговорни за усвояване на целевите субстрати, - индукция на системи за мобилизиране и усвояване на вътреклетъчни резерви - индукция на системи за транспорт и асимилация на алтернативни източници

на лимитиращия субстрат (фиг. 41). Това наблюдение се потвърждава от транскрипционния отговор на фосфатната

лимитация. Един предходен анализ е определил 62 положително регулирани сигнални транскрипти при фосфорна лимитация в аеробни условия. Включването на втора дименсия (т.е. анаеробна фосфорна лимитация), води до 50 % понижаване на броя на гените, съставящи този клъстер. Наистина, 31 гени показват значителна позитивна регулация, съизмерима с тази при другите режими на хранителна лимитация при аеробни и анаеробни фосфат-лимитирани хемостатни култури. Сред тези гени, 7 участват в транспорта, 14 в метаболизма, 1 в белтъчната синтеза, 1 в транскрипцията и 8 имат неизвестна функция, съгласно литературните данни. Повлияни от фосфорната лимитация са 23 гени (74 %) и именно те могат да бъдат директно свързани с фосфорния метаболизъм. Всичките 7 гени, класифицирани в транспортната категория, са асоциирани с фосфатния транспорт, други са отговорни за мобилизирането на фосфатите и техния метаболизъм. В този клъстер има 8 гена (25%), които до сега не могат да бъдат пряко свързани с фосфатния метаболизъм. Сред тях са такива, които са свързани с общи метаболитни функции, като генът отговорен за репресията на транскрипцията на ДНК полимераза ІІІ и такива, отговарящи за активиране на сигналните пътища при промени във външната среда.

80

Транскрипционна кръстосана регулация идентифицирана чрез двумерен транскриптомен анализ

Чрез комбиниране на транскрипционните отговори по отношение на (ана)аеробиозата в култура, подложена на хранителна лимитация по 4 макроелемента, е възможно да се идентифицират генни клъстери, които са подложени на транскрипционна регулация от 2 фактора на външната среда. Идентифицирането на такива клъстери не е възможно при конвенционално „едно-дименсиално” сравнение по двойки спрямо условията на култивиране.

В настоящия експеримент могат да се определят осем такива клъстери (Фиг. 40В, набор II и IV). За да се обясни биологичното значение на дефинираните клъстери ще направим следната интерпретация (Фиг. 42).

Фигура 42. Пример за идентифициране на генни клъстери, които са подложени на

транскрипционна регулация от 2 фактора на външната среда. От 428-те гени, които показват транскрипционен отговор на въглеродна

лимитация (Фиг. 40В, набори II, III и IV) само 33 гена показват значим отговор на въглеродна лимитация независимо от наличието на кислород (Фиг. 40В, набор VII). При аеробни условия значителен транскрипционен отговор показват 193 гена (Фиг. 40В, набор II). От останалите 202 гена (Фиг. 40В, набор IV), които отговарят само на въглеродна лимитация при анаеробни култури, 167 гена са негативно регулирани при анаеробни, въглерод-лимитирани култури и 35 гена са положително повлияни. От 35-те гена, които на транскрипционно ниво са положително повлияни при анаеробни,

428 Сlimit

193 Сlimit; + O2 35 Сlimit; + O2 202 Сlimit; - O2

167 Сlimit; - O2

Негат. регул. 35 Сlimit; - O2 Полож. регул.

21 Сlimit; - O2

Полож. регул. МХ функции

14 Сlimit; - O2 Полож. регул. Др. функции

- Окислително фосфор.; - Дишане; - МХ дехидрогенази; - МХ оксидоредуктази

- Хексозен транспорт; - Рибозомални белтъци; - Различни метаболитни

пътища

81

въглерод-лимитирани хемостатни култури, 21 гена са свързани с митохондриалната функция дори при дисимилация на глюкозата по ферментативен път. От тях 15 са включени в окислителното фосфорилиране и дишането, а останалите са отговорни за ключови митохондриални дехидрогенази, оксидоредуктази и белтъци, необходими за нормалния растеж при дишане. Останалите 14 гена от този клъстер включват 2 гена, отговорни за хексозния транспорт, 5 гена, кодиращи рибозомални белтъци и 7 гена, принадлежащи на различни метаболитни пътища.

Ниското съдържание на иРНК за тези гени в анаеробни, хемостатни култури, лимитирани по N, P и S, имащи високи остатъчни концентрации на С, показва че глюкозните катаболити играят важна роля при тяхната транскрипционна регулация. Обратно, при аеробни условия, видът на хранителната лимитация не влияе съществено върху транскрипцията. По-точни изследвания показват, че при аеробни култури, високо транскрипционно ниво се наблюдава при всички режими на лимитация (С, N, P и S). Нещо повече, също при аеробни култури, комбинираната експресия на тези гени предполага средно ниво на индукция при глюкозна лимитация.

ДНК-микрочип техниката като диагностичен метод в биотехнологията Детайлното познаване на стимулите от външната среда, на които са изложени

микроорганизмите при индустриалните ферментации, е много важно за правилното съставяне и оптимизиране на ферментационния процес. ДНК-микрочип техниката дава основа, която по принцип позволява използването на самите микроорганизми като биосензор. За прилагането на ДНК-микрочип техниката обаче, е важно безпогрешното съответствие между свързани параметри на външната среда и транскрипционните отговори. Смисълът на твърдението „важно” е, че се въвежда понятието „сигнален транскрипт”, т.е. транскрипт, чиито нива специфично се повишават/понижават в отговор на единични стимули от външната среда.

Представеното изследване показва, че по принцип силни сигнални транскрипти не могат да бъдат идентифицирани чрез вариране на изследвания параметър в постоянни експериментални условия с 1 променлива (едно-дименсиален транскрипционен анализ). Вместо това, определянето на силен сигнален транскрип изисква транскрипционните отговори на външно условие да бъдат анализирани срещу множествен експериментален фон. Например: наборът от „сигнални транскрипти” за (ае) анаеробиоза и хранителна лимитация от 4 макроелемента, които предварително са изследвани чрез едно-дименсиално транскриптомно сравнение, е значително намален по размер чрез дву-дименсиалния подход.

Този комбинативен подход е възможен поради характера на хемостатните култури, които позволяват промяната на индивидуален параметър, при всички останали – константни. Въпреки, че това изследване покрива една много малка част от възможната промяна на факторите на външната среда, на които S. cerevisiae може да бъде подложен при индустриални условия или в екосистемите, ясно се показва комплексния характер на транскрипционната регулация. В реални условия транскрипционните отговори на клетките се повлияват от стотици екстрацелуларни сигнали. Взаимодействието между тези сигнали води до формиране на многофакторно пространство, в което всяка възможна комбинация от сигнали води до уникален транскриптом. Следователно, трябва да се очаква, че броят на силните сигнали ще се понижи по-късно, когато освен хранителна лимитация и О2, се включат и химични или физични параметри.

Значението на комбинираната природа на регулацията на генната експресия е много по-голямо от изучавания случай със S. cerevisiae и индустриалната биотехнология. Например: в областта на медицината може да се очаква, че

82

транскрипционните профили ще се припокриват със съответните болестни състояния или фармакологичен ефект. Те могат да бъдат еднакво чувствителни и на други стимули и вариации на въздействие върху клетката.

Неразкрита транскрипционна регулация

Независимо от комбинативната природа на транскрипционната регулация, идентифицирането на безпогрешните „сигнални транскрипти” ще бъде възможно, когато механизмите на транскрипционната регулация се разберат напълно. В идеалния случай „сигналните транскрипти” ще се кодират от гени, които отговарят на единичен транскрипционен регулаторен белтък, чиято експресия и активност са уникално зависими от индивидуален стимул от външната среда. Идентифицирането на такива гени и регулатори изисква детайлни познания за регулоните и разпознаване на последователностите на всички свързани транскрипционни регулатори. Такова познание е много важно за рационалното и предсказуемо препрограмиране на транскрипционната регулация с цел подобряване на индустриалните микроорганизми.

Дори за добре проучен микроорганизъм като S. cerevisiae, физиологичната роля на много транскрипционни регулатори, а също така и последователност от мотиви, които те разпознават, трябва да бъдат изяснени.

Най-общо казано, комбинираният анализ на транскрипционния отговор по отношение на стимули от външната среда вероятно увеличава възможността за разпознаване на съответни регулаторни елементи и тяхното идентифициране.

Използваният подход позволява установяването на йерархични връзки при транскрипционната регулация. Това се илюстрира от наличието на суб-мрежа от гени, свързани с митохондриалната функция. При анаеробни условия тези гени са регулирани първоначално от глюкозна репресия-депресия. Обаче, при аеробни условия, високо ниво на транскрипция се наблюдава дори при условия на глюкозен излишък. Заедно, тези данни показват, че при аеробни условия кислородната регулация подтиска глюкозната репресия.

Чрез разширяване на мрежата от данни и комбинирайки ги с in silico анализа на промоторната структура, комбинирания анализ на траскриптомите може да подпомогне разкриването на цялостната транскрипционна регулаторна мрежа.

Функционален анализ

Определянето на физиологични функции на “непознати функционални гени” все още представлява голямо предизвикателство в пост-геномната ера. Чрез идентифициране на групите от гени, които се ко-експресират, ДНК-микрочип техниката може да предоставя функционален анализ. И наистина, много изследвания свързват нивото на иРНК с условията на култивиране. Но дори когато се използват хемостатни култури за промяна на един параметър на външната среда, сравнението на двойки води до голям брой прицелни гени, които усложняват функционалния анализ. Нещо повече, при проведеното понастоящем изследване в геномен мащаб на транскрипционните отговори на ниски температури е доказана много ниска корелация между транскрипционните отговори на гени и фенотип на съответните нулеви мутанти при ниска температура.

Сравнен с предходни изследвания, получени чрез едно-дименсиален метод, комбинираният подход води до ясно обогатяване на “мрежата от гени”, чиято функция е свързана с гени с известна функция, свързана с влияние на външната среда, и/или с гени и съответните им регулаторни елементи. Логически, гените с неизвестна функция, открити в база данните, по всяка вероятност имат пряка функционална връзка със съответния хранителен статус на културите и с влиянието на външната среда. Тази

83

хипотеза е тествана на суб-мрежа от гени, които показват съответно стимулиране при анаеробни условия.

Сред сигналните гени, имащи “силен отговор”, описани в това изследване, 38% нямат ясно изразена биологична функция. Важно е да се отбележи, че твърдението за някои от тези гени, принадлежащи към група Отворени Рамки за Четене, за които се предлага да бъдат изключени от дрождевата геномна директория въз основа на сравнителен геномен анализ на S. cerevisiae, S. bayanus, S. mikate и S. paradoxus, търпят ревизия. Установено е, че три от тези гени имат значителен отговор при фосфатна лимитация и азотна лимитация, което показва че са биологично важни. Като се има предвид, че при непрекъснатите култури условията са стандартизирани, то ДНК-микрочип анализът показва добра повторяемост в различни лаборатории.

Предполага се, че усилията на много лаборатории чрез хемостат базирани мултидименсиални експерименти ще създадат база данни за генната експресия. Тя ще бъде изключително средство за функционален анализ и системна биология на дрожди. Такива база данни могат да бъдат направени не само по отношение на транскриптомните данни, но могат да касаят и други нива на информация.

Заключение

Настоящото изследване представлява първо количествено оценяване на влиянието

на кръстосаната транскрипционна регулация при въздействието на различни параметри на външната среда. Като модел са сравнени отговорите на аеробни и анаеробни хемостатни култури на дрождите S. cerevisiae, при лимитираща растежа концентрация на въглерод, азот, фосфор и сяра. Доказано е, че природата на лимитиращия фактор има силно въздействие върху мрежата от транскрипти, които отговорят за наличието на кислород и обратно. Ето защо, може да се направи заключение, че идентификацията на значимите транскрипти за определени условия на външната среда, може да се получи чрез комбиниране на транскрипционната база данни, получена при различни референтни условия. Освен това, двудименсионалният подход за транскрипционен анализ е ценен нов подход за изучаване на взаимовръзката на различни транскрипционни регулаторни системи.

84

Протокол за провеждане на ДНК-микрочип анализ Това е примерен ДНК-микрочип протокол, описващ детайлно един специфичен

случай, макар че са възможни и алтернативни варианти (Фиг. 43). Експериментът се провежда с две сравнявани проби (сравнение по двойки). Те се означават като третирана проба (Проба) и нетретирана проба (Контрола). 1. Натрупване на биомаса от Проба и Контрола. 2. Изолиране и пречистване на целева нуклеинова киселина: това може да бъде както

РНК, необходима за изследване на експресионен профил и ДНК за сравнителна хибридизация, така и ДНК/РНК свързани към специфичен белтък, който е имунопреципитиран (ChIP-on-chip), за епигенетични или регулаторни изследвания. В този примерен протокол, тоталната (ядрена и цитоплазмена) РНК е изолирана чрез гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформна екстракция. Екстракцията позволява изолиране на повечето РНК (докато колонните методи имат ограничение до 200 нуклеотиди) и ако е проведена правилно - тя постига по-добро пречистване.

3. Пречистената РНК се анализира качествено (чрез капилярна електрофореза) и количествено (чрез нанокапков спектрофотометер): ако се установи наличие на достатъчно материал (> 1 мкг) експериментът може да бъде продължен.

4. Белязаният продукт се генерира чрез обратна транскрипция, а понякога по избор, чрез PCR амплификация. РНК се подлага на обратна транскрипция чрез полиТ праймери, които амплифицират само мРНК или чрез произволни праймери, които апмплифицират цялата РНК, която е предимно рРНК. Белязането се извършва на стъпката “обратна транскрипция” или допълнително, след амплификацията, ако има такава. Веригата, които се бележи, зависи от микрочип техниката, което означава че ако белязането се извършва в сместа за обратна транскрипция, то амплифицираната кДНК се приема за матрична верига, докато сондите се инкорпорират в комплементарната й верига. Бележещото вещество обикновено е флуоресцентно багрило; само един вид апарат използва белязане с радиоизотопи. Белязането може да бъде директно или индиректно (използва се широко в практиката), което изисква етап на свързване. Етапът на свързване може да бъде преди хибридизацията (двуканален микрочип), като се използват аминоалил–УTФ (ааУТФ) и N-хидроксисукцинимид (NHS) амино – реактивни багрила (подобни на цианиновите багрила) или след хибридизацията (едноканален микрочип), при който се използва биотин и белязан стрептавин. Модифицираните нуклеотиди (обикновено смес от ааУTФ и TTФ в съотношение 1:4) се добавят ензимно в по-малки концентрации спрямо нормалните нуклеотиди: най-често по 1 на всеки 60 бази (измерено със спектрофотометер). След това ааДНК се пречиства чрез колона (използва се фосфатен буфер, тъй като Трис буферът съдържа амино-групи). Аминоалиловата група е амино-група, прикачена към базата на нуклеотида чрез дълга връзка, която взаимодейства с реактивни багрила. В експеримента се залага и контрола по отношение на багрилото. Това е своеобразен тип реплика за отстраняване на маскировъчни ефекти на багрилото (при двуканалния микрочип). Осъществява се като на едно предметно стъкло пробата се бележи със флуоресцентното багрило родамин (cy3, червен цвят), а контролата – с флуоресцентното багрило флуоресцин (cy5, зелен цвят); на второ предметно стъкло проба и контрола се бележат с противоположните багрила. В този експеримент, това става в присъствие на аминоалил – УТФ, добавен към сместа за обратна транскрипция.

5. Белязаните проби се смесват с подходящ хибридизационен разтвор, който може да съдържа SDS, цитрат, декстран-сулфат, блокиращ агент (СОТ1 ДНК, ДНК от

85

сперма на пъстърва, ДНК от телешки тимус, полиА или полиТ), разтвор на Денхард и формамин.

6. Тази смес се денатурира и добавя в игловидния отвор на микрочипа, който може да бъде ген-чип или стъклен микрочип, който е ограничен от капак, наречен миксер, съдържащ 2 игловидни отвора, и запечатан с пластина отстрани.

7. Отворите се запечатват и микрочипът хибридизира в термокамера, където се подлага на ротация, или чрез миксер при който размесването се осъществява чрез промяна на налягането в отворите.

8. След приключване на хибридизацията (за една нощ), всички неспецифични свързвания се отмиват (с SDS и цитрат).

9. Микрочипът се изсушава и сканира със специален скенер, в който лазерен лъч се насочва през багрилото и емисията от това облъчване се измерва чрез детектор.

10. Изображението се разчертава с шаблон и количествено се определя интензивността на дадена характеристика (няколко пиксела съставят характеристиката).

11. Първичните данни се нормализират, като най-простият метод е да се извади интензивността на фона и тогава да се раздели тоталната интензивност на характеристиките на тази от всеки канал или на интензивността на еталонен ген. След това се пресмята t-стойността за всяка интензивност. Прилагат се и по-сложни методи, включващи z-отношение, LOESS и LOWESS регресия и устойчив мултичип анализ (RMA = robust multichip analysis) за Афимитрични чипове (едно-канални, силиконови чипове, in-situ синтезирани къси олигонуклеотиди).

86

Фигура 43. Експериментален протокол за провеждане на ДНК-микрочип анализ

Исторически данни за техниките с ДНК-микрочипове През февруари 2001 год., две независими научноизследователски групи

публикуват своите първоначални изследвания по секвениране на човешкия геном.

87

Всепризнато е, че това е едно от най-значимите събития в историята на биологията. В допълнение към човешкия геном, съществуват повече от 100 организма, чиито геном е напълно секвениран. При тези организми, фокусът е съсредоточен върху определяне на функционалната информация за гените. Този нов фокус поставя началото на изследвания познати като Функционална Геномика. Повечето разработки по секвениране могат по алегория да се сравнят с проектите за определяне на всички думи в даден език. Функционалната Геномика описва значението или дефиницията на думите и разкрива синтаксиса на езика.

Проектите по Функционална Геномика са широко мащабни. Освен това, те са мултидисциплинарни, включващи разработки по молекулярна биология, физика, химия и инженерни дисциплини. Прилагат се и възможностите на роботиката, които позволяват ефективното провеждане на съвременни анализи.

Един от подходите на Функционалната Геномика включва идентифициране на промените в експресията на гените при специфични условия. Например, много от болестите са резултат от неправилна регулация на генната експресия. Технологията на микрочипове от ДНК (ДНК-микрочипове) позволява едновременен мониторинг на експресията на хиляди гени и е призната за една от най-успешните реализации на подходите на Функционалната Геномика. Приложенията на техниката с ДНК-микрочипове се простират извън границите на фундаменталната биология в диагностиката, мониторинга на околната среда и фармакологията. В допълнение, фармацевтичните компании използват тази технологията за да ускорят процесите на откриване на лекарства.

От макро- към микрочипове Технологията с ДНК-микрочипове се заражда по времето, когато учените

посрещат предизвикателствата на откритите мощни и високоспециализирани техники, които могат да бъдат използвани за откриване и определяне на относителното изобилие от транскрипти в РНК проби. В началото на 90-те години на миналия век, когато изследванията с микрочипове са в своето начало, ръчно се правят отпечатъци на колонии върху найлонови мембрани с помощта на устройство с 96 микроигли (т.нар. макрочип). След това тези техники с макрочипове се комбинират с радиоактивно-белязани проби за получаването на „едноцветни” анализи.

През периода средата – края на 90-те години стават популярни протоколите за флуоресцентно белязане. Въпреки че този метод на белязане изисква специфично оборудване за улавяне на флуоресцентния сигнал, той е приложим за 2-цветни хибридизационни анализи. Експресионните профили могат да бъдат определени по-надеждно, тъй като експериментаторите имат възможност да сравняват две различни проби в един микрочип.

През 1995 год., Schena и кол. разработват система с висок капацитет за паралелно наблюдение на експресията на 45 гени на Arabidopsis чрез поставянето на микрокапки от комплементарна ДНК (кДНК) върху микроскопски предметни стъкла, прилагайки техниката на високоскоростно роботизирано отпечатване. При това изследване миниатюризираният високо-плътностен формат позволява използването на по-малки обеми за хибридизация, което повишава чувствителността на метода и дава възможност да бъдат определени рядко срещани тренскрипти, получени от 2 микрограма информационна (матрична) РНК (мРНК).

През 1996 год., Schena и кол. докладват минималния праг на детекция на ДНК-микрочип анализа, позволяващ създаването на профил на транскрипти, които тегловно съставляват една петстотин хилядна част от мРНК. Независимо, че това е значително подобрение в чувствителността на метода спрямо методите на колонните филтри и

88

радиоактивно-белязаните проби (които биха могли количествено да определят нивата на експресия на транскрипт в концентрация 0,005 % в дадена проба), то е твърде далеч от съвременните граници на детекция. Съвременните протоколи изискват едва 2-3 микрограма тотална РНК за директно или индиректно (амино-алил) белязане. В допълнение, разработени са голям брой РНК-амплификационните техники, линейни и експоненциални, за да бъде възможно определянето на транскрипционни профили на малки проби.

Основният вариант на ДНК-микрочип анализа е усъвършенстван с множество подобрения през последното десетилетие. Освен преминаването от ръчно-отпечатвани колонии върху найлонова мембрана към фото-литографското принтиране на повече от 1,3 милиона проби върху стъклена пластина, ДНК-микрочип анализът е усъвършенстван чрез прилагане на подходящо покритие на стъклената пластина, което позволява по-добро качество на нанесените точки (капки) - уеднаквяване по размер и морфология.

Разработването на множество различни флуорофори позволява провеждането на многоцветни хибридизационни анализи, които използват различни свързани химични съединения и съвременни апарати с висока резолюция на сканиране и принтиране. По отношение на представянето на резултатите, разработен е софтуер, позволяващ на експериментатора лесно да архивира, да разглежда и статистически да обработва голям брой данни.

В допълнение към едновременното определяне на относителното изобилие от транскрипти в две РНК-проби, приложението на ДНК-микрочип анализа се разширява и включва високопродуктивно мини-секвениране, откриване на единичен нуклеотиден полиморфизъм (single nucleotide polymorpohism = SNP), Сравнителна Хибридизационна Геномика в Микрочип (Array Comparative Hybridization Genomics = aCHG) и хроматин имунофлуопреципитация в микрочип. Днес микрочип анализът включва приложения, свързани с белтъци, като антитяло микрочип, както и клетъчни приложения, като клетъчен и тъканен микрочип.

89

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Най-често използвани хранителни среди при култивиране на дрожди

1. Течна среда Дрождев екстракт – малцов екстракт (YM среда)

Дрождев екстракт – 3 гр. Малцов екстракт – 3 гр. Пептон – 5 гр. Глюкоза – 10 гр. Дест. вода – 1000 мл. рН 5 – 6 в зависимост от вида Стерилизация: 1 атм. за 15 мин. 2. Дрождев екстракт – малцов екстракт агар (YM среда)

Дрождев екстракт – 3 гр. Малцов екстракт – 3 гр. Пептон – 5 гр. Глюкоза – 10 гр. Агар – 20 гр. Дест. вода – 1000 мл. рН 5 – 6 в зависимост от вида Стерилизация: 1 атм. за 15 мин. 3. Течна среда малцов екстракт (пивна мъст)

За получане на пивна мъст към 1 кг. малцов екстракт се добавят 2.6 л. чешмяна вода, след което получената суспензия се оставя на 45ºС за 3 часа с последващ престой на 63ºС за 1 час. След това суспензията се филтрува и автоклавира на 1 атм. за 15 мин. Пхолучените преципитати се филтруват отново. Така получената бистра пивна мъст се разрежда до конценрация 15º Балинга (специфична скорост на утаяване на малцовия екстракт, изразена като Балинг градуси, които се определят с захаромер на Балинг). рН на пивната мъст се коригира до 5.6 и отново се автоклавира за 15 мин. на 1 атм.

Готова пивна мъст би могла да се вземе и от пивоварните заводи. В този случай се коригират само Балинг градусите до 15º и рН на средата до 5.6.

За приготвянето на малцов екстракт среда освен готова пивна мъст би могло да се използва и прахообразен малцов екстракт (готов търговски продукт), като 15 гр. малцов екстракт се разтварят в 100 мл. дест. вода и рН се коригира до 5.6.

4. Малцов екстракт агар

Течна среда малцов екстракт се разрежда до концентрация 10 градуса на Балинг и към нея се прибавя агар в концентрация 2%. Когато се използва прахообразен малцов екстракт, неговата концентрация трябва да е 10%.

5. YPD среда, агаризарана

Глюкоза – 40 гр. Пептон – 5 гр. Дрождев автолизат – 500 мл. Агар – 20 гр. Дест. вода – 500 мл. рН на средата 5.6 Стерилизация: 1 атм. за 15 мин.

90

6. Среда на Сабуро, агаризирана

Глюкоза – 40 гр. Пептон – 10 гр. Агар – 20 гр. Дест. вода – 500 мл. рН на средата 7.0 Стерилизация: 1 атм. за 15 мин. За морфологично охарактеризиране на вегетативни дрождеви клетки се

използват някои от следните хранителни среди, например: 1. Течна среда малцов екстракт (пивна мъст)

2. Течна 2% глюкоза – дрождев екстракт – пептонна вода

Глюкоза – 20 гр.

Пептон – 10 гр.

Дрождев екстракт – 5 гр. Дест. вода – 1000 мл. рН не се коригира.

Стерилизация: 1 атм. за 15 мин. 3. Малцов екстракт агар

4. Среда 2% глюкоза – дрождев екстракт – пептон агар

Средата се пригатвя като към течната 2% глюкоза – дрождев екстракт – пептонна вода се прибави агар в концентрация 2%. Стерилизация на 1 атм. за 15 мин.

5. Морфологичен агар

Използва се готова среда Бакто морфологичeн агар за дрожди (Difco). 35 гр. от средата се разтварят в 1л. дест. вода . рН се коригира до 5.6. Стерилизация на 1 атм. за 15 мин.

За наблюдение и определяне на типа псевдомицел се използват някои от следните хранителни среди, например:

1. Царевичен агар

12.5 гр. царевично брашно се разтварят в 300 мл. дест вода. Суспензията се загрява до 60ºС за 1 час, след което се филтрува. Добавя се дест. вода до достигане на първоначалният обем от 300 мл. Към полученият филтрат се прибавят 3.8 гр. агар. Стерилизация на 1 атм. за 15 мин.

За приготвянето на среда царевичен агар също се използва и готов търговски продукт.

2. Картофен агар (картофено – глюкозен агар)

100гр. обелени и нарязани на дребно картофи се накисват в 300 мл. чешмяна вода. Така престояват няколко часа. След това течността се филтрува и автоклавира на 1 атм. за 15 мин. Полученият картофен екстракт се използва за приготвянето на среда, като към 230 мл. екстракт се прибавят 770 мл. Чешмяна вода, 20 гр. глюкоза и 20 гр. агар. Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

91

3. Оризов агар

20 гр. ориз се заливат с 1000 мл. чешмяна вода и се варят на слаб огън 1 час. След охлаждане, суспензията се филтрува и към филтрата се добавя чешмяна вода до достигане на първоначалният обем от 1000 мл. Към този оризов екстракт се добавят 20 гр. агар. Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

За образуване и наблюдение на балистоспори се използват някои от средните хранителни среди, например:

1. Агаризирана среда малцов екстракт

2. Картофено глюкозен агар

3. Царевичен агар

За образуване и наблюдение на аскоспори се използват някои от средните хранителни среди, например:

1. Зеленчуков сок агар

Еднакви количества моркови, червено цвекло, краставица и картофи се наряват на дребно и се смесват с същото количество вода. Тази смес се автоклавира за 10 мин. на 1 атм., след което се филтрува. Към филтрата се добавят 2% дрождев екстракт и 2% агар. рН се коригира до 5.6. Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

2. Среда на Городкова (модифицирана)

Глюкоза – 1 гр.

Пептон – 10 гр.

Натриев хлорид – 5 гр.

Агар – 20 гр.

Дест. вода – 1000 мл.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

3. Ацетатен агар на Fowell

Натриев ацетат трихидрат – 5 гр.

Агар – 20 гр.

Дест. вода – 1000 мл.

рН на средата се коригира до 6.5 – 7.0.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

4. Ацетатен агар на Kleyn

92

Бакто триптоза – 2.5 гр.

Глюкоза – 0.62 гр.

Натриев хлорид – 0.62 гр.

Натриев ацетат трихидрат – 5 гр.

Агар – 15 гр.

Дест. вода – 1000 мл.

рН на средата се коригира до 6.9 – 7.1.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

5. Малц екстракт агар (МЕ агар)

Малцов екстракт – 20 гр.

Агар – 12 гр.

Дест. вода – 400 мл.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

6. Картофен агар

7. Царевичен агар

8. Дрождев екстракт – 2% глюкозен агар

Глюкоза – 20 гр.

Дрождев екстракт – 5 гр.

Агар – 20 гр.

Дест. вода – 1000 мл.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

9. Оризов агар

10. Подтискащ растежа агар (ПР агар)

Дрождев екстракт – 0.05 гр.

Пептон – 0.05 гр.

Глюкоза – 0.25 гр.

Агар – 5 гр.

Дест. вода – 250 мл.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

93

11. YM агар + 2 % натриев хлорид

Средата се приготвя като към YM агар се прибави натриев хлорид в концентрация 2 %.

12. Овесен агар

4 гр. овесени ядки се варят 1 час в 100 мл. чешмяна вода, след което се филтруват. Към филтрата се добавя вода до достигане на първоначалния обем (100 мл.). Добавят се 1.5 гр. агар. Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

За наблюдение на базидиоспори се използва някои от следната хранителна среда, например:

1. Захароза – дрождев екстракт агар

KH2PO4 – 1 гр.

MgSO4 . 7H2O – 0.5 гр.

CaCl2 – 0.1 гр.

NaCl – 0.1 гр.

Биотин – 5.0 мк.гр.

Захароза – 20 гр.

Дрождев екстракт – 0.5 гр.

Агар 40 гр.

Дест. вода – 1000 мл.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

За определяне на способността за ферментация на дрождеви видове се използват някои от следните хранителни среди, например:

1. Дрождев автолизат

В колбичка се смесват равни количества дрождеви клетки и вода. Клетките се инкубират 3 дни на 50ºС, след което се поставят да врат за няколко минути. рН се коригира до 6.0 с KOH. Супернатантата се филтрува. Така полученият филтрат представлява дрождев автолизат.

2. Основна среда за ферментация

4.5 гр. дрождев екстракт и 7.5 тр. Пептон се разтварят в 1000 мл. дест. вода. Добавя се бром-тимолблу до достигане на тревисто-зелен цвят. В епруветки с предварително поставени в тях мини-епруветчици (видалчета) се разливат по 2 мл. От средата. Епруветките със среда се автоклавират на 1 атм. за 15 мин.

94

За определяне на способността за асимилация на различни въглеродни източници от дрождеви видове се използват някои от следните следните хранителни среди, например:

1. Основна среда за асимилация I

(NH4)2SO4 – 5 гр.

KH2PO4 – 1 гр.

MgSO4 . 7H2O – 0.5 гр.

Агар – 20 гр.

Дест. вода – 1000 мл.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

2. Основна среда за асимилация II

6.7 гр. Бакто дрождева азотна база (Yeast Nitrogen Base) и 20 гр. агар се разтварят в 1000 мл. дест. вода. Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

Yeast Nitrogen Base (Difco) Количествата са за 1 л.

Азотен източник Амониев сулфат 5.0 гр. Аминокиселини L-Хистидин монохидрохлорид 10.0 мгр. LD-Метионин 20.0 мгр. LD-Триптофан 20.0 мгр. Витамини Биотин 2.0 мкгр. Калциев пантотенат 400.0 мкгр. Фолиева киселина 2.0 мкгр. Инозитол 2,000.0 мкгр. Ниацин 400.0 мкгр. p-Аминобензоена киселина 200.0 мкгр. Пиридоксин хидрохлорид 400.0 мкгр. Рибофлавин 200.0 мкгр. Тиамин хидрохлорид 400.0 мкгр. Вещества, осигуряващи микроелементи Борна киселина 500.0 мкгр. Меден сулфат 40.0 мкгр. Калиев йодид 100.0 мкгр.

95

Железен хлорид 200.0 мкгр. Манганов сулфат 400.0 мкгр. Натриев молибдат 200.0 мкгр. Цинков сулфат 400.0 мкгр. Соли Калиев дихидроген фосфат 1.0 гр. Магнезиев сулфат 0.5 гр. Натриев хлорид 0.1 гр. Калциев хлорид 0.1 гр.

За определяне на способността за асимилация на различни азотни източници от дрождеви видове се използват някои от следните хранителни среди, например:

1. Основна среда за асимилация I

Глюкоза – 20 гр.

KH2PO4 – 1 гр.

MgSO4 . 7H2O – 0.5 гр.

Агар – 20 гр.

Дест. вода – 1000 мл.

Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

2. Основна среда за асимилация II

11.7 гр. Бакто дрождева въглеродна база (Yeast Carbon Base) и 20 гр. агар се разтварят в 1000 мл. дест. вода. Средата се стерилизира на 1 атм. за 15 мин.

Yeast Carbon Base (Difco) Количествата са за 1 л.

Въглероден източник Глюкоза 10.0 гр. Аминокиселини L-Хистидин монохидрохлорид 1.0 мгр. LD-Метионин 2.0 мгр. LD-Триптофан 2.0 мгр. Витамини Биотин 2.0 мкгр. Калциев пантотенат 400.0 мкгр. Фолиева киселина 2.0 мкгр. Инозитол 2,000.0 мкгр.

96

Ниацин 400.0 мкгр. p-Аминобензоена киселина 200.0 мкгр. Пиридоксин хидрохлорид 400.0 мкгр. Рибофлавин 200.0 мкгр. Тиамин хидрохлорид 400.0 мкгр. Вещества, осигуряващи микроелементи Борна киселина 500.0 мкгр. Меден сулфат 40.0 мкгр. Калиев йодид 100.0 мкгр. Железен хлорид 200.0 мкгр. Манганов сулфат 400.0 мкгр. Натриев молибдат 200.0 мкгр. Цинков сулфат 400.0 мкгр. Соли Калиев дихидроген фосфат 1.0 гр. Магнезиев сулфат 0.5 гр. Натриев хлорид 0.1 гр. Калциев хлорид 0.1 гр.

97

Използвана литература

1. Michael Madigan, John Martinko, Paul Dunlap, David Clark. Brock Biology of

Microorganisms 12th Edition, Southern Illinois University, USA, 2010

2. Walker G., 1998, Yeast physiology and biotechnology, John Willey & Sons,

Chichester, England

3. Carlile M. Watkinson S. and Gooday G., 2001, The Fungi, Second edition, Academic

press, USA

4. Feldmann H., 2005, Yeast molecular biology, Adolf-Butenandt-Institute, University of

Munich.

5. Analytical Biochemistry: Methods in Enzymology, Vols. 350 and 351, Guide to Yeast

Genetics and Molecular and Cell Biology, Parts B and C. Guthrie C. and Fink G., Eds.

Academic Press, New York, 2002

6. Nduka Okafor Modern Industrial Microbiology and Biotechnology, 1st ed., 2007,

Science Publishers

7. Webster J. And Weber R., Introduction to Fungi, 3rd Edition Cambridge University

Press, 2007.

8. The Yeasts, Volumes 1 - 6, Second Edition, Rose, A. H. Rose, J. S. Harrison,

Academic Press, 1993

9. Exploitation of Fungi - Symposium of the British Mycological Society held at the

University of Manchester September 2005 - Edited by G. D. Robson, P. Van West and

G. M. Gadd