POLYVINYL ALCOHOL HYDROGEL (PVA) TO REPAIR OSTEOCHONDRAL DEFECTS: HISTOLOGICAL EVALUATION, MORPHOMETRIC AND X-ray

FLUORESCENCE

Nilza A. Batista1, 5, Ana A. Rodrigues1, 5, Vanessa P. Bavaresco2, 5, José Ricardo Lenzi Mariolani1, 5, Marcelo R. Cunha 3, Arnaldo R. Santos Jr.4,5, William D. Belangero 1, 5.

1 Laboratório de Biomateriais em Ortopedia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, (SP), Brasil2Departamento de Plásticos, Colégio Técnico da Unicamp, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, (SP), Brasil3Departamento de Morfologia e Patologia, Faculdade de Medicina de Jundiaí, Jundiaí, SP, 4 Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH), Universidade Federal do ABC, Santo André, SP, Brasil5 INCT em Biofabricação, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil

E-mail: arnaldo.santos@ufabc.edu.br

Resumo. This study aimed at assessing performance of Polyvinyl Alcohol hydrogel (PVA) acetalized and irradiated by electron beams with 1 mm thickness and diameter of 2mm implanted into osteochondral defects made in the knees of rats divided four experimental groups (EGs) for times follow-up of 03, 06 12 and 24 weeks (EG03, EG06, EG12, EG24) compared with control group (GC00) in which the material was not deployed. The parameters utilized for analyzes were: Optical Microscopy (OM), Morphometry (MF) and X-ray Fluorescence (EDXRF). The results of the MO showed no foreign body reaction with formation, differentiation and the maintenance of neo tissue formed receiving cavity. The bulk density of neoformed tissue of EGs increases with the time tracking for all EGs analysis as MF. The result of the EDRFX there was increase the concentration Calcium and Phosphorus levels as time increased in all the following EGs compared to GC00. It was concluded that the PVA showed promise as osteochondral defect repair.

Keywords: Osteochondral defects, Polyvinyl alcohol hydrogel, Microscopic evaluation, Morphometric, X-ray fluorescence.

1. INTRODUÇÃO

A cartilagem articular (CA) é um tecido altamente especializado que tem como finalidade revestir as superfícies epifisárias, absorver choques e facilitar o deslizamento entre as mesmas. O comportamento viscoelástico da cartilagem articular não depende apenas das propriedades mecânicas intrínsecas da matriz extracelular, mais também da resistência ao escoamento da água intersticial quando o tecido é deformado. Estudos físico-químicos comprovaram que no solvatado presente na rede de colágeno da CA, há um polímero na forma de gel (hidrogel) responsável pelo comportamento mecânico da cartilagem articular [Broom 1998, Mow 1997, 1984].

A CA suporta forças de compressão e cisalhamento minimizando o atrito e o desgaste para que os movimentos articulares repetitivos sejam indolores. [Buckwalter 2000, Hall 1991, Costa 2001, Peretti 2010]. Mudanças no mecanismo de lubrificação aceleram de modo drástico a degeneração articular devido aumento da área de contato e do atrito entre as superfícies. No entanto, a cartilagem articular pode sofrer alterações degenerativas com exposição do osso subcondral [Curl W, 1997] que podem ser de origem traumática como as fraturas articulares, lesões ligamentares ou meniscais, ou de origem inflamatória ou degenerativa secundárias a doenças autoimunes ou metabólicas [Beris, 2005].

O tratamento eficaz para essas lesões é um dos maiores desafios enfrentados pelos profissionais da área dos biomateriais que consiste em obter um biomaterial artificial que mimetize as propriedades físicas, químicas e mecânicas da cartilagem articular e do osso subcondral [Mow 1997; Costa 2001; Ribeiro 2004; Mankin 1992].

Atualmente são utilizadas diferentes técnicas para preservação da articulação como a abrasão, microfraturas, mosaicoplastia, transplantes autólogos de condrócitos de 1ª e 2ª geração, e transplante alógeno osteocondral. [Johnson, 1986; Kreuz PC, Mithoefer K, Williams RJ, Hangody,1997, 2003; Brittberg, 1994; Jones, 2000; Davidson, 2007; Mcnickle, 2008].

Todas as técnicas apresentam limitações, já que o neotecido formado apresenta durabilidade e estrutura mecânica inferior ao tecido cartilaginoso original, comprometimento da área doadora, alto custo, incompatibilidade genética dentre outras.

Existem alguns implantes osteocondrais obtidos a partir de hidrogéis poliméricos que apresentam características físicas e químicas semelhantes aos da cartilagem articular. [Bavaresco, 2008; Suciu, 2003; Sawe, 2004; Oka 2001; Malmonge, 2002; Garrido, 2007; Sawae, 1996].

Mow (1997), concluiu que o PVA como reparador da CA, mostrou-se resistente a carga o qual foi submetido e foi capaz de exsudar líquido sinovial e promover um regime de lubrificação a qual é conferida às diversas articulações do corpo humano cujos valores de coeficiente de atrito estão entre 0,003 e 0,06.

Hidrogel à base de PVA é um biomaterial promissor como reparador de defeitos osteocondrais, pois apresenta estabilidade química na presença dos fluídos biológicos, elasticidade, boa capacidade de absorção de água além do baixo custo de síntese [Kobayashi, 2005; Bavaresco, 2004, 2008, Gu, 1999].

Diante dos resultados satisfatórios de testes de toxicidade in vitro realizados por Rodrigues et al (2012), o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de implantes de hidrogel de Álcool de Polivinil (PVA) reticulado via radiação ionizante como reparador de defeitos osteocondrais no joelho de ratos.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Obtenção dos dispositivos de PVA

Utilizou-se o uma solução aquosa a 10% de polímero de PVA (341584 Sigma Audrey®), o qual foi dissolvido sob temperatura de 70°C. Verteu-se 20 ml da solução em placas de Petri silanizadas obtiveram-se as membranas de PVA com 1 mm de espessura as quais foram desidratadas por 72h conforme Fig. 1.

Após esse período, as membranas foram submetidas ao processo de acetalização em solução de formaldeído 40% (v/v), ácido sulfúrico e sulfato de sódio anidro com intuito de melhorar a resistência mecânica devido à reticulação intermolecular formada pelas ligações carbono, oxigênio e carbono (C-O-C) gerado pela formação dos grupos acetais seguida da

lavagem em água destilada corrente por 12h para remoção total da solução de acetalização e irradiadas por feixe de elétrons com dose de 25 kGy em ambiente livre de oxigênio (Bavaresco, 2004) e obtidos os dispositivos de dimensões de dois mm de diâmetro e um mm de espessura os quais foram mantidos sob refrigeração até o momento do implante conforme Fig.2.

2.2. Animais

Utilizaram-se 24 ratos machos com 10(± 2) semanas e massa corpórea de 380g (± 20) para os Grupos Experimentais (GEs - GE03, GE06, GE12, GE24) para tempos de seguimento de 03, 06 12 e 24 semanas respectivamente.

2.3. Procedimento Cirúrgico

Conforme protocolo de Ética em Experimentação Animal n° 1047-1/2008 submetido e aprovado pelo Instituto de Biologia da UNICAMP, os animais foram pesados e anestesiados via endovenosa caudal com tiopental sódico na dose 25 mg/Kg seguida da tricotomia e assepsia com solução de álcool iodado dos membros posteriores.

De acordo com a Fig. 3, realizou-se incisão na pele dos lados direito e esquerdo de cada animal e por meio de acesso parapatelar a patela foi luxada e com afastadores a região intercondiliana foi exposta e com uma broca dotada de limitador de profundidade foram feitos os defeitos com dois mm de diâmetro e um mm de profundidade.

Após, com auxilio de uma trefina e sob pressão, o dispositivo PVA foi introduzido no mesmo nível da cartilagem articular adjacente. Ao final, cápsula articular e pele foram suturadas e os animais mantidos em gaiolas no biotério e ração e água foram oferecidas à vontade até o dia do sacrifício que foi realizado por aprofundamento anestésico e os fêmures foram desarticulados realizada a osteotomia do terço médio da diáfise femoral. Em seguida, as amostras foram fixadas em solução tamponada de formaldeído com pH 7,5 por 48h.

Figura 3 - Procedimento cirúrgico: (a) incisão de pele; (b) exposição côndilo – região intercondiliana; (c) confecção do defeito osteocondral; (d) implante PVA com trefina; (e) defeito com o implante de PVA; (f) sutura.

3. ANÁLISES

bd

3.1. Ensaio de Espectrometria de Fluorescência de Raios-X (EDXRF)

Para esta análise, três amostras de PVA de cada um dos GEs (n=12) mais três amostras de PVA do GC00(não implantados) foram utilizadas para quantificar os elementos minerais Cálcio (Ca), Fósforo (P) e Enxofre (S) conforme Batista [2011].

Todas as amostras (n=15) após serem depositadas em celas específicas de polietileno Chemplex® foram submetidas à irradiação do feixe incidente, e 25% do tempo morto detectados por espectrofotômetro de fluorescência por dispersão em energia de Raios-X com detector de semicondutor Silício (Si), com resolução de energia de 165 eV. Os espectros de RX foram interpretados utilizando-se o programa AXIL e para as determinações quantitativas dos componentes avaliados (Ca, P e S), as intensidades das linhas características dos elementos foram usadas para correlações com as concentrações obtidas [Criss, 1968].

3.2. Microscópica Óptica (MO)

Após fixação, as amostras foram descalcificadas com solução de ácido etilenodiaminotetra acético sal dissódico (EDTA), ácido clorídrico (HCl), tartarato de sódio e de potássio e água destilada por um período e em seguida lavadas em água destilada corrente por 60 minutos para retirada do sal de Cálcio residual e excesso do realizadas secções longitudinais e mergulhadas em álcool 70%, desidratadas em gradientes de álcool 100% (v/v), diafanizadas com Xilol, embebidas em parafina e confeccionados blocos e cortes histológicos com 4mmm e corados com Hematoxilina e Eosina (HE). foram capturadas imagens para aumentos de 25, 200 e 400X utilizando-se o software Leica IM 50. Nesta análise, foram avaliados: tecido de granulação (TG), fibras colágenas (FC), matriz óssea mineralizada (MO), neotecido ósseo (TN), desabamento neotecido (DN) [Batista, 2011].

3.3. Estudo Morfométrico (EM) A análise quantitativa foi realizada baseada no método de estereologia o qual permite

determinar parâmetros tridimensionais de um órgão, tecido ou estrutura morfológica por meio da contagem de pontos em imagens bidimensionais [Lacerda, 1999].

A quantificação do tecido neoformado foi será realizada de acordo com o princípio de Delesse, conforme a fórmula VV = PP/PT (%), onde:

VV = densidade de volume ou volume relativoPP = quantidade de pontos sobre o osso neoformadoPT = número total de pontos do sistemaForam utilizadas seis amostras histológicas da área receptora de cada GE com 10 µm de

espessura. Os dados foram obtidos por meio de microscopia óptica de luz, em aumento de 10 vezes onde com auxílio de um retículo quadrilátero contendo sistema de 100 pontos foi calculada a densidade do tecido neoformado onde foi implantado o PVA em cada uma das amostras. Os valores obtidos da densidade de volume do osso neoformado na área do implante foram submetidos aos testes estatísticos Anova® e Tukey® para diferenciação significativa entre os grupos estudados.

4. RESULTADOS

4.1. Espectrometria de Fluorescência de Raios-X (EDXRF)

O gráfico da Fig.4 representa as médias dos valores dos componentes minerais Cálcio, Fósforo e Enxofre presentes nos dispositivos osteocondrais em relação ao G0 e dos GEs.

Figura 4. Valores médios do módulo de fluência (MPa) dos componentes minerais Cálcio, Fósforo e Enxofre presentes nos dispositivos osteocondrais do GC00 e dos GEs.

4.2. Microscopia Óptica (MO)

A Fig. 4 apresentam os resultados da MO dos GEs corados com HE para aumentos de 10, 200 e 400X. Observa-se ausência do PVA em todos os GEs. Tais resultados são justificados porque durante o processo de desidratação e, por estar solto no leito receptor e com ausência de qualquer tipo de tecido na sua superfície o mesmo foi “arrancado” em todas as amostras.

Figura 4 – Corte longitudinal de defeitos com o implante do PVA. (A) GE3 intensa presença de tecido de granulação (TG); (B) GE6 com intensa presença de fibras colágenas. (at) ausência de tecido na superfície PVA; (os) osso subcondral; C) GE12 com intensa presença de matriz óssea mineralizada (MO); (D) GE24 com intensa presença de tecido ósseo neoformado (TN). (at) ausência de tecido na superfície PVA; (os) osso subcondral; (*) defeito osteocondral onde se localizava o implante de PVA; (nt) neotecido formado. Coloração Hematoxilina e Eosina. Aumentos 25, 200 e 400X.

4.3. Estudo Morfométrico (EM)

De acordo com o EM, conforme Fig. 5, os valores do volume relativo da neoformação

óssea na área do implante para os grupos foram respectivamente: GE03 (14.25±3.62), GE06

(21.667±4.55), GE12 (24.83±2.28), GE24 (34.16±8.92).

Figura 5 - Análise Morfométrica demonstrando a densidade do osso jovem na área do implante em percentagem nos grupos estudados, sendo significativamente maior no GE24.

Porém se observou diferença significativa entre os grupos GE06 e GE12 para nível de

confiança de (p<0,05) realizados pela análise estatística de comparação múltipla Anova® e

Tukey® conforme dados apresentados na Fig.6.

Figura 6 – Analise estatística da significância entre os valores da densidade de osso neoformado na área do implante. Nota-se que somente não houve diferença estatística ao comparar os grupos GE06 com GE12. Análise Estatística Anova® e Tukey® p < (0,05).

5. DISCUSSÃO

A região intercondiliana foi escolhida para a fixação do hidrogel de PVA por ser submetida à constante solicitação mecânica, exercida por sua contra-superfície (patela) e também pela facilidade de acesso para a realização do procedimento cirúrgico.

Em nosso estudo, acreditamos que a manutenção da integridade superficial do PVA se deu devido à presença do líquido sinovial e ao fato de não ter havido interações do tipo adesivo ou abrasivo significativas entre as superfícies da patela e do PVA.

Podemos constatar que a reticulação do PVA via radiação ionizante promoveu a formação de estruturas fortes, porém complacentes com sítios capazes de absorver e reter o líquido sinovial diminuindo o atrito entre as superfícies articulares.

Os resultados de EDRX mostraram a incorporação dos minerais Cálcio e Fósforo em todos os GEs conforme aumento do tempo de seguimento, confirmando assim a diferenciação do tecido fibrocartilaginoso inicial em tecido ósseo ao final de 24 semanas.

Implantes mesmo os inertes, são envolvidos por cápsula de tecido fibroso e isso foi confirmado no presente estudo [Mow, 1984].

Formação e manutenção do neotecido em todos os GEs estudados, demonstrando o comportamento inerte do PVA avaliado [Batista, 2011].

Os resultados demonstraram crescimento progressivo do volume relativo tecido neoformado na área do implante conforme tempo de seguimentos em todos os GEs que demonstrou boa atividade do metabolismo na presença PVA utilizado caracterizando-o como biomaterial compatível e osteocondutor.

Dessa modo, o desempenho do PVA reticulado e irradiado apresentou desempenho satisfatório conforme resultados já descritos na literatura, mostrando que o mesmo é adequado para as terapias relacionadas ao reparo de defeitos osteocondrais.

O implante de PVA suportou a carga recebida, não sofreu ruptura ou desgaste e, além disso, ofereceu ambiente estável e adequado para a formação de neotecido ósseo na interface entre o implante e a cavidade receptora.

CONCLUSÃO

De maneira geral, o comportamento do hidrogel de PVA foi considerado satisfatório graças ao processo de lubrificação natural que foi mantido em todos os GEs.

Os resultados foram considerados satisfatórios e promissores para a aplicação desejada e novas análises deverão ser realizadas para confirmar os resultado obtidos até então.

AGRADECIMENTOS

CNPq - 574058/2008-7CNPq/FAPESP - 08/57860-3 e 573661/2008-1 - INCT em Biofabricação (BIOFABRIS) Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH), Universidade Federal do ABC, (UFABC), SP, Brasil.

REFERÊNCIAS

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POLYVINYL ALCOHOL HYDROGEL (PVA) TO REPAIR OSTEOCHONDRAL DEFECTS: HISTOLOGICAL EVALUATION, MORPHOMETRIC AND X-ray

FLUORESCENCE

Nilza A. Batista1,5, Ana A. Rodrigues1,5, Vanessa P. Bavaresco2,5, José Ricardo Lenzi Mariolani1,5, Marcelo R. Cunha 3, Arnaldo R. Santos Jr.4,5, William D. Belangero 1, 5

1 Orthopaedic Biomaterials Laboratory, School of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, (SP), Brazil .2Technical College Unicamp, Department of Plastic, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, (SP), Brazil .

3Department of Morphology and Pathology, Faculty of Medicine of Jundiaí, Jundiaí, (SP), Brazil .4 Center for Natural and Human Sciences (CCNH), Federal University from ABC, Santo André, (SP), Brazil.5 INCT em Biofabricação, State University of Campinas, Campinas, (SP), Brazil.

E-mail: arnaldo.santos@ufabc.edu.br

ABSTRACT. This study aimed at assessing performance of polyvinyl alcohol hydrogel (PVA) acetalized and irradiated by electron beams with 1 mm thickness and diameter of 2mm implanted into osteochondral defects made in the knees of rats divided four experimental groups (EGs) for times follow-up of 03, 06 12 and 24 weeks (EG03, EG06, EG12, EG24) compared with control group (GC00) in which the material was not deployed. The parameters utilized for analyzes were: Optical Microscopy (OM), Morphometry (MF) and X-ray Fluorescence (EDXRF). The results of the MO showed no foreign body reaction with formation, differentiation and the maintenance of neo tissue formed receiving cavity. The bulk density of neoformed tissue of EGs increases with the time tracking for all EGs analysis as MF. The result of the EDRFX there was increase the concentration Calcium and Phosphorus levels as time increased in all the following EGs compared to GC00. It was concluded that the PVA showed promise as osteochondral defect repair.

Keywords: Osteochondral defects, Polyvinyl alcohol hydrogel, Microscopic evaluation, Morphometric, X-ray fluorescence.