01プレゼン資料（広島県立総合技術研究所保健C 中廣） - JST...2×Reaction Mix 12.5μl Enzyme Mix 1μl dH2O 1.8μl RT-mate 2.5μl GI検出用プライマーMix

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遺伝子検査、蛍光目視で簡単判定

広島県立総合技術研究所

保健環境センター総務企画部

中廣賢太

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ノロウイルス

サポウイルス

蛍光色の違いで，複数遺伝子の同時検査を可能とする遺伝子検査技術を開発しました

ノロウイルス？

サポウイルス？

新技術


従来の遺伝子増幅法，検出法増幅方法

ＰＣＲ法ＬＡＭＰ法

検出方法ゲル電気泳動により増幅産物のサイズを確認

蛍光標識プローブによる発光を機器測定

増幅副産物（ピロリン酸Mg）による白濁を確認

メリット・最も普及した方法・電気泳動が不要

・定量が可能・等温で増幅可能・高額な装置が不要

デメリット・ゲル電気泳動が必要・高額な装置が必要

複数対象の同時検査

対象ごとに増幅産物のサイズを変える必要がある

対象ごとにプローブの蛍光色を変える必要がある

判定不可（１対象のみ）

＋＋＋＋－－

Realtime

＋＋－－


従来の遺伝子増幅法，検出法増幅方法












＋＋＋＋－－

Realtime

＋＋－－

5

①遺伝子増幅に必要なプライマーと呼ばれる短

いDNA配列を蛍光標識し，遺伝子増幅産物に

色を付ける（増幅対象ごとに異なる蛍光色で

標識）。

②遺伝子増幅後に未反応のプライマーの蛍光

を消光させ，増幅産物の蛍光のみが発光する

ようにする。

③反応液に紫外線を照射し，発光した蛍光色か

ら検出遺伝子の対象を判定する。

新技術のご紹介FF

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新技術の原理

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❶ 遺伝子ＡとＢの同時検査（反応液開始前）

❷ 遺伝子Ａが存在する場合

遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂに対するプライマーを加え，増幅反応を行う

遺伝子Ａのプライマーにより増幅反応が進む

蛍光物質を標識したプライマーが増幅産物の中に取り込まれる

遺伝子（ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）

蛍光ａに対する消光物質を標識

遺伝子Ａに対する蛍光標識プライマーと相補配列を有するオリゴヌクレオチド

蛍光ｂに対する消光物質を標識

遺伝子Ｂに対する蛍光標識プライマーと相補配列を有するオリゴヌクレオチド

遺伝子Ａに対するプライマー

遺伝子Ｂに対するプライマー

蛍光ｂを標識

蛍光ａを標識


❸ 消光物質標識オリゴヌクレオチドの添加

77

未反応のプライマーに消光物質を標識したオリゴヌクレオチドが結合し，蛍光を無効化

紫外線を照射すると増幅産物に取り込まれた遺伝子Ａに対する蛍光のみが発光

紫外線照射

新技術の原理

❹ 遺伝子Ａの検出


遺伝子（ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）

蛍光ａに対する消光物質を標識

遺伝子Ａに対する蛍光標識プライマーと相補配列を有するオリゴヌクレオチド

蛍光ｂに対する消光物質を標識

遺伝子Ｂに対する蛍光標識プライマーと相補配列を有するオリゴヌクレオチド

遺伝子Ａに対するプライマー

遺伝子Ｂに対するプライマー

蛍光ｂを標識

蛍光ａを標識


新技術の特徴・従来技術との比較

• 蛍光色により，どの遺伝子が検出されたか目視による判定が可能

→ 増幅遺伝子の分別が不要

→ 高額な装置が不要

• すべての遺伝子増幅法に応用可能

→ 複数の対象を同時に検査できなかった

遺伝子検査法で，複数同時検査が可能


新技術をＬＡＭＰ法へ応用増幅方法












＋＋＋＋－－

Realtime

＋＋－－

カプシド

ウイルス遺伝子ウイルス遺伝子を取り囲むタンパク質の殻

・大きさ 30-38nm （約3～4/100000 mm）

・表面を蛋白で覆れ，内部にRNAを遺伝子として持つ

・ヒトに感染するノロウイルスは主に２種類（GI と GII）

・ヒトの小腸上皮細胞でのみ増幅，急性胃腸炎，食中毒の原因

・症状は嘔吐，下痢，吐き気，腹痛


ＬＡＭＰ法への応用：ノロウイルスの遺伝子検査

LAMP法は

・１ステップの等温反応・増幅効率が高く，短時間で判定可能・ピロリン酸Mgによる白濁で容易に陽性確認

種々の微生物の迅速遺伝子検査法に利用


しかし，…

単一遺伝子を検出対象とするため，多重検出に不向き

検出対象ごとにLAMP反応を行う必要がある11

ＬＡＭＰ法への応用：ＬＡＭＰ法のメリット

ＡとＢのどちらが陽性かわからない


Ａ検出系（ノロウイルスGI）

Ｂ検出系（ノロウイルスGII）

Ａ検出系（ノロウイルスGI）

Ｂ検出系（ノロウイルスGII）

Ａが陽性

Ａ検出系

Ｂ検出系

Ａ＆Ｂ検出系 LAMP反応を行うと

白濁

白濁

Ａ検出系とＢ検出系のプライマーを混合

＋

２つの系の検出を区別できる工夫が必要

ＬＡＭＰ法への応用：ＬＡＭＰ法のデメリット

未反応のプライマーの蛍光を消光する消光物質標識オリゴヌクレオチドを増幅反応終了後に添加

ノロウイルスGI＆GII検出系

ノロウイルスGI検出系プライマーを緑

ノロウイルスGII検出系プライマーを赤

の蛍光色素で標識

RT-LAMP反応後

それぞれの観察される蛍光色から検出ウイルスを判定

ノロウイルス GI

ノロウイルス GII

ノロウイルス GI＆

ノロウイルス GII


ＬＡＭＰ法への応用：新技術を応用したＬＡＭＰ法

ウイルスRNA抽出

ノロウイルス患者便 10%乳剤

QIAampViral RNA Mini Kit(キアゲン)

抽出RNA

Duplex RT-LAMP

試薬2×Reaction Miｘ 12.5 μlEnzyme Mix 1 μlｄH2O 1.8 μlRT-mate 2.5 μlGI検出用プライマーMix 2.1 μlGII検出用プライマーMix 3.1 μl抽出RNA 2 μl

液量/サンプル

63℃90min

陽性反応を示した（白濁）検体

消光物質標識オリゴヌクレオチドの添加（各0.5 nmol）

G１LF_R;TGGRCAGGRGAYCGCRAKCT-BHQ1

G２LF_R;GAGRTTYTCWGAYYTSAGCAC-BHQ2

UV（312nm）照射


ＬＡＭＰ法への応用：検査手順

●供試検体

・遺伝子検査（RT-PCR）でノロウイルス陽性検体 70検体〔食中毒・感染症事例患者便 65検体，小児急性胃腸炎患者便 5検体〕

・遺伝子グループ別の内訳

ノロウイルスGIノロウイルスGIIノロウイルスGI＆GII

単独感染 17検体単独感染 41検体

重感染 12検体

●遺伝子型別の分類

・Kageyamaら（2004）および病原体検出情報（http://idsc.nih.go.jp/pathogen/refer/noro-kaisetu1.html）

●検体中のウイルス量

・TaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法にて定量（Kageyamaら，2003）


ＬＡＭＰ法への応用：供試検体について

RT-LAMP反応終了後

UV照射（消光前）

UV照射（消光後）

１２３４５６

１：陰性２：ノロウイルスGI３：ノロウイルスGII４：ノロウイルスGII５：ノロウイルスGI&GII６：ノロウイルスGI&GII


消光物質標識オリゴヌクレオチド添加

16

－＋＋＋＋＋

緑赤赤黄黄

ＬＡＭＰ法への応用：蛍光色によるウイルス判定

0

2

4

6

8

10

12

14

16

陽性

・陰

性検

体数

反応液中のウイルスゲノムコピー数

（コピー/μl）

陰性陽性

0

1

2

3

4

5

6

7

陽性

・陰

性検

体数

反応液中のウイルスゲノムコピー数

（コピー/μl）

陰性陽性

ノロウイルス GI ノロウイルス GII


ＬＡＭＰ法への応用：検体中のウイルス量と検出結果

● 新技術をLAMP法へ応用

・ノロウイルスの幅広い遺伝子型に対応可能（GI.1, 4, 6，GII.1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 21）

・推定検出限界値は103～104コピー/tube程度

→ 反応液の蛍光色（緑・赤）で２種類のウイルスを判別


ＬＡＭＰ法への応用：ノロウイルスの遺伝子検査まとめ

→ ノロウイルスのDuplex RT-LAMP法を確立

→ GI，GIIごとに必要であったLAMP反応を１度で


新技術をＰＣＲ法へ応用増幅方法












＋＋＋＋－－

Realtime

＋＋－－

電気泳動不要，４種類のウイルスを対象とした Multiplex RT-PCRに

消光物質標識オリゴヌクレオチド添加

４種のウイルス遺伝子の増幅プライマーを４色の蛍光で標識（ノロウイルスGI：緑，ノロウイルスGII：赤，サポウイルス：黄，アストロウイルス：青）

1 2 3 4 5

１：ノロウイルスGI２：ノロウイルスGII３：サポウイルス４：アストロウイルス５：陰性

ＰＣＲ実施


1 2 3 4 5

緑赤黄青

新技術をＰＣＲ法へ応用

◆対象施設

• 民間または病院の検査センター，地方衛生研究所，保健所等

◆用途

• 感染症に係る病原体の遺伝子検査（ノロウイルス，インフルエンザウイルス，レジオネラ，マイコプラズマ等）

• 既存の販売検査キットに対し，比較的容易に応用が可能

想定される用途

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• 遺伝子増幅後に消光物質標識オリゴヌクレオチドを添加する際，反応液の蓋をあける必要がある。

→ 反応液が流出すると，次の検査の汚染要因

になりかねない

実用化に向けた課題


• 新技術を用いた新たな遺伝子診断薬の開発を希望

• 販売中の検査キットへの活用を希望

企業への期待


本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：標的核酸の検出方法

• 出願番号：特願2011-134800• 特許番号：特許第5863162号

• 出願人：広島県

• 発明者：福田伸治，桑山勝，

重本直樹，谷澤由枝，

山田裕子，松尾健


お問い合わせ先

○ 最初の相談について

広島県立総合技術研究所保健環境センター総務企画部

ＴＥＬ０８２－２５５－７１３１

ＦＡＸ０８２－２５２－８６４２

e-mail hkcsoumu＠pref.hiroshima.lg.jp

○ 契約に関することについて

広島県立総合技術研究所企画部

ＴＥＬ０８２－２２３－１２００

ＦＡＸ０８２－２２３－１４２１

e-mail sgkkikaku＠pref.hiroshima.lg.jp

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