МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

Кафедра микробиологии

На правах рукописи

Кошкарова Лилия Андреевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ВОДОРОДА С ПОМОЩЬЮ

БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ГИДРОГЕНАЗЫ THIOCAPSA ROSEOPERSICINA BBS

03.02.03 - микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н., проф. Нетрусов Александр Иванович

Москва, 2016

2

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ…………………………….............…………5

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………………6

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………….………………………………………………10

1.1. Гидрогеназы: строение, свойства, функции..………………...…………………………..10

1.1.1. Роль гидрогеназ in vivo.…….............................................................................................11

1.1.2. Классификация гидрогеназ на основе строения активного центра…………………..19

1.1.2.1. [Fe]-гидрогеназы……….…...……………………………………………………...…..19

1.1.2.2. [FeFe]- гидрогеназы…………………………………………………….……………...20

1.1.2.3. [NiFe]- гидрогеназы……………………………………………………………………22

1.1.2.3.1. Строение [NiFe]- гидрогеназ.……………………………………………………….23

1.1.2.3.2. Активный центр. Каталитический цикл……………………………………………27

1.1.2.3.3. Инактивация гидрогеназ…………………………………………………………….29

1.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS……………………………………...…...….32

1.2.1. Общая характеристика Thiocapsa roseopersicina BBS…………………..………….…32

1.2.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS…………….……………………………...34

1.2.2.1. HupSL-гидрогеназа………………………………………………………….…..……..35

1.2.2.2. HupUV-гидрогеназа……………………………..…………………………….…….....36

1.2.2.3. Hox 1-гидрогеназа………………..…………………………..……………….…..……37

1.2.2.4. Hox 2-гидрогеназа………………..………………………………………………….…38

1.2.2.5. HynSL-гидрогеназа……………….……………………………………………………39

1.2.3. Созревание гидрогеназ в Thiocapsa roseopersicina………………………………….…41

1.3. Биосенсоры…………………………………………………………………………………42

1.3.1 Общие принципы строения………………………………………………………………42

1.3.2. Преобразователи сигнала……………………………………………………………..…43

1.3.3. Чувствительные (распознающие) элементы………………………………………...…45

1.3.4. Ферментные электрохимические сенсоры……………………………………………..48

1.3.4.1. Прямой и медиаторный биоэлектрокатализ…………………………………………49

1.3.4.2. Методы иммобилизации ферментов…………………………………………….……51

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………………………...57

2.1. Культуры микроорганизмов.………………………………………………………...……57

2.1. Культивирование микроорганизмов.……………………………………………………..57

2.3. Получение биомассы.…………………………………………………………………...…58

2.4. Газовая хроматография.……………………………………………………………...……58

2.5. Определение видовой принадлежности микроорганизмов.…………………………….59

3

2.6. Методы долговременного хранения T. roseopersicina.………………………………….60

2.6.1. Лиофилизация.………………………………………………………………………...…60

2.6.2. Тест на ускоренное хранение.…………………………………………………..………61

2.6.3. Хранение при низких температурах (-80ºС).………………………………………..…62

2.7. Выделение и очистка гидрогеназы.……………………………………………………....63

2.8. Измерение гидрогеназной активности.…………………………………………………..65

2.9. Изготовление ферментных электродов………………………….…………………….…65

2.10. Электрохимические измерения………………………………………….…………...….66

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………………………….……68

3.1. Определение видовой пренадлежности.………………………………………………….68

3.2. Культивирование штамма-продуцента.…………………………………………………..68

3.3. Долговременное хранение T. roseopersicina BBS.…………………………….…………70

3.3.1. Хранение T. roseopersicina при низких температурах (-80ºС).………………….……71

3.3.2. Лиофильное высушивание T. roseopersicina.………………………………………..…73

3.3.2.1. Прогнозирование сроков хранения культуры.…………………………………….…75

3.3.2.2. Оценка гидрогеназной активности клеток после хранения культуры в

лиофилизированном виде. ………………………………………………………………….…80

3.4. Выделение и очистка гидрогеназы из T. roseopersicina BBS.………………………..…80

3.5. Оценка электрохимических характеристик ферментного электрода на основе

гидрогеназы T.roseopersicina BBS…………………………………………………………….88

3.5.1. Метод электрохимических измерений…………………………………………………88

3.5.2. Кинетические характеристики катализа иммобилизованной на электрод

гидрогеназой…………………………………………………………………………………….90

3.5.3. Биоэлектрокатализ гидрогеназами в присутствии промотора – нейтрального

красного…………………………………………………………………………………….…...93

3.5.4. Электрохимическе характеристики электрода с иммобилизованной гидрогеназой,

полученной по модифицированной схеме очистки……………………………………..……94

3.5.5. Исследование зависимости электрохимических характеристик ферментных

электродов от парциального давления водорода……………………………………….…….95

3.5.6. Влияние метана и двуокиси углерода на электрохимическую активность

гидрогеназных электродов……………………………………….…………………………...100

3.5.7. Измерение водорода непосредственно в среде культивирования

микроорганизмов……………………………………………………………………………...105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………………………..109

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………….………..113

4

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………….114

БЛАГОДАРНОСТИ…………………………………………………………………………...135

Приложение……………………………………………………………………………………136

5

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВЭ вспомогательный электрод

ДМСО диметилсульфоксид

КОЕ колониеобразующая единица

МАЛДИ матрично-ассоциированная лазерная десорбциея/ионизация

ОЦП потенциал открытой цепи

РЭ рабочий или индикаторный электрод

СОМ сухое обезжиренное молоко

Фд ферредоксин

ЭС электрода сравнения

6

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время все более широкое распространение получают сенсоры, в

качестве распознающего элемента которых выступает биологический объект. Их действие

основано на важнейших химических реакциях живых организмов: антитело/антиген,

фермент/субстрат, рецептор/гормон. Поскольку данные реакции крайне специфичны,

указанные сенсоры крайне чувствительны и селективны. Чаще всего в качестве

чувствительных элементов сенсоров используют ферменты. Для сенсоров на основе

ферментов могут быть использованы преобразователи различных типов (Evtugyn, 2014),

но в большей части выпускаемых в промышленности биосенсоров в настоящее время

используют электрохимические преобразователи, что обусловлено их невысокой

стоимостью, простотой изготовления и использования (Эггинс, 2005).

Возможность применения фермента в качестве чувствительного элемента

биосенсора определяют его доступность (простота и дешевизна выделения и очистки),

стабильность при хранении и иммобилизации, наличие удобных для аппаратурного

оформления способов регистрации сигнала, достигаемые аналитические характеристики

определения субстрата либо эффектора. Поэтому для создания сенсора необходима

комплексная работа по оптимизации всех указанных этапов.

В качестве чувствительного элемента для детекции водорода может быть

использован фермент гидрогеназа, который in vivo отвечает за образование/поглощение

водорода клетками. Хотя гидрогеназы катализируют довольно простую реакцию, но она

используется в различных метаболических путях у широкого спектра микроорганизмов

(Кондратьева, Гоготов, 1981). Они выполняют функцию регуляторов окислительно-

восстановительного потенциала содержимого клетки, а также функцию получения

энергии за счёт окисления водорода (Hoehler et al., 2002).

Гидрогеназа, выделенная из пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina

BBS, в последние годы привлекает к себе внимание биотехнологов в связи со своей

стабильностью. Данный фермент с широким температурным диапазоном вплоть до 80ºС

(Gogotov et al., 1978) способен к катализу в присутствии О2 (Morozov et al., 2006), в

сравнении с платиной более устойчив к действию таких каталитических ядов, как

сероводород и угарный газ (Зорин и др., 1986), хорошо иммобилизуется. Исходя из

вышеуказанных характеристик, данный фермент перспективен для использования в

качестве чувствительного элемента биосенсора.

7

Актуальность работы.

В последние десятилетия все больше возрастает интерес к гидрогеназам,

наблюдается значительный прогресс в изучении данной группы ферментов. Понимание

строения, функционирования и роли их в клетки помимо фундаментального значения

имеет и практическую значимость. Поскольку данные ферменты принимают активное

участие в процессе анаэробной коррозии, то их изучение будет способствовать борьбе с

этим процессом/предотвращению этого процесса. Также открываются все новые

возможности практического применения гидрогеназ, в числе которых можно выделить

следующие: образование водорода в фотокаталитических системах, получение энергии в

топливных элементах за счет использования гидрогеназных электродов, очистка сточных

вод, зараженных тяжелыми металлами, регенерации кофакторов, биосинтез химических

веществ, меченных дейтерием или тритием.

Также гидрогеназы могут выступать в качестве чувствительного элемента в

биосенсоре на водород. Таким образом, электроды на основе платины, ресурсы которой

ограничены, могут быть заменены на ферментные, получаемые на основе возобновляемых

ресурсов. Современные технологии изготовления электрохимических сенсоров, в

частности трафаретная печать, дают возможность миниатюризировать сенсорные

структуры, а также менять форму и материал основы, варьируя их в зависимости от

потребностей заказчика.

Цель работы состояла в создании научных основ технологии получения

электрохимических биосенсоров на основе гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina BBS.

Задачи

1. Разработать и оптимизировать условия культивирования штамма-продуцента

Thiocapsa roseopersicina BBS.

2. Подобрать методы и условия для долговременного хранения

T. roseopersicina BBS.

3. Оценить выживаемость T. roseopersicina BBS в лиофилизированной форме с

применением кинетического аппарата (тест на ускоренное хранение).

4. Выделить чистый препарат Hyn SL гидрогеназы из T. roseopersicina BBS для

дальнейшего использования в качестве сенсорного элемента на водород.

5. Создать с использованием выделенного фермента комбинированную сенсорную

систему.

6. Исследовать возможность прямого анализа H2 в среде культивирования с

применением разработанного электрохимического биосенсора.

8

Научная новизна.

Оптимизированная схема лиофильного высушивания позволила получить

сублимированный препарат с высокой выживаемостью пурпурной серной бактерии

Thiocapsa roseopersicina BBS, при том, что лиофилизация считается непригодной для

хранения данной группы микроорганизмов. Показано соответствие кинетической модели

выживаемости микроорганизмов экспериментальным данным, что позволило

прогнозировать сроки хранения лиофилизированной культуры. Предложена

модифицированная схема очистки гидрогеназы T. roseopersicina BBS, исключающая

использование на последней стадии препаративного электрофореза, что дает возможность

масштабировать выделение фермента с помощью ВЭЖХ с использованием показанными

носителями. Показана принципиальная возможность использования гидрогеназного

электрода на основе Hyn SL гидрогеназы T. roseopersicina BBS в качестве сенсора на

водород. Разработана технология измерения Н2 в двух режимах - потенциометрическом и

амперометрическом. Установлено отсутствие влияния двуокиси углерода и метана на

работу сенсора. Разработаны технологические операции для анализа водорода

непосредственно в среде культивирования микроорганизмов.

Практическая значимость работы.

Разработанные технологические операции культивирования Thiocapsa

roseopersicina BBS и выделения гидрогеназы из данного микроорганизма позволяют

снизить стоимость получения фермента. Оптимизированная методика лифильного

высушивания может быть использована для длительного хранения родственных групп

микроорганизмов, поскольку является более экономичной в сравнении с рекомендуемой

для пурпурных серных бактерий криоконсервацией. Разработанные научные основы

технологии производства водородных биосенсоров в дальнейшем могут быть

использованы для производства сенсоров, используемых различных сферах деятельности

человека, таких как медицина (детекция концентрации водорода в выдыхаемом воздухе,

как показатель состояния желудочно-кишечного тракта), биотехнология (детекция

образования биоводорода, контроль состояния сообщества метантенков), научные

исследования, промышленная безопасность (контроль довзрывоопасных концентраций

водорода в рабочих помещениях) и т.п.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на VIII всероссийской научной молодежной

школы с международным участием «Возобновляемые источники энергии» (Москва, 2012),

на Международном форуме Reenfor-2013 «Возобновляемая энергетика. Пути повышения

9

энергетической и экономической эффективности» (Москва, 2013), на XXVII зимней

молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и

биотехнологии» (Москва, 2015), на XXII и XXIII международной конференции студентов,

аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2015, 2016), на 7-й международной

конференции «Photosynthesis Research for Sustainability» (Пущино, 2016).

10

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гидрогеназы: строение, свойства, функции.

Гидрогеназы – это ферменты, способные к активации молекулярного водорода и

его окислению, либо, наоборот, восстановлению протонов до водорода. Сам термин

гидрогеназа был предложен Стеферсоном и Стиклендом в 1931 году для фермента,

обуславливающего способность клеток Escherichia coli поглощать H2 (Кондратьева,

Гоготов, 1981). В настоящее время ферменты такого типа найдены во всех трех доменах

жизни. Гидрогеназы различных организмов могут отличаться по молекулярному весу,

акцептору/донору электронов, строению, локализации в клетке. Многие микроорганизмы

содержат несколько гидрогеназ, отличающихся по свойствам и выполняемым функциям

(Vignais, Billoud, 2007; Lubitz et al., 2014). Все ныне известные гидрогеназы относятся к

трем классам, выделяемым на основании строения активного центра: [Fe]-гидрогеназы

(ранее упоминались в литературе как «неметаллические»), [FeFe]-гидрогеназы

(железосодержащие гидрогеназы) и [NiFe]-гидрогеназы (железоникелевые гидрогеназы)

(Vignais, 2008; Peters et al., 2015).

1.1.1. Роль гидрогеназ in vivo.

Хотя гидрогеназы катализируют довольно простую реакцию, но она используется в

различных метаболических путях у широкого спектра микроорганизмов (Кондратьева,

Гоготов, 1981). Одной из эволюционно значимых функций гидрогеназ было обеспечение

жизнедеятельности организмов в древней атмосфере, насыщенной водородом (Hoehler et

al., 2001). В настоящее время гидрогеназы выполняют функцию регуляторов

окислительно-восстановительного потенциала содержимого клетки, а также функцию

получения энергии за счёт окисления водорода (Hoehler et al., 2002). Так гидрогеназы

через выделение H2 могут осуществлять сброс избытка восстановительных эквивалентов,

которые были получены в процессах брожения и фотосинтеза. Различные группы

микроорганизмов могут использовать водород в качестве источника энергии, как в

аэробных (водородные бактерии), так и анаэробных условиях (метаногены,

сульфатредукторы, фототрофы, Vignais et al., 2001). Окисление водорода гидрогеназами

может использоваться клеткой для получения восстановительных эквивалентов для

биосинтеза различных соединений. Водород может служить донором электронов для

фотосинтеза, аэробного и анаэробного дыхания (Robson, 2001). Ряд гидрогеназ также

поглощают водород, образуемый нитрогеназой в процессе азотфиксации, тем самым

возвращая клетке часть затраченной энергии (Vignais et al., 1985).

Гидрогеназы, выполняющие разные функции, располагаются в различных частях

клетки, они могут быть цитоплазмотические, мембраносвязанные, могут быть

11

локализованы в периплазме, у эукариотических клеток могут находиться в органеллах

(Vincent et al., 2007). Многие микроорганизмы имеют несколько различных гидрогеназ,

причем они могут относиться к разным группам по строению, локализоваться в разных

частях клетки (Kim, Kim, 2011). У представителей различных таксономических групп

могут встречаться гидрогеназы со сходеым строением, локализацией в клетке и функциям.

Распространенность двух основных типов гидрогеназ в различных филумах бактерий и

архей отображена в таблице 1. Гидрогеназы могут быть конститутивными либо

индуцибельными. Клетка может содержать гены различных по функциям гидрогеназ и

активировать синтез фермента, необходимого в данных условиях (Vignais, 2005).

Классификация гидрогеназ на основании выполняемой ими функции в клетке, их

строения, филогенетического положения приведина согласно (Kim, Kim, 2011):

I. [NiFe]-гидрогеназы

1. Группа 1. Поглощающие мембраносвязанные [Ni-Fe]-гидрогеназы → Получение

энергии (бактерии, археи).

2. Группа 2.

3. Регуляторные H2-сенсорные гидрогеназы → детекции водорода в окружающей

среде и запуск каскадов клеточных реакций, контролирующих синтез других

гидрогеназ клетки (бактерии).

a. Цианобактериальные поглощающие гидрогеназы → Получение энергии

(цианобактерии).

4. Группа 3.

a. F420-восстанавлиающие гидрогеназы → Получение энергии (метаногены)

b.НАД-восстанавливающие гидрогеназы → Получение энергии,

ферментация (бактерии, метаногены)

c. F420-невосстанавлиающие гидрогеназы → Получение энергии

(метаногены)

d.Гидрогеназы, осуществляющие восстановление и окисление

НАДН/НАДФН → Получение энергии, редокс-контороль (бактерии,

цианобактерии)

5. Группа 4. Н2-выделяющие мультисубъедииничные мембраносвязанные

гидрогеназы → Брожение (бактерии, археи).

II. [FeFe]-гидрогеназы → Брожение, получение энергии (бактерии, эукариоты).

III. [Fe]-гидрогеназы → Брожение (археи).

12

Таблица 1. Таксономическое распределение гомологов [NiFe]- и [FeFe]-гидрогеназ

в 2862 сиквенсах геномов организмов, принадлежащих к доменам Bacteria и Arhaea

(Peters et al., 2015).

Домен Филум Общее количество

геномов

Количество геномов с гомологами

[FeFe]-гидрогеназ [NiFe]- гидрогеназ

Archaea Crenarchaeota 50 0 22

Euryarchaeota 110 0 70

Korarchaeota 1 0 1

Nanoarchaeota 1 0 0

Thaumarchaeota 5 0 0

Bacteria Acidobacteria 7 0 4

Actinobacteria 301 8 72

Aquificae 14 0 13

Armatimonadetes 2 0 0

Bacteroidetes 94 9 12

Caldiserica 1 0 0

Chlamydia 109 0 0

Chlorobi 11 0 10

Chloroflexi 24 11 20

Chrysiogenetes 1 0 1

Cyanobacteria 79 0 43

Deferribacteres 4 0 4

Deinococcus-Thermus 21 0 1

Dictyoglomi 2 2 2

Elusimicrobia 1 0 1

Fibrobacteres 2 0 0

Firmicutes 622 160 86

Fusobacteria 11 2 0

Gemmatimonadetes 1 0 1

Ignavibacteriae 2 2 0

Nitrospirae 4 1 2

Planctomycetes 8 0 1

Proteobacteria 1240 28 497

Spirochaetes 65 20 0

Synergistetes 5 2 3

Tenericutes 89 0 0

13

Thermodesulfobacteria 2 1 2

Thermotogae 18 18 1

Verrucomicrobia 5 1 2

1.1.1.1. [Ni-Fe]-гидрогеназы.

Самый многочисленный и хорошо изученный класс гидрогеназ. Они были

обнаружены у организмов, относящихся к доменам Bacteria и Archaea (рис. 1). Считается,

что [Ni-Fe]-гидрогеназы более устойчивы к ингибирующему действию угарного газа и

кислорода, чем [Fe-Fe]-гидрогеназы. По строению, функциям в клетке и

филогенетическому положению выделяют 4 группы [Ni-Fe]- гидрогеназ. В настоящее

время некоторые исследователи предлагают выделить пятую группу (Constant et al., 2011;

Peters et al., 2015)

Рис. 1. Распределение [NiFe]-гидрогеназ на “универсальном” таксономическим

дереве жизни. Группы, содержащие хотя бы один гомолог [NiFe]-гидрогеназ, отмечены

красным. LUCA (last universal common ancestor) - последний универсальный общий

предок (Peters et al., 2015).

1 группа. Поглощающие мембраносвязанные [Ni-Fe]-гидрогеназы.

Ферменты этой группы позволяют микроорганизмам использовать молекулярный

водород в качестве источника энергии. Окисление водорода мебраносвязанной

гидрогеназой в таком случае связано с дыхательной цепью микроорганизмов, конечным

акцептором электронов в которой могут выступать кислород, в случае аэробного дыхания,

и в случае анаэробного - нитраты, сульфаты, фумарат, углекислый газ (Kim, Kim, 2011).

Гидрогеназы этой группы были преимущественно обнаружены у представителей филума

Proteobacteria.

Часть гидрогеназ данной группы связаны с пулом хинонов дыхательной цепи через

цитохром b. С помощью цитохрома и гидрофобного участка С-конца малой субъединицы

14

фермент заякорен в мембране. Подобные ферменты были выделены у таких

микроорганизмов как Wolinella succinogenes, Aquifex aeolicus, Hydrogenobacter

thermophilus (Peters et al., 2015). У гипертермофила Aquifex aeolicus было обнаружено три

гидрогеназы, две из которых относятся к первой группе и связаны с мембраной через

цитохром b. При этом одна из них участвует в окислении водорода через серное дыхание,

другая связана с дыхательной цепью, в которой кислород выступает в качестве конечного

акцептора электронов (Guiral et al., 2009). Также гидрогеназа, связанная с цитохромом b,

была найдена у метаногенной археи Methanosarcina mazei. С цитохрома электроны,

полученные при окислении Н2, передаются через переносчик, сходный с хинонами у

бактерий, на гетеросульфидредуктазу (Ide et al., 1999).

Другая часть ферментов первой группы связана с цепью переноса электронов через

низкопотенциальный цитохром c. Такие гидрогеназы были обнаружены у представителей

пурпурных серных и сульфатредуцирующих бактерий (Vignais, Billoud, 2007).

Гидрогеназы этой группы также характеризуются наличием сигнального пептида

(30-50 аминокислотных оснований) на N-конце малой субъединицы. Сигнальный пептид

содержит специальный мотив, который узнается Tat-системой транслокации белков (twin-

arginine translocation, Vignais, Colbea, 2004). Tat-система отвечает за транслокацию

полностью синтезированного и свернутого белка, при этом затрачивается энергия в виде

трансмембранного потенциала (Lee et al., 2006). Гидрогеназы первой группы полностью

сворачиваются и собираются в цитоплазме и затем транслоцируются через мембрану

(Vignais, Billoud, 2007).

2 группа. Цитоплазматические цианобактериальные поглощающие и водород-

сенсорные гидрогеназы.

Эта группа гидрогеназ отличается от первой двумя основными характеристиками

(Vignais, Billoud, 2007):

1. Отсутствием сигнального пептида на N–конце малой субъединицы, поскольку

ферменты цитоплазматические.

2. Наличием значительного количества идентичных делеций в аминокислотной

последовательности малых субъединиц в сравнении с последовательностями малых

субъединиц первой группы.

2ɑ. Цианобактериальные поглощающие гидрогеназы.

Подгруппа 2ɑ включает в себя гидрогеназы цианобактерий, способных к фиксации

молекулярного азота при помощи мультифермента нитрогеназы (Kim, Kim, 2011).

Фиксация азота очень энегозатратный процесс - на восстановление одной молекулы азота

требуется не менее 16 молекул АТФ, но в каждом каталитическом цикле часть энергии

15

тратится на восстановление протонов. На одну восстановленную молекулу N2 приходится

не менее одной молекулы водорода (Bothe et al 2010). Таким образом, при помощи

поглощающих гидрогеназ клетка возвращает энергию, затраченную на образование

водорода при фиксации азота. Также электроны, полученные при окислении водорода

гидрогеназой, могут пойти на восстановление молекулярного кислорода, поскольку он

оказывает ингибирущее действие на активность нитрогеназы (Peters et al., 2015).

2b. Регуляторные H2-сенсорные гидрогеназы.

Ферменты подгруппы 2b представляют собой регуляторные гидрогненазы. Они

предназначены для детекции водорода в окружающей среде и запуска каскадов клеточных

реакций, контролирующих синтез других гидрогеназ клетки (Kim, Kim, 2011). Так для

представителя класса Betaproteobacteria почвенной бактерии Ralstonia eutropha было

показано наличие трех гидрогеназ. В клетках данного микроорганизма регуляротная

гидрогеназа HoxBC регулирует экспрессию мембраносвязанной (HoxKGZ) и

цитоплазматической НАД-зависимой гидрогеназы (HoxFUYH, Lenz et al., 2002).

Ферменты этой продгруппы, в отличие от большинства гидрогеназ, не

чувствительны к кислороду. Причиной, предположительно, является тот факт, что

газовый канал, ведущий к активному центру фермента, слишком узкий для прохождения

молекулы кислорода, поскольку в образовании канала гидрогеназ данной группы

используются другие, более «объемные», аминокислоты, нежели при формировании

газовых каналов у других гидрогеназ (Vignais, Billoud, 2007).

3 группа. Цитоплазматические мультисубъединичные [NiFe]-гидрогеназы.

В данную группу входят мультисубъединичные ферменты, причем две

субъединицы составляют основной модуль фермента, а остальные субъединицы отвечают

за связывание с растворимыми кофакторами, такими как НАДН, НАДФН, кофактор

метаногенеза F420 (Kim, Kim, 2011).

3ɑ. F420-восстанавлиающие гидрогеназы.

Ферменты этой подгруппы найдены только у представителей метаногенных архей.

Функцией таких гидрогеназ является восстановление кофактора F420 за счет окисления

водорода. Таким образом, они обеспечивают восстановителями несколько этапов в

процессе восстановления углекислого газа до метана (Vignais, Billoud, 2007). Эти

ферменты состоят из большой и малой субъединицы, а также ФАД-содержащей

субъединицы для переноса электрона на кофактор F420 (Alex et al., 1990).

16

3b. НАД-восстанавливающие гидрогеназы.

Ферменты этой подгруппы принадлежат преимущественно термофильным археям.

Они состоят из 4 субъединиц, 2 из которых составляют основной модуль фермента, а 2

другие включают FeS кластер и НАД(Ф)/ФАД-связывающий домен. В настоящее время

хорошо изучена гидрогеназа из Pyrococcus furiosus. Она представляет собой

поглощающую гидрогеназу, которая восстанавливает НАДФ+, используемый в

биосинтезе. В тоже время с помощью мутагенеза показано, что данная гидрогеназа не

требуется для роста или снабжения НАДН каких-то метаболических процессов при

выращивании микроорганизма в стандартных лабораторных условиях (Schut et al., 2012;

Peters et al., 2015).

3c. Гидрогеназы, не восстанавливающие F420.

Обнаружены у архей, преимущественно метаногенных, представляют собой

тримеры и способны к восстановлению метилвиологена. Ферменты данной подгруппы

образуют комплекс с гетеродисульфидредуктазой, который восстанавливает

гетеродисульфид CoM-S-S-CoB одновременно с Фд, используя водород в качестве донора

электронов. При этом в отсутствии Фд отмечена лишь невысокая активность (Kaster et al.,

2011). Предполагают, что, совмещая эндотермическую реакцию восстановления

ферредоксина с экзотермической реакцией восстановления гетеродисульфида и используя

водород как донор электронов, при помощи комплекса ферментов метаногены запасают

энергию (Peters et al., 2015).

3d. Гидрогеназы, осуществляющие восстановление и окисление

НАДН/НАДФН.

Эта подгруппа включает в себя мультисубъединичные гидрогеназы с

дополнительным НАДН-оксидоредуктазным модулем. Гидрогеназы такого типа были

обнаружены в аэробных H2-использующих микроорганизмах, таких как Ralstonia

eutropha. У данных микроорганизмов они окисляют водород с восстановлением НАД+,

который идет либо в аэробную дыхательную цепь либо используется в биосинтезе (Peters

et al., 2015). Также гидрогеназы 3d подгруппы были обнаружены у многих представителей

цианобактерий, где они выполняют функцию сброса избытка восстановительных

эквивалентов, полученных при ферментации и фотосинтезе (Tamagnini et al., 2007).

4 группа. Н2-выделяющие мультисубъедииничные мембраносвязанные

гидрогеназы.

Мембраносвязанные мультисубъединичные ферменты (6 субъединиц или более).

Гидрогеназы этой группы используются клеткой для того, чтобы избавиться от избытка

восстановительных эквивалентов, полученных в процессах анаэробного окисления

17

одноуглеродных соединений (СО, формиат, ацетат), путем выделения Н2. Большинство

ферментов этой группы взаимодействуют с ферредоксином (Vignais, 2008).

К ферментам четвертой группы относится гидрогеназы энтеробактерий

(гидрогеназа-3 E. coli), участвующие в разложении формиата до водорода и СО2 (Vignais,

Colbeau, 2004). Также к этой группе относится CO-индуцируемая гидрогеназа пурпурной

фотобактиерии Rhodospirillum rubrum. Она совместно с СО-дегидрогеназой окисляет СО

до СО2, образуя при этом водород, что позволяет R. rubrum расти в темноте, используя СО

в качестве единственного источника энергии. Гидрогеназы 4 группы также были найдены

у представителей домена архей, в частности у видов Methanosarcina barkeri,

Methanothermobacter marburgensis, Pyrococcus furiosus (Hedderich , 2004; Kim, Kim, 2011).

5 группа.

Некоторое время назад на основании биохимических характеристик, анализа

сиквенсов геномов, филогенетического реконструирования было предложено выделить

гидрогеназы представителей рода Streptomyces, способные к окислению водорода в очень

низких концентрациях (˂1 ppm), в отдельную 5 группу [NiFe]-гидрогеназ. В дальнейшем

было показано, что гидрогеназы такого типа распространены у почвенных бактерий.

Гидрогеназы пятой группы схожи с ферментами первой, они также состоят из двух

субъединиц, в тоже время они не связаны с цитохромами, а их активность не подавляется

кислородом (Constant, 2011; Peters et al., 2015).

1.1.1.2. [FeFe]-гидрогеназы.

Гидрогеназы этого типа были найдены у многих анаэробных прокариот, способных

к выделению водорода, таких как клостридии и сульфатредукторы. Это единственный тип

гидрогеназ, который был найден у некоторых представителей эукариот, они были

обнаружены у анаэробных грибов, трихомонад, зеленых водорослей (рис. 2., Meyer, 2007).

У представителей эукариот гидрогеназы расположены в органеллах эндосимбиотического

происхождения (хлоропласты, гидрогеносомы). В отличие от [NiFe]-гидрогеназ,

большинство из которых отвечает за поглощение водорода, [FeFe]-гидрогеназы обычно

вовлечены в процесс выделения H2 (Vignais, Billoud, 2007).

18

Рис. 2. Распределение [FeFe]-гидрогеназ на “универсальном” таксономическим

дереве жизни. Группы, содержащие хотя бы один гомолог [FeFe]-гидрогеназ отмечены

красным. LUCA (last universal common ancestor) - последний универсальный общий

предок (Peters et al., 2015).

Большинство ферментов этой группы ферредоксинзависимые и служат для сброса

восстановительных эквивалентов, накопленных клеткой в процессе брожения. Так у

представителей рода Clostridium пируват окисляется до ацетил-КоА при помощи

пуруват:ферредоксин-оксидоредуктазы. При этом образуется восстановленный

ферредоксин (Nath, Das, 2004):

Пируват +КоА+ Фд(ок)→ Ацетил- КоА+ Фд(вос)+СО2

Для нормального протекания реакции необходимо регенерировать окисленный

ферредоксин. При помощи гидрогеназы с восстановленного ферредоксина электроны

передаются на протоны с образованием Н2 (Hallenbeck, Benemann, 2002).

Другим примером ферментов этой группы могут служить гидрогеназы зеленых

водорослей. Виды, синтезирующие [FeFe]-гидрогеназы, например Chlamydomonas

reinhardtii, способны к светозависимому выделению водорода после предварительной

темновой адаптации. Выделение водорода необходимо водорослям для сброса избытка

восстановителей при переходе от анаэробных темновых условий к световым (Цыганков,

2006). Хотя большинство [FeFe]-гидрогеназ относится к выделяющим H2, у D. vulgaris

была обнаружена поглощающая переплазматическая гидрогеназа этого типа.

Предположительно, она выполняет функцию защиты от окислительного стресса (Pohorelic

et al., 2002; Fournier et al., 2004).

1.1.1.3. [Fe]-гидрогеназы.

Гидрогеназы этой группы обнаружены только у представителей домена архей,

способных к метаногенезу. Они участвуют в реакциях восстановления углекислого газа до

метана (Kim, Kim, 2011), а именно восстановлении метенилтетрагидрометаноптерина в

19

метилентетрагидрометаноптерин с использованием Н2 (реакция 1). Но синтез гидрогеназ

такого типа осуществляется только в условиях недостатка никеля в среде, когда синтез

[NiFe]-гидрогеназ не происходит (Thauer, 1998). Поскольку в нормальных условиях

превращение метенилтетрагидрометаноптерина в метилентетрагидрометаноптерин идет

через 2 фермента: F420-восстанавливающей гидрогеназы и F420-зависимой

метилентетрагидрометаноптерин дегидрогеназы, осуществляющие реакции 2 и 3

соответственно (Shima, Thauer, 2007). Hmd гидрогеназа Methanothermobacter marburgensis

является самым изученным ферментом этой группы (Vignais, Billoud, 2007).

Метенил-H4-МП + Н2 ↔ Метилен- H4-МП + Н+

(1)

F420 + Н2 ↔ F420Н2 (2)

Метенил-H4-МП + F420Н2 ↔ Метилен- H4-МП + Н+

+ F420 (3)

1.1.2. Классификация гидрогеназ на основе строения активного центра.

На основании строения активного центра гидрогеназы разделяют на три группы:

[Fe]-гидрогеназы (ранее упоминались в литературе как «неметаллические»), [FeFe]-

гидрогеназы (железосодержащие гидрогеназы) и [NiFe]-гидрогеназы (железоникелевые

гидрогеназы) (Vignais, 2008; Peters et al., 2015). Это деление лежит в основе всех

классификаций этой группы ферментов (Гоготов и др., 2010).

1.1.2.1. [Fe]-гидрогеназы.

Данный тип гидрогеназ был открыт позже других и в данный момент несколько

хуже изучен. Несколько лет назад считалось, что гидрогеназы такого типа не содержат

атомов металла в активном центре, поэтому их называли «неметаллическими» (Berkessel,

2001). В настоящее время показано, что ферменты этой группы представляют собой

гомодимер, который содержит атом железа в активном центре (рис. 3), но не содержит

FeS- кластеров (Shima, Thauer, 2007). Fe представляет собой каталитически активную

составляющую железо-гуанилил-пиридинолового кофактора (Iron-Guanylyl Pyridinol

Cofactor; FE9). Кофактор может быть отделен при денатурации фермента в присутствии

меркаптоэтанола, он чувствителен к воздействию света и температуры, что препятствует

получению его в чистом виде (Lyon et al., 2004). Атом железа в кофакторе соединен с

двумя СО-лигандами, ацильной группы пиридинола, атомом азота цистеина и одним

неустановленным лигандом (Stiebritz, Reiher, 2012). Предположительно шестая

20

координационная позиция предназначена для связи с Н2 и его конкурентным ингибитором

CO (Shima et al., 2008).

Данные тип гидрогеназ участвует в одном из этапов восстановления углекислоты

до метана. Эти цитоплазматические гидрогеназы обнаружены только у представителей

домена архей, у которых они синтезируются лишь в условиях недостатка никеля (Thauer,

1998; Shima, Thauer, 2007).

Рис. 3. Структура [Fe]-гидрогеназы Methanocaldococcus jannashii (Stiebritz, Reiher,

2012).

1.1.2.2. [FeFe]- гидрогеназы.

[FeFe]- гидрогеназы в отличие от двух других классов гидрогеназ, которые обычно

представляют собой димеры, могут иметь различное количество субъединиц. Описаны

ферменты, состоящие из одной, двух, трех и четырех субъединиц (Meyer, 2007). Для

данной группы характерны высокая чувствительность к кислороду и высокая

каталитическая активность. Это единственные гидрогеназы, найденные у

эукариотических организмов (Adams, 1990; Vignais, Colbeau, 2004).

Все изученные к настоящему времени [FeFe]-гидрогеназы имеют схожую

архитектуру. Для них характерно модульное строение, они состоят из активного сайта (Н-

кластера) и вспомогательных FeS-кластеров, иначе F-кластеров (Vignais et al., 2001).

Крайне консервативным являются 3 участка Н-кластера - 3 мотива, обозначенных как L1

(TSCCPxW), L2 (MPCxxKxxE), and L3 (ExMACxxGCxxGGGxP). По этим трем мотивам

легко идентифицировать [FeFe]- гидрогеназы и отличать их от сиквенсов HydA гомологов

(Mulder et al., 2011).

21

В активном сайте ферментов данного типа находится 6 атомов железа:

нестандартный 2Fe кластер соединен с типичным [4Fe-4S]-кластером с помощью

цистеинового лиганда, соединенного с белком (Vignais et al., 2001). Каждый атом железа в

этом кластере координирован терминально расположенными CN и СО лигандами. Атомы

железа связаны между собой дитиолатом (стандартно 1,3-пропандитиолат -SCH2CH2CH2S-

, либо 1,3-дитиолометиламин -SCH2NHCH2S-, Nicolet et al., 2001). Третий СО лиганд либо

соединяет 2 атома железа, либо соединен терминально с дистальным атомом железа.

Предполагают, что его позиция зависит от редокс-состояния 2Fe-кластера. Два атома

железа часто обозначают как проксимальный и дистальный (относительно [4Fe-4S]-

кластера и белкового остова (Siegbahn et al., 2007). При инкубировании фермента в

атмосфере угарного газа дополнительный СО лиганд присоединеняется к вакантному

координационному сайту дистального атома железа, что приводит к инактивации

фермента (Lemon, Peters, 2001). Предположительно, этот координационный сайт является

местом связывания водорода либо протона (Vignais, Billoud, 2007). Активный сайт,

погруженный вглубь молекулы, соединен с поверхностью с помощью гидрофобных

каналов (Vignais, Colbeau, 2004).

Самые значительные различия в строении [FeFe]-гидрогеназ проявляются в

организации вспомогательных FeS–кластеров, которые, предположительно, играют роль в

регуляции переноса электронов к и/или от Н-кластера (Mulder et al., 2011). Наиболее

просто устроенные ферменты, которые не содержат доменов с F-кластерами, а только Н-

кластер, были обнаружены у некоторых водорослей, включая Chlamydomonas reinhardti,

Scenedesmus obliquus (Florin et al., 2001; Happe, Kaminski, 2002; Forestier et al., 2003).

Показано, что вспомогательные домены [FeFe]-гидрогеназ состоят из одного или

комбинации следующих типов (Mulder et al., 2011):

1. Два [4Fe-4S]-домена, схожих по строению с бактериальным ферредоксином.

2. Короткий домен, содержащий [4Fe-4S]-кластер с лигандами: 3 цистеина и

гистидин.

3. Схожий с ферредоксином растений [2Fe-2S]-содержащий домен.

4. Тиоредоксин-подобный [2Fe-2S]-содержащий домен, гомологичный NuoE-

субъединице NADH: убихинон-оксидоредуктазы.

У разных [FeFe]-гидрогеназ наблюдают различные комбинации данных «модулей»

(рис. 4). В настоящее время предложена классификация [FeFe]-гидрогеназ, основанная на

строении F-кластеров (Meyer, 2007). Физиологическая роль различных комбинаций пока

не совсем понятна. Известно, что фермент может проявлять активность и

взаимодействовать с ферредоксинами и без F-кластеров, поскольку есть подобные,

22

содержащие только Н-кластер, гидрогеназы водрослей и получены ферменты путем

трансгенных делеций F-кластерных доменов (King et al., 2006). Можно предположить, что

различные конфигурации данных доменов дают возможность проводить специфические

метаболические взаимодействия, иметь определенное внутриклеточное положение,

взаимодействовать с редокс-партнером (Mulder et al., 2011). Однако на данный момент

мало данных, подтверждающих это предположение.

Рис. 4. Схема строения [FeFe]-гидрогеназ (Mulder et al., 2011). Цветными фигурами

отображены различные модули F-кластеров. A. Тиоредоксин-подобный [2Fe-2S]-

содержащий домен, гомологичный NuoE-субъединице NADH: убихинон-

оксидоредуктазы; B. H-кластер; C. Фд-подобный 2[4Fe-4S]-домен; D. Схожий с

ферредоксином растений [2Fe-2S]-содержащий домен; E. Короткий домен, содержащий

[4Fe-4S]-кластер с лигандами: 3 цистеинами и гистидином.

1.1.2.3. [NiFe]- гидрогеназы.

Это самый обширный и хорошо изученный класс гидрогеназ. Отличительной

особенностью ферментов данной группы является наличие атомов железа и никеля в

активном центре (Vignais, Billoud, 2007). Ферменты такого типа найдены у многих

бактерий и архей, но не обнаружены у эукариот. Они на 2-3 порядка менее активны, чем

[FeFe]- гидрогеназы. [NiFe]- гидрогеназы отличаются тем, что при контакте с воздухом не

образуется ковалентной связи активный центр–кислород, что обеспечивает их быструю

реактивацию (Гоготов и др., 2010). Обратимое ингибирование кислородом позволило

значительно упростить методики их получения (Albracht, 1994). Также выделяют

23

подгруппу [NiFeSe]-гидрогеназ, в активном центре которых один из терминально

расположенных цистеиновых остатков, координирующих Ni, заменен на селеноцистеин

(SeCys, Parkin, 2014).

Рис. 5. Структура [NiFe]-гидрогеназы Desulfovibrio vulgaris и [FeFe]-гидрогеназы

Desulfovibrio desulfuricans. Схематически стрелками обозначены пути передачи протонов

и электронов (через железосерные кластеры), а также газовый канал. Ниже приведены

схемы строения активного центра гидрогеназ, стрелками указаны свободные

координационные сайты. NC – цианогруппа (Lubitz et al., 2014).

1.1.2.3.1. Строение [NiFe]-гидрогеназ.

Принципиально все [NiFe]-гидрогеназы имеют схожее строение, даже подкласс

[NiFeSe]-гидрогеназ значительно не отличается от остальных представителей класса

(Lubitz et al., 2014). Большинство [NiFe]-гидрогеназ состоят из двух субъединиц. Большая

субъединица содержит активный сайт, а малая FeS-кластеры электронтранспортной цепи

(Yagi, Hiuchi, 2013). Но есть гидрогеназы, содержащие дополнительные субъединицы, в

частности, у представителей 3 группы (см. раздел 1.1.4) они отвечают за связывание с

24

растворимыми кофакторами, такими как НАДН, НАДФН, кофактор метаногенеза F420

(Kim, Kim, 2011).

Молекулярный вес стандартной малой субъединицы около 29 kDa, она содержит

три FeS-кластера, формирующие электронтранспортную цепь, по которой электроны от

глубоко погруженного в глобулу активного центра выводятся к поверхности молекулы,

где передаются на физиологический акцептор. Они обозначаются как проксимальный

[4Fe-4S], медиальный [3Fe-4S] и дистальный [4Fe-4S], основываясь на их расположении

относительно [NiFe]-активного сайта (Lubitz et al., 2014). По цепи переноса электроны

двигаются последовательно по одному (Гоготов и др., 2010). Предполагается, что

проксимальный кластер (ближайший к активному центру) участвует в процессе активации

молекулы водорода (Vignais, 2005), а дистальный кластер передает/принимает электроны

от физиологического акцептора/донора (Lubitz et al., 2014). Медиальный кластер может

отсутствовать, может иметь структуру как [3Fe-4S], например у Desulfovibrio sp. (Vignais,

Billoud, 2007), так и [4Fe-4S], например у Desulfovibrio baculatum (Garcin et al., 1999). У

Clostridium pasteurianum обнаружена гидрогеназа, содержащая кластер со структурой

[2Fe-2S]. У мембраносвязанных железоникелевых гидрогеназ на N-конце малой

субъединицы располагается сигнальный пептид (30-50 аминокислотных оснований),

содержащий специальный мотив, который узнается одной из систем транслокации белков

(Vignais, Colbea, 2004).

Большая субъединица имеет молекулярную массу около 60 kDa. Содержит 2

металлических центра: [NiFe]-активный центр и ион магния, расположенный на С-конце

большой субъединицы, у ферментов некоторых микроорганизмов, например D. baculatum,

он замещен на железо (Garcin et al., 1999). Ранее предполагалось, что он участвует в

поддержании четвертичной структуры, однако, на сегодняшний день большинство

исследований свидетельствует о том, что он участвует в переносе протона (Volbeda et al.,

2005).

Активный центр всех [NiFe]-гидрогеназ имеет схожее строение. Расстояние между

атомами металлов составляет 2,63А. Четыре атома серы, входящих в состав четырех

цистеинов, координируют атом никеля, при этом два из них соединяют никель с атомом

железа, оставшиеся два связаны в терминальной позиции (Lubitz et al., 2014). Атом железа

связан с двумя небелковыми лигандами – одним СО и двумя СN-

(Volbeda et al., 1996;

Happe et al., 1997). У Desulfovibrio vuigaris один из трех лигандов предположительно

представлен SO (Higuchi et al., 1997). Цианид известен как хороший σ-донор, он

формирует водородные связи с аминокислотами, окружающими активный сайт. В то же

время СО-лиганд образует слабые водородные связи или не формирует их (Volbeda,

25

Fontecilla-Camps, 2005; Lubitz et al., 2014). Существует ещё один лиганд, образующий

мостик между атомами железа и никеля. Предполагается, что в окисленном неактивном

состоянии это кислород или гидрокси-группа. В восстановленном состоянии он

замещается гидрид-ионом (Brecht et al., 2003; Foerster et al., 2003).

Поскольку активный центр глубоко погружен в молекулу белка, на 30 Ǻ от

поверхности (Volbeda, Fontecilla-Camps, 2005), а стандартный размер молекулы

составляет 5х5х5 нм3, то в белке есть газовые каналы для прохождения субстрата и

ингибитора, протонный и электронный каналы (Lubitz et al., 2014). Поскольку

молекулярный водород и ингибиторы, такие как угарный газ и кислород - неполярные

молекулы, они поступают к активному центру через гидрофобный канал (Vignais, 2008). С

помощью метода рентгеноструктурной кристаллографии было показано, что на

поверхности молекулы начинаются несколько гидрофобных каналов, которые

объединяются в один рядом с активным сайтом (Montet et al., 1997). Канал образован

гидрофобными аминокислотами (Vignais, 2005), причем мутантные гидрогеназы с

уменьшенным диаметром канала демонстрируют более низкую чувствительность к

кислороду, чем штаммы дикого типа. Предполагается, что присутствующие на конце

газового канала в [NiFe]-гидрогеназах остатки изолейцина и фенилаланина необходимы

для образования своего рода узкого горлышка, затрудняющего доступ крупных молекул,

ингибирующих фермент (Buhrke et al., 2005; Duche et al., 2005).

Точный механизм передачи протонов к поверхности не ясен, предложено

несколько возможных путей. Вероятнее всего, в молекуле существует несколько

одновременно функционирующих путей (Vignais, 2005; Lubitz et al., 2014). С помощью

направленного мутагенеза, рентгеноструктурного анализа и теоретических расчетов было

показано, что один из цистеинов, лигандов никеля (Cys543 у D. fructosovorans, Cys530 у D.

gigas, Cys536 у D. desulfuricans и соответствующий цистеин у T. roseopersicina, SeCys у

Desulfomicrobium norvegicum) принимает протоны из активного центра (Vignais, 2005).

Затем протон передается на ближайший остаток глутамата, крайне консервативный и

присутствующий во всех типах [NiFe]-гидрогеназ [Glu24 в [NiFe]-гидрогеназе D.

desulfuricans (Matias et al., 2001) и соответствующий Glu18 в [NiFeSe]-гидрогеназе Dm.

norvegicum (Garcin et al., 1999)]. На следующем этапе протоны передаются либо на С–

терминальный сайт, содержащий атом металла, через сеть молекул воды, либо к

поверхности молекулы через цепь глутаматов, расположенных рядом с проксимальным

FeS-кластером (Lubitz et al., 2014). Для гидрогеназы из Desulfovibrio gigas показано, что

перенос протона происходит через Cys530, Glu18, четыре внутренние молекулы воды,

His536, ещё одну внутреннюю молекулу воды, Glu46 и молекулу воды, связанную с

26

магнием в большой субъединице, в малой субъединице задействованы Glu18, Thr18, Glu16

и Glu73 (Volbeda, Fontecilla-Camps, 2005). Исследования показывают ключевую роль в

процессе переноса протонов остатка Glu18 большой субъединицы, поскольку замена

карбоксильной группы глутамата на амидную группу глутамина приводит к полной

потере ферментативной активности при полном сохранении простетической группы.

Непосредственно после остатка Glu18 путь переноса протона может отличаться в

зависимости от источника выделения гидрогеназы. В работе (Massanz, Friedrich, 1999)

предполагается, что пути переноса протона расходятся от Glu18 большой субъединицы,

поскольку замена других остатков не влияет на активность фермента. В настоящее время

предложен еще один путь переноса: протон с активного сайта переносится на остаток

аргинина, а затем достигает поверхности молекулы через богатый гистидинами мотив

(Szori-Doroghazi et al., 2012).

[NiFeSe]-гидрогеназы представляют собой подкласс [NiFe]-гидрогеназ. Общее

строение ферментов этого подкласса принципиального не отличается от других [NiFe]-

гидрогеназ. Различия существуют в С-терминальном регионе большой субъединицы,

[NiFe]-активном сайте и медиальном [FeS]-кластере (Lubitz et al., 2014). В настоящее

время [NiFeSe]-гидрогеназы обнаружены только в группе 1 (поглощающих

мембраносвязанных [Ni-Fe]-гидрогеназ) и 3 (цитоплазматических мультисубъединичных

[NiFe]-гидрогеназ, Parkin, 2014). При этом только несколько гидрогеназ были реально

выделены: из сульфатредукторов Desulfovibrio salexigens, Desulfomicrobium baculatum,

Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, метаногенов Methanococcus vannielii и Methanococcus

voltae (Baltazar et al., 2011).

В ферментах данного подтипа один из терминально расположенных цистеиновых

остатков, координирующих Ni, заменен на селеноцистеин (SeCys). Медиальный [FeS]-

кластер у ферментов данного подкласса имеет структуру [4Fe-4S], в то время как у

стандартных [NiFe]-гидрогеназ он имеет вид [3Fe-4S]. [4Fe-4S]-кластер поддерживается 4

остатками цистеина. В С-терминальном регионе большой субъединицы у [NiFe]-

гидрогеназ находится ион магния. В [NiFeSe]-гидрогеназах вместо магния предполагалось

наличие иона железа (Garcin et al., 1999; Marques et al., 2010), но в последних работах

полагают, что вместо железа в данной позиции находится ион кальция (Volbeda et al.,

2013).

Активность [NiFeSe]-гидрогеназ значительно выше, чем их [NiFe]-аналогов.

[NiFeSe]-гидрогеназы, входящие в 1 группу поглощающих мембраносвязанных [NiFe]-

гидрогеназ (см. раздел 1.1.4), интересны тем, что их активность по образованию водорода

значительно выше, чем по поглощению (Parkin, 2014). Большинство организмов,

27

синтезирующих [NiFeSe]-гидрогеназы также могут синтезировать их [Ni-Fe]-гомологи,

что, скорее всего, служит запасной системой на случай дефицита селена в окружающей

среде (Baltazar et al., 2011). Но, например, такой микроорганизм как Methanocaldococcus

jannaschi содержит гены только селеносодержащей гидрогеназы и поэтому зависит от

содержания селена в среде (Rother et al., 2001).

1.1.2.3.2. Активный центр. Каталитический цикл.

Биметаллический комплекс Ni-Fe, формирующий активный центр гидрогеназ,

способен образовывать несколько стабильных структур, предположительно, благодаря

координации с лигандами различных типов: тиолатами (хорошие π-акцепторы),

цианидами (хорошие σ-доноры) и карбонилами (хорошие π-акцепторы) (De Lacey et al.,

2007). В аэробных условиях железоникелевые гидрогеназы неактивны. Существует две

формы окисленного фермента, которые обычно присутствуют одновременно и

отличаются ЭПР сигналами никеля и скоростью активации: Ni-B («готовое» состояние)

может быть активировано за секунды, в то время как Ni-A («неготовое» состояние)

требует длительного времени для активации, которое зависит от вида и условий (Albracht,

1994). При анаэробной инактивации обычно образуется Ni-B форма, но при определенных

условиях образование Ni-A также возможно. Разница между этими двумя состояниями,

предположительно, заключается в различии одного из лигандов, соединяющих атомы

железа и никеля в активном центре. Два из соединяющих лигандов, представленые S,

одинаковы для всех состоняий активного центра. Третим лигандом у формы Ni-B в

настоящее время считают ОН¯, в то время как для Ni-A он не установлен (Shafaat et al.,

2013). Возможными лигандами считают SO, O2-

, SOH, а также ОН¯, как и в случае Ni-B,

но в иной ориентации и/или окружении. Неактивные окисленные состояния Ni-A и Ni-B

проходят через Ni-SU и Ni-SIr, соответственно, прежде чем войти в каталитический цикл

через форму Ni-SIa (рис. 6, Lubitz et al., 2014). В самом цикле участвуют Ni-SIa , Ni-C, и Ni-

R. Все формы, имеющие в названии литеру «S» это ЭПР-неактивные состояния (EPR-

silent), все остальные формы, кроме Ni-R, ЭПР-активные. Ni-SU (“silent unready”) и Ni-SIr

(“silent ready”) формы образуются при одноэлектронном восстановлении Ni-A и Ni-B (De

Lacey et al., 2007).

Ni-SIr существует в двух формах (Ni-SIr)I и (Ni-SIr)II. Предполагают, что (Ni-SIr)I

сохраняет свойственный Ni-B форме ОН¯ лиганд, соединяющий Ni и Fe активного центра.

В то время как более у протонированной формы (Ni-SIr)II, предположительно, H2O слабо

связана с активным сайтом. После полного удаления молекулы воды из активного центра,

когда лиганд, соединяющий атомы Ni и Fe, отсутствует, происходит переход в активное

28

состояние Ni-SIa (Kramer et al., 2013). За счет этой вакантной координационной позиции

может произойти присоединение, как молекулы водорода, так и ингибитора – СО. Форма

Ni-SU тоже переходит в Ni-SIa, но каким образом и почему на это требуется длительное

время, пока не установлено (De Lacey et al., 1997). Последние исследования показывают,

что у устойчивых к кислороду гидрогеназ форма Ni-A и, соответственно, Ni-SU

отсутствуют (Shafaat et al., 2013).

В каталитическом цикле (рис. 6) задействованы только три состояния Ni-SIa, Ni-C

(активное восстановленное состояние), и Ni-R (полностью восстановленное состояние). В

форме Ni-SIa отсутствует мостиковый лиганд, соединяющий атомы железа и никеля, при

этом никель координирован 4 лигандами. На первом этапе H2 поляризуется на Ni и

происходит гетеролитический разрыв связи (гетеролитическое расщипление молекулы

водорода). В результирующем Ni-R состоянии H- образует мост между Ni(II) и Fe(II), а Н

+

соединяется с серой терминального цистеина (Cys546 в Desulfovibrio vulgaris, Lubitz et al.,

2014). Высвобождение протона (соединенного с серой) и электрона приводят к

образованию Ni-С состояния, которое показано для многих гидрогеназ. Высвобождение

еще одного протона и электрона ведет к образованию форм Ni-SIa и замыканию цикла

(Goris et al., 2011). Процесс выделения водорода идет в обратном направлении, но с

образованием тех же промежуточных форм.

29

Рис. 6. Модель, отображающая общую схему каталитического цикла и

инактивации/реактивации [NiFe]-гидрогеназ. Каталитические реакции обозначены черным

в направлении окисления Н2. Схемы инактивации кислородом отображены зеленым (до

Ni-B) и красным (до Ni-A). Анаэробная инактивация обозначена прирывистой линией

(Lubitz et al., 2014).

1.1.3.3. Инактивация гидрогеназ.

Многие никель-содержащие гидрогеназы инактивируются следовыми

количествами кислорода (Albracht, 1994). Как указано выше, существуют две формы

окисленного фермента: Ni-B и Ni-A. Для образования формы Ni-B, которая может быть

быстро активирована, кислород должен быть быстро преобразован в воду и гидроксид, с

использованием 4 электронов и 3 протонов. Предположительно электроны переносятся на

кислород через активный сайт по одному, причем несогласованно с переносом протонов

(Warren et al., 2010). Возможный механизм процесса описан ниже (Lubitz et al., 2014).

Первый электрон поступает за счет окисления железоникелевого центра, в результате

образуется супероксид-подобное нестабильное состояние. Следующий электрон

поступает с проксимального [4Fe-3S]-кластера и восстанавливает супероксид до

30

гидропероксида. Третий электрон у чувствительных к кислороду гидрогеназ поступает с

медиального кластера и приводит к разрыву связи между двумя атомами кислорода,

образуются вода и гидроксильный радикал. Эта стадия является критической, поскольку

гидроксильный радикал крайне реакционноспособен, скорее всего на этой стадии

чувствительные к кислороду гидрогеназы переходят в Ni-A-состояние, имея только 3

легкодоступных электрона. У толерантных к действию кислорода гидрогеназ третий

электрон, скорее всего, поступает с проксимального железосерного кластера, а электрон с

медиального кластера остается доступным для восстановления гидроксильного радикада

до гидроксида, стандартного лиганда у Ni-B формы.

В настоящее время показано два механизма устойчивости [NiFe]-гидрогеназ к

кислороду. Первый свойственен мебраносвязанным гидрогеназам, толерантным к

действию О2 (Fritsch et al., 2013). Их отличает нестандартное строение проксимального

железосерного кластера: [4Fe-3S] вместо [4Fe-4S], наличие 6 вместо 4 цистеиновых

лигандов. В результате образуется открытая подвижная форма кластера Cys6 [4Fe–3S].

Такая форма может донировать 2 электрона на активный центр, в то время как

стандартная Cys4 [4Fe–4S] только один (Yagi , Higuchi, 2013). И это, как описано выше,

становится решающим фактором при действии кислорода.

Второй механизм связан со строением газового канала, по которому молекулярный

водород попадает к активному центру. У гидрогеназ, устойчивых к действию кислорода,

он сужается к активному центру, поэтому О2, более крупная молекула в сравнении с Н2, к

нему не поступает. У стандартных железоникелевых гидрогеназ газовый канал около

активного центра образован двумя консервативными аминокислотами, обычно валином и

лейцином (De Lacey et al., 2007). У ферментов, устойчивых к действию кислорода, таких

как регуляторная гидрогеназа Ralstonia eutropha, HupUV-гидрогеназы Rhodobacter

capsulatus, Bradyrhizobium japonicum, валин и лейцин заменены более объемными

аминокислотами – изолейцином и фенилаланином соответственно (Elsen et al., 1996;

Volbeda et al., 2002). Для подтверждения предположения о том, что данные

аминокислотные остатки играют роль в устойчивости ферментов к кислороду, в

гидрогеназах Ralstonia eutropha и Rhodobacter capsulatus изолейцин и фенилаланин

заменили на валин и лейцин. В обоих случаях полученные ферменты ингибировались

кислородом (Buhrke et al., 2005; Duche et al., 2005). Таким образом, внесение изменений с

помощью мутагенеза в строение газовых каналов может служить путем исскуственного

повышения устойчивости гидрогеназ к действию кислорода.

СO является конкурентным ингибитором большинства железоникелевых

гидрогеназ. Он связывается с открытой координационной позицией никеля, что игибирует

31

активность фермента (Vincent et al., 2007). Угарный газ оказывает ингибирующее

действие только на состояния активного центра Ni-SIa и Ni-L. При связывании с Ni-SIa

образуется ЭПР-неактивное состояние Ni-SCO. Ni-SCO состояние светочувствительно, на

свету протисходит фотолиз связи CO с активным центром (Pandelia et al., 2010). Ранее

считали, что Ni-CO состояние активного центра образуется за счет связывания СО с Ni-C

формой, но сейчас показано, что взаимодействие происходит с Ni-L-парамагнитным

состоянием, в которое переходит Ni-C при освещении и низкой температуре (Lubitz et al.,

2014). Устойчивых к действию угарного газа [NiFe]-гидрогеназ мало, к ним относятся CO-

индуцируемая гидрогеназа Rhodospirillum rubrum, гидрогеназа гипертермофила

Pyrococcus furiosus, О2-толерантная гидрогеназа Ralstonia eutropha (Fox et al., 1996; Silva et

al., 2000; Bleijlevens et al., 2004).

Характерной чертой [NiFe]-гидрогеназ является снижение активности по

окислению водорода при высоких значениях окислительно-восстановительного

потенциала даже в строго анаэробных условиях. Этот эффект был впервые показан для

гидрогеназы из Desulfovibrio gigas двумя независимыми группами в 1985 году и

впоследствии подтверждено многими исследователями для различных гидрогеназ

(Fernandez et al., 1985; Mege et al., 1985) В дальнейшем было показано, что анаэробная

инактивация связана с переходом активной формы Ni-SI в форму Ni-B. В предполагаемом

механизме инактивации задействован остаток глутамата, расположенный рядом с

активным центром. Остаток глутамата взаимодействует с молекулой воды, протон

остается связанным с его карбоксильной группой, а ОН-группа связывается с активным

центром в Ni-SI –состоянии, в результате чего он переходит в Ni-B (De Lacey et al., 2007).

Схема процесса представлена на рисунке 7.

Рис. 7. Предполагаемый механизм анаэробной инактивации [NiFe]-гидрогеназ.

R(O)O- – остаток глутамата (De Lacey et al., 2007).

Сульфид является ингибитором некоторых гидрогеназ. Предположительно, в

результате инактивации сульфидом образуется серосодержащий лиганд, соединяющий

32

атомы Fe и Ni, вместо ОН-лиганда в Ni-B состоянии активного центра (De Lacey et al.,

2007). В тоже время такие группы микроорганизмов как сульфатредукторы и пурпурные

серобактерии восстанавливают серу (сульфат) до сульфида, используя водород как донор

электронов. В настоящее время показано, что сульфид не может инактивировать

железоникелевые гидрогеназы при потенциалах более отрицательных чем +100 mV, и,

сомнительно, что потенциалы выше данного значения будут зарегистрированны in vivo.

Но такие значения потенциала могут наблюдаться при каких-либо стадиях очистки

ферментов (Vincent et al., 2007).

Ацетилен, как и СО, является конкурентным ингибитором, исходя из этого

предполагают, что эти газы имеют один сайт связывания с водородом (He et al., 1989).

Хотя точный сайт связывания для C2H2 не известен, показано, что он обратимо

связывается с большой субъединицей фермента. На гидрогеназе из Т. roseopersicina было

показано, что ацителен защищает фермент от необратимого игибирования

иодоацетамидом (Zorin et al., 1996). Оба ингибитора действуют только на активную форму

фермента, поступая к активному центру молекулы через гидрофобные каналы (Montet et

al., 1997).

Для железоникелевой гидрогеназы из Azotobacter vinelandii показано, что цианид

является необратимым ингибитором, причем он действует только на окисленную форму

фермента, которая образуется в присутствии О2 и Н2 (Sun et al., 1991). При этом цианид не

действует на активный фермент, выделенный в анаэробных условиях (Seefeldt et al., 1989).

Металлы побочных подгрупп, такие как Cu(II) и Hg(II), ингибируют рост бактерий,

таких как D. desulfuricans, подавляя метаболизм водорода (De Lacey et al., 2007). Для

гидрогеназы D. gigas показано, что потеря каталитической активности связана с

повреждением [3Fe-4S]-кластера в электронтранспортной цепи (Fernandez et al., 1989).

Схожий эффект Hg(II) был отмечен для гидрогеназы D. vulgaris (Kamachi et al., 1995).

Cu(II) и Hg(II) необратимо ингибируют гидрогеназу Т. roseopersicina (Задворный и др.,

2000).

1.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS.

1.2.1. Общая характеристика Thiocapsa roseopersicina BBS.

Thiocapsa roseopersicina (Thi.o.cap´sa. Gr. n. thios sulfur; L. n. capsa box; M.L. fem. n.

Thiocapsa sulfur box; ro.se.o.per.si.ci´na. L. adj. roseus rosy; Gr. n. persicus the peach;M.L.

fem. adj. roseopersicina rosy peach-colored) является представителем пурпурных серных

бактерий, домен Bacteria, филум Proteobacteria, класс Gammaproteobacteria, порядок

Chromatiales, семейство Chromatiaceae (Bergey’s…, 2009).

33

Вид был открыт Сергеем Николаевичем Виноградским в 1880-х годах, является

типовым видом рода Thiocapsa (Guyoneaud et al., 1998; Турова и др., 2009). ГЦ состав

63,3-66,3%. Клетки имеют округлую форму, 1,2-3,0 μм, обычно 1,5 μм в диаметре,

неподвижные. Могут образовывать агрегаты из двух, четырех и более клеток

(Кондратьева, 1996). Клетки окружены плотной слизистой капсулой, не содержат газовых

визикул. Грамотрицательные, имеют хорошо развитую систему

внутрицитоплазматических мембран визикулярного типа, содержащую

бактериохлорофилл а и каротиноиды спириллоксантиновой группы (Schmidt, 1965;

Кондратьева, 1972; Горленко, 2010). Фотосинтетические пигменты обуславливают цвет

клеточной суспензии: от розового до розового-красного, отдельные клетки бесцветны

(Bergey’s…, 2009). В качестве запасных веществ T. roseopersicina образует гранулы

полифосфатов, полисахариды, поли-β-гидроксибутират, S0. Данный вид способен к

фотолитоавтотрофному росту в анаэробных условиях на свету с использованием

водорода, сульфида, тиосульфата и серы как доноров электронов (Guyoneaud et al., 1998).

При окислении сульфида сера откладывается в форме глобул внутри клетки. Способность

хранить серу внутри клетки в форме глобул является характерным свойством семейства

Chromatiaceae. Конечным продуктом окисления является сульфат (Кондратьева и др.,

1989; Горленко, 2010). В присутствии сульфида и бикарбоната такие простые

органические вещества как ацетат, пируват, фумарат, малат, сукцинат, глицерол, фруктоза

могут быть фотоассимилированы. Не использует лактат, пропионат, бутират, тартрат, α-

оксоглуторат, цитрат, бензоат и спирты (Puchkova et al., 2000; Caumette et al., 2004).

Хемоавтотрофный рост или хемогетеротрофный рост возможен в микроаэрофильных и

аэробных условиях в темноте (Wit, Gemerden, 1987). Фиксация углекислоты происходит в

цикле Кальвина, причем синтез рибулозобисфосфаткарбоксилазы не подавляется

кислородом (Турова и др., 2009). Большинство штаммов способны к ассимиляционной

сульфатредукции. Присутствует нитрогеназная активность (Кондратьева, 1996; Puchkova

et al., 2000; Caumette et al., 2004). Мезофильный микроорганизм с температурным

оптимумом роста от 20 до 35°С, pH может варировать от 6,5 до 7,5 при оптимуме в pH 7,3

(Bergey’s…, 2009).

Thiocapsa roseopersicina одна из самых широко распространенных пурпурных

серных бактерий в природе. Она обитает в прудах, озерах, лагунах, где много

растворенной органики. Может быть обнаружена в прудах с жидкими органическими

отходами, содержащих деградабельную органику и сульфид водорода. Также

распространена в эстуариях и низинах, затопляемых морской водой. Данный вид может

развиваться при различном уровне солености среды, от морской до пресной. Штаммы,

34

выделенные из морских местообитаний, растут и при низких концентрацией солей,

поэтому данный вид относят к галотолерантным, а не галофильным микрогранизмам

(Кондратьева и др., 1989; Bergey’s…, 2009).

Thiocapsa roseopersicina штамм BBS является одним из наиболее хорошо

изученных представителей Chromatiaceae. Этот штамм был выделен в 1969 году из

эстуария Белого моря аспирантом кафедры микробиологии биологического факультета

МГУ Богоровым Л.В. (Богоров, 1974). Его изучение привело к открытию способности

фототрофных бактерий к хемолитоавтотрофному росту (Kondratieva et al., 1976; Турова и

др., 2009). Подробно изучали его метаболизм водорода, серы, углерода, биосинтез

фотосинтетических пигментов (Zhukov, 1976; Жуков, Фирсов 1976; Петушкова,

Ивановский, 1976 a,b; Корсунский, Гоготов 1980; Kondratieva et al., 1981; Kovacs et al.,

2003; Laurinavichene et al., 2007). Особо стоит отметить, что подробно изучены

гидрогеназы данного штамма, их строение, созревание, функционирование в клетке, гены

кодирующие сами гидрогеназы и ферментов, отвечающих за их синтез (Kovacs et al.,

2005 c; Palagyi-Meszaros et al., 2009; Maroti et al., 2010a; Tengolics et al., 2014).

В тоже время, штамм BBS по ряду параметров отличается от типового штамма

Thiocapsa roseopersicina DSM 217, так он не способен к сульфатредукции, ауксотрофен по

В12, а так же имеются некоторые отличия в спектре используемых соединений. В

частности, штамм BBS не способен использовать в качестве субстрата фруктозу, но при

этом метаболизирует глюкозу (Турова и др., 2009). В настоящее время на основании

данных, полученных с помощью анализа последовательностей генов 16S рРНК, cbbl и

nifH штамма BBS, результатов ДНК-ДНК гибридизации с типовым штаммом Thiocapsa

roseopersicina, а также на основе сравнения фенотипических признаков у представителей

разных видов рода Thiocapsa, внесено предложение выделить данный штамм BBS в

самостоятельный вид Thiocapsa bogorovii sp. nov. (Турова и др., 2009).

1.2.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS.

Thiocapsa roseopersicina относится к тем микроорганизмам, у которых было

найдено несколько гидрогеназ. Все они относятся к [NiFe]-гидрогеназам, но имеют

разную локализацию в клетке и различные функции in vivo (Kovacs et al., 2005). Всего у

данного микроорганизма обнаружено 4 функционирующих гидрогеназы: HupSL, HynSL,

Hox1, Hox2 (Tengolics et al., 2014). Гены еще одной регуляторной гидрогеназы HupUV

были найдены в геноме, но они не экспрессируются (Kovacs et al., 2005a). HupSL и HynSL

гидрогеназы относятся к первой группе поглощающих мебраносвязанных гидрогеназ, обе

транслоцируются через мембрану при помощи Tat-системы. T. roseopersicina является

35

первой бактерией, у которой обнаружили более одной гидрогеназы Hox-типа (Maroti et al.,

2010a). Помимо самих ферментов показано наличие вспомогательных белков,

принимающих участие в пострансляционном созревании гидрогеназ (Fodor et al., 2001;

Maroti et al., 2003; Maroti et al., 2010b) и транскрипционной регуляции (Kovacs et al., 2005

a; Kovacs et al., 2005b).

Пока не совсем ясно, зачем T. roseopersicina такое количество гидрогеназ, тем

более что ряд функций могут выполнять несколько из них параллельно. Наличие

нескольких гидрогеназ связывают с тем фактом, что данному микроорганизму

необходимо иметь возможность к смене типа метаболизма (фотоавтотрофия,

фотогетеротрофия, хемогетеротрофия, хемолитоавтотрофия) для выживания в природных

условиях. Наличие нескольких гидрогеназ, выполняющих различные функции и

связанных с различными метаболическими путями, повышает приспособленность

микроорганизма к изменяющимся условиям окружающей среды (Kovacs et al., 2005c).

1.2.2.1. HupSL-гидрогеназа.

НupSL гидрогеназа является мембраносвязанным ферментом, активным центром

обращена в периплазму (Palagyi-Meszaros et al., 2009; Maroti et al., 2010b). Она относится к

1 группе мебраносвязанных поглощающих [NiFe]-гидрогеназ. Ферменты этой группы

преимущественно отвечают за перенос электронов от Н2 к пулу хинонов в

электронтранспортной цепи через цитохром b-типа и связаны с хемоосмотическим

механизмом запасания энергии. Они используют водород из окружающей среды или

водород, образованный при работе нитрогеназного комплекса (Vignais et al., 2001). После

выделения из мембраны НupSL гидрогеназа из Thiocapsa roseopersicina становится очень

чувствительна к различным внешним факторам, что свойственно для гидрогеназ первой

группы (Kovacs et al., 2005; Rakhely et al., 2007). Высокая нестабильность вне мембраны не

позволяет выделить ее в активной форме (Kovacs et al., 2002).

НupSL гидрогеназа имеет Tat-сигнальные последовательности, за счет чего

переносится через мембрану при помощи Тat-системы секреции, заякорена в мембране с

периплазматической стороны (Palagyi-Meszaros et al., 2009). Поскольку гидрогеназа

локализована в периплазме (Kovacs et al., 1983), то окисление водорода ведет к

образованию протонного градиента, который может быть использован на синтез ATФ

(Kovacs, Bagyinka, 1990; Palagyi-Meszaros et al., 2009; Tengolics et al., 2014). НupSL

гидрогеназа необходима тиокапсе для Н2-зависимого роста (Palagyi-Meszaros et al., 2009).

Показано, что, окисляя водород на свету для фиксации углекислоты, и в темноте, при

наличии кислорода, для дыхания, она передает электроны на электронтранспортную сеть

36

на уровне хинонов. Окислять водород на свету так же способна Hox-гидрогеназа, но она

способна окислять Н2 для фиксации углекислоты только в присутствии окисляемых

соединений серы. В то время как НupSL гидрогеназа проводит ту же реакцию вне

зависимости от наличия или отсутствия соединений серы (Laurinavichene et al., 2007). О2-

зависимое окисление водорода НupSL гидрогеназой ингибируется тиосульфатом, который

также может выступать в качестве донора электронов. При этом ингибирование

происходит на уровне экспрессии. Снижение концентрации тиосульфата в среде с 4 до 2

г/л ведет к 16-кратному увеличению уровня hupSL мРНК (Palagyi-Meszaros et al., 2009).

Хотя в природе кислородное дыхание может быть выгодно для выживания бактерий в

изменяющихся с аэробных на анаэробные (и наоборот) условиях, но вопрос роста

бактерии при использовании в таком случае водорода как донора электронов остается

открытым, поскольку синтез НupSL гидрогеназы подавляется кислородом (Laurinavichene

et al., 2007). Возможность использования других акцепторов для окисления Н2 в темноте в

настоящий момент исследуют. В отличие от Wolinella succinogenes, Нup-зависимое

восстановление серы не обнаружено у T. roseopersicina (Dietrich, Klimmek, 2002; Tengolics

et al., 2014).

Малую и большую субъединицы белка кодируют гены hupS и hupL hupSLCDHIR-

оперона (Colbeau et al., 1994). В то время как для ряда бактерий, таких как Rhodobacter

capsulatus и Ralstonia eutropha, показано, что экспрессия гидрогеназ регулируется уровнем

водорода в окружающей среде, эксрессия НupSL гидрогеназы T. roseopersicina

коститутивна (Maroti et al., 2010b). В данном микроорганизме не синтезируются

регуляторные гидрогеназы. Продукт гена hupС гомологичен цитохромам b-типа, которые

обычно заякорены в мембране и переносят электроны с Нup-гидрогеназ на хиноны (Gross

et al., 2004; Maroti et al., 2010b; Tengölics et al., 2014). HupC белок, видимо, выполняет

туже функцию и у T. roseopersicina. Было показано, что в отсутствие белка HupC

гидрогеназная активность в мембранной фракции почти отсутствует. Но и в растворимой

фракции активность оказывается значительно ниже, что может свидетельствовать о том,

что без HupC гидрогеназа НupSL менее стабильна. HupC влияет на активность белка in

vivo и на его экспрессию, но не участвует с созревании белка. По видимому, HupC белок

создает функциональный комплекс с большой и малой субъединицами in vivo и участвует

в передаче электронов с гидрогеназы (Tengolics et al., 2014).

1.2.2.2. HupUV-гидрогеназа.

Гены сенсорной гидрогеназы HupUV были обнаружены в геноме Thiocapsa

roseopersicina. Также были обнаружены гены вспомогательных белков HupR и HupТ,

37

необходимые для регуляторного каскада (Maroti et al., 2010). Лишь у небольшого

количества микроорганизмов, например метаногенов, гидрогеназы экспрессируются

конститутивно. В большинстве случаев синтез гидрогеназ регулируется различными

изменениями в условиях среды, в том числе наличием водорода. Так у Rhodobacter

capsulatus в сигнальном пути, активирующем синтез гидрогеназы HupSL, участвуют

HupUV (регуляторная гидрогеназа), HupT (киназа), HupR (регулятор ответа, Elsen et al.,

2003). Хотя гены регуляторной системы присутствуют в геноме, экспрессия ни одной из

гидрогеназ T. roseopersicina не регулируется подобным образом. Показано, что гены hupU,

hupV, hupT не экспрессируются у данного микроорганизма (Kovacs et al., 2005a).

1.2.2.3. Hox 1-гидрогеназа.

Одна из двух цитоплазматических Hox-гидрогеназ Thiocapsa roseopersicina, была

обнаружена раньше и обозначается как Hox1 (Maroti et al., 2010a). Данный фермент

является аналогом НАД+-восстанавливающих цианобактериальных гидрогеназ,

относящихся к 3 группе цитоплазматических мультисубъединичных [NiFe]-гидрогеназ

(Rakhely et al., 2007). Это первая подобная гидрогеназа, найденная не у цианобактреий, но

некоторое время назад подобный фермент был обнаружен у родственного организма

Allochromatim vinosum (Long et al., 2007). Структура hox1 оперона предполагает

гетеропентамерную структуру фермента HoxEFUYH. Две субъединицы HoxF и HoxU

ответственны за диафоразную активность, а HoxY и HoxH представляют собой малую и

большую субъединицу гидрогеназы, соответственно (Rakhely et al., 2004). HoxE

прикрепляется к диафоразной части фермента. Предполагается, что HoxE in vivo

принимает участие в переносе электронов. Показано, что белок HoxE необходим для

активности гидрогназы in vivo, но его отсутствие не влияет на активность фермента in

vitro (Palagyi-Meszaros et al., 2009).

Hoх1-гидрогеназа отвечает за длительное светозависимое и темновое выделение

водорода. На свету образование водорода идет при наличии тиосульфата, сероводорода,

сульфитов и серы. Эти вещества выступают в качестве доноров электронов, которые

поступают в электронтранспортную цепь, где в результате обратного транспорта

электронов образуется НАДН. Hoх-гидрогеназа окисляет полученный НАДН с

образованием водорода (Rakhely et al., 2007). В темноте H2 образуется за счет окисления

НАДН, полученного в процессе ферментации, но содержание серы в клетках оказывает

ингибирующий эффект на выделение H2 (Rakhely et al., 2007; Tengolics et al., 2014). Сброс

избытка восстановительных эквивалентов у пупрпурных серных бактерий может также

происходить за счет выделения H2S. Поскольку образование сероводорода в данном

38

случае энергетически более выгодный процесс, то он подавляет образование водорода при

наличии в клетках серы. Поэтому сообщений о выделении водорода в темноте

пурпурными серными бактериями крайне мало (Mas, Gemerden, 1995; Rakhely et al., 2007).

Кроме того, часть образованного Hoх1-гидрогеназой водорода может быть использована

Hyn-гидрогеназой на восстановление серы (Laurinavichene et al., 2007).

Hoх1-гидрогеназа, как и Нup, способна к окислению водорода для ассимиляции

углекислоты, но в отличие от Нup, только в присутствии соединений серы. При наличии

S0

(или тиосульфата) как основного донора электронов для фотосинтеза, фермент может

образовывать дополнительные молекулы НАДН для синтеза гликогена (Laurinavichene et

al., 2007). Также Hoх 1-гидрогеназа участвует в светозависимом поглощении водорода,

образованном нитрогеназой при фиксации азота (Rakhely et al., 2004).

1.2.2.4. Hox 2-гидрогеназа.

Возможность наличия у Thiocapsa roseopersicina еще одной гидрогеназы была

отмечена в 2004 году (Rakhely et al., 2004). В штамме с неактивными Hyn SL, HupSL, Hox1

гидрогеназами при фотомиксотрофных условиях роста (использовались углекислота и

органические вещества) на поздних стадиях культивирования обнаруживали небольшуя

гидрогеназнуя активность in vivo и in vitro. В то время как в тех же условиях у штамма

мутантного по гену hypF активность не наблюдали. Поскольку белок HypF необходим для

созревания гидрогеназ (Fodor et al., 2001), предположили наличие еще одной гидрогеназы

у данного микроорганизма. Впоследствии оказалось, что Thiocapsa roseopersicina первая

бактерия, у которой обнаружили более одной гидрогеназы Hox-типа. Единственное

описание Hox2 гидрогеназы приведено в работе Maroti с соавторами (Maroti et al., 2010a).

Если Hox1-гидрогеназу тиокапсы относят к цианобактериальному типу Hox-

ферментов, то Hox2 имеет большее сходство с растворимой гидрогеназой Methylococcus

capsulatus и напоминает НАД+-восстанавливающие гидрогеназы представителей класса

Gammaproteobacteria (например, растворимую гидрогеназу Ralstonia eutropha Н16, Tran-

Betcke et al., 1990). Hox2-гидрогеназа кодируется 4 генами (hox2FUYH). Хотя многие Hox-

гидрогеназы содержат 5 субъединиц, но в геноме Thiocapsa roseopersicina генов

потенциально возможной 5 субъединицы не было обнаружено (Maroti et al., 2010a).

Гены hox2 оперона экспрессируются на низком уровне, когда клетки растут в

стандартной среде Пфенинга и фиксируют N2. Показано, что добавление глюкозы при

репрессии нитрогеназы индуцирует экспрессию Hox2, но только при низких

концентрациях тиосульфата в среде (2 г/л). Тиосульфат не может служить источником

электронов для Hox2 in vivo и просто снижение его концентрации не вызывает индукцию

39

экспрессии Hox2. Предполагают, что клетки в качестве источника электронов используют

прежде всего тиосульфат, когда же его концентрация снижается, начинают

метаболизировать глюкозу, в процессе чего электроны поступают на Hox2-гидрогеназу,

которая образует молекулярный водород. Поэтому высокие концентрации тиосульфата

подавляют экспрессию Hox2 даже при наличии глюкозы в среде. При этом базовой

концентрации Hox2 в клетке, по видимому, становится недостаточно при переходе к

метаболизму глюкозы. Hox2 катализирует и обратную реакцию окисления водорода. Но

при наличии в мутантном штамме только данной гидрогеназы, она может восполнить

только часть поглощающей активности, присущей дикому штамму (Maroti et al., 2010a).

1.2.2.5. HynSL-гидрогеназа.

Это еще одна мембраносвязанная гидрогеназа T. roseopersicina, раньше

обозначавшаяся как HydSL. Так же как HupSL она ориентирована в периплазму и имеет

Tat-сигнальные последовательности, за счет чего переносится через мембрану при

помощи Тat-системы секреции (Palagyi-Meszaros et al., 2009). Но при этом, в отличие от

HupSL, она устойчива к инактивации кислородом, выделяется из мембран в виде

активного димера. Температурный оптимум фермента составляет 80°С, хотя T.

roseopersicina мезофильный микроорганизм (Kovacs et al., 2005c). Гены большой hynL и

hynS малой субъединицы расположены в опероне нестандартно. Между ними находятся

промежуток в 1979 пар нуклеотидов, в котором расположены 2 открытые рамки

считывания isp1 и isp2 (Rakhely et al., 1998). Isp1 это трамсмембранный протеин

содержащий гем b-типа, а Isp2 белок, гомологичный гетеросульфидредуктазе (Rakhely et

al., 1998; Dahl et al., 1999; Palagyi-Meszaros et al., 2009). Isp2 белок также схож с DsrK-

белком системы окисления серы у пурпурных серных бактерий (Dahl et al., 1999; Tengolics

et al., 2014). Ген, гомологичный isp2, у Acidianus ambivalens входит в кластер генов

мембраносвязанной гидрогеназы, которая в клетках образует комплекс совместно с

мебраносвязанной периплазматической Н2:полисульфид оксидоредуктазой (Laska et al.,

2003).

Было показано, что оба белка Isp1 и Isp2 важны для функционирования

гидрогеназы in vivo. Предполают, что они играют роль переносчиков электронов на/с

HynSL-гидрогеназы (Maroti et al., 2010b). При отсутствии функциональных Isp белков

HynSL-гидрогеназа полностью теряет способность образовывать H2, частично теряется

активность по поглощению водорода in vivo. При этом отсутствие Isp белков не

сказывается на работе фермента in vitro (Palagyi-Meszaros et al., 2009). Также Isp1 и Isp2 не

влияют на посттрансляционное созревание гидрогеназы и уровень ее экспрессии.

40

Поскольку Isp1 интегрирован в мембрану, правдоподобной казалась теория, что HynSL-

гидрогеназа связана с мембраной через этот белок. Однако было установлено, что HynSL

остается в мембранной фракции вне зависимости от наличия или отсутствия Isp1.

Гидрогеназа слабо связана с мембраной и легко может быть «смыта» с ее поверхности

(Palagyi-Meszaros et al., 2009).

В работе (Abdullatypov, Tsygankov, 2015) представлена предполагаемая модель

фермента (Рис. 8.), полученная на основе гомологичного моделирования, где в качестве

шаблонной структуры была взята трёхмерная структура гидрогеназы HydSL

Allochromatium vinosum.

Рис. 8. Модель гидрогеназы HynSL T. roseopersicina.

а - общий вид полноразмерного фермента. С-концевой фрагмент выделен

фиолетовым; б – реконструированный активный центр. Атом никеля выделен

оранжевым, железа – фиолетовым, углерода – голубым, кислорода – красным, азота –

синим, магмия – желтым. Атомы координирующих остатков показаны в виде палочек:

зелёный – сера, голубой – углерод, красный – кислород; в – FeS кластеры малой

субъединицы. Атом железа окрашен фиолетовым, серы - зеленым.

HynSL-гидрогеназа может функционировать как на выделение, так и на

поглощение водорода (Szilagyi et al., 2002). Выделение водорода зависит от содержания в

среде или клетках тиосульфата и элементарной серы. Показано, что выделение водорода

светозависимое и зависит от протондвижущей силы. Донорами электронов для

41

образования водорода могут выступать только те вещества, которые передают электроны

в активный центр через цитохром с (тиосульфат, сера). Сульфит, органические вещества,

такие как глюкоза и сукцинат, не могут стимулировать образование водорода HynSL ни на

свету, ни в темноте (Tengolics et al., 2014).

Поглощение водорода HynSL также возможно. Электроны, полученные в этом

процессе, могут быть использованы на восстановление S0

(образование сероводорода) или

нитрата. Выделение водорода HynSL и образование сероводорода - конкурирующие

процессы (Tengolics et al., 2014). HynSL может окислять водород, полученный при работе

нитрогеназного комплекса, в темноте, в то время как на свету этот процесс могут

осуществлять HupSL и Hox1 гидрогеназы. Также HynSL окисляет водород, выделяемый

Hox1 в темновых условиях для сброса избытка восстановленных эквивалетов при

катаболизме органических соединений (Laurinavichene et al., 2007).

Физиологическую роль HynSL-гидрогеназы, как при окислении, так и при

восстановлении водорода связывают с работой электронтранспортной цепи фотосинтеза

(Maroti et al., 2010b; Tengolics et al., 2014). Гены hynS-isp1-isp2-hynL транскрибируются

совместно (Rakhely et al., 1998) и регулируются кислородом через FnrT-гомолога(Kovacs

et al., 2005b) редокс-регуляторной системы FNR(Fumarate and Nitrate Reductase), которая

через активатор транскрипции- FNR регулирует экспрессию многих генов, участвующих в

анаэробных процеесах.

1.2.3. Созревание гидрогеназ в Thiocapsa roseopersicina.

Помимо структурных генов гидрогеназ важную роль играют вспомогательные

гены, ответственные за созревание белка в клетке. У представителей Proteobacteria

имеется как минимум 7 hyp генов (hypA, hypB, hypC, hypD, hypE, hypF) и эндопептидаз,

отвечающих за сборку и созревание гидрогеназ (Vignais, Billoud, 2007). Общие принципы

созревания гидрогеназ распространияются и на T. roseopersicina, но вариации в

специфичности вспомогательных белков могут наблюдаться, когда клетки экспрессируют

несколько гидрогеназ, связанных с различными метаболическими путями в клетке (Maroti

at al., 2010 a,b).

У T. roseopersicina вспомогательные гены расположены не в одном опероне, а

распределены по всему геному. Несколько, hupDHI, hoxW, hynH, были обнаружены в

непосредственной близости от структурных генов (Colbeau et al., 1994; Rakhely et al.,

2004), другие были найдены при помощи транспозонного мутагенеза: hypC1, hypC2 , hypD,

hypE, hypF, hynD, hupK (Fodor et al., 2001; Maroti et al., 2003). Позже на основании

сиквенса генома было установлено наличие hypA и hypB генов (Maroti at al., 2010b). С

42

помощью мутационного анализа было установлено, что белки HypD, HypE и HypF

необходимы для созревания всех гидрогеназ T. roseopersicina, HupK участвует в

созревании мембраносвязанных (HynSL и Hup SL), в то время шапероны HypC1 и HypC2

плейотропны (Maroti et al., 2003, Maroti et al., 2010b). Оба белка HypC взаимодействуют с

HynL и HoxH субъединицами, в то время как только HypC2 взаимодействует с HypD и

HupK. Три эндопептидазы HynD, HupD и HoxW высокоспецифичны и участвуют в

последнем этапе сборки больших субъединиц HynL, HupL и HoxH (Maroti et al., 2010b). В

то же время при гетерологичной экспрессии структурных генов HynSL-гидрогеназы

T. roseopersicina совместно с вспомогательными генами в Escherichia coli не

формировался активный фермент. Этот факт свидетельствует о том, что имеются

дополнительные неизученные вспомогательные белки, участвующие в формировании

активного фермента (Weyman et al., 2011).

1.3. Биосенсоры.

1.3.1. Общие принципы строения.

Датчики (сенсоры) позволяют собирать и фиксировать информацию о состояниях

физических систем. Это может быть информация о химическом составе, форме, строении,

положении и динамике (Егоров и др., 2008). Все сенсоры можно разделить на три типа

(Эггинс, 2005):

1. Физические

2. Химические

3. Биологические

Принципы действия физических сенсоров, их преимущественно называют

датчиками, базируются на определенных физических явлениях и свойствах, служат для

определения температуры, давления и т.д. (Эггинс, 2005). Химические сенсоры – это

устройства, избирательно реагирующее на конкретный химический объект путем

химической реакции и которые можно использовать для качественного или

количественного определения этого объекта – «аналита» (Каттралл, 2000). Биологические

сенсоры отличаются от химических только тем, что в качестве чувствительного элемента

выступает вещество биологической природы (Эггинс, 2005; Turner, 2013).

Принципиально химические сенсоры состоят из двух основных частей:

чувствительный (распознающий) элемент и преобразователь сигнала (Lowe, 1989;

Каттралл, 2000; Nakamura, Karube, 2003; Эггинс, 2005; Newman, Setford, 2006; Turner,

2013). Также некоторые авторы отдельно выделяют устройство обработки сигнала,

которое представляет полученную от преобразоватля информацию в удобном для

43

пользователя виде - на экране устройства возникает числовое отображение исследуемого

параметра в нужных единицах измерения (Эггинс, 2005).

Рис. 9. Схема химического сенсора (биосенсора; модифицировано по Newman,

Setford, 2006).

1.3.2. Преобразователи сигнала.

1.3.2.1.Оптические преобразователи.

Действие оптических преобразователей сигнала может быть основано на

спектроскопии поглощения, флуоресцентной, люминисцентной, спектроскопии

внутреннего отражения, поверхностного плазмонного резонанса и светорассеяния

(Cooper, 2002; Fan et al., 2008). Таким образом, классическая спектрофотометрия в

видимой и ультрафиолетовой областях является примером такого типа измерений

(Каттралл, 2000; Исмаилов, Алескерова 2015). Но совершенно иные возможности для

применения оптические преобразователи приобрели с появлением волоконной оптики.

Оптическое волокно в таком случае выполняет функцию волновода, а биологический

материал, выполняющий функцию чувствительного элемента, может быть расположен в

специальной ячейке на конце, в «окне» волновода (рис. 10), либо на его поверхности.

Изменения, происходящие в чувствительном элементе, будут оказывать влияние на

характеристики проходящих в оптическом волокне волн (поляризация, фаза,

интенсивность и тд). Использование оптических волокон позволяет миниатюризировать

оптические сенсоры, а так же использовать их для анализа отдаленных объектов (Эггинс,

2005).

44

а б

Рис. 10. Схема оптического сенсора. а - со встроенной внутренней ячейкой; б - С

ферментами, иммобилизованными на внешней стенки волновода (Эггинс, 2005).

1.3.2.2. Пьезоэлектрические (масс-чувствительные) преобразователи.

В пьезоэлектрических, или масс-чувствительных, сенсорах в качестве

преобразователя используются пьезокристаллы. Электрический сигнал в таких

устройствах возникает за счет колебаний кристалла, частота которых зависит от массы

вещества, адсорбированного на его поверхности (Эггинс, 2005). Так, детекция вещества

происходит при его реакции с чувствительным слоем, нанесенном на поверхность

кристалла. Например, при иммобилизации на поверхности кристалла антител, масса

увеличивается за счет присоединения антигена (Петрухин, Максименко, 2008).

1.3.2.3. Калоримертические (термометрические) преобразователи.

Термометрические преобразователи реагируют на изменения температуры (Thakur,

Ragavan, 2013). Многие биологические процессы протекают с выделением тепла. В

преобразователях такого вида используют термисторы - устройства, реагирующие на

незначительные колебания температуры. В основе работы термисторов лежит явление

уменьшения электрического сопротивления (примерно 4-7% на 1°С) сплавленных при

высоких температурах оксидов металлов (BaO/CaO, оксиды некоторых переходных

металлов). Терморезисторы удобны для измерений температуры с точностью ± 0,005°С

(Каттралл, 2000). Терморезисторы можно изготовить различных размеров и форм, что

дает возможность значительно миниатюризировать сенсоры (Ramanathan, Danielsson,

2001).

1.3.2.4. Электрохимические преобразователи.

Это самый распространенный тип преобразователей. При их использовании

определяемый компонент реагирует с чувствительным слоем непосредственно на

электроде или в объеме слоя раствора около электрода. Среди электрохимических

45

сенсоров выделяют следующие: потенциометрические, амперометрические,

кондуктометрические (Mehrvar, Abdi, 2004).

Потенциометрические преобразователи основаны на ионоселективных электродах,

которые дают селективный отклик на присутствие определяемых ионов или молекул

веществ в растворах (Pohanka, Sklаdal, 2008). Аналитическим сигналом в них является

потенциал, который образуется на поверхности твердого материала, помещенного в

раствор, содержащий ионы, которые могут обмениваться с поверхностью. Величина

потенциала связана с количеством ионов в растворе. Измерить поверхностный потенциал

непосредственно невозможно, однако его можно измерить, используя соответствующую

электрохимическую ячейку и электрод сравнения (Bakker, Pretsch, 2005).

В случае вольтамперометрии измеряют силу тока в электрохимической ячейке как

функцию приложенного потенциала (Chaubey, Malhotra, 2002). Многие вещества

окисляются или восстанавливаются при определенном потенциале, который характерен

именно для данного вещества. Если потенциал зафиксирован на величине,

соответствующей окислению или восстановлению определяемого вещества, то сила тока

прямо связана с его концентрацией. На этом принципе основано действие

амперометрических электрохимических сенсоров (Егоров и др., 2008). Чувствительность

амперометрических электрохимических сенсоров, как правило, выше

потенциометрических (Pohanka, Skladal, 2008).

Химические реакции в большинстве случаев сопровождаются изменением состава

раствора. Как правило, при этом меняется его электропроводность, что может быть

количественно охарактеризовано кондуктометрическими сенсорами. (Grieshaber et al.,

2008).

1.3.3. Чувствительные (распознающие) элементы.

Распознающий элемент - основной компонент любого сенсора. Именно он

определяет способность прибора избирательно реагировать на один или несколько

аналитов среди множества других веществ. Он определяет чувствительность и

селективность сенсора, точность его измерений. Взаимодействуя с аналитом,

чувствительный элемент выдает сигнал: изменение цвета, флуоресценции, потока

электронов и т.п. Этот сигнал фиксируется преобразователем, который преобразует

интенсивность сигнала в данные о количестве аналита (Каттралл, 2000). В случае

биосенсоров распознающим элементом могут выступать различный биологический

материал: ферменты, ткани, бактерии, дрожжи, антигены/антитела, липосомы, органеллы,

рецепторы, ДНК (Решетилов, 2005). Преимуществом биологического материала является

46

высокая селективность и чувствительность (Evtugyn, 2014). Мы остановимся на

нескольких более подробно.

1.3.3.1. Антитела.

Антитела – гликопротеины сыворотки крови, которые продуцируются клетками

иммунной системы в ответ на появление в организме инородных тел (антигенов). Синтез

антител могут вызвать бактерии, вирусы, их части (фрагменты мебран, ДНК), белки, ряд

лекарств и т.п. (North, 1985; Lu et al., 2014; Fakanya, Tothill, 2014; Bahadır,Sezgintürk 2015).

Взаимодействие антиген-антитело очень специфично, некоторые антитела способны

различать и взаимодействовать только с одним из оптических изомеров вещества

(Evtugyn, 2014).

Ряд факторов влияет на иммуногенность каждой конкретной молекулы, т.е. на ее

способность вызывать иммунный ответ. Не на все анализируемые вещества можно

получить антитела. Основными параметрами являются инородность молекулы для

организма, ее молекулярная масса и химическая структура. Иммунная система животного

не будет реагировать на белки своего организма, но ответ появится на чужеродный белок.

Молекулы, способные вызвать сильный иммунный ответ, в среднем имеют молекулярную

массу более 100 kDa. Молекулы, с молекулярной массой меньше 10 kDa слабо- или

неиммуногенны (Byfield, Abuknesha, 1994). Однако ряд низкомолекулярных соединений,

называемых гаптенами, способны вызывать иммунный ответ и взаимодействовать с

антителами в том случае, если они внутри организма предварительно связываются с

какими-то биополимерами. Это свойство гаптенов может быть использовано при

получении к ним антител (Evtugyn, 2014).

В таких сенсорах могут быть использованы пьезоэлектрические,

электрохимические и оптические преобразователи. Так в пьезоэлектрических сенсорах

измерение происходит путем детекции изменения массы чувствительного слоя, что и

происходит при взаимодействии антитела с антигеном. На таком принципе основаны

сенсоры на ряд патогенов, полютантов (Karaseva, Ermolaeva, 2012; Bisoffi at al., 2013;

Sharma, Mutharasan, 2013; Verma, Bhardwaj, 2015).

1.3.3.2. Рецепторы.

In vivo рецепторы (обычно белки) реагируют на присоединение к ним какого-то

вещества путем изменения конформации, тем самым запуская ответ клетки на этот

«раздражитель». Так существуют рецепторы на гормоны, аминокислоты, инсулин,

нейротрасмиттеры, а так же на ряд синтетических соединений, таких как лекарства

47

(Эггинс, 2005). Рецепторы интересны для использования в качестве чувствительных

элементах в сенсорах с той точки зрения, что они изначально рассчитаны не только на

передачу сигнала в клетке, но и на его усиление, а также высокоспецифичны, поскольку

сайт связывания оптимизирован для взаимодействия с конкретным лигандом (Byfield,

Abuknesha, 1994). Примером приборов, в которых в качестве чувствительного элемента

используются рецепторы, может служить оптический сенсор на ацетилхолин (Rogers at al.,

1989), а так же потенциометрический сенсор на рибофлавин (Yao, Rechnitz, 1987).

Поскольку получение чистых препаратов рецепторов в большинстве случаев крайне

затратно и длительно, а большинство рецепторов после изоляции быстро теряют

активность, то в настоящее время ведутся исследования по созданию искусственных

рецепторов (Vo-Dinh, Cullum, 2000).

1.3.3.3. Клетки.

В качестве чувствительного компонента сенсоров могут выступать как отдельные

клетки многоклеточных организмов, так и одноклеточные организмы. Чаще в подобного

рода биосенсорах находят применение клетки бактерий, одноклеточных водорослей и

дрожжей, поскольку они более устойчивы к различного рода воздействиям (Byfield,

Abuknesha, 1994). В некоторых случаях клетки могут быть заменены на орагнеллы

(митохондрии, пластиды), липосомы, и даже отдельные ферменты или ферментные

комплексы. В случае использования бесклеточных систем сенсоры будут более

специфичны и время ответа будет меньше (Evtugyn, 2014). Но в тоже время использование

интактных клеток имеет ряд преимуществ. Во-первых, это значительно дешевле,

поскольку не требует затрат на очистку ферментов, получения фракций отдельных

органелл и т.п. Во-вторых, не требуется подбирать условия для работы ферментов,

реакции проходят в естественных, оптимальных условиях. В таких сенсорах можно

использовать многокомпонентные превращения исходного аналита, с детекцией

конечного продукта. А также широкая специфичность не всегда является недостатком,

иногда требуется детекция определенной группы веществ (Byfield, Abuknesha, 1994;

Alenina et al., 2012; Ефременко и др., 2014). При использовании интактных клеток для

действий тех или иных химических агентов (токсинов, мутагенов) имеется больше

мишеней для воздействия, чем в случае использования бесклеточных систем (Исмаилов,

Алескерова, 2015). В настоящее время существуют различные методы иммобилизации

клеток (Готовцев и др., 2015), что также способствует развитию данного направления.

В большинстве таких сенсоров используют электрохимические преобразователи

(Khlupova et al., 2007; Hnaien et al., 2011; Evtugyn, 2014). Но в последнее время повысился

48

интерес к оптическим методам детекции. Так в сенсорах, основанных на интактных

клетках фотобактерий, интенсивность свечения клеток служит количественным

индикатором общей или специфичной токсичности образца. При использовании такого

теста как первичного, можно определить присутствуют ли в среде токсические агенты в

опасной для живого организма концентрации. В тоже время существуют системы

специфической детекции токсинов на основе генно-инженерных штаммов, в которых

активируется свечение при включении специфических генов-мишеней (Chun et al., 1996;

Kohler et al., 2000; Dizer et al., 2002).

1.3.3.4. Ферменты.

В настоящее время в большей части выпускаемых в промышленности биосенсоров

в качестве чувствительного элемента используются ферменты. Различные ферменты

катализируют большое количество разнообразных реакций, поэтому сенсоры на их основе

могут быть сконструированы для широкого спектра соединений (Эггинс, 2005). В

настоящее время самым распространенным типом является сенсор на глюкозу. Для

сенсоров на основе ферментов могут быть использованы преобразователи различных

типов (Evtugyn, 2014). Ниже мы подробнее остановимся на электрохимических

ферментных сенсорах.

1.3.4. Ферментные электрохимические сенсоры.

Выделяют три, так называемых, поколения ферментных электрохимических

биосенсоров (Ahuja et al, 2007; Putzbach, Ronkainen, 2013):

1. В первом поколении сенсоров детектировалось изменение концентрации субстрата

или продукта реакции. Продукт (субстрат) реакции диффундировал к электроду,

вызывая электрический сигнал.

2. Во втором поколении перенос электронов от фермента к электроду

осуществляется при помощи медиаторов – низкомолекулярных редокс-активных

соединений.

3. В сенсорах третьего поколения фермент иммобилизован на электроде. В таком

случае диффузия (продукта реакции, медиатора) не вносит вклад в анализ.

Фермент может быть иммобилизован вместе с медиатором, а для ряда ферментов

возможен прямой перенос электронов от активного центра на электрод.

В первых биосенсорах, основанных на электроде Кларка, определяли скорость

ферментативной реакции оксидоредуктаз по потреблению кислорода, который шел на

окисление субстрата, либо амперометрически измеряли уровень пероксида водорода -

49

продукта реакции многих оксидоредуктаз (Clark , Lyons, 1962; Davis, 1985). Однако в

таком случае на измерение концентрации кислорода в образце влияет его концентрация в

окружающей среде, а также наличие в образце веществ, которые могут быть окислены.

Так же при высоском напряжении, необходимом для окисления Н2О2, ошибку вносят

электроактивные соединения, часто присутствующие в образцах, например, аскорбиновая

и мочевая кислота в крови (Putzbach, Ronkainen, 2013).

1.3.4.1. Прямой и медиаторный биоэлектрокатализ.

В ферментных электрохимических сенсорах используется явление

биоэлектрокатализа – использования ферментов для ускорения электродных процессов,

поскольку скорость ферментативного превращения веществ значительно выше

электрохимического (Дамаскин, Петрий, 1987). Соответственно, по способу передачи

электрона с активного центра фермента на электрод выделяют прямой и медиаторный

биоэлектрокатализ.

Далеко не все ферменты способны передавать электроны непосредственно на

электрод (прямой биоэлектрокатализ), что обусловлено большим расстоянием между

редокс-активным центром и электродом. Для детекции сигнала от таких ферментов с

помощью электрохимических методов перспективно использовать медиаторы (Chaubey,

Malhotra, 2002; Silveira, Almeida, 2013). Под медиатором понимается низкомолекулярная

редокс-пара, которая переносит электроны от редокс-центра фермента к поверхности

индикаторного электрода. В каталитическом цикле медиатор сначала реагирует с

восстановленным ферментом и затем диффундирует к поверхности электрода, где

подвергается быстрой электрохимической реакции с переносом заряда (Биосенсоры...,

1992). В качестве медиаторов могут выступать природные и синтетические соединения,

такие как небольшие белки, например цитохромы, ряд коферментов (НАДН, ФАДН2 и

др), редокс-красители, органические и неорганические молекулы и ионы (Биосенсоры...,

1992; Silveira, Almeida, 2013). Для эффективного выполнения своих функций медиаторы

должны обладать рядом свойств (Chaubey, Malhotra, 2002) :

1. быстро реагировать с ферментом;

2. электрохимическое превращение медиатора должно быть быстрым и обратимым;

3. разница редокс потенциалов медиатора и редокс-активной группы в активном

центре фермента не должна быть чрезвычайно высокой;

4. медиатор должен быть устойчив как в окисленной, так и в восстановленной

формах;

5. восстановленный медиатор не должен окисляться кислородом;

50

Медиаторы могут находиться в растворе, могут быть иммобилизованы вместе с

ферментами на электроде (Chaubey, Malhotra, 2002; Moyo et al., 2012; Silveira, Almeida,

2013). Для иммобилизации могут быть использованы различные методы, ниже они будут

рассмотрены подробнее.

Использование медиаторов в биосенсорах дает ряд преимуществ (Chaubey,

Malhotra, 2002):

1. Измерения меньше зависят от концентрации кислорода;

2. Рабочий потенциал ферментного электрода определяется окислительным

потенциалом медиатора;

3. При использовании медиатора с низким значением окислительного потенциала,

можно избежать влияния многих нежелательных соединений;

4. Если окисление или восстановление медиатора не связано с протонами, то на

работу такого ферментного электрода до определенной степени не должен влиять

рН среды;

Для гидрогеназ показано, что ввиду низкого равновесного потенциала самой

реакции, фермент способен восстанавливать большое число медиаторов, например:

метилвиологен, бензилвиологен, НАДН, НАДФН, ферри/ферроцианид. Кроме того, в

качестве медиатора возможно использовать цитохром c3 (Кондратьева, Гоготов, 1981).

Наиболее применимым из этих медиаторов является метилвиологен (N,N'-диметил-,'-

дипиридил, Yagi et al., 1975).

Явление прямого биоэлектрокатализа впервые было продемонстрировано

сравнительно недавно, в 80-х годах двадцатого века. Несколько групп ученых независимо,

примерно в одно время опубликовали работы, в которых сообщалось о способности

лакказы и цитохрома с напрямую переносить электроны на электрод (Eddowes, Hill, 1977;

Yeh, Kuwana, 1977; Березин и др., 1978). В одной из первых работ в этой области такая же

возможность была показана и для гидрогеназы (Yaropolov et al., 1984). В настоящее время

способность к прямому биоэлектрокатализу была показана для целого ряда ферментов

таких как лакказы, пероксидазы, каталазы, оксидазы (Ferapontova et al., 2005).

Хотя на данный момент в литературе можно встретить много примеров, все же

способность к прямому переносу электронов характерна для небольшого количества

ферментов. Долгое время такой процесс вообще считали невозможным (Frew, Hill, 1988;

Silveira, Almeida, 2013). Одна из главных причин кроется в строении молекулы ферментов,

потому как активный центр большинства из них расположен внутри глобулы

полипептида. В таком случае передача электрона напрямую к электроду и от него

невозможна без значительных изменений в конформации (Wollenberger et al., 2008). Для

51

прямого переноса редокс-активный центр должен быть расположен близко к поверхности

белковой глобулы, либо у фермента должна быть система переноса электронов от

активного центра к поверхности пептида. Так у гидрогеназ электроны передаются от

активного центра на электрод через систему Fe-S-кластеров (Vignais, Billoud, 2007).

Ферменты, способные к прямому биолектрокатализу, в клетке участвуют в путях переноса

электронов. Строение таких ферментов предполагает передачу электрона от активного

центра на редокс-активный центр другой молекулы (Ferapontova et al., 2005; Wollenberger

et al., 2008).

Другой из причин, по которой явление прямого биоэлектрокатализа было

продемонстрировано сравнительно недавно, является тот факт, что для эффективного его

протекания требуется постоянное и надежное взаимодействие между электродом и

ферментом. Эффективность прямого биоэлектрокатализа для растворенных молекул

ферментов, как правило, низкая. Это объясняется крайне низкой скоростью диффузии

биомолекул к поверхности электрода и значительными стерическими затруднениями

(Frew, Hill, 1988). В тоже время процесс иммобилизации может негативно сказаться на

активности и стабильности фермента за счет изменения его трехмерной структуры и

резкого ограничения подвижности. Проблемы также могут возникнуть в случае

непрочного и нестабильного связывания ферментов с поверхностью, их денатурации на

электроде, неправильной ориентации при иммобилизации (Frew, Hill, 1988; Ferapontova et

al., 2005; Secundo, 2013). Ориентация фермента на поверхности электрода крайне важна,

поскольку для прямой передачи электрона фермент должен быть ориентирован редокс-

активным центром к поверхности электрода. Структура поверхности электрода и состав

раствора, в который он будет погружен, также играют роль (Frew, Hill, 1988).

Существуют разные методы иммобилизации ферментов на поверхности электрода.

Правильно подобранный метод также положительно скажется на характеристиках

сенсора.

1.3.4.2. Методы иммобилизации ферментов.

Иммобилизация - перевод полимера в нерастворимую форму путем включения в

состав инертного носителя или в результате физического или химического связывания на

поверхности преобразователя сигнала (Евтюгин и др., 2007). Это один из ключевых

этапов в создании биосенсора, т.к. от него зависит сама возможность измерения сигнала,

операционные характеристики биосенсора, чувствительность и селективность

определения биологической мишени в матрицах сложного состава. Правильно

подобранный метод иммобилизации может решить проблемы с ориентацией фермента на

52

электроде, потерей фермента в процессе работы из-за инактивации или перехода из

иммобилизованной формы в раствор (Secundo, 2013). Классификация способов

иммобилизации у разных авторов может отличаться, так как зачастую подходы

объединяют разные методы и определить их в какую-то определенную группу сложно

(Brady, Jordaan, 2009; Sassolas et al., 2012; Evtugyn, 2014). Все методы можно разделить на

две группы: физическая (нековалентная) и ковалентная иммобилизация.

Рис. 11. Схематическое представление основных методов иммобилизации. Е-

фермент, P-белок (Sassolas et al., 2012).

1.3.4.2.1. Методы нековалентной иммобилизации.

Адсорбция. Метод практически не нарушает нативной конформации фермента

(Эггинс, 2005). Биополимер удерживается на инертном носителе за счет

электростатических, ван-дер-вальсовых, ионных и водородных взаимодействий, которые

достаточно слабы, но множественны и обеспечивают относительно прочное связывание

(Sassolas et al., 2012). Сорбция во многом зависит от своиств поверхности – ее заряда,

наличия полярных групп, величины редокс-потенциала, энергетической однородности и

т.д. Предварительная обработка поверхности носителя с целью получения (внесения)

заряженных или полярных групп способствует адсорбции ферментов. С этой целью

используют различные методы окисления, модификации полимерами и т.п. (Евтюгин и

др., 2007). К недостаткам такой техники можно отнести непрочное связывание ферментов,

низкую стабильность ферментного слоя (Ahuja et al., 2007). Для повышения стабильности

53

можно использовать дополнительные покровные мембраны или сочетать адсорбцию с

последующей ковалентной сшивкой (Evtugyn, 2014).

Физический захват. Это способ нековалентной иммобилизации, при котором

биологический материал включается в формирующуюся полимерную матрицу. Между

ферментом и мономером не происходит никаких химических реакций, которые бы могли

повлиять на активность. С помощью одного полимера на поверхности преобразователя

можно иммобилизовать несколько разных ферментов. Ферментные электроды,

полученные таким способом, отличаются повышенной операционной стабильностью, а

также стабильностью при хранении. К недостаткам такого метода стоит отнести

затрудненную диффузию к ферменту и от него субстратов и продуктов реакции,

частичное вымывание фермента через поры в слое полимера (Биосенсоры…, 1992).

Золь-гель иммобилизация основана на поликонденсации полимеров

непосредственно на поверхности трансдьюсера в присутствии ферментов. Обычно в

качестве полимера используются орнганосиликаты и силоксаны (Kandimalla et al., 2008).

Электрополимеризация – захват биологического компонента в растущую пленку

полимера, формируемую на поверхности электрода в процессе электролиза. Такой способ

позволяет контролировать величину получаемого слоя, легко поддается автоматизации. В

зависимости от способа проведения электрополимеризации биологические компоненты

могут располагаться под слоем полимера, во всем его объеме или на поверхности. В

последнем случае процесс адсорбции можно проводить при условиях, отличных от

условий электрополимеризации, что позволяет уменьшить потери препарата фермента. В

большинстве случаев используют проводящие полимеры, такие как полианилин,

полипиррол, политиофен (Ahuja et al., 2007).

Фотополимеризация. На поверхность наносят смесь мономеров и биологического

компонента, полимеризацию инициируют ультрафиолетовым излучением. Такой способ

оказывает меньшее денатурирующее действие по сравнению с химической инициацией

схожих реакций (Andreescu et al., 2002).

Включение в полиионные комплексы. Их получают путем взаимодействия

высокомолекулярных полиэлектролитов – поликатионов (полианилин, политианин,

политиофен) и полианионов (нафион, полистиролсульфат, поливинилсульфонат).

Включение биомолекул происходит при процессе формирования комплексов при

послойном осаждениии полиэлектролитов из раствора (Евтюгин и др., 2007). Включение в

синтетические липидные мембраны (пленки Ленгмюра-Блодже). Такие мембраны близки

по свойствам к природным, но сами пленки обладают низкой механической

устойчивостью, а также возможны потери фермента из-за слабого связывания с

54

мембраной. Для повышения устойчивости пленки наносят на поверхность полимеров

либо непосредственно на преобразователь сигнала. Для более прочного связывания

ферментов предлагают ковалентно пришивать ферменты, добавлять дополнительные

компоненты в мембранный слой и т.д. (Girard-Egrot et al., 2005).

Микрокапсулирование и двойное эмульгирование. В этих методах физического

включения в состав полимерной матрицы, при которых предварительно получают прямую

или обратную эмульсию растворов полимера в органическом растворителе и

биологического компонента в воде. После высушивания получают мембрану, в которой

полимерный носитель содержит микрокапсулы воды, содержащие ферменты и

низкомолекулярные ионы электролитов. В отличие от прямого включения в полимер

данный способ позволяет сохранить гидрофильное окружение биополимера на всех

стадиях иммобилизации, что позволяет добиться достаточно высокой активности

фермента (Евтюгин и др., 2007).

Так же ферменты могут быть включены в гели на основе полисахаридов, в

углеродные пасты, глины и т.д. (Sassolas et al., 2012).

Аффинная иммобилизация. В ней используют специфические взаимодействия

между определенными группами природных биологических компонентов. Хотя

аффинные взаимодействия имеют обратимый характер, прочность связывания, а главное,

специфичность взаимодействия обеспечивают надежное закрепление ферментов на

поверхности преобразователя. К тому же такая иммобилизация обеспечивает строгую

правильную ориентацию ферментов относительно поверхности. Одним из наиболее

распространенных способов является авидин-биотиновое связывание (Dupont-Filliard et

al., 2004). Он основан на том, что между природным амином (биотином) и белком

авидином (или стрептовидином) образуется прочный комплекс. Фермент биотинируют -

прикрепляют к нему биотин, например при помощи ковалентного связывания. Авидин,

прикрепленный к трансдьюсеру, обрабатывают раствором биотинированного фермента.

Через авидин-биотиновое взаимодействие фермент прикрепляют к преобразователю

(Sassolas et al., 2012). Также могут быть использованные и другие белок-специфичные

взаимодействия. Конканавалин (лектин, выделяемый из некоторых бобовых)

специфически связывается с маннозными остатками ферментов. Протеин А (белок

микробного происхождения) прочно связывает иммуноглобулины G. Для иммобилизации

ферментов на носителях, модифицированных антигенами, используют коньюгаты этих

ферментов с антителами (Евтюгин и др, 2007).

55

1.3.4.2.2. Ковалентная иммобилизация.

В данном методе идет образование ковалентных связей между молекулами

биополимера и нерастворимым носителем, которым может выступать преобразователь

сигнала биосенсора. Такое связывание необратимо, что позволяет достичь наибольшей

устойчивости иммобилизованного фермента и расширить спектр условий, в которых

сохраняется стабильный сигнал биосенсора и значительно увеличивает срок его службы.

В тоже время зачастую это приводит к снижению активности и стабильности фермента за

счет изменения его трехмерной структуры и резкого ограничения подвижности. (Ahuja et

al., 2007). «Пришивание» белков к преобразователю осуществляется через имеющиеся

функциональные группы полипептидов, которые при этом не должны оказывать влияние

на каталитическую активность фермента. Это могут быть амино- , гидроксильные,

карбоксильные -, тиольные, амидозольные группы, сахаридные остатки гликопротеидов.

(Эггинс, 2005; Евтюгин и др, 2007).

Кросс-сшивка. Некоторыми авторами выделяется в отдельный тип, а некоторые

относят к ковалентной иммобилизации. «Сшивание» осуществляется при помощи таких

бифункциональных сшивающих реагентов как глутаровый альдегид, карбодиимиды, N-

гидроксисукцинимид. Ферменты можно сшивать между собой, а так же со специально

добавляемыми инертными белками, такими как бычий сывороточный альбумин. В таком

случае продукт становится нерастворимый и осаждается на поверхность преобразователя

(Evtugyn, 2014). Но это невыгодно, так как неизбежны потери и неэффективное

использование части ферментного слоя. Поэтому чаще носитель подбирают таким

образом, чтобы он тоже реагировал со сшивающим реагентом (Тернер, 1992).

Заключение

На основании литературных данных можно заключить, что в последние

десятилетия наблюдается значительный прогресс в изучении гидрогеназ, активно

изучаются механизм их действия, функции в клетке, пути созревания, принципы

регуляции синтеза. Помимо фундаментального это обусловлено практическим интересом.

Согласно (Гоготов и др., 2010) можно выделить следующие направления использования

данной группы ферментов:

1. Образование водорода.

1.1. фотокаталитические системы образования водорода.

1.2. водородные ферментные электроды для образования водорода с

использованием электрической энергии.

1.3. образование водорода из металлов и восстановленных соединений.

56

2. Поглощение водорода.

2.1. Водородный ферментный элетрод для топливных элементов.

2.2. Амперометрический биосенсор для водорода.

2.3. Аккумуляция энергии водорода.

2.4. Биосинтез чистых химических веществ.

2.5. Обработка сточных вод, загрязненных тяжелыми металлами.

3. Водород-дейтериевый обмен.

3.1. Препаративное разделение изотопов водорода.

3.2. Освобождение от трития воды, используемой в ядерной энергетике.

3.3. Биосинтез химических веещств, меченных дейтерием или тритием.

Одним из перспективных направлений применения гидрогеназ является

использование их в качествие чувсвтительного элемента в биосенсорах на водород. В

качестве таких сенсорных элементов могут быть использованы различные биологические

объекты, такие как ферменты, ткани, бактерии, дрожжи, антигены/антитела, липосомы,

органеллы, рецепторы, ДНК. Преимуществом биологического материала является

высокая селективность и чувствительность. В настоящее время самое широкое

применение в промышленности нашли ферментные сенсоры. Ферменты крайне

разнообразны по строению и выполняемым в организме функциям, катализируют

большое количество разнообразных реакций, поэтому возможно подобрать сенсорный

элемент к большому количеству веществ. Но для создания биосенсора помимо

специфичности и чувствительности фермент должен обладать рядом характеристик, таких

как простота и дешевизна выделения и очистки, стабильность при хранении и

иммобилизации, наличие удобных для аппаратурного оформления способов регистрации

сигнала, достигаемые аналитические характеристики определения субстрата либо

эффектора. Для полноценного функционирования сенсора нужен комплексный подход и

оптимизация всех указанных этапов. Соответствующие направления были заложены в

основу экспериментальной части данной работы.

57

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культуры микроорганизмов.

В работе использовали штамм серной пурпурной бактерии Thiocapsa roseopersicina

BBS, полученная из коллекции фототрофных микроорганизмов кафедры микробиологии

МГУ (№13 КМ МГУ). Штамм №21 термофильного сахаролитического, образующего Н2,

микроорганизма был выделен из целлюлозолитического водород-образуещего

сообщества. Данное сообщество было выделено из образца коровьего навоза.

2.2. Культивирование микроорганизмов.

Культивирование T. roseopersicina BBS проводили на свету при 28°С на

модифицированной среде Пфенинга. Минеральный фон (г/л): MgCl2*6H2O – 0,3; KH2PO4 -

1; KCl -0,3; NaCl – 10; NH4Cl – 0,3; добавки к среде, стерилизуются отдельно (г/л):

Na2S2O3*5H2O - 2; NaHCO3 – 2; CH3COONa*3H2O – 2; Na2S*9H2O – 0,6; цианокобаламин

–20 мкг/л, раствор микроэлементов 1 мл/л. Раствор микроэлементов (г/л): Трилон Б - 5;

FeSO4*7H2O – 2; H3BO3 – 0,3; MnCl2*7H2O – 0,03; ZnSO4*7H2O – 0,1; Na2MoO4*2H2O –

0,03; CuCl2*2H2O - 0,01; CoCl2*2H2O – 0,2; NiCl2*2H2O – 0,04; pH доводили после

добавления всех компонентов, стерильным 5% раствором Н3PO4. Помимо жидкой

использовали полужидкую среду того же состава с добавлением 0,8% агара.

Культивирование штамма №22 проводили в темноте при 60°С на среде для

термофильных анаэробных сахаролитических микроорганизмов (модифицированная

среда Имшенецкого) следующего состава (г/л): KH2PO4 – 2,0; K2HPO4 – 3,0; (NH4)2SO4 –

2,0; MgCl2 * 6H2O – 0,2; CaCl2 * 2H2O – 0,05; FeSO4 * 7H2O - 0,011; дрожжевой экстракт –

1,0; пептон – 5,0; глюкоза -10; цистеин (в виде 25%-го раствора) – 0,15 мл; микроэлементы

SL-10 – 1 мл/л. Раствор микроэлементов SL-10 следующего состава (мг/л): FeCl2 * 4 H2O –

1,5; ZnCl2 – 70,0; MnCl2 * 4H2O – 100,0; H3BO3 – 6,0; CoCl2 * 6H2O – 190,0; CuCl2 * 2H2O —

2,0; NiCl2 * 6H2O — 24,0; Na2MoO4 * 2H2O — 36,0; Na2WO4 -15,0; Na2SeO3 * 5H2O -15,0.

рН среды-7,0 – 7,2 до стерилизации.

В случае строго анаэробного культивирования во флаконах заменяли газовую фазу

на аргон. Флаконы герметично закрывали резиновыми пробками и обжимали

алюминиевыми колпачками. Система замены газа во флаконе состояла из баллона с

инертным газом (аргон), водоструйного насоса и манометра контроля давления. На

первом этапе с помощью водоструйного насоса создавали отрицательное давление -0,9

атм. во флаконе, что контролируется с помощью манометра. На следующем этапе, после

того, как во флаконах прекращается «холодное кипение» среды, флакон заполняли

аргоном из баллона до 0,5 ати. Эту процедуру повторяли несколько раз для достижения

максимального анаэробиоза внутри флаконов. Избыточное давление во флаконах, после

58

последнего цикла замены газовой фазы перед стерилизацией сбрасывали с помощью

медицинской иглы.

Если в качестве донора электронов использовали водород, то ацетат в

модифицированную среду Пфенинга не добавляли. Флаконы герметично закрывали, а

газовую фазу в них заменяли на водород. В таком случае в вышеописанной системе

вместо баллона с аргоном использовали водородный генератор Хроматек 6.140

(«Хроматек», Россия).

Стерилизацию осуществляли методом автоклавирования. Минеральный фон

стерилизовали при избыточном давлении 1,0 ати в течение 30 минут, добавки при

избыточном давлении 0,5 ати в течение 30 минут. Раствор микроэлементов стерилизовали

фильтрацией с помощью шприцевых фильтров Minisart® NML16534K с мембраной из

ацетата целлюлозы с размером пор 0.2 мкм(Sartorius, Германия).

2.3. Получение биомассы.

Для выращивания культуры использовали стеклянные емкости объемом 10, 25

литров либо 5-литровые емкости из полиэтилентерефталата. Емкости стерилизовали с

дистиллированной водой, отдельно готовили 10-кратные концентраты минерального

фона. После культивирования в течение 4-7 суток, в зависимости от объема и

конфигурации емкостей культивирования, биомассу отделяли сепарированием. Частота

вращения ротора сепаратора - 10500 оборотов в минуту, соответственно относительное

центробежное ускорение составляло от 2666 g в центре до 7025 g в периферической зоне.

Сырую биомассу хранили в пластиковых емкостях объемом 50 мл (типа Falcon) в

морозильном ларе при температуре -80ºС.

2.4. Газовая хроматография.

Хроматографическое разделение и анализ газообразных продуктов проводили на

хроматографе Кристалл 2000М (Россия) со следующими параметрами

хроматографирования:

• Детектор: ДТП (детектор по теплопроводности, катарометр)

• Колонка: набивная, с внутренним диаметром 3мм, длиной 1 м

• Неподвижная фаза: уголь

• Температура термостата колонок: 110ºС

• Температура детектора: 150ºС

• Газ-носитель: аргон

• Расход газа-носителя: 30 мл/мин

• Давление газа-носителя: 20 кПа

• Объем вводимой пробы: 1 мл

59

• Время анализа - 4 минуты

• Программное обеспечение: «Хроматэк-аналитик 2.5»

Смесь газообразных метаболитов отбирали из флаконов с помощью стерильных

шприцев и вводили образец в хроматографическую колонку через систему ввода –

шестипортовый кран. Количественное определение компонентов рассчитывали по

площади под хроматографическим пиком. Избыточное давление во флаконах измеряли с

помощью манометра WIKA и учитывали эти данные при расчёте конечных концентрации

газовых метаболитов.

2.5. Определение видовой принадлежности микроорганизмов.

2.5.1. Выделение ДНК.

Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили согласно методу(Булыгина и др.,

2002). Концентрация полученного препарата ДНК при использовании этого метода

составляла 30 – 50 мкг/мл. РНК в полученном препарате присутствует в следовых

количествах (менее 1%, согласно данным электрофоретического анализа, не

представлены).

2.5.2. ПЦР гена 16S рРНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования

ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система

(Lane, 1991). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий

состав: 1x буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2

мМ MgCl2); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль

соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).

Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94оС х 9

мин, 55оС х 1 мин, 72

оС х 2 мин; последующие 30 циклов - 94

оС х 1 мин, 55

оС х 1 мин,

72оС х 2 мин; завершающий цикл - 72

оС х 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы

при напряженности электрического поля 6 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР

проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps

(Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

2.5.3. Секвенирование ПЦР-продуктов.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК и

гиразы B, проводили по методу (Sanger et al., 1977) с помощью набора реактивов Big Dye

Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc.,USA) на автоматическом секвенаторе ABI

60

PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.,USA) согласно инструкциям производителя. При

этом для секвенирования использовали праймеры (Lane, 1991) и чтение проводили в двух

направлениях.

2.5.4. Анализ последовательностей 16S рРНК.

Поиск нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и гиразы В,

гомологичных соответствующим последовательностям изучаемых штаммов в базе данных

GenBank проводили с помощью программных пакетов BLAST (Camacho et al., 2009) и

RDP (Cole et al., 2014).

2.6. Методы долговременного хранения T. roseopersicina.

2.6.1. Лиофилизация.

Для долговременного хранения культуры использовали стерильные стеклянные

ампулы с диаметром дна 0,8 см. В качестве защитной среды выбрали 10% сухое

обезжиренное молоко (СОМ) с 7,5% сахарозой, стерилизовали автоклавированием при 0,5

ати в течение 30 минут. Для лиофилизации использовали культуру, достигшую начала

стационарной стадии роста. Клетки концентрировали центрифугированием в течение 10

мин при 15000 g, 4ºС на центрифуге Eppendorf 5810R. Полученный осадок

ресуспендировали в защитной среде. В каждую ампулу вносили по 0,5 мл суспензии

клеток в защитной среде (все подготовительные этапы проводили в аэробных условиях).

После заполнения ампулы помещали в морозильный ларь, где они находились при

температуре –80ºС несколько часов до полного замораживания. Лиофильное

высушивание проводили с помощью прибора FreeZone1 (Labconco, США) при глубине

вакуума в 0,043 мбар, температуре конденсора -52ºС в течении 1,5 - 2 суток, в

зависимости от объема проб. По окончании высушивания газовую фазу в вакуумной

камере восстанавливали осушенным инертным газом (азотом) во избежание попадания

влажного воздуха в ампулы. Затем ампулы запаивали под вакуумом – 1 бар – газово-

кислородной горелкой. Готовые запаянные ампулы помещали на хранение при

температуре 4°С.

2.6.1.1. Проверка жизнеспособности клеток.

Для проверки жизнеспособности клеток ампулы вскрывали, вносили в них 0,5 мл

свежей среды. Из полученной суспензии клеток делали серию разведений.

Культивирование проводили в толще полужидкого агара в пробирках, герметично

закрытых резиновыми пробками.

61

2.6.1.2. Измерение активности клеток после лиофилизации.

Для измерения активности фермента в клетках после лиофилизации все

содержимое ампулы помещали в 50 мл модифицированной среды Пфенинга. Делали 3

пересева, измерение активности проводили на 1 и 3 пересев.

2.6.2. Тест на ускоренное хранение.

Запаянные ампулы помещали на хранение при температурах 25, 35 и 50ºС. Через

определенные промежутки времени ампулы вскрывали и делали высев на полужидкий

агар для проверки жизнеспособности клеток. Для каждой температуры после подсчета

количества жизнеспособных клеток рассчитывали константу скорости физико-

химических процессов, протекающих в образце и приводящих к снижению выживаемости

клеток. На основе данных коэффициентов по уравнению Аррениуса и правилу Вант-

Гоффа (коэффициента Q10) рассчитывали предполагаемую константу для хранения при

4ºС.

Скорость снижения количества жизнеспособных клеток от времени описывают

уравнением кинетики первого порядка (King et al., 1998; Donev, 2001).

N= N0е-kt

(1)

где N0- исходное количество клеток в образце, N – количество клеток в момент времени t,

k- константа скорости физико-химических процессов, протекающих в образце при данной

температуре и приводящих к снижению выживаемости клеток, е – основание натурального

логарифма.

Логарифмируя уравнение, получаем:

ln N=ln N0-kt (2)

Данное уравнение может быть представлено прямой линией в координатах lg N и t.

Достаточно выраженная линейность расположения экспериментальных данных

свидетельствует о правомерности использования данного уравнения. Если данные не

линейны, то нужно использовать уравнение кинетики иного порядка.

С помощью вышеуказанного уравнения можно рассчитать сроки хранения

препаратов только на исследованных температурах. Константа k, на основе которой

производят расчет, изменяет значение при изменении температуры хранения.

Зависимость константы химической реакции k от температуры может быть описана

при помощи уравнения Аррениуса либо, более упрощенно, по правилу Вант-Гоффа. С

помощью данных методов можно найти значения k для любых температур хранения. Чем

выше температура, тем быстрее протекают процессы, поэтому получить данные для

расчета k для более высоких температур возможно за относительно короткие сроки. На

основе данных о хранении культуры при высоких температурах с помощью указанных

62

методов возможно определить примерные сроки хранения при любой температуре,

интересующей исследователя.

Согласно уравнению Аррениуса (van Boekel, 2008):

RT

E

e

0kk

где kₒ–это предэкспоненциальный множитель, E-энергия активации, R- газовая

постоянная, T- абсолютная температура. После логарифмирования уравнение имеет

следующий вид:

RT

E 0klnkln

Графически данное уравнение можно представить прямой в координатах -ln k и

1/T. Пользуясь таким графиком, можно путем экстраполяции найти константу k для

любой температуры, и, соответственно, прогнозировать выживаемость клеток.

Согласно правилу Вант-Гоффа (в зарубежной литературе также называемое

методом Q10) при изменении температуры на каждые 10 градусов скорость большинства

реакций изменяется в 2-4 раза (Кузнецов и др., 1977; Karel, Lund, 2003; Blaustein et al., 2013).

Поскольку скорость реакции и константа скорости химической реакции

прямопропорциональны, то зависимость может быть представлена в следующем виде:

1

2

kk

Т

Т

где Т1=Т2+10 ºС, k Т1- константа скорости при температуре Т1, k Т2- константа скорости при

температуре Т2, γ-температурный коэффициент скорости реакции, который может быть

равен от 2 до 4.

2.6.3. Хранение при низких температурах (-80ºС).

Для хранения использовали культуру в конце логарифмической - начале

стационарной фазы роста. Клетки отделяли центрифугированием, после чего

ресуспендировали в свежей питательной среде. В случае замораживания без

криопротектора полученную суспензию по 0,5 мл переносили в пластиковые пробирки

(объемом 1,5 мл) и замораживали. В качестве криопротектора в суспензию клеток в

свежей питательной среде добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) до конечной

концентрации 5%, выдерживали 15 минут, после чего переносили по 0,5 мл суспензии в

пластиковые пробирки и сразу замораживали.

63

Замораживание проводили двумя способами. В первом случае в режиме быстрого

охлаждения, штатив с пробирками помещали непосредственно в морозильный ларь (-

80ºС). Во втором варианте температура снижалась примерно в минуту на 1ºС, чего

достигали путем помещения штатива с образцами в термоизоляционный контейнер из

вспененного полипропилена, фольгированного с одной стороны (толщина стенки 1 см,

внутренний объем 350 см3).

Число жизнеспособных клеток определяли после смешивания суспенизии с

криопротектором, непосредственно после замораживания и после различных сроков

хранения при -80ºС. Размораживали клетки на водной бане при 37 ºС. При наличии

криопротектора, клетки отделяли центрифугированием и перерастворяли в том же объеме

свежей питательной среды. Из размороженной суспензии клеток делали серию

разведений. Культивирование проводили в толще полужидкого агара в пробирках,

герметично закрытых резиновыми пробками.

2.7. Выделение и очистка гидрогеназы.

2.7.1. Первая схема очистки.

Данная часть работы была выполнена совместно с Зориным Н.А. (ИФПБ РАН). К

клеточной пасте добавляли бидистиллят в пропорции примерно 1:1 (по весу). Смесь

инкубировали при перемешивании и заливали ацетоном, охлажденным до 4ºС.

Полученную смесь выдерживали при перемешивании в течение 30 минут. Осадок

отфильтровывали под вакуумом на стеклянной воронке с фильтром Шотта, после чего

промывали охлажденным ацетоном и высушивали в течение около 15 часов под

вакуумом. Полученный ацетоновый порошок растворяли в бидистилляте (1:4).

Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком при 22 кГц 3 раза по 7 минут.

Неразрушенные клетки и обломки клеток осаждали центрифугированием (10 000 g, 30

мин., 4ºС). Супернатант фракционировали сульфатом аммония. Сначала концентрацию

сульфата доводили до 25% насыщения, центрифугировали 30 мин при 10 000 g, осадок

отбрасывали. Затем в супернатанте доводили концентрацию (NH₄)₂SO₄ до 70%

насыщения, при этом гидрогеназа выпадала в осадок, снова центрифугировали при тех же

условиях. Полученный осадок ресуспендировали в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7,0. Для

удаления термолабильных белков раствор нагревали на водяной бане до 70ºС, после чего

выдерживали при данной температуре в течение нескольких минут. Денатурировавшие

белки отделяли центрифугиованием в течение 40 минут при 10 000 g.

Для дальнейшей очистки растворимую фракцию, содержащую гидрогеназу,

наносили на колонку с фенилсефарозой CL-4B, уравновешенную 0,8 М раствором

64

сульфата аммония, гидрогеназу элюировали 4 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,0).

Фракции с гидрогеназной активностью наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой DE52,

уравновешенную 20 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,0). Гидрогеназу элюировали 0,5 М

раствором KCl.

После этого повторно проводили гидрофобную хроматографию на фенилсефарозе.

Фракции, содержащие гидрогеназную активность, концентрировали ультрафильтрацией с

помощью концентраторов Amicon (30 кДа) и подвергали дальнейшей очистке с помощью

препаративного электрофореза.

При препаративном электрофорезе в 7,5% ПААГ использовали стеклянные

колонки с цилиндрической формой геля, высотой 6,5 см и площадью поперечного сечения

1 см2. Электрофорез проводили при постоянной силе тока 5-10 мА/ см

2 в течение 3 - 5

часов и температуры геля не выше 20оС. Полосу, обладающую гидрогеназной

активностью, вырезали из геля, измельчали и элюировали фермент 10 мМ Трис–HCl

буфером (рН 7,5).

Раствор гидрогеназы концентрировали на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой DE52,

уравновешанной 40мМ фосфатным буфером. Элюцию фермента проводили 0,5 М КСl в

20 мМ фосфатном буфере.

2.7.2. Вторая схема очистки.

Данная часть работы была выполнена совместно с Динариевой Т.Ю. (МГУ им.

М.В. Ломоносова). Получение мембранной фракции клеток T.roseopersicina BBS и

разрушение мембран для получения экстакта, содержащего целевой белок, проводили,

модифицировав ранее описанномый метод (Серебрякова и др. 1977). В полученных

экстрактах белки осаждали высаливанием сульфатом аммония от 30 до 70% насыщения.

После центрифугирования (10 000 g, 10 мин, 4 ºC) осадок был растворен в 10 мМ К-

фосфатном буфере (рН 7,0). Полученный раствор прогревали при 70ºC в течение 2,5

минут, затем охлаждали до 4 ºC и центрифугировали (20 000 g, 30 мин, 4 ºC). Супернатант

использовали для дальнейшей очистки фермента. На последующих стадиях проводили

гидрофобную хроматографию, ионообменную хроматографию и хроматофокусирование

(Kovacs et al., 1985), используя колонки с фенилсефарозой CL-6B (1.6 х 20.0 см), Q-

сефарозой FF (1.6 23 см) и колонку Mono P HR 5/5 (5 х 5 мм) соответственно.

Хроматографию проводили с помощью системы FPLC (Pharmacia, Швеция).

После стадии хроматофокусирования фракции, содержащие гидрогеназную

активность, объединили и концентрировали с последующей заменой полибуфера 74 на 20

мМ К-фосфатный (рН 7,0), содержащий 0.5 мМ KCl и 0,02% NaN3, при помощи

65

концентратора Amicon Ultra-15 30 КДа (Аmicon, США). Конечный препарат хранили при -

80 ºC.

2.7.3. MALDI-TOF спектрометрия.

Масс-спектрометрический анализ проводили на времяпролетном масс-

спектрометре (4800, Proteomics Analyzer MDS Sciex). К 20 мкл образца добавили 0,4 мкл

0,5 М раствора дитиотреитола и 0,5 мкл раствора (0,1 г/л) модифицированного трипсина

(Promega). Предварительно в образце довели pH до 8.0. Полученный раствор

инкубировали при 26ºС в течение 18 часов. После инкубации на пластине масс-

спектрометра смешали 1 мкл образца и 1 мкл раствора α-циано-4-гидроксикоричной

кислоты (3 г/л) в 80% (по объему) ацетонитрила, содержащем 0,3% трифторуксусной

кислоты. Анализ и идентификацию полученных масс-спектров проводили с помощью

внутренних баз данных, используя программу Mascot, встроенную в программное

обеспечение GPS (MDS Sciex).

2.8. Измерение гидрогеназной активности.

Активность фермента определяли по восстановлению метилвиологена водородом

спектрофотометрическим методом в анаэробной кювете (Zorin et al., 1996). Реакционная

смесь, общим объемом 2 мл, содержала 50 мМ Tris-HCl-буфер (pH 7,0), 4 мМ

метилвиологена. Измерения проводили при температуре 30°С. Спектрофотометрически

контролировали концентрацию продукта реакции – восстановленной формы

метилвиологена. Для расчета активности использовали молярный коэффициент

восстановленного метиллвиологена –ε600=1,3104мМ

-1см

-1 (Thorneley, 1974). Для

элиминирования периода индукции реакцию инициировали введением дитионита натрия

(~10-3

М) в раствор, что не влияет на кинетику действия гидрогеназы (Albracht, 1994).

2.9. Изготовление ферментных электродов.

Графитовую ткань модифицировали нейтральным красным, после чего на ней

сорбировали фермент. Использовали графитовую ткань ТВШ-300М (1×0,5см) ГУП

«Альтен» (Россия) с толщиной 0.7-0.8 мм и удельным электросопротивлением 50-70

мОм.см. Электрополимеризацию нейтрального красного проводили на поверхности

графитовой ткани из фосфатного буферного раствора при pH 6. Рост полимера проходил в

потенциодинамическом режиме в диапазоне потенциалов от -0.8 до 0.8 В (отн. Ag/AgCl) с

предварительной гидрофилизацией графитовой ткани в концентрированной серной

кислоте в течение 10 минут и отмывкой в течение 10 мин в фосфатном буферном растворе

(pH 7). Сорбцию гидрогеназ проводили в течение 12 часов из раствора, содержащего 1

мг/мл фермента при температуре 4С (0,5 М КCl, 20 мМ К-фосфатный буфер, pH 7).

66

2.10. Электрохимические измерения.

2.10.1. Исследование электрохимической активности ферментных электродов.

Электрохимическая ячейка состояла из трех отделов, соединенных между собой. Ее

конструкция предусматривала продувку газом поверх и через раствор (рис. 12).

Температуру эксперимента задавали подключением рубашки ячейки к термостатируемой

водяной бане. В качестве раствора использовали фосфатный буфер (0,05M KH2PO4, 0.1M

KCl, pH 7), если не указано особо. Электродом сравнения служил хлорсеребряный

электрод, в качестве вспомогательного использовали стеклоуглеродный электрод.

Поляризационные кривые записывали гальваностатическим и потенциодинамическим

методом с помощью потенциостата EmStat 2 PalmSens (Нидерланды) при постоянном

потоке газа через ячейку. Если не указано особо, данные представлены относительно

обратимого водородного электрода (ОВЭ).

Рис. 12. Электрохимическая ячейка. 1 - исследуемый электрод; 2 - электрод

сравнения (хлоридсеребряный электрод); 3 – вспомогательный электрод

(стеклоуглеродный электрод); 4 – подача и 5 – отвод газа; 6 и 7- подача воды в рубашку

термостатирования.

67

2.10.2. Исследование влияния метана и двуокиси углерода на

электрохимическую активность гидрогеназных электродов.

Влияние метана и двуокиси углерода на электрохимическую активность

гидрогеназных электродов проводили в потенциостатическом режиме. Осуществляли

непрерывную запись тока до достижения стационарного значения при барботировании

пространства рабочего электрода водородом, либо исследуемыми газами, либо их смесью.

Смесь газов представляла собой в контроле - 80% водорода на 20% аргона, в опыте - 80%

водорода на 20% исследуемого газа (CH4 либо СО2). Смеси газов готовили и подавали с

помощью формирователя газовых потоков "Хроматэк-Кристалл ФГП" (Россия). При

исследовании влияния СО2 на работу электрода использовали буфер: 0,5M KH2PO4, 0.1M

KCl, pH 7.

2.10.3. Исследование зависимости характеристик ферментных электродов от

парциального давления водорода.

Проводили изучение зависимости характеристик ферментных электродов (тока

окисления водорода и стандартного потенциала) от парциального давления водорода в

смеси с аргоном. Смеси газов готовили и подавали с помощью формирователя газовых

потоков "Хроматэк-Кристалл ФГП" (Россия).

68

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение видовой пренадлежности.

Для подтверждения видовой принадлежности был проведен анализ гена 16S pРНК,

определена почти полная последовательность гена - 1478 п.н. (Приложение 1). Согласно

анализу последовательностей в базе Gene Bank, наиболее близкими оказались

последовательности представителей семейства Chromatiaceae, при этом самый высокий

уровень сходства с представителями рода Thiocapsa. Наиболее близким к штамму с

уровнем идентичности 100% оказался Thiocapsa sp. MTWDM061 (1452 п.н.), выделенный

из Северного моря вблизи города Бюзум, ФРГ (Tank et al., 2009). С ранее полученной

последовательностью штамма Thiocapsa roseopersicina (bogorovii) BBS в 1428п.н.

идентичность составила 99% (Турова и др., 2009)

3.2. Культивирование штамма-продуцента.

В коллекции фототрофных микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ штамм

поддерживали при периодических пересевах на модифицированной среде Пфенинга,

далее стандартная среда (г/л): КН2PO4 – 0,5; NH4Cl – 0,5; KCl – 0,33; MgCl2 – 0,33; NaCl –

20; CaCl2x H2O - 0,3; NaHCO3 – 2; Na2Sx 9H2O – 1; Na2S2O3x 5H2O - 2; витамин B12 -

0,02мг; раствор микроэлементов - 1 мл (см. раздел 2.2).

Для оптимизации условий и повышения экономичности культивирования были

внесены некоторые изменения в состав среды культивирования. Вид T. roseopersicina

способен существовать при различной солености воды, различные штаммы этого вида

выделяли из различных местообитаний – как морских, так и пресноводных (Bergey’s…,

2009). Штамм BBS был выделен из эстуария Белого моря (Богоров, 1974). В самом море

значительный приток речных вод и недостаточный обмен с океаном обеспечивает

сравнительно низкую соленость поверхностных вод 26-24 г/л, а в эстуарии, в котором

идет смешение морской и пресной воды, соленость еще ниже (Шамраев, Шишкина, 1980).

Для данного штамма показан оптимум солености 1-2% (Турова и др., 2009). Исходя из

этого, концентрацию вносимого NaCl уменьшили с 20 до 10 г/л. Оставшиеся 4 соли

минерального фона - КН2PO4, NH4Cl, KCl , MgCl2 – вносили в концентрации 0,33 г/л, в

соответствии с модификацией В.М. Горленко (Богоров, 1974). Также из среды исключили

хлорид кальция и снизили концентрацию сульфида натрия с 1 до 0,6 г/л, поскольку

данные соединения при незначительных изменениях условия культивирования, таких как

рН, способны образовывать нерастворимые комплексы. Как видно из рисунка 13,

внесенные изменения в состав среды не оказали влияния на рост культуры.

Поскольку у пурпурных бактерий синтез бактериохлорофиллов на свету

подавляется кислородом, сравнили рост культуры в строго анаэробных и

69

микроаэрофильных условиях на свету. Для этого в части флаконов заменили газовую фазу

на аргон, а часть просто герметично закрыли без замены газовой фазы, которая составляла

не менее половины объема флакона. Как видно из рисунка 13, разницы в росте культуры

отмечено не было.

Для снижения возможности контаминации при периодических пересевах культуру

поддерживали на среде, из которой исключили все органические компоненты, при этом

газовую фазу во флаконах заменили на водород. Как видно из рисунка 14, максимальная

плотность популяции была ниже, но кинетика роста была сходной.

Рис. 13. Динамика роста T. roseopersicina BBS. 1 – стандартная среда, газовая фаза

заменена на аргон; 2 - стандартная среда без замены газовой фазы; 3 – модифицированная

среда, газовая фаза заменена на аргон; 4 - модифицированная среда, без замены газовой

фазы.

70

Рис. 14. Динамика роста T. roseopersicina BBS на среде с ацетатом (1) и

водородом (2).

Полученные данные свидетельствуют, что модифицированная среда может быть

успешно использована для культивирования T. roseopersicina BBS. Поскольку она

является более экономичной, то в дальнейшем ее использовали для получения биомассы

для выделения гидрогеназы.

3.3. Долговременное хранение T. roseopersicina BBS.

Методы долговременного хранения микроорганизмов позволяют снизить риск

контаминации культур и потери активности клеток, уменьшают вероятность

возникновения значительных генетических перестроек и снижают затраты времени/ и

труда исследователей на постоянный пересев культур (Lapage et al., 1970; Safronova,

Novikova, 1996). Важнейшими критериями, которыми должен обладать используемый для

долговременного хранения метод, являются обеспечение максимального титра

жизнеспособных клеток длительное время и сохранение их активности по всем исходно

заявленным параметрам. Тот факт, что выделение, определение, характеристика новых

штаммов микроорганизмов, работы по их генетической модификации, селекции - крайне

дорогостоящие процедуры, еще раз подчеркивает, насколько важна задача по

поддержанию уже имеющихся культур (Malik, Claus, 1987; Malik, 1988a).

Хранение при низких температурах является широко применимым методом в

лабораторной практике. Для бактерий рода Chromatium рекомендуют хранение в жидком

азоте, что является довольно затратным методом. В данной работе для Thiocapsa

roseopersicina BBS использовали более экономичный метод – хранение при -80 ºС.

71

Еще одним методом длительного хранения было выбрано лиофильное

высушивание. Хотя лиофилизация широко используется и оптимальные условия

подобраны для большого количества культур, тем не менее, для сохранения пурпурных

серных бактерий многими авторами данный метод не рекомендуется, поскольку

считается, что данная группа микроорганизмов не переносит процесс сублимации (The

Prokaryotes…, 2006; Bergey’s…, 2009). И даже если ряд лабораторий использует в своей

практике лиофилизацию для хранения фототрофов, то в литературе данных по этому

вопросу крайне мало, но имеющиеся данные свидетельствуют о том, что лиофильное

высушивание применимо как долгосрочный способ хранения для данной группы

микроорганизмов (Malik, 1990; Kupletskaya, Netrusov, 2011).

3.3.1. Хранение T. roseopersicina при низких температурах (-80ºС).

Для хранения культуры Thiocapsa roseopersicina BBS при замораживании выбрали

температуру хранения -80ºС. Температура замораживания имеет большое значение при

хранении культуры. Практически все известные группы бактерий способны длительно

храниться в замороженном состоянии при криогенных температурах (температуры ниже

120 К, т.е. менее минус 153°С), такую температурную область хранения обеспечивают

сжиженные газы, чаще всего из-за доступности и безопасности используют азот

(Похиленко и др., 2009). Но этот способ довольно затратный, при этом показано, что

температуры -70ºС достаточно для длительного хранения большого количества видов

микроорганизмов, в то время как хранение при -20 ºС пригодно для хранения

большинства культур в течение 1-2 лет (Tedeschi, De Paoli, 2011).

Еще одним важным фактором является скорость замораживания суспензии клеток.

В литературе нет единого мнения какая скорость замораживания вызывает большее

повреждение клеток (Donev, 2001), тем не менее многие авторы рекомендуют охлаждать

культуру со скоростью 1ºС в минуту (Darvall, 2000; Похиленко и др., 2009; Prakash et al.,

2013). Поэтому в нашей работе часть образцов охлаждали с указанной скоростью – режим

медленного охлаждения, а часть в режиме быстрого охлаждения - помещали сразу

непосредственно в низкотемпературный морозильник (кельвинатор) на -80ºС без контроля

скорости замораживания.

Для замораживания использовали один из внутриклеточных криопротекторов -

диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 5%. Для оценки вклада ДМСО в

сохранение жизнеспособности клеток часть проб замораживали без добавления

криопротектора. Поскольку криопротекторы могут ингибировать рост клеток,

рекомендуют проверять их действие на культуру, а также не выдерживать долго

72

суспензию клеток в растворе криопротектора после разморозки. Тем не менее, перед

замораживанием рекомендуют выдерживать клетки с криопротектором при комнатной

температуре не менее 15 минут, но не больше 45-60, чтобы криопротектор проник в

клетки (Tedeschi, De Paoli, 2011). Поэтому сразу после размораживания мы отделяли

клетки центрифугированием и ресуспендировали их в таком же объеме свежей

питательной среды, а также проверяли действие ДМСО до замораживания. После

выдерживания суспензии клеток с ДМСО в течение 20 минут одновременно с

замораживанием основного объема проб, 3 образца центрифугировали и клетки

перерастворяли в питательной среде, после чего делали ряд разведений и высев на

определение КОЕ. Исходный титр культуры составил (4,7±0,1)*1010

жизнеспособных

клеток на мл, а после инкубирования с ДМСО (3±0,2)*1010

, таким образом, ДМСО

незначительно снизил титр жизнеспособных клеток. При этом, как видно из таблицы 2,

при использовании ДМСО в качестве криопротектора титр клеток не снизился после

замораживания, в то время как в образцах без криопротектора концентрация

жизнеспособных клеток после замораживания снизилась почти на порядок. Также стоит

отметить, что скорость замораживания не оказывала влияния на жизнеспособность

клеток.

Через полгода хранения при -80ºС концентрация жизнеспособных клеток

оставалась в пределах того же порядка, что и через сутки после замораживания. В работе

(Malik, 1984) также в течение года хранения в жидком азоте с 5% ДМСО штамма

Thiocapsa roseopersicina DSM 217 титр клеток остался на том же уровне. Но, стоит

отметить, что после замораживания в жидком азоте концентрация жизнеспособных клеток

снизилась на два порядка. При этом хранение при -80ºС менее затратный метод в

сравнении с хранением в жидком азоте.

Таким образом, было показано, что данный метод применим для длительного

хранения Thiocapsa roseopersicina BBS. Скорость замораживания не оказывает значимого

влияния на выживаемость клеток. Такой внутриклеточный криопротектор как ДМСО

повышает выживаемость культуры после замораживания, но и при отсутствии

криопротектора после замораживания титр падает меньше чем на порядок и сохраняется в

пределах этого порядка в течение полугода хранения.

73

Таблица 2. Оценка жизнеспособности клеток культуры Thiocapsa roseopersicina

BBS после замораживания и хранения при -80 ºС.

Исходный титр

Концентрация жизнеспособных клеток на мл суспензии при

хранении при -80 ºС

Сутки

2 месяца

6 месяцев Режим

медленного

охлаждения

Режим

быстрого

охлаждения

Без

криопротекто

ра

(5,2±0,1)х1010

(6,7±2)х109 (5,6±1,7)х10

9 (5,5±1,3)х10

9

(1,4

±0,5)х109

ДМСО (5%) (3,3±0,2)х1010

* (3,4±0,3)х1010

(1,3±0,25)х1010

(2,7±0,1)х1010

(1,1±0,6)

х1010

* - после инкубирования с ДМСО в течение 20 минут до замораживания.

3.3.2. Лиофильное высушивание T. roseopersicina.

Лиофилизация - один из самых широко используемых методов долговременного

хранения микроорганизмов. Он надежен, эффективен, экономичен и удобен (Prakash et al.,

2013). По мнению автора, он имеет ряд значительных преимуществ по сравнению с

другими методами ускоренного хранения. После процесса лиофилизации культуры

обычно хранят при 4ºС, что не требует специального оборудования и дополнительных

затрат на хранение, как в случае с замораживанием в жидком азоте. В отличие от методов

замораживания, культуры после лиофилизации способны выдерживать и более высокие

температуры, чем при стандартном хранении, что позволяет транспортировать

законсервированные этим способом микроорганизмы на большие расстояния без потери

жизнеспособности и заявленных свойств с минимальными затратами (Morgan et al., 2006).

Как было сказано выше, данный метод не рекомендуется для хранения пурпурных серных

бактерий, но по ряду литературных данных данная группа микроорганизмов может

успешно переносить условия лиофильной сушки (Malik, 1990; Kupletskaya, Netrusov,

2011).

Для лиофилизации T. roseopersicina BBS в качестве защитной среды использовали

10% сухое обезжиренное молоко с 7,5% сахарозой. Все этапы подготовки культуры

проводили в аэробных условиях. Культуру лиофилизировали в стеклянных ампулах

(рис.15), которые после процесса сублимации запаивали под вакуумом.

74

Рис. 15. Ампулы с лиофильно высушенной культурой T. roseopersicina BBS.

Количество жизнеспособных клеток оценивали в исходной суспензии клеток в

среде культивирования, после смешивания с защитной средой и после процесса

сублимации. Исходное количество жизнеспособных клеток составило (11±0,2)×108 на

миллилитр суспензии, после замены среды культивирования защитной средой

концентрация клеток снизилась до (7,5±2)×108 кл/мл. После лиофилизации для

регидратации полученной структуры в ампулу добавляли свежую среду культивирования.

Вносимый объем соответствовал объему суспензии клеток в защитной среде внесенной в

ампулу до лиофилизации. В полученной суспензии концентрация жизнеспособных клеток

составила (2±0,5)×108

кл/мл.

В работе (Malik, 1990) лиофилизировали типовой штамм вида Thiocapsa

roseopersicina DSM 217. В качестве защитной среды автор использовал 20% сухое

обезжиренное молоко, содержащее 5% мезо-инозитол (или 5% раффинозы) и 10%

активированного угля. Данная стерильная защитная среда была предварительно

лиофильно высушена, и на полученную лиофильную структуру были нанесены несколько

капель суспензии культуры в растворе 5% мезо-инозитола (или 5% раффинозы) с 10%

активированного угля. После чего проводили повторное высушивание. Ампула,

содержащая высушенную культуру, была закрыта ватной пробкой и вставлена во

внешнюю ампулу, которую запаивали. Для лучшей выживаемости культуры все

подготовительные этапы проводили в анаэробных условиях, поскольку аноксигенные

фототрофные бактерии чувствительны к кислороду в присутствии света (Malik, 1988b).

Поскольку проведение всех подготовительных этапов в анаэробных условиях

трудоемко, при этом культура не является строго анаэробной, для получения

75

лиофилизированной культуры более простой методикой мы оценили возможность

проведения всех подготовительных этапов в аэробных условиях (центрифугирование,

смешивание с защитной средой и т.п.). Как было указано выше, после проведения

подготовительных этапов и самого процесса лиофильного высушивания, титр культуры

упал почти на порядок. При этом в работе (Malik, 1990) титр Thiocapsa roseopersicina

DSM 217 упал на 1,5 порядка, хотя все подготовительные этапы до лиофилизации были

проведены в анаэробных условиях. Можно предположить, что более высокая

выживаемость культуры в нашем эксперименте обусловлена свойствами штамма BBS, так

как разные штаммы одного вида могут по-разному переносить лиофильное высушивание

(Prakash et al., 2013). Так же, возможно, выбранная нами защитная среда и условия

лиофилизации лучше подходят для хранения данной культуры.

Таким образом, полученные нами данные наши данные наряду с работами (Malik,

1990; Kupletskaya, Netrusov, 2011) являются еще одним подтверждением, что пурпурные

серные бактерии могут быть сохранены лиофильным высушиванием.

3.3.2.1. Прогнозирование сроков хранения культуры.

При изучении влияния протекторных сред на выживаемость микроорганизмов

было установлено, что сохранение высокого титра культуры непосредственно после

процесса лиофилизации не всегда коррелирует с длительным сроком хранения (Heckly,

1961; Кузнецов и др., 1977). В связи с этим оценка эффективности тех или иных защитных

сред может быть проведена только через длительный срок хранения, исчисляемый годами.

В этом ключе тест на ускоренное хранение является удобным способом «экспресс-

оценки» сроков хранения культуры, на которые в дальнейшем может ориентироваться

исследователь. С повышением температуры увеличивается скорость протекания

процессов, влияющих на снижение жизнеспособности клеток в лиофилизированной

структуре, поэтому получить данные для расчета сроков хранения при повышенных

температурах можно за более короткие сроки. Данный метод позволяет на основе данных

о хранении культуры при высоких температурах определить примерные сроки хранения

при температуре, интересующей исследователя.

На ускоренное хранение были заложены ампулы с лиофилизированной культурой,

полученные как описано выше (см. раздел 2.6.1.). Для теста были выбраны температуры

50, 35 и 25 ºС. Через различные промежутки времени проводили высевы для определения

концентрации жизнеспособных клеток в ампулах. На основании полученных данных

построили графики зависимости концентрации жизнеспособных клеток от температуры

(рис. 16). Как видно из рисунка, для всех исследованных температур в

76

полулогарифмических координатах зависимость линейная, что подтверждает

применимость в данном случае кинетического уравнения реакции первого порядка.

Константу скорости реакции для каждой температуры находили арифметически методом

наименьших квадратов (Griffin et al., 1981). При 25ºС константа скорости составила 0,0456

сутки-1

, при 35 ºС и 50 ºС соответственно 0,2083 сутки-1

и 1,333 сутки-1

.

Рис. 16. График зависимости логарифма концентрации жизнеспособных клеток

(ln N) от времени хранения при температуре 25ºС, 35ºС, 50ºС.

С помощью полученных констант можно рассчитать примерные сроки хранения

только на исследованных температурах (25, 35 и 50ºС). Мы предполагаем хранить ампулы

с лиофилизированной культурой при 4ºС, поэтому нам было необходимо получить

константу k для этой температуры. Зависимость константы скорости химической реакции

k от температуры описывали при помощи уравнения Аррениуса либо, более упрощенно,

по правилу Вант-Гоффа (в зарубежной литературе также называемое методом Q10).

На основе экспериментально полученных констант с помощью метода наименьших

квадратов нами был построен график Аррениуса (рис. 17). При помощи данной прямой

можно найти предположительную константу для интересующей нас температуры. Как

видно из рисунка 17 четырем градусам на графике соответствует lg k равный -6,344, из

чего следует, что предположительная константа скорости k для 4ºС составляет 0,001756

сутки-1

. Зная константу, с помощью уравнения кинетики первого порядка можно

рассчитать количество жизнеспособных клеток на интересующий нас момент времени,

или наоборот время, через которое количество жизнеспособных клеток снизится до

77

определенного значения. Так в таблице 3 представлены данные о предполагаемом

количестве жизнеспособных клеток через 1, 5, 10, 15 и 20 лет хранения.

Рис. 17. Зависимость логарифма константы скорости отмирания клеток от

температуры. Сплошной линией отображены экспериментально полученные данные,

прерывистой - прогнозируемые.

При использовании для расчетов правила Вант-Гоффа (коэффициента Q10) нужно

определить температурный коэффициент γ. В литературе имеются примеры, где для

оценки выживаемости клеток микроорганизмов был принято, что температурный

коэффициент равен двум (Кузнецов и др., 1977). Исходя из полученных нами

экспериментально значений констант скорости (k25ºС=0,0456, k35ºС=0,2083, k50ºС=1,3333),

температурный коэффициент скорости реакции γ при наших условиях для исследуемой

культуры равен 4. Зная температурный коэффициент и константу скорости для

определенной температуры, с помощью правила Вант-Гоффа можно найти

ориентировочную k для интересующей исследователя температуры. Как видно из

формулы, при использовании этого метода, при наличии несколько экспериментально

полученных k для разных температур, мы получим несколько k4ºС. В таблице 3

представлены данные о константах k4ºС, рассчитанных по правилу Вант-Гоффа на основе

каждой экспериментально полученной константы - k25ºС, k35ºС, k50ºС.

Для оценки соответствия прогнозируемых сроков хранения и реальных через 10

месяцев хранения при 4ºС сделали высев для оценки жизнеспособности клеток.

Концентрация жизнеспособных клеток составила (6,6±2)*107 кл/мл. Как видно из таблицы

3, рассчитанные концентрации сопоставимы с полученными экспериментально.

78

Следовательно, на сроках хранения до года прогнозируемые данные совпадают с

реальными.

Таким образом, в работе использовали два метода расчета зависимости константы

скорости реакции k от температуры - уравнение Аррениуса и правило Вант-Гоффа. Как

видно из таблицы 3, оба метода дают сопоставимые результаты, хотя по уравнению

Аррениуса срок хранения культуры выше. Хотя расчет по уравнению Арениуса считается

более точным, правило Вант-Гоффа в нашем случае также может быть

использовано для расчета ориентировочных сроков хранения культуры. Преимуществом

правила Вант-Гоффа является тот факт, что для ориентировочного расчета можно

ограничиться экспериментальными данными только по одной температуре.

Данных по лиофилизации фототрофов в литературе крайне мало, а данные по

применению подобных тестов нами не обнаружены. Более того, в ряде источников

указано, что пурпурные бактерии не могут быть сохранены в лиофилизированной форме

(The Prokaryotes..., 2006; Bergey's..., 2009). По нашим расчетам количество

жизнеспособных клеток после 10 лет хранения пурпурной серной бактерии Thiocapsa

roseopersicina при 4ºС будет не ниже 7,2*103

кл/мл. Наши данные соотносятся с работой

(Kupletskaya, Netrusov, 2011), где было показано, что фототрофный микроорганизм

Allochromatium minutissimum способен сохранять жизнеспособность в лиофилизированной

форме более 50 лет.

Таким образом, в работе было показано, что для такого фототрофного

микроорганизма как Thiocapsa roseopersicina штамм BBS лиофилизация может быть

использована в качестве метода долговременного хранения. На основании теста на

ускоренное хранение можно заключить, что концентрация жизнеспособных клеток (при

использовании в качестве защитной среды 10% СОМ с 7,5% сахарозой, при исходном

титре 2*108

при температуре хранения 4 ºС) через десять лет хранения останется в

пределах 3-4 порядков.

79

Таблица 3. Прогнозируемые показатели количества жизнеспособных клеток Thiocapsa roseopersicina при хранении ампул при 4ºС

(КОЕ/мл).

Метод

прогнозирования

Значение

константы

скорости k для 4 ºС

(1/сутки)

1 год 5 лет 10 лет 15 лет 20 лет

По уравнению

Аррениуса

0,00176 1*108 8*10

6 3,2*10

5 1,3*10

4 5,4*10

2

По правилу Вант-

Гоффа k50ºС → К4ºС

0,00226 8,8*107 3,2*10

6 5,2*10

4 8,4*10

2 <10

По правилу Вант-

Гоффа k35ºС → К4ºС

0,00279 7,2*107 1,2*10

6 7,2*10

3 50 <10

По правилу Вант-

Гоффа k25ºС → К4ºС

0,00244 8,2*107 2,4*10

6 2,8*10

4 3,2*10

2 <10

3.3.2.2. Оценка гидрогеназной активности клеток после хранения культуры в

лиофилизированном виде.

Важным показателем при выборе способа долговременного хранения культур

является сохранение микроорганизмом заявленных свойств. С точки зрения

биотехнологии штамм Thiocapsa roseopersicina BBS интересен наличием устойчивой

гидрогеназы, поэтому сохранение гидрогеназной активности является важным

параметром при оценке успешности хранения культуры. Мы провели измерение

активности клеток при стандартном культивировании методом периодических пересевов

и после хранения в лиофильном виде при 4 и 50ºС. Причем гидрогеназную активность

оценивали как при первом высеве лиофильной формы в свежую питательную среду, так и

на третий пересев. Высев из ампул, хранившихся при 50ºС, провели на 12 сутки, когда

титр жизнеспособных клеток был крайне низок, что соответствовало последним срокам

хранения культуры. Как видно из таблицы 4, гидрогеназная активность клеток

сохраняется на исходном уровне после хранения культуры в лиофилизированной форме.

Таблица 4. Влияние хранения в лиофильном виде на гидрогеназную активность

клеток Thiocapsa roseopersicina BBS. Данные представлены в виде среднее ±

доверительный интервал, n=4, p=0,05.

Метод хранения Активность мкмоль Н2/час*мг белка

I пересев III пересев

Периодический пересев 1 ±0,5

Лиофилизация (хранение

при 50оС в течение 12

суток)

0,6 ± 0,35

0,45±0,25

Лиофилизация (хранение

при 4оС в течение 6

месяцев).

0,65 ±0,1 0.95±0,2

3.4. Выделение и очистка гидрогеназы из T. roseopersicina BBS.

T. roseopersicina BBS синтезирует 4 функционирующих гидрогеназы: HupSL,

HynSL, Hox1, Hox2, все они относятся к [NiFe]-гидрогеназам, но имеют разную

локализацию в клетке и различные функции in vivo (Kovacs et al., 2005; Tengolics et al.,

81

2014). Мембраносвязанная HynSL-гидрогеназа привлекает к себе внимание

исследователей в связи со своей стабильностью. Она сохраняет активность после

удаления из мембраны, является относительно устойчивой к инактивирующему действию

кислорода, сульфида и угарного газа, температурный оптимум находится около 80ºС.

HynSL-гидрогеназа является перспективным ферментом для использования в

биологических топливных элементах, создания сенсоров на водород на основе

ферментного электрода. Поэтому оптимизация и удешевление систем выделения и

очистки гидрогеназы является необходимым этапом дальнейшего применения данного

фермента в биотехнологии.

3.4.1. Первая схема очистки.

Данная часть работы была выполнена совместно с Николаем Алексеевичем

Зориным (Институт фундаментальных проблем биологии РАН). Отдельные стадии

очистки и их эффективность приведены в таблице 5.

Клетки T. roseopersicina BBS разрушали ацетоном (100%). Обработка ацетоном не

только разрушает клеточную оболочку, но также обезвоживает клетки и освобождает их в

значительной степени от липидов, денатурирует лабильные белки (Гауровитц, 1953;

Северин, Соловьева,1989). Также с помощью промывания ацетоном вымывали большое

количество фотосинтетических пигментов. Эта стадия очистки так же удобна тем, что

полученный после высушивания ацетоновый порошок может храниться в холодильнике

длительное время (Северин, Соловьева,1989).

Ацетоновый порошок перерастворяли в бидистилляте, после чего обрабатывали

ультразвуком, что способствовало разрушению оставшихся комплексов белков с

мембранами и пигментами. Потеря 40% общей активности свидетельствует о том, что

значительная часть фермента все же остается связанной с мембранными комплексами и

уходит в осадок при центрифугировании.

Гидрогеназа выпадает в осадок при насыщении (NH4)2SO4 от 30 до 60% (Гоготов и

др., 1976). Сначала при насыщении 25% (NH4)2SO4 осадили часть белков. Затем

концентрацию сульфата подняли до 70% насыщения, полученный осадок, содержащий

целевой белок использовали для дальнейшей очистки. Как видно из таблицы 5, на этапе

фракционирования сульфатом аммония мы потеряли значительную часть ферментной

активности. Возможно, это связано с тем, что часть фермента, которая была связана с

мембранами или пигмент-белковыми комплексами перешла в осадок при насыщении

сульфатом аммония до 25%.

82

Поскольку гидрогеназа T. roseopersicina является термостабильным белком

(Gogotov et al., 1978), то это позволяет ввести стадию прогревания экстракта,

позволяющая удалить часть термолабильных белков. Данная стадия обеспечила удаление

более 70% белка из исходного экстракта при сохранении около 90% активности

гидрогеназы. Следующей стадией очистки была гидрофобная хроматография на

фенилсефарозе CL-4B. Поскольку гидрофобные взаимодействия усиливаются при

повышении концентрации солей, то для проведения хроматографии не требовалось

обессоливать экстракт. После этого этапа степень очистки составила 13.

Поскольку pI гидрогеназы равна 4,2 (Задворный и др., 2000), то для ионообменной

хроматографии был выбран анионообменник - ДЭАЭ целлюлоза, в качестве буфера

использовали 20мМ калий-фосфатный с рН 7,0. После проведения данных стадий очистки

была достигнута степень очистки 32,5, но выход фермента составил 11,7%, поскольку

значительные потери активности были на первых стадиях очистки.

По вышеописанной схеме очистку проводили дважды (в таблице 5 приведены

обобщенные данные), для повышения общей концентрации белка в препарате, наносимом

на электрофорез, объединили экстракты, полученные из двух последовательных этапов.

Объединили 2 экстракта, полученный в результате раствор нанесли на колонку с

фенилсефарозой. После гидрофобной хроматографии количество белка сократилось

больше чем в 5 раз. Белок концентрировали ультрафильтрацией и дальше проводили

препаративный электрофорез в 7,5% ПААГ. Полученный в результате этого этапа

фермент концентрировали на колонке с ДЭАЕ-целлюлозой.

Абсолютный спектр полученного препарата белка представлен на рисунке 18. Пик

при 280 нм соответствует поглощению ароматических аминокислот, обычно используется

для оценки концентрации общего белка. Белки, содержащие железо-серные кластеры,

дают пик при длинне волны около 400 нм (Карякин, Варфоломеев, 1986). По мере

восстановления кластера наблюдается падение величины поглащения в данной области и

смещение пика к 420 нм (Sweeney, Rabinowitz, 1980). Таким образом, пик в области 410

нм свидетельствует о наличии железно-серных кластеров в полученном препарате. В тоже

время, пик при 510 нм свидетельствует о незначительной примеси цитохромов.

HynSL-гидрогненаза ассоциирована с клеточной мембраной T. roseopersina.

Предполагали, что HynSL связана с мембраной через содержащий гем b-типа Isp1 белок.

Однако было установлено, что HynSL остается в мембранной фракции вне зависимости от

наличия или отсутствия Isp1 (Palagyi-Meszaros et al., 2009). Исходя из этого можно

предположить, что значительные потери активности на начальных этапах очистки связаны

с тем, что значительная часть фермента не перешла в раствор, а осталась связанной с

83

мембранной фракцией. Поэтому фермент частично перешел в осадок при

центрифугировании после обработки ультразвуком, а также часть фермента, которая была

связана с мембранами или пигмент-белковыми комплексами перешла в осадок при

насыщении сульфатом аммония до 25%.

В результате был получен электрофоретически гомогенный препарат с удельной

активностью 38 мкмоль H2/мин на мг белка. Средний выход гидрогеназы по активности -

6%.

Таблица 5. Очистка мембрансвязанной гидрогеназы HynSL из T.roseopersicina BBS

Стадия очистки Белок

общий

мг

Общая

активность

мкмоль

H2/мин

Удельная

активность

мкмоль

H2/мин ∙ мг б

Степень

очистки

Выход

%

Суспендированный

ацетоновый порошок

66350

3509

0.052

1 100

Обработка

ультразвуком

23875

2050

0,086

1,65 58,4

Фракционирование

(NH4)2SO4 (30-70%)

10155

530

0,053 1,02 15,1

Нагревание, 70ºС 2711 469 0,17 3,3 13,4

Фенилсефароза CL-4B 593 410

0,69 13 11,7

ДЭАЭ –целлюлоза

DE52

231 393 1,7 32,5 11,2

Фенилсефароза CL-4B 44,2 329 7,44 135 9,4

Электрофорез 8,6 301 35 636 8,5

ДЭАЭ –целлюлоза

DE52

5.76 219 38 690 6.2

84

Рис. 18. Абсолютный спектр поглощения гидрогеназы T. roseopersicina BBS.

3.4.2. Вторая схема очистки.

Данная часть работы была выполнена совместно с Татьяной Юрьевной Динариевой

(кафедра микробиологии биологического факультета МГУ). В использованную выше

схему очистки внесли ряд изменений, общая схема представлена в таблице 6.

Поскольку гидрогеназа связана с клеточной мембраной, на первом этапе работы

получили фракцию мембран. Таким образом на первом этапе избавлялись от большого

количества цитоплазматических белков. Клетки разрушали ультразвуком, после чего с

помощью ультрацетрифугирования отделяли мембранную фракцию.

Как и в предыдущем варианте очистки использовали ацетон, чтобы избавиться от

большого количества фотосинтетических пигментов - мембраны многократно промывали

охлажденным ацетоном до почти полного обесцвечивания экстракта. Помимо этого

ацетон размывает мембрану, что переводит целевой белок в раствор. В полученном

экстракте выход по активности составил 36%, что свидетельствует о том, что не весь

целевой белок был извлечен из мембранной фракции.

После фракционирования экстракта сульфатом аммония степень очистки

увеличилась с 1,8 до 3, а прогревание не дало увеличения степени очистки, хотя и снизило

общую концентрацию белка. В предыдущей схеме очистки мы использовали данные

методы для избавления от большого количества нецелевых белков. В тоже время в данной

схеме мы в значительной мере сделали это на начальном этапе при получении фракции

мембран, поэтому прогревание и фракционирование сульфатом аммония в данном случае

не столь эффективны. На следующем этапе провели гидрофобную хроматографию на

85

фенилсефарозе. Общее количество белка снизилось на 25%, а степень очистки возросла до

3,8.

Использованные в предыдущем варианте очистки инообменная хроматография на

ДЭАЭ-целлюлозе DE52 и препаративный электрофорез были заменены на FPLC c

использованием в качестве носителя Q-сефарозы FF и Mono P. После очистки на Q-

сефарозе FF, являющейся сильным анионообменнником, степень очистки с 3,8 выросла до

18,3, но в тоже время выход составил 6,5%.. В результате последней стадии –

хроматофокусирования - степень очистки достигла 108.3 раз, а выход составил 5,3%. В

конечном препарате активность составила 43.3 мкмоль H2/мин∙мг белка.

Таблица 6. Очистка мембрансвязанной гидрогеназы HynSL из T.roseopersicina BBS

Стадия очистки Белок

общий,

мг

Общая

активность,

мкмоль

H2/мин

Удельная

активность,

мкмоль

H2/мин ∙ мг

б.

Степень

очистки

Выход,

%

Фракция мембран 336,5 147,9 0,4 1 100,0

Экстракт 76,7 53,4 0,7 1,8 36,1

Фракционирование

(NH4)2SO4 (30-

70%)

61,8 74,0 1,2 3,0 50,0

Нагревание, 70ºС 52,70 65,4 1,2 3,0 44,2

Фенилсефароза CL

6B

39,8 58,8 1,5 3,8 39,8

Q-Сефароза FF 1,3 9,6 7,3 18,3 6,5

Mono P 0,18 7,8 43,3 108,3 5,3

Жидкостную хроматографию среднего давления (FPLC) с носителями monoQ и

monoP использовали в работе (Kovacs et al., 1985) для очистки гидрогеназы из

T. roseopersicina BBS, при этом авторы наносили на monoQ непосредственно грубый

экстракт (растворенный в буфере ацетоновый порошок, полученный после разрушения

клеток ацетоном). В итоге авторами был получено 32 мг фермента, но удельная

активность препарата составляла 264 мкМ Н2/час на мг белка (по выделению водорода).

Параллельно в той же работе (Kovacs et al., 1985) использовали схему очистки, схожую с

использованной нами в первом варианте:

86

Получение ацетонового порошка → Гидрофобная хроматография, фенилсефароза

CL-4B → Ионообменная хроматография, ДЭАЭ-целлюлоза DE52 → Электрофорез,

ПААГ.

Но в результате авторы получили 4 мг фермента с удельной активностью

215 мкмоль H2/час ∙ мг белка, т.е. 3,6 мкмоль H2/мин ∙ мг белка. Это соответствовало

полученным активностям в работах (Гоготов и др., 1976; Серябрякова и др., 1977) 77,3 и

130 мкл H2/мин ∙ мг белка. В более поздних работах этой группы удельная активность

препарата фермента составила 40 мкмоль H2/мин ∙ мг белка (Sherman et al., 1991;

Задворный и др., 2004; Zadvorny et al., 2006). Но в работах для конечной очистки

использовали препаративный электрофорез.

Считается, что гидрогеназа связана с цитохромом, на который передает электроны

in vivo, он блокирует туннелирование электрона от дистального железо-серного кластера

на электрод, а эффективно разделить фермент и цитохром возможно только на стадии

электрофореза. (Воронин, 2010). Так, было показано, что при использовании для

изготовления электродов препаратов фермента, не прошедших эту стадию очистки,

максимальная активность электродов была в 3 раза ниже (Воронин, 2010). В нашей работе

мы модифицировали систему очистки белка и не использовали препаративный

электрофорез. При этом (см. раздел 3.5.4.) мы получили функционирующий

гидрогеназный электрод с активностью, сопоставимой с активностью электродов,

полученных на основе стандартного метода очистки гидрогеназы (с препаративным

электрофорезом). Таким образом, в дальнейшей работе возможно масштабирование

процесса очистки за счет использования препаративных установок ВЭЖХ с

использованием носителей того же типа, что использовались в данной работе.

3.4.3. Анализ препарата гидрогеназы методом МАЛДИ масс-спектрометрии.

Идентификацию полученного белка и проверку чистоты препарата проводили при

помощи метода МАЛДИ (матрично-ассоциированная лазерная десорбция/ионизация)

масс-спектрометрии. В результате был получен масс-спектр образца, который

предварительно обработали трипсином (рис. 19). Для идентификации белков стандартом

является методика, получившая в литературе название peptide mass fingerprinting – PMF

(Краснов и др., 2010). Она основана на том, что набор пептидов - продуктов

ферментативного гидролиза уникален для каждого белка подобно отпечаткам пальцев

человека. Для каждого белка с известной последовательностью рассчитываются массы

пептидов - продуктов теоретического ферментативного гидролиза с учетом указанного

пользователем числа пропущенных сайтов гидролиза и возможных модификаций. Далее

87

фактический масс-спектр продуктов гидролиза определяемого белка сравнивается со

всеми теоретическими спектрами белков и выявляется белок, у которого степень

соответствия наивысшая.

На основании анализа полученного спектра с помощью программы Mascot, было

показано, что в образце содержится гомогенный препарат HydSL гидрогеназы

T.roseopersicina, степень соответствия полученного фермента с предшественником

большой субъединицы (hynL) стабильной NiFe-содержащей гидрогеназы T. roseopersicina

BBS составила 60%, а с предшественником малой субъединицы (hynS) – 37% (рис. 21 и

22). Таким образом, было показано, что выделенный и очищенный белок является

целевым.

Рис. 19. MALDI-TOF масс-спектр триптического гидролизата Hyd SL гидрогеназы.

88

1 MSERIVVDPV TRIEGHLRIE AQMDGENIAQ AYSSGTSVRG LETILKGRDP

51 RDAWAFAQRI CGVCTLVHGI ASVRSVEDAL KIELPPNAQL IRNLMISSQF

101 VHDHVMHFYH LHALDWVDVV SALSADPKAT SDLAQSISSW PKSSPGYFAD

151 TQKRIKTFVE SGQLGIFANG YWGHPAYKLP PEANLMAVAH YLEALAWQRD

201 VARLHAIFGG KNPHPNFVVG GVPSPIDIDS DSAINAKRLA EVQQILQSMQ

251 TFVDQVYVPD TLAIASFYKD WGERGEGLGN FMSYGDLPAT GTMDPAQFLF

301 PRGVILNRDL STIHEIDLHD AGQIQEYVAH SWYEYSGGND QGLHPYDGET

351 NLEYDARGGV KPPYTQLDVH DGYSWMKAPR WKGHAMEVGP LARVLLLYAS

401 GHEQTKELVE MTLTTLDLPV RALYSTLGRT AARTLETKIL TDTAQDWYNQ

451 LIANIKAGDS RTFNETLWEP SSWPAEARGA GYMEAPRGAL GHWIVIKDRK

501 IANYQAVVPS TWNAGPRDPS DQPGAYEAAL QDNHQLVDVK QPIEILRTIH

551 SFDPCIACAV HLTDPETGEQ MEIKIT

Рис. 20. Аминокислотная последовательность большой субъединицы Hyd SL

T.roseopersicina BBS, полученная на основании нуклеотидных последовательностей

структурных генов hynL. Жирным шрифтом выделено соответствие пептидов.

1 MAARNPTDKT LGESLRERGV SRRGFLKFCA ATASMMALPP SMAPAIAAAL

51 EQAKRPSVIW LSFQECTGCT ESLTRSHAPT LEDLILDVIS LDYHHTLQAA

101 AGDAAEHARE QAMAANPGEY LVIVDGSIPGP PDSNPGYSTV AGHSNYAMLM

151 ETVENAAAVI AVGTCATFGG LPGANPNPTG AMSVMDLVKD KPVINVSGCP

201 PIPMVITGVI AHYLTFGRLP ELDAYNRPMA FFGQSIHDRC YRRPFYDKGL

251 FAKTFDDEGA RLGWCLYELG CKGPTTYNAC ATMRWNDGTS WPVEAGHPCL

301 GCSEPRFWDA GGFYNTVSVP TSASGVNVLA AGAAGAIVGG AVAALAKKQT

351 KTAVAHRQPV TVEELEAKL

Рис. 21. Аминокислотная последовательность малой субъединицы HydSL

T.roseopersicina BBS, полученная на основании нуклеотидных последовательностей

структурных генов hynL. Жирным шрифтом выделено соответствие пептидов.

3.5. Оценка электрохимических характеристик ферментного электрода на

основе гидрогеназы T.roseopersicina BBS.

3.5.1. Метод электрохимических измерений.

Применяемые в современном анализе электрохимические сенсоры функционируют

преимущественно по трехэлектродной схеме, состоящей из рабочего или индикаторного

электрода (РЭ), вспомогательного электрода (ВЭ) и электрода сравнения (ЭС) (рис. 22). В

соответствии с целями исследования каждый из электродов может иметь различный

дизайн и состав. Выбор формы и относительного размера каждой из трех составляющих

трехэлектродной схемы основывается на теоретических требованиях. Рабочий электрод

89

должен быть небольшим, чтобы исключить распределение потенциала по геометрии

электрода. Вспомогательный электрод должен иметь существенно большую площадь, чем

рабочий электрод, чтобы весь протекающий ток определялся электрохимическими

реакциями именно на рабочем электроде.

Рис. 22. Принципиальная схема электрохимических измерений. РЭ - рабочий

электрод, ВЭ - вспомогательный электрод, ЭС - электрод сравнения.

Рис.23. Схема строения электрода. а. при непосредственном нанесении фермента на

электрод; б. с модификацией поверхности нейтральным красным

Измерения проводили по схеме, представленной на рисунке 22. В качестве

вспомогательного в работе использовали стеклоуглеродный электрод, а в качестве

электрода сравнения хлоридсеребряный. Ферментный электрод выступал в качестве

90

рабочего. Измерения проводили с помощью универсального портативного потенциостата-

гальваностата EmStat-2 (Palm Instruments BV, Нидерланды) и персонального компьютера.

Ферментный электрод представлял собой углеродную ткань, поверхность которой

была модифицирована электрополимеризованным нейтральным красным, на который

иммобилизировали фермент. Основа углеродная тканевая представляет собой обугленную

вискозную ткань с нанесенным на нее пироуглеродом, полученным термолизом бензола.

Она обладает высокой электропроводностью, но при этом химически инертна.

Гидрогеназа может быть иммобилизована непосредственно на углеродную ткань, но ранее

было показано (Morozov et al., 2002), что эффективность биоэлектрокатализа можно

увеличить за счет нанесения на поверхность электрода положительно заряженного

полимера, в структуре которого присутствуют заместители, являющиеся субстратом для

гидрогеназы. Поэтому поверхность электрода модифицировали нейтральным красным.

3.5.2. Кинетические характеристики катализа иммобилизованной на электрод

гидрогеназой.

При внесении электрода с иммобилизованной гидрогеназой в буферный раствор,

насыщенный водородом, наблюдали постепенное снижение потенциала разомкнутой цепи

до значения, близкого равновесному водородному потенциалу. Этот процесс называется

активацией и обусловлен переходом фермента из неактивной в активную форму (см.

раздел 1.1.2.3.2.). Пример активации представлен на рисунке 24.

Рис. 24. Активация электрода на основе углеродной ткани с иммобилизованной

гидрогеназой из T. roseopersicina в атмосфере водорода (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, pH 7,

25oC).

91

В атмосфере аргона стационарный потенциал ферментного электрода сильно

смещен в положительную область и составляет более 500 мВ, а в отсутствии гидрогеназы

фоновая реакция электроокисления водорода в наблюдаемой области потенциалов

отсутствует и наблюдаются малые фоновые катодные токи. Следовательно, наблюдаемый

потенциал не связан с окислительно-восстановительными реакциями каких-либо групп в

белке и устанавливается только в присутствии водорода при наличии активного фермента.

В настоящее время большинство исследователей сходятся во мнении, что

расщепление водорода в активном центре гидрогеназ происходит гетеролитически. Это

мнение основано, в частности, на работах по изучению изотопного обмена между Н2 и

D2O (Карякин, Варфоломеев, 1986). Во всех случаях подтверждается модель:

H2 + E EH- + H

+

Механизм действия гидрогеназы включает связывание молекулы водорода с

последующим последовательным переносом двух электронов от нее на второй субстрат.

Схема катализа гидрогеназой из T. roseopersicina, представленная в работе (Yaropolov et

al., 1984), может быть записана как:

E + H2 EH2

EH2 EH¯ + H

+

EH¯ EH˙- e

-

EH˙ EH

+ + e

-

EH+

E +H

+

Как было показано в работе (Yaropolov et al., 1984), по сравнению с окислительно-

восстановительными стадиями все остальные протекают намного быстрее. Учитывая это и

полагая коэффициенты переноса обеих стадий равными (Морозов, 2003), уравнение для

тока можно записать в виде (Varfolomeyev et al., 1993):

α

α

α

α

где где i - величина плотности тока, - коэффициент переноса, E – потенциал, F –

постоянная Фарадея, R – универсальная газовая постоянная.

92

Таким образом, при положительных перенапряжениях в атмосфере водорода

наблюдали токи окисления водорода (рис. 25). Однако если потенциал электрода

превышает 200 мВ, то стационарные токи не устанавливаются – происходит постоянное

снижение величины тока. Например, при потенциале 250 мВ ток снижается более чем на

20% за 10 мин. Возможной причиной этого явления может быть окислительная

инактивация гидрогеназы при потенциалах выше 200 мВ. Поэтому, если не указано особо,

за максимальный ток принимали значение при перенапряжении 200 мВ. В области

отрицательных потенциалов в атмосфере водорода наблюдается катодный ток, который

соответствует выделению водорода. В отсутствии гидрогеназы реакция электроокисления

водорода в наблюдаемой области потенциалов отсутствует и наблюдаются малые

фоновые катодные токи.

В атмосфере аргона эффективное электрокаталитическое выделение водорода

происходит только при потенциалах ниже 200 мВ, что, как и падение тока окисления

водорода в атмосфере водорода при потенциалах выше 200 мВ, свидетельствует об

окислительной инактивации фермента при потенциалах выше 200 мВ.

Рис.25. Зависимость тока от времени при различных значениях перенапряжения

1. – 160 мВ; 2. – 120 мВ; 3. – 80 мВ; 4 – 40 мВ (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, pH 7, 25oC).

93

3.5.3. Биоэлектрокатализ гидрогеназами в присутствии промотора –

нейтрального красного.

Ранее было показано (Karyakin et al., 2007), что эффективность биоэлектрокатализа

можно увеличить за счет нанесения на поверхность электрода положительно заряженного

полимера, в структуре которого присутствуют заместители, являющиеся переносчиками

электронов с/на гидрогеназу. При выборе полимера важную роль играет его цена и

коммерческая доступность. Для данной работы был выбран азиновый краситель

нейтральный красный. Он, как и ряд азинов, способен полимеризоваться на поверхности

электрода с образованием положительно заряженных слоев (Karyakin, 1999), а область его

электроактивности близка к равновесному водородному потенциалу.

Рис.26. Поляризационные кривые окисления водорода в атмосфере водорода на

электроде, модифицированном слоем электрополимеризованного нейтрального красного

(1), и электроде с необработанной поверхностью (2) (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, pH 7,

25oC).

На рисунке 26 отображены поляризационные кривые окисления водорода для

электрода, модифицированном нейтральным красным, и электрода, полученным

иммобилизацией фермента непосредственно на электрод. Как видно из рисунка 26

значения плотности тока на электроде с модифицированной поверхностью в 4-5 выше при

всех значениях потенциалов. Максимальное значение тока окисления водорода при

модификации электрода нейтральным красным составляет 850 мкА/см2, что ниже

значений, полученных для электродов модифицированных поливиологеном и

полиполипиррол-виологеном, для которых значения составляют 1200 и 1400

94

соответственно (Morozov et al, 2006), но при этом нейтральный красный является

недорогим, коммерчески доступным реактивом с низкой токсичностью, что оправдывает

его использование.

Таким образом, использование нейтрального красного для дизайна поверхности

электрода позволяет получать высокоактивные водородные ферментные

электрокатализаторы окисления водорода. Максимальный ток окисления водорода

составляет 850 мкА/см2 при потенциале 200 мВ.

3.5.4. Электрохимическе характеристики электрода с иммобилизованной

гидрогеназой, полученной по модифицированной схеме очистки.

В работе были внесены изменения в схему очистки гидрогеназы (см. раздел 3.4.), в

частности вместо препаративного электрофореза провели FPLC-хроматографию на

monoP. Гомогенный препарат гидрогеназы в предыдущих работах получали с помощью

препаративного электрофореза (Серябрякова и др., 1977; Zadvorny et al., 2006; Sherman et

al., 1991). При использовании для изготовления электродов препаратов фермента, не

прошедших эту стадию очистки, максимальная активность электродов была в 3 раза ниже,

поскольку, предположительно, в препарате остается цитохром, связанный с гидрогеназой,

который блокирует передачу электронов с фермента на электрод (Воронин, 2010). Для

оценки применимости внесенных нами модификаций полученный препарат фермента

использовали для изготовления электрода.

Фермент иммобилизовали на электрод, модифицированный нейтральным красным.

Максимальное значения тока, полученные на данном электроде, составило 700мВ (см.

рис. 27), что ниже максимального. Но в предыдущих работах было показано, что

концентрация фермента в наносимом на электрод растворе должна составлять не менее 1

мг/мл, иначе это будет отражаться на значениях плотности тока (Воронин, 2010). В нашем

случае концентрация фермента составила 0,8 мг/мл, чем и объясняется заниженные

показатели плотности тока. Таким образом, при модификации метода очистки получен

препарат фермента, активность которого сопоставима с активностью электродов,

полученных при стандартной методике очистки, включающей электрофорез.

95

Рис. 27. Поляризационные кривые электроокисления водорода на тканевом

электроде, модифицированном нейтральным красным с иммобилизованной гидрогеназой,

полученной по модифицированной схеме очистки (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, pH 7, 25oC).

3.5.5. Исследование зависимости электрохимических характеристик

ферментных электродов от парциального давления водорода.

Целью дальнейшей работы была оценка принципиальной возможности применения

ферментного электрода для оценки концентрации водорода в среде. Были протестированы

два режима работы потенциометрический и амперометрический, поскольку возможны

расхождения по чувствительности и линейных диапазонам.

При первом режиме измеряли зависимость потенциала открытой цепи от

концентрации водорода. На рисунке 28 представлена зависимость потенциала открытой

цепи от процентного содержания водорода.

Согласно уравнению Нернста

где E0 - стандартный электродный потенциал, R – универсальная газовая

постоянная (8,314 Дж/моль*K), T - абсолютная температура (0 K, что равно −273,15°C), z -

число электронов, участвующих в электродном процессе, F - постоянная Фарадея

(96485,33289 Kл*моль-1

), [Ox] и [Red] - произведения концентраций (активностей)

веществ, принимающих участие в соответствующей полуреакции в окисленной (Ox) и

восстановленной (Red) формах.

96

Подставив значения температуры, E0 и pH, получаем

Из получившегося уравнения следует, что потенциал пропорционален логарифму

концентрации водорода, поэтому строили зависимость потенциала от lgC. Зависимость

линеаризировали в диапазоне от 0 до 30% (рис. 29), при этом коэффициент детерминации

составил 0,979. Но при диапазоне от 0 до 100% он составляет 0,949.

Рис. 28. Зависимость потенциала разомкнутой цепи от концентрации водорода для

гидрогеназного электрода (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, 25oC, рН 7).

Рис. 29. Зависимость потенциала разомкнутой цепи от логарифма концентрации

водорода для гидрогеназного электрода (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, pH 7, 25oC).

97

Протестировали также амперометрический режим работы. На рисунке 30

представлен график зависимости плотности тока от концентрации водорода. При

линеаризации данных в билогарифмической системе координат в диапазоне от 0 до 30%

водорода коэффициент детерминации равен 0,962 (рис. 31), при этом от 0 до 100%

коэффициент равен 0,9.

Рис. 30. Зависимость плотности тока при потенциале 100 мВ относительно

потенциала разомкнутой цепи от концентрации водорода для гидрогеназного электрода

(0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, pH 7, 25oC).

Рис. 31. Зависимость логарифма плотности тока при потенциале 100мВ

относительно потенциала разомкнутой цепи от логарифма концентрации водорода для

гидрогеназного электрода (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, pH 7, 25oC).

98

Таким образом, была показана возможность функционирования электрода в

качестве сенсора как потенциометрическом, так и амперометрическом режиме.

Как видно из рисунка 30 зависимость силы тока от процентного содержания

водорода имеет характерный вид равнобокой гиперболы. Принимая силу тока как

скорость химической реакции, рассчитали кажущуюся константу Михаэлиса.

Линеаризировали уравнение Михаэлиса-Ментон путем

где S – концентрация субстрата, V – скорость реакции, Km – константа Михаэлиса.

На рисунке 32 представлена зависимость S/V от S, прямая отсекает на оси х

отрезок – Km. Концентрацию Н2 в жидкости рассчитывали при помощи закона Генри. Из

графика получаем Кm(каж)=0,09 мМ Н2, что соответствует 12% смеси подаваемой газовой

смеси. Для растворенной гидрогеназы из T. roseopersicina BBS рассчитана Кm по

метилвиологену, он составляет 1,6*10-3

М (Карякин и др., 1984). Таким образом,

полученное нами значение для иммобилизованного фермента в 18 раз больше Кm для

растворенного фермента. Это может быть связано как с ограничениями в подвижности

самого фермента при иммобилизации, проблемами при передаче электронов с

дистального FeS-кластера на электрод, а также свойствами самого электрода, т.е. в нашем

случае свойствами углеродной ткани.

Рис. 32. График зависимости S/V1 от S (график Ленгмюра–Хейнса).

-Km

Km/V

99

В работах (Qian et al., 2002; Lutz, Fan, 2005) были также предложены модели

датчиков на водород, на основе фермента гидрогеназы. Куайн с соавторами (Qian et al.,

2002) иммобилизовали фермент между двумя слоями монтмориллонитовой глины с

включенным полибутилвиологеном, которые были закреплены на стеклоуглеродном

электроде. Верхний слой глины был покрыт целлюлозной пористой мембраной. Электрод

помещали в буферный раствор, содержащий 2 мМ метилвиологена. В данной системе и

метилвиологен и полибутилвиологен участвовали в переносе электронов с фермента на

стеклоуглеродный электрод. При исследовании влияния концентрации Н2 на силу тока

получили линейную зависимость от 1% до 100% водорода. Но для измерений

концентраций ниже 1%, по мнению авторов, требуется либо увеличить площадь

электрода, либо создать систему с большей чувствительностью.

Еще в одной схеме (Lutz, Fan, 2005) сенсора на водород в раствор для измерений

добавляли гидрогеназу из Ralstonia eutropha и бензилвиологен. При окислении Н2

гидрогеназа восстанавливает бензилвиологен, который детектируют электрохимически в

потенциостатическом режиме. Необходимость добавлять в раствор фермент и переносчик

ограничивает области применения такого датчика, а так же повышает расход фермента на

каждое измерение.

Предлагаемая нами схема измерений, в которой строение электрода подразумевает

непосредственную передачу электронов на электрод, имеет преимущество над

вышеописанными аналогами. Фермент в такой системе находится в иммобилизованной

форме, не требуется внесение медиаторов в раствор. В сравнении с описанным выше

предложенный нами электрод имеет более простое устройство, его возможно

миниатюризировать, в частности, используя технологию трафаретной печати (screen-

printed электроды). Это дешевый и простой в исполнении метод обеспечивает простоту

массового производства, высокую воспроизводимость получаемого продукта и низкую

стоимость, что дает возможность одноразового применения (Couto et al., 2016).

Трафаретная печать, или screen-printing – это метод печати графических изображений и

текста на различных поверхностях при помощи специальной формы (трафарета). Краска

наносится на трафарет, затем проникает сквозь него посредством механического

воздействия, ложась на поверхность. В качестве материала подложки для трафаретной

печати могут быть использованы различные материалы, такие как бумага, текстиль,

металл, кожа, керамика и синтетические материалы (Hobby, 1997). При использовании

печатного станка можно получить большие тиражи не отличающихся друг от друга по

свойствам сенсорных структур. Пример сенсорной структуры, которую можно получить с

помощью такой методики, представлен на рисунке 33. Преимуществом такой технологии

100

также является возможность изменения форм и размера электродов и самой сенсорной

структуры путем замены трафаретов для печатного станка, а также возможность

использовать различные материалы подложки, электродов и изолятора. Все

вышеуказанные параметры возможно подбирать исходя из потребностей измерений.

Рис. 33. Возможное расположение электродов трехэлектродной сенсорной

структуры (Борисова, 2011).

3.5.6. Влияние метана и двуокиси углерода на электрохимическую активность

гидрогеназных электродов.

Поскольку ферментный электрод предполагается помещать непосредственно в

среду культивирования микроорганизмов, необходимо исследовать влияние образуемых

микроорганизмами метаболитов на его работу. Так платина, используемая в качестве

чувствительного элемента в электрохимических датчиках, даёт отклик на другие

соединения, выделяемые микроорганизмами либо отравляется ими. Платиновые

катализаторы отравляются окисью углерода в концентрации более 0,01%, а при

содержании угарного газа 0,1 % платиновый электрод необратимо теряет 99% своей

активности за 10 минут (Igarashi et al., 1995), сероводород отравляет платину в 100 раз

эффективнее СО (Karyakin et al., 2005). Одними из основных продуктов анаэробного

микробного сообщества могут быть метан и углекислый газ. Для подтверждения

предположения о том, что метан и двуокись углерода не влияют на работу гидрогеназного

электрода, проверили возможность данных газов вызывать анодные токи и снижать

значения токов окисления водорода.

Как видно из рисунка 34, в атмосфере водорода при заданном потенциале 100 мВ

относительно потенциала разомкнутой цепи плотность тока составила 150 мкА/см2. При

замене водорода на метан при том же значении потенциала анодных токов не наблюдали.

Зависимость плотности тока от времени в атмосфере водорода и двуокиси углерода имеет

аналогичный вид. При подаче в ячейку молекулярного водорода, при заданном

101

потенциале 150 мВ относительно потенциала разомкнутой цепи, регистрировали 310

мкА/см2, при смене барботруемого газа с водорода на CO2 анодные токи отсутствовали

(рис. 35). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что исследуемые

газы не вызывают положительных откликов ферментного сенсора, ток при заданном

потенциале обусловлен исключительно окислением водорода.

Рис. 34. - Зависимость плотности тока от времени в атмосфере водорода и метана

для ферментного электрода при потенциале 100 мВ относительно потенциала

разомкнутой цепи (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl, 25oC, рН 7).

Рис. 35. - Зависимость плотности тока от времени в атмосфере водорода и двуокиси

углерода для ферментного электрода при потенциале 150 мВ относительно потенциала

разомкнутой цепи (0,5 М КН2РО4, 0,1 М KCl, 25oC, рН 7).

102

Для оценки ингибирующего действия газов на работу электрода через ячейку

пропускали смесь газов -20% аргона/80% водорода и в амперометрическом режиме

задавали различные значения потенциала, фиксируя показания тока окисления водорода,

после чего в подаваемой газовой смеси аргон заменяли на метан и проводили те же

измерения. Как видно из рисунка 36, в присутствии метана токи окисления водорода

практически не менялись. Таким же образом проверяли влияние двуокиси углерода на

работу ферментного электрода. Углекислый газ, как видно из рисунка 37, так же, как и

метан, не оказывал ингибирующего действия на работу электрода при всех значениях

перенапряжения. Затем, задавая определенное значение напряжения, и при

барбатировании рабочего пространства ячейки той же смесью газов (80% водорода, 20%

исследуемого газа) снимали показания тока в течение 60 минут. Как видно из рисунка 38 и

39 длительное воздействие метана и СО2 на электрод также не вызвало снижение токов

окисления водорода.

Рис. 36. - Влияние метана на токи окисления водорода на ферментном электроде.

1 - 20% аргона и 80% водорода; 2 - 20% метана и 80 % водорода (0,05 М КН2РО4, 0,1 М

KCl, 25ºC, рН 7).

103

Рис. 37. - Влияние двуокиси углерода на токи окисления водорода на ферментном

электроде. 1 - 20% аргона и 80% водорода; 2 - 20% двуокиси углерода и 80 % водорода

(0,5 М КН2РО4, 0,1 М KCl, 25oC, рН 7).

Рис. 38. Зависимость плотности тока от времени для ферментного электрода при

потенциале 100 мВ относительно потенциала разомкнутой цепи. 1 -20% аргона 80%

водорода; 2. -20% двуокиси углерода с 80 % водорода в газовой смеси (0,5 М КН2РО4, 0,1

М KCl, 25oC, рН 7).

104

Рис. 39. Зависимость плотности тока от времени для ферментного электрода при

при потенциале 100 мВ относительно потенциала разомкнутой цепи. 1 -20% аргона 80%

водорода; 2. -20% метана с 80 % водорода в газовой смеси. (0,05 М КН2РО4, 0,1 М KCl,

25oC, рН 7).

В работе Куайна с соавторами (Qian et al., 2002) также проверяли влияние метана

на работу гидрогеназного электрода. Фермент был иммобилизован между двумя слоями

монтмориллонитовой глины с включенным полибутилвиологеном, которые были

закреплены на стеклоуглеродном электроде. Такой модифицированный стеклоуглеродный

электрод не показал активности в атмосфере метана. В тоже время непродолжительное

воздействие метана на электрод не вызвало снижение токов окисления водорода. Наши

данные согласуются с результатами работы (Qian et al., 2002) в том, что метан не

оказывает действие на работу гидрогеназного электрода. Углекислый газ, как было

показано в работе, непосредственно не оказывает влияния на работу электрода, но при

выделении его микроорганизмами в больших количествах он может влиять на

кислотность среды, что необходимо учитывать при разработке ферментного сенсора, так

как значение рН среды оказывает влияние на работу ферментного электрода (Tsygankov et

al., 2007).

Проблемой для биотехнологического применения большинства гидрогеназ

является тот факт, что они необратимо инактивируются кислородом (Stiebritz, Reiher,

2012). При наличии 1 % кислорода в растворе гидрогеназа из T. roseopersicina необратимо

теряет 100% активности, поскольку окисляется активный центр фермента (Gogotov et al.,

1978). Однако при иммобилизации гидрогеназы на поверхности электрода, ее

стабильность значительно увеличивается. Так было показано, что при концентрации

105

кислорода 5%, электроды сохраняют более 75% своей активности, после удаления

кислорода из газовой смеси электроды восстанавливают 100% активности, то есть

наблюдается обратимое ингибирование (Morozov et al., 2006). Для ферментного электрода

на основе гидрогеназы из T. roseopersicina BBS показано, что он устойчив к действию

угарного газа и сульфида. Эти газы в небольших количествах зачастую образуются при

микробной ферментации, из-за чего невозможно использовать платину непосредственно в

среде культивирования, поскольку она отравляется следами этих газов (Mohtadi et al.,

2003; Karyakin et al., 2005). Для гидрогеназного электрода показано отсутствие

ингибирования при содержании СО до 0,1 %. Только при 1% CO активность снижается на

10%. Более того ингибирование СО ферментных электродов является обратимым

(Karyakin et al., 2002). Также в присутствии 5 мМ сульфида натрия токи окисления

водорода практически не изменяются (Karyakin et al., 2005).

Таким образом, гидрогеназный электрод устойчив к действию таких продуктов

брожения как метан, сульфид, угарный и углекислый газ. Он толерантен к воздействию

кислорода. Такой электрод возможно использовать как чувствительный элемент

биосенсора на водород непосредственно в среде культивирования микроорганизмов.

3.5.7. Измерение водорода непосредственно в среде культивирования

микроорганизмов.

Определение водорода проводили в культуральной жидкости термофильного

сахаролитического микроорганизма (штамм №21), основными газообразными

метаболитами которого являются водород и двуокись углерода. На рисунке 40

представлены кривые роста и выделения газовых метаболитов данного штамма (на 20 мл

среды культивирования). Поскольку данный микроорганизм является термофильным,

измерения проводили при 60ºС. Согласно уравнению Нернста, изменение температуры

влечет за собой изменение потенциала открытой цепи. При измерении ОЦП в буфере (0,5

М КН2РО4, 0,1 М KCl, рН 7) значение изменилось с -605 мВ до -647 мВ при повышении

температуры с 25 до 60ºС.

106

Рис. 40. Кривые роста и продукции газовых метаболитов сахаролитической

культурой № 21 за 48 часов. 1 – концентрация СО2; 2 – концентрация Н2; 3 – оптическая

плотность.

Ранее было показано (Voronin et al., 2012; Abramov et al., 2013), что ферментный

электрод стабилен при работе в среде культивирования термофильных микроорганизмов.

При работе в режиме потенциометрии в течение 25 суток значение ОЦП изменилось на

14%. После 25 дней измерения ОЦП добавили нагрузку. Через 13 суток культивирования

активность снизилась на 27%.

Измерение концентрации водорода непосредственно в процессе культивирования

микроорганизмов требует измерения при 60ºС, в среде культивирования с содержащимися

в ней метаболитами. Поэтому провели измерения плотности тока при 60ºС в

культуральной жидкости после отделения клеток микроорганизмов. Клетки отделяли

после 15 часов культивирования фильтрацией с помощью шприцевых фильтров Minisart

NML16534K (мембрана из ацетата целлюлозы, размер пор 0.2 мкм). При этом через

раствор в течение 5 минут пропускали смесь газов с заданной концентрацией водорода

(1%, 2%, 3%, 5%), после чего поток перекрывали и измерения проводили в стационарной

системе. Измерения провели при перенапряжении 50 мВ. На рисунке 41 данные

представлены в двойной логарифмической системе координат.

107

Рис. 41. Зависимость величины плотности тока (lgI) при потенциале 50мВ

относительно потенциала разомкнутой цепи от концентрации водорода (lgH2) для

гидрогеназного электрода (модифицированная среда Имшенецкого, pH 7, 60oC).

В целях проведения эксперимента по определению водорода непосредственно в

среде культивирования флакон со свежей питательной средой засевали (10% посевного) и

час инкубировали в термостате при 60ºС, после чего культуральную жидкость из этого

флакона анаэробно вносили в ячейку. Среду продували аргоном в течение 5-10 минут, в

ячейке с помощью внешней рубашки поддерживали температуру культивирования в 60ºС.

Детекцию ОЦП начали после перекрытия потока аргона. Непосредственно после начала

измерений наблюдали падение потенциала. Предварительная продувка среды аргоном

исключает возможность падения за счет водорода, внесенного с посевным материалом.

Как видно из рисунка 42, примерно за 40 минут от начала измерений потенциал упал до -

450 мВ, затем около 1,5 часов держался примерно на том же уровне, после чего опустился

до -590 мВ. Падение потенциала свидетельствует об образовании водорода в среде.

108

Рис. 42. Временная зависимость величины потенциала разомкнутой цепи в режиме

детекции непосредственно в среде культивирования микроорганизмов

(модифицированная среда Имшенецкого, pH 7, 60oC).

Через 2 часа культивирования измерили плотность тока при перенапряжении 50

мВ, значение тока составило 4,56 мкА/см2. На основании калибровочной кривой провели

количественный анализ Н2, который составил 2,8% водорода в газовой фазе и 1,8*10-5

М

водорода в растворе.

Необходимо подчеркнуть, что для определения Н2 может быть применен иной

подход. Количество водорода, окисленного на электроде, можно рассчитать через

количество электронов, поступивших на электрод. Стоить отметить, что в таких расчетах

невозможно оценить поток паразитных утечек электронов. Интегральный анализ

зависимости силы тока от времени позволяет получить количество кулонов, прошедших

через систему. Зная заряд одного моля электронов (число Фарадея) и учитывая факт, что

при окислении одной молекулы водорода на электрод поступает 2 электрона, можно

рассчитать количество молей окисленного водорода. В частности, на рисунке 43, показано

измерение силы тока непосредственно в среде культивирования микробного сообщества.

На основании интегрального анализа получили 1150 µКл, прошедших через систему за

это время, что соответствует 6*10-9

моль Н2. Такой метод может быть использован при

определении микроколичеств водорода, например в различных участках кишечника

животных и насекомых, частях микробного мата и т.п.

109

Рис.43. Зависимость тока от времени при потенциале 50 мВ относительно

потенциала разомкнутой цепи (модифицированная среда Имшенецкого, pH 7, 60oC).

На основании полученных данных, можно заключить, что модифицированный

гидрогеназный электрод может быть использован для измерения водорода

непосредственно в среде культивирования микроорганизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основная цель данной работы состояла в разработке научных основ технологии

получения сенсоров на водород, в основе функционирования которых лежит

использование фермента гидрогеназы. Важными параметрами для производства

ферментного сенсора являются простота и стоимость выделения и очистки фермента, его

стабильность при хранении и иммобилизации, достигаемые аналитические

характеристики. Поэтому для создания сенсора необходима комплексная работа по

оптимизации всех указанных аспектов, на что и была ориентирована эта работа.

Проведенная оптимизация культивирования штамма-продуцента позволила

повысить экономичность процесса, тем самым снизив стоимость получаемой биомассы.

Кроме того, модифицированная, более экономичная среда культивирования может быть

использована для культивирования родственных микроорганизмов.

Подобранные методы для длительного хранения позволили получить высокую

выживаемость штамма-продуцента. Показано, что для T. roseopersicina BBS применимо

хранение при низких температурах (-80 ºС) – метод более экономически выгодный в

110

сравнении с рекомендуемым для пурпурных серных бактерий хранением в жидком азоте

(The Prokaryotes…, 2006; Bergey’s…, 2009; Koshkarova et al., 2016).

В литературе крайне мало данных о лиофильном высушивании фототрофных

микроорганизмов. Согласно (The Prokaryotes…, 2006; Bergey’s…, 2009) пурпурные серные

бактерии не переносят лиофилизацию. При этом существует ограниченное количество

работ, в которых представители этой группы были успешно сохранены с помощью данной

методики (Malik, 1990; Kupletskaya, Netrusov, 2011). Так в работе (Malik, 1990) был

лиофильно высушен типовой штамм того же вида T. roseopersicina. Нам удалось добиться

более высокой выживаемости культуры в сравнении с опубликованными данными (Malik,

1990) при использовании более простой методики. В работе был использован

кинетический аппарат, позволивший оценить динамику выживаемости клеток в процессе

хранения. Подобных работ в литературе для фототрофных микроорганизмов обнаружено

не было. Показано соответствие скорости отмирания клеток теоретической модели при

хранении в течение года, рассчитано, что при таких условиях лиофильного высушивания

и исходной концентрации клеток непосредственно после лиофилизации (2±0,5)×108

кл/мл

после 10 лет хранения количество жизнеспособных клеток останется в пределах 104 – 10

3

кл/мл. Наши данные согласуются с данными (Kupletskaya, Netrusov, 2011), авторы

показали, что пурпурную серную бактерию Allochromatium minutissimum можно хранить в

лиофилизированной форме более 50 лет.

Выбранные и усовершенствованные методики выделения и очистки гидрогеназы

позволили получить высокостабильный и активный препарат фермента с удельной

активностью 38 и 43,3 мкмоль H2/мин ∙ мг белка. Установлена возможность замены

конечной ступени очистки фермента – препаративного электрофореза на

хроматофокусирование. Ранее было показано, что при использовании для изготовления

электродов препаратов фермента, не прошедших эту стадию очистки, максимальная

активность электродов была в 3 раза ниже (Воронин, 2010). В работе, заменив

препаративный электрофорез на хроматофокусирование, получили функционирующий

гидрогеназный электрод с активностью, сопоставимой с активностью электродов,

полученных на основе ферментного препарата, прошедшего стадию электрофореза.

Резюмируя, можно заключить, что очистку фермента возможно масштабировать,

используя препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию (Динариева и

др., 2015).

В нашей работе мы модифицировали систему очистки белка и не использовали

препаративный электрофорез. При этом (см. раздел 3.5.4.) мы получили

функционирующий гидрогеназный электрод с активностью, сопоставимой с активностью

111

электродов, полученных на основе стандартного метода очистки гидрогеназы (с

препаративным электрофорезом).

Большинство выпускаемых на сегодняшний день датчиков на водород

применяются для мониторинга состава воздуха промышленной зоны с целью обеспечения

пожаро- и взрывобезопасных условий, они громоздки и имеют высокую стоимость.

Анализаторы, которые возможно миниатюризировать, такие как термокаталитические и

полупроводниковые сенсоры, требуют высокой минимальной рабочей температуры (от

100ºС), электрохимические сенсоры на основе различных твердых электролитов имеют

также высокую рабочую температуру либо небольшой диапазон измерения

(Добровольский и др., 2006). Электрохимические датчики на основе платины

функционируют при комнатных температурах и выше, но платина отравляется такими

веществами как сероводород и окись углерода (Igarashi et al., 1995; Karyakin et al., 2005),

которые могут образовываться при микробной ферментации. Мембраны, используемые

для защиты платины, снижают селективность сенсоров и могут обрастать

микроорганизмами, что также сказывается на работе сенсора. Для измерения водорода в

газовой фазе можно также использовать газовую хроматографию, но для этого требуется

дорогостоящее оборудование, измерение идет дискретно, требуется отбор и ввод пробы

оператором.

Альтернативой вышеописанным методам может служить измерение водорода с

помощью биосенсоров на основе ферментов. В настоящее время это направление активно

развивается, биосенсоры находят все большее применение в различных сферах

деятельности человека (Reshetilov, 2007; Evtugyn, 2014). Таким образом, такие

катализаторы как платина, имеющие ограниченные ресурсы, могут быть заменены на

ферментные, получаемые на основе возобновляемых ресурсов. Для определения водорода

используется фермент гидрогеназа. В работах (Qian et al., 2002; Lutz, Fan, 2005)

предложено различное устройство сенсоров на водород с использованием очищенных

препаратов гидрогеназ. В отличие от указанных предложенный нами сенсор на основе

ферментного электрода имеет ряд преимуществ. Фермент находится в

иммобилизированой форме, что более экономично, чем использование растворимой

формы, увеличивает его стабильность. В процессе реакции электроны передаются

непосредственно на электрод, что не требует добавления медиаторов в раствор

(Кошкарова, Воронин, 2015). Также предложенный нами сенсор имеет более простое

строение, его можно миниатюризировать в частности с применением технологии

трафаретной печати, которая обеспечивает простоту массового производства, высокую

воспроизводимость получаемого продукта и низкую стоимость, что дает возможность

112

одноразового применения (Couto et al., 2016). К преимуществам стоит отнести также

характеристики самого иммобилизованного фермента. Он устойчив к ингибиторному

действию сульфида и угарного газа (Karyakin et al., 2002, Karyakin et al., 2005), устойчив к

действию протеолитических ферментов (Kovacs et al., 1988), может функционировать при

наличии кислорода в среде (Morozov et al., 2006), в то время как проблемой для

биотехнологического применения большинства гидрогеназ является тот факт, что они

необратимо инактивируются кислородом (Stiebritz, Reiher, 2012).

С помощью предложенного сенсора возможно будет проводить детекцию водорода

непосредственно в жидкости, в частности в среде культивирования микроорганизмов,

непрерывно записывая показания. Это менее трудоемко и затратно, чем наиболее часто

используемая в микробиологии газовая хроматография. Использование трафаретной

печати позволит изменять форму и размеры электродов в зависимости от поставленных

целей и задач.

Разработанные научные основы технологии создания биосенсора на водород в

дальнейшем могут быть использованы для разработки и производства водородных

биосенсоров различной конструкции для применения в различных сферах деятельности

человека от промышленности и медицины до научных исследований.

113

ВЫВОДЫ

1. Подобраны методы консервирования культуры, обеспечивающие получение

стабильного коллекционного материала и длительное хранение Thiocapsa

roseopersicina BBS. Показана применимость кинетического аппарата (теста на

ускоренного хранения) в анализе выживаемости клеток T. roseopersicina BBS в

процессе хранения. Расчетное время хранения культуры не менее 10 лет.

2. С использованием двух методик очистки и выделения получены

высокоочищенные препараты фермента с активностями 38 и 43,3 мкмоль H2/мин

∙ мг белка.

3. Полученный ферментный электрод на основе HynSL-гидрогеназы

T. roseopersicina BBS способен эффективно функционировать как биосенсор в

различных режимах и средах.

4. Показана возможность использования разработанного электрода для анализа Н2

непосредственно в среде культивирования микроорганизмов.

114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Р., Ярополов

А.И.. Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы. //

Докл. АН СССР. - 1978. - Т.240(3). – C.615-617.

2. Биосенсоры: основы и приложения. Под ред. Тернера Э., Краубе И., Уилсона Д.

Москва: Мир. – 1992. - 615с.

3. Богоров Л.В. О свойствах Thiocapsa roseopersicina штамм BBS, выделенного из

эстуария Белого моря // Микробиология. - 1974. - Т. 43. - С. 326-332.

4. Борисова А.В. Электрохимические (био)сенсоры на основе Fe-Ni

гексацианоферратов, полученных методом межфазного химического синтезаДисс. канд.

хим. наук. 2011. Москва: МГУ. 130c.

5. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Кравченко И.К., Быкова С.А.,

Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов

у представителей метанотрофных бактерий. // Микробиология. – 2002. -Т.71(4). - С.500-

508.

6. Воронин О.Г. Высокоэффективный электрокатализ гидрогеназами для конверсии

органических отходов в электрчество. Дисс. канд. хим. наук. 2010. Москва: МГУ. 135 c.

7. Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Кондратьева Е.Н. Очистка и свойства гидрогеназы

Thiocapsa roseopersicina // Биохимия. - 1976. - Т. 41. - С.836–842.

8. Горленко В.М. Аноксигенные фототрофные бактерии. В: Труды института

микробиологии имени С.Н. Виноградского. Выпуск XV. Фотосинтезирующие

микроорганизмы. Под ред. Гальченко Б.Ф. // Москва: Макс Пресс. - 2010. - С.133-175.

9. Готовцев П.М., Юзбашева Е.Ю., Горин К.В., Бутылин В.В., Бадранова Г.У.,

Перковская Н.И., Мостова Е.Б., Намсараев З.Б., Руднева Н.И., Комова А.В., Василов Р.Г.,

Синеокий С.П. Иммобилизация микробных клеток для биотехнологических производств.

Современные решения и перспективные технологии. // Биотехнология. – 2015. - № 2. -

С.33-45.

10. Дамаскин Б.Б., Петрий О.А. Электрохимия: учеб. пособие для хим. фак. ун-в.

Москва: Высш.шк.– 1987. - 295с.

11. Динариева Т.Ю., Кошкарова Л.А., Кант Й., Нетрусов А.И. Выделение и очистка

термостабильной гидрогеназы из пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina

BBS. // Материалы конференции «Автотрофные микроорганизмы: 5-й Всероссийский

симпозиум с международным участием». Москва, 2015. с.400.

115

12. Егоров А.А., Егоров М.А., Царева Ю.И. Химические сенсоры: классификация,

принципы работы, области применения. // Физико-химическая кинетика в газовой

динамике. - 2008. – № 6. - С.28-44.

13. Ефременко Е.Н., Сенько О.В., Алескерова Л.Э., Аленина К.А., Мажуль М.М.,

Исмаилов А.Д. Биосенсоры на основе иммобилизованных в криогеле поливинилового

спирта светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum для биомониторинга

экотоксикантов. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т.50(5). - С.490-496.

14. Жуков В.Г., Фирсов Н.Н. Фотоассимиляция органических соединений

Thiocapsa roseopersicina. // Микробиология. – 1976. - № 6. – С. 946–950.

15. Задворный О.А., Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Влияние ионов металлов на

гидрогеназу пурпурной серобактерии Thiocapsa roseopersicina. // Биохимия. – 2000. –

Т.65(11). – С.1525-1529.

16. Задворный О.А., Зорин Н.А., Гоготов И.Н., Горленко В.М. Свойства стабильной

гидрогеназы пурпурной серной бактерии Lamprobacter modestohalophilus. // Биохимия. –

2004. – Т.69(2). – С.204-210.

17. Зорин Н.А. Ингибирование гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina различными

соединениями. // Биохимия. - 1986. -Т.51. - С.770–774.

18. Исмаилов А.Д., Алескерова Л.Э. Фотобиосенсоры на основе светящихся

бактерий. // Биохимия. - 2015. - Т.80(6). - С.867-881.

19. Карякин Α.Α., Варфоломеев С.Д. Каталитические свойства гидрогеназ. //

Успехи химии. – 1986. – T.55(9). – C.1524-1549.

20. Карякин А.А., Ярополов А.И., Зорин И.А., Гоготов И.Н., Варфоломеев С.Д.

Кинетика и механизм окисления водорода гидрогеназой Thiocapsa roseosersicina //

Биохимия. – 1984. – Т.49(4). - С.611-621.

21. Каттралл Р. Химические сенсоры. Москва: Научный мир. – 2000. – 144с.

22. Кондратьева Е.Н. Фотосинтезирующие бактерии и бактериальный фотосинтез.

Москва: Изд-во МГУ. - 1972. - 76с.

23. Кондратьева Е.Н., Гоготов И.Н. Молекулярный водород в метаболизме

микроорганизмов. Москва: Наука. – 1981. – 342с.

24. Кондратьева Е.Н., Максимова И.В., Самуилов В.Д. Фототрофные

микроорганизмы. Москва: Изд-во МГУ. – 1989. – 376с.

25. Кондратьева Е.Н. Автотрофные прокариоты. Москва: Изд-во МГУ. – 1996. -

304с.

26. Корсунский О.Ф., Гоготов И.Н. Очистка и свойства редуктазы из фототрофной

бактерии Thiocapsa roseopersicina. // Биохимия. – 1980. - Т.45. - С.1488-1496.

116

27. Краснов Н. В., Лютвинский Я. И., Подольская Е. П. Масс-спектрометрия с

мягкими методами ионизации в протеомном анализе. // Научное приборостроение. – 2010.

– Т.20.(4) - С.5–20.

28. Кузнецов В.Д., Филиппова С.Н., Муравьева С.А., Фишман В.М.

Прогнозирование выживаемости лиофилизированных спор Actinomyces parvullus,

основанное на методе «Ускоренного хранения». // Микробиология. - 1977. - Т.46(2). -

С.318-323.

29. Морозов С.В., Водородный топливный электрод на основе ферментов. Дисс.

канд. хим. наук. 2003, Москва: МГУ. 159 c.

30. Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н. Окисление сульфита Thiocapsa

roseopersicina. // Микробиология. - 1976. - Т.45. - С.592-597.

31. Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н. Ферменты, участвующие в метаболизме

тиосульфата у Thiocapsa roseopersicina при ее росте в разных условиях. // Микробиология.

- 1976. - Т.45. - С.950-965.

32. Петрухин О.М., Максименко О.О. Сенсоры в аналитической химии. // Рос. хим.

ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2008. - Т.52(2). – С.3-6.

33. Похиленко В.Д., Баранов А.М., Детушев К.В. Методы длительного хранения

коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития. // Известия высших

учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. – 2009. – Т.12(4). – С.99-

121.

34. Решетилов А.Н. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для

экологического мониторинга и контроля биотехнологических процессов. // Прикладная

биохимия и микробиология. – 2005. - Т.41(5). – С.504-513.

35. Турова Т.П., Кеппен О.И., Ковалева О.Л., Слободова Н.В., Берг И.А.,

Ивановский Р.Н. Филогенетическое положение пурпурной серной бактерии Thiocapsa sp.

штамм BBS на основании анализа генов 16S рРНК, cbbL и nifH и описание его в качестве

вида Thiocapsa bogorovii sp.nov. // Микробиология. - 2009. - Т. 78. - С.381–392.

36. Цыганков А.А. Получение водорода биологическим путем // Рос. хим. ж. (Ж.

Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2006. - Т.50(6). - С.26-33.

37. Шамраев Ю.И., Шишкина Л.А. Океанология. Ленинград: Гидрометеоиздат. -

1980. – 382с.

38. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. Москва: Техносфера. – 2005. –

336с.

117

39. Alenina K.A., Aleskerova L.E., Kascheyeva P.B., Ismailov A.D. The poly(vinyl

alcohol)-immobilized photobacteria for toxicology monitoring. // Engineering. - 2012. - V.4. -

P.118-119.

40. Abdullatypov A.V., Tsygankov A.A. Modeling three-dimensional structure of two

closely related Ni-Fe hydrogenases. // Photosynth Res. – 2015. – V.125(1-2). – P.341-353.

41. Adams M.W. The structure and mechanism of iron-hydrogenases. // Biochim.

Biophys. Acta. - 1990. – V.1020(2). - P.115-145.

42. Ahuja T., Mir I.A., Kumar D.R. Biomolecular immobilization on conducting

polymers for biosensing applications. // Biomaterials. – 2007. – V.28(5). – P.791-805.

43. Albracht S.P. Nickel hydrogenases: in search of the active site. // Biochim. Biophys.

Acta. - 1994. – V.1188. - P.167-204.

44. Alex L.A., Reeve J.N., Orme-Johnson W.H., Walsh C.T. Cloning, sequence

determination, and expression of the genes encoding the subunits of the nickel-containing 8-

hydroxy-5-deazaflavin reducing hydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum

delta H. // Biochemistry. – 1990. - V.29. – P.7237–7244.

45. Andreescu S., Barthelmebs L., Marty J-L. Immobilization of acetylcholinesterase on

screen-printed electrodes: comparative study between three immobilization methods and

applications to the detection of organophosphorus insecticides. // Anal. Chim. Acta. – 2002. –

V.464. - P.171–180.

46. Bahadır B., Sezginturk K. Applications of electrochemical immunosensors for early

clinical diagnostics. // Talanta. – 2015. – V.15. – P.162-174.

47. Baltazar C.S.A., Marques M.C., Soares C.M., DeLacey A.M., Pereira I.A.C., Matias

P.M. Nickel–Iron–Selenium Hydrogenases – An Overview. // Eur. J. Inorg. Chem. – 2011. -

V.2011(7). – P.948–962.

48. Bakker E., Pretsch E. Potentiometric sensors for trace-level analysis. // Trac-Trends

in Analytical Chemistry. – 2005. - V.24(3). - P.199–207.

49. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Edited by Garrity G.M., Brenner D.J.,

Krieg N.R., Staley J.T. 2nd ed. Springer. - 2009. - V.2. - 1106p.

50. Berkessel A. Activation of dihydrogen without transition metals. // Curr. Opin. Chem.

Biol. – 2001. - V.5.(5). - P.486-490.

51. Bisoffi M., Severns V., Branch D.W., Edwards T.L., Larson R.S. Rapid detection of

human immunodeficiency virus types 1 and 2 by use of an improved piezoelectric biosensor. // J.

Clin. Microbiol. – 2013. – V.51(6). – P.1685-1691.

52. Blaustein R.A., Pachepsky Y., Hill R.L., Shelton D.R., Whelan G. Escherichia coli

survival in waters: temperature dependence. // Water Res. – 2013. – V.47(2). - P.569-78.

118

53. Bleijlevens B., Buhrke T., van der Linden E., Friedrich B., Albracht S.P. The

auxiliary protein HypX provides oxygen tolerance to the soluble [NiFe]-hydrogenase of

Ralstonia eutropha H16 by way of a cyanide ligand to nickel. // Biol. Chem. – 2004. – V.

279(45). – P.46686-46691.

54. Brecht M., van Gastel M., Buhrke T., Friedrich B., Lubitz W. Direct detection of a

hydrogen ligand in the [NiFe]-center of the regulatory H2-sensing hydrogenase from Ralstonia

eutropha in its reduced state by HYSCORE and ENDOR spectroscopy. // J. Am. Chem. Soc. -

2003. - V.125. - P.13075-13083.

55. Brady D., Jordaan J. Advances in enzyme immobilization. // Biotechnol. Lett. – 2009.

– V.31. – P.1639–1650.

56. Buhrke T., Lenz O., Krauss N., Friedrich B. Oxygen tolerance of the H2-sensing

[NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 is based on limited access of oxygen to the

active site. // J. Biol. Chem. - 2005. – V.28 - P.23791–23796.

57. Byfield M.P., Abuknesha R.A. Biochemical aspects of biosensors. // Biosensors and

Bioelectronics. – 1994. - V.9. – P.373-400.

58. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., Madden

T.L. BLAST+: architecture and applications. // BMC Bioinformatics. – 2009. – V.10. – P.421-

429.

59. Caumette P., Guyoneaud R., Imhoff J.F., Suling J., Gorlenko V. Thiocapsa marina

sp. nov., a novel, okenone-containing, purple sulfur bacterium isolated from brackish coastal and

marine environments. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2004. – V.54. – P.1031-1036.

60. Chaubey A., Malhotra B.D. Mediated biosensors. // Biosensors and Bioelectronics. –

2002. - V.17. – P.441–456.

61. Chun U.-H., Simonov N., Chen Y., Britzb M.L. Continuous pollution monitoring

using Photobacterium phosphoreum. // Resources, Conservation and Recycling. – 1996. – V.18.

– P.25-40.

62. Clark L.C., Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular

surgery. // Ann. NY Acad. Sci. – 1962. - V.102. – P.29–45.

63. Colbeau A., Kovacs K.L., Chabert J., Vignais P.M. Cloning and sequencing of the

structural (hupSLC) and accessory (hupDHI) genes for hydrogenase biosynthesis in Thiocapsa

roseopersicina. // Gene. – 1994. - V.140. - P.25–31.

64. Cole J.R., Wang Q., Fish J.A., Chai B., McGarrell D.M., Sun Y., Brown C.T., Porras-

Alfaro A., Kuske C.R., Tiedje J.M. Ribosomal Database Project: data and tools for high

throughput rRNA analysis. // Nucleic. Acids. Res. – 2014. – V.42. – P.633-642.

119

65. Constant P., Chowdhury S.P., Hesse L., Pratscher J., Conrad R. Genome data mining

and soil survey for the novel group 5 [NiFe]-hydrogenase to explore the diversity and ecological

importance of presumptive high-affinity H(2)-oxidizing bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. –

2011. – V.77(17). – P.6027-6035.

66. Cooper M.A. Optical biosensors in drug discovery. // Nature Reviews Drug

Discovery. – 2002. - V.1. - P.515-528.

67. Couto R.A., Lima J.L., Quinaz M.B. Recent developments, characteristics and

potential applications of screen-printed electrodes in pharmaceutical and biological analysis. //

Talanta. – 2016. – V. 146. - P. 801-814.

68. Dahl C., Rakhely G., Pott-Sperling A.S., Fodor B., Takacs M., Toth A., Kraeling M.,

Gyorfi K., Kovacs A., Tusz J., Kovacs K.L. Genes involved in hydrogen and sulfur metabolism

in phototrophic sulfur bacteria. // FEMS Microbiol. Lett. – 1999. – V.180 - P.317–324.

69. Darvall J.G. Preservation of microorganisms. // Culture. – 2000. – V.21(2). - P.1-5.

70. Davis G. Electrochemical techniques for the development of amperometric

biosensors. // Biosensors. – 1985. – V.1(2). – P.161–178.

71. De Lacey A.L., Hatchikian E.C., Volbeda A., Frey M., Fontecilla-Camps J.C.,

Fernandez V.M. Infrared-spectroelectrochemical characterization of the [NiFe]-hydrogenase of

Desulfovibrio gigas. // J. Am. Chem. Soc. - 1997. – V.119. - P.7181-7189.

72. De Lacey A.L., Fernandez V.M., Rousset M., Cammack R. Activation and

inactivation of hydrogenase function and the catalytic cycle: spectroelectrochemical studies. //

Chem. Rev. - 2007. - V.107. - P.4304-4330.

73. Dietrich W., Klimmek O. The function of methyl-menaquinone-6 and polysulfide

reductase membrane anchor (PsrC) in polysulfide respiration of Wolinella succinogenes. // Eur.

J. Biochem. – 2002. – V.269. – P.1086–1095.

74. Dizer H., Wittekindt E., Fischer B., Hansen P.D. The cytotoxic and genotoxic

potential of surface water and wastewater effluents as determined by bioluminescence, umu-

assays and selected biomarkers. // Chemosphere. – 2002. – V.46(2). – P.225-233.

75. Duche O., Elsen S., Cournac L., Colbeau A. Enlarging the gas access channel to the

active site renders the regulatory hydrogenase HupUV of Rhodobacter capsulatus O2-sensitive

without affecting its transductory activity. // FEBS J. - 2005. – V.272. - P.3899–3908.

76. Dupont-Filliard A., Billon M., Livache T., Guillerez S. Biotin/avidin system for the

generation of fully renewable DNA sensor based on biotinylated polypyrrole film. // Anal. Chim.

Acta. – 2004. – V.515. - P.271–277.

120

77. Eddowes M.J., Hill H.A.O. Novel method for the investigation of the

electrochemistry of metalloproteins: cytochrome c. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. – 1977. –

V. 21. - P.771–772.

78. Elsen S., Colbeau A., Chabert J., Vignais P.M. The hupTUV operon is involved in

negative control of hydrogenase synthesis in Rhodobacter capsulatus. // J. Bacteriol. – 1996. –

V.178. - P.5174-5181.

79. Elsen S., Duche O., Colbeau A. Interaction between the H2 sensor HupUV and the

histidine kinase HupT controls HupSL hydrogenase synthesis in Rhodobacter capsulatus. // J.

Bacteriol. – 2003. - V.185. – P.7111–7119.

80. Evtugyn G. Biosensor: Essentials. Springer. - 2014. - 274p.

81. Fakanya W.M., Tothill E.I. Detection of the inflammation biomarker C-reactive

protein in serum samples: towards an optimal biosensor formula. // Biosensors (Basel). – 2014. –

V.4. - P.340-357.

82. Fan X., White I.M., Shopova S.I., Zhu H., Suter J.D., Sun Y. Sensitive optical

biosensors for unlabeled targets: a review. // Anal. Chim. Acta. – 2008. – V.620. - P.8-26.

83. Ferapontova E.E., Shleev S., Ruzgas T., Stoica L., Christenson A., Tkac J.,

Yaropolov A.I., Gorton L. Direct electrochemistry of proteins and enzymes. // Perspectives in

Bioanalysis. – 2005. – V.1. – P.517-598.

84. Fernandez V.M., Hatchikian E.C., Cammack R. Properties and reactivation of two

different deactivated forms of Desulfovibrio gigas hydrogenase. // Biochim. Biophys. Acta. -

1985. – V.832. – P.69-79.

85. Fernandez V.M., Rua M.L., Reyes P., Cammack R., Hatchikian E.C. Inhibition of

Desulfovibrio gigas hydrogenase with copper salts and other metal ions. // Eur. J. Biochem. –

1989. – V.185(2). – P.449-454.

86. Florin L., Tsokoglou A., Happe T. A novel type of iron hydrogenase in the green alga

Scenedesmus obliquus is linked to the photosynthetic electron transport chain. // J. Biol. Chem. -

2001. – V.276. – P.6125–6132.

87. Fodor B.D., Rakhely G., Kovacs A.T., Kovacs K. L. Transposon mutagenesis in

purple sulfur photosynthetic bacteria: identification of hypF, encoding a protein capable of

processing [NiFe]-hydrogenases in alpha, beta, and gamma subdivisions of the proteobacteria. //

Appl. Environ. Microbiol. - 2001. – V.67. - P.2476–2483.

88. Foerster S., Stein M., Brecht M., Ogata H., Higuchi Y., Lubitz W. Single crystal EPR

studies of the reduced active site of [NiFe]-hydrogenase from Desulfiovibrio vulgaris. // J. Am.

Chem. Soc. - 2003. – V.125. – P.83-93.

121

89. Forestier M., King P., Zhang L., Posewitz M., Schwarzer S., Happe T., Ghirardi

M.L., Seibert M. Expression of two [Fe]-hydrogenasesin Chlamydomonas reinhardtii under

anaerobic conditions. // Eur. J. Biochem. – 2003. – V.270. – P.2750–2758.

90. Fournier M., Dermoun Z., Durand M.C., Dolla A. A new function of the

Desulfovibrio vulgaris Hildenborough [Fe]-hydrogenase in the protection against oxidative

stress. // J. Biol. Chem. – 2004. – V.279. – P.1787-1793.

91. Fox J.D., Kerby R.L., Roberts G.P., Ludden P.W. Characterization of the CO-

induced, CO-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large

subunit of the enzyme. // J. Bacteriol. – 1996. – V.178(6). – P.1515-1524.

92. Frew J.E., Hill H.A. Direct and indirect electron transfer between electrodes and

redox proteins. // Eur. J. Biochem. – 1988. –V.172(2). – P.261-269.

93. Fritsch J., Lenz O., Friedrich B. Structure, function and biosynthesis of O2-tolerant

hydrogenases. // Nat. Rev. Microbiol. – 2013. - V.11. – P.106-114.

94. Garcin E., Vernede X., Hatchikian E.C., Volbeda A., Frey M., Fonticilla-Camps J.C

The crystal structure of a reduced [NiFeSe]-hydrogenase provides an image of the activated

catalytic center. // Structure. - 1999. – V.7. - P.557-566.

95. Girard-Egrot A.P., Godoy S., Blum L.J. Enzyme association with lipidic Langmuir–

Blodgett films: interests and applications in nanobioscience. // Adv. Colloid. Interface. Sci. –

2005. – V.116. – P.205–225.

96. Gogotov I.N., Zorin N.A., Serebriakova L.T., Kondratieva E.N. The properties of

hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina. // Biochim Biophys Acta. – 1978. – V.523(2). -

P.335-343.

97. Goris T., Wait A.F., Saggu M., Fritsch J., Heidary N., Stein M., Zebger I., Lendzian

F., Armstrong F.A., Friedrich B., Lenz O. A unique iron-sulfur cluster is crucial for oxygen

tolerance of a [NiFe]-hydrogenase. // Nat. Chem. Biol. – 2011. –V.7(5). – P.310-318.

98. Grieshaber D., MacKenzie R., Voros J., Reimhult E. Electrochemical Biosensors -

Sensor Principles and Architectures. // Sensors. – 2008. – V.8. – P.1400-1458.

99. Griffin C.W., Cook E.C. Mehaffey M.A. Predicting the stability of freeze-dried

Fusobacterium mortiferum proficiency testing samples by accelerated storage tests. //

Cryobiology. - 1981. - V.18. - P.420-425.

100. Gross R., Pisa R., Sanger M., Lancaster C.R., Simon J. Characterization of the

menaquinone reduction site in the diheme cytochrome b membrane anchor of Wolinella

succinogenes NiFe-hydrogenase. // J. Biol. Chem. – 2004. – V.279. - P.274–281.

122

101. Guiral M., Prunetti L., Lignon S., Lebrun R., Moinier D., Giudici-Orticonit M.T.

New insights into the respiratory chains of the chemolithoautotrophic and hyperthermophilic

bacterium Aquifex aeolicus. // J. Proteome Res. – 2009. - V.8. – P.1717–1730.

102. Donev T. Methods for conservation of industrial microorganisms. Sofia: NBIMCC.

- 2001. - 96р.

103. Hallenbeck P.C., Benemann J.R. Biological hydrogen production: fundamentals and

limiting processes. // Int. J. Hydrogen Energy. – 2002. - V.27. – P.1185–1193.

104. Happe R.P., Roseboom W., Pierik A.J., Albracht S.P., Bagley K.A. Biological

activation of hydrogen. // Nature. – 1997. - V.385. – P.126.

105. Happe T., Kaminski A. Differential regulation of the Fe-hydrogenase during

anaerobic adaptation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. // Eur. J. Biochem. - 2002. –

V.269. – P.1022–1032.

106. He S.H., Woo S.B., DerVartanian D.V., Le Gall J., Peck H.D. Effects of acetylene

on hydrogenases from the sulfate reducing and methanogenic bacteria. // Biochem. Biophys.

Res. Commun. – 1989. - V.30. - P.127-133.

107. Hedderich R. Energy-converting [NiFe]-hydrogenases from archaea and

extremophiles: ancestors of complex I. // J. Bioenerg. Biomembr. – 2004. – V.36(1). – P.65-75.

108. Heckly R.J. Preservation of bacteria by liophilization // Adv. appl. microbiol. - 1961.

- V.3. - P.1-76.

109. Higuchi Y., Yagi T., Yasuoka N. Unusual ligand structure in Ni-Fe active center and

an additional Mg site in hydrogenase revealed by high resolution X-ray structure analysis. //

Structure. – 1997. – V.5(12). – P.1671-1680.

110. Hnaien M., Lagarde F., Bausells J., Errachid A., Jaffrezic-Renault N. A new

bacterial biosensor for trichloroethylene detection based on a three-dimensional carbon

nanotubes bioarchitecture. // Anal. Bioanal. Chem. - 2011. – V.400. – P.1083–1092.

111. Hobby A. Screen printing for the industrial user. // The Gwent Group, Leaders in

paste manufacturing, sensor/ biosensor development and Instrumentation. 1997. URL:

http://www.gwent.org/gem_screen_printing.html (дата обращения: 25.05.2016).

112. Hoehler T.M., Bebout B.M., Des Marais D.J. The role of microbial mats in the

production of reduced gases on the early Earth. // Nature. - 2001. – V.412. - P.324–327.

113. Hoehler T.M., Albert D.B., Alperin M.J., Bebout B.M., Martens C.S., Des Marais

D.J. Comparative ecology of H2 cycling in sedimentary and phototropic ecosystems. // Int. J.

Gen. Mol. Microbiol. - 2002. - V.81. - P.575–585.

123

114. Ide T., Baumer S., Deppenmeier U. Energy conservation by the H2: heterodisulfide

oxidoreductase from Methanosarcina mazei Gö1: identification of two proton-translocating

segments. // J. Bacteriol. – 1999. - V.181(13). - P.4076-4080.

115. Igarashi H., Fujino T., Watanabe M. Hydrogen electrooxidation on platinum

catalysts in the presence of trace carbon monoxide. // J. Electroanal. Chem. - 1995. - V.391. -

P.119-123.

116. Kandimalla V.B., Tripathi V.S., Ju H. Biosensors based on immobilization of

biomolecules in sol-gel matrices. In: Electrochemical sensors, biosensors and their biomedical

applications. Edited by Zhang X., Ju H., Wang J. Amsterdam: Elsevier Inc. – 2008. – P.504-523.

117. Kamachi T., Uno S., Hiraishi T., Okura I. Effect of Hg(II) on hydrogenase activity

from Desulfovibrio vulgaris (Miyazaki). // J. Mol. Catal. A: Chem. – 1995. – V.96. P.329-333.

118. Karaseva N.A., Ermolaeva T.N. A piezoelectric immunosensor for chloramphenicol

detection in food. // Talanta. – 2012. – V.93. – P.44-48.

119. Karel M., Lund D.B. Physical principles of food preservation. New York: Marcel

Dekker, Inc. – 2003. – 571p.

120. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Schuhmann W., Schmidt H.L. Electropolymerized

Azines: Part II. In a search of the best electrocatalyst of NADH oxidation. // Electroanalysis. -

1999. – V.11(8). - P.553-557.

121. Karyakin A.A., Morozov S.V., Karyakina E.E., Varfolomeyev S.D., Zorin N.A.,

Cosnier S. Hydrogen fuel electrode based on bioelectrocatalysis by the enzyme hydrogenase. //

Electrochemistry Communications. - 2002. - V.4(5). - P.417–420.

122. Karyakin A.A., Morozov S.V., Karyakina E.E., Zorin N.A., Perelygin V.V., Cosnier

S. Hydrogenase electrodes for fuel cells. // Biochem. Soc. Trans. - 2005. - V.33(1). - P.73-75.

123. Karyakin A.A., Morozov S.V., Voronin O.G. Zorin N.A., Karyakina E.E., Fateyev

V.N., Cosnier S. The limiting performance characteristics in bioelectrocatalysis of hydrogenase

enzymes // Angеwandtе Chemie. - 2007. - V.46. - P.7244-7246.

124. Kaster A.K., Moll J., Parey K., Thauer R.K. Coupling of ferredoxin and

heterodisulfide reduction via electron bifurcation in hydrogenotrophic methanogenic archaea. //

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2011. – V.108. – P.2981-2986.

125. Khlupova M., Kuznetsov B., Demkiv O., Gonchar M., Csoregi E., Shleev S. Intact

and permeabilized cells of the yeast Hansenula polymorpha as bioselective elements for

amperometric assay of formaldehyde. // Talanta. – 2007. – V.71. - P.934–940.

126. Kim D.H., Kim M.S. Hydrogenases for biological hydrogen production. //

Bioresource Technology. – 2011. – V.102. - P.8423–8431.

124

127. King P.W., Posewitz M.C., Ghirardi M.L., Seibert M. Functional studies of [FeFe]-

hydrogenase maturation in an Escherichia coli biosyntheticsystem. // J. Bacteriol. – 2006. –

V.188. – P.2163–2172.

128. King V.A., Lin H.J., Liu C.F. Accelerated storage testing of freeze-dried and

controlled low-temperature vacuum dehydrated Lactobacillus acidophilus. // J. Gen. Appl.

Microbiol. – 1998. - V.44. - P.161–165.

129. Kohler S., Belkin S., Schmid R.D. Reporter gene bioassays in environmental

analysis. // Fresenius J. Anal. Chem. – 2000. - V.366(6-7). - P.769-779.

130. Kondratieva E.N., Zhukov V.G., Ivanovsky R.N., Petushkova U.P., Monosov E.Z.

The capacity of phototrophic sulfur bacterium Thiocapsa roseopersicina for chemosynthesis. //

Arch.Microbiol. - 1976. - V.108. - P.287-292.

131. Kondratieva E.N., Ivanovsky R.N., Krasilnikoova E.N. Light and dark metabolism

in pure sulfur bacteria. // Soviet Science Review. - 1981. - V.2. - P.325-364.

132. Koshkarova L., Shestakov A., Netrusov A. Long-term storage of Thiocapsa

roseopersicina BBS. // International conference “Photosynthesis Research for Sustainability”.

Pushchino, 2016. P.206.

133. Kovacs K.L., Bagyinka C., Serebriakova L.T. Distribution and orientation of

hydrogenase in various photosynthetic bacteria. // Curr. Microbiol. – 1983. – V.9. – P.215–218.

134. Kovacs K.L., Tigyi G., Alfonz H. Purification of hydrogenase by fast protein liquid

chromatography and by conventional separation techniques: a comparative study. // Prep

Biochem. – 1985. – V.15(5). – P.321-334.

135. Kovacs K.L., Bagyinka C., Tigyi G. Proteolytic resistance and its utilization in

purification of hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina // Biochim. Biophys. Acta. - 1988. -

V.935. - P.166–172.

136. Kovacs K.L., Bagyinka C. Structural properties, functional states and physiological

roles of hydrogenase in photosynthetic bacteria. // FEMS Microbiol. Rev. – 1990. – V.87. –

P.407–412.

137. Kovacs K.L., Fodor B.D., Kovacs A.T., Csanadi G., Maroti G., Balogh J., Arvani S.,

Rakhely G. Hydrogenases, accessory genes and the regulation of [NiFe]-hydrogenase

biosynthesis in Thiocapsa roseopersicina. // Int. J. Hydr. Energy. - 2002. - V.27. – P.1463–1469.

138. Kovacs A.T., Rakhely G., Kovacs K.L. Genes involved in the biosynthesis of

photosynthetic pigments in the purple sulfur photosynthetic bacterium Thiocapsa roseopersicina.

// Appl. Environ. Microbiol. – 2003. - V.69(6). - P.3093–3102.

125

139. Kovacs A.T., Rakhely G., Balogh J., Maroti G., Cournac L., Carrier P., Meszaros

L.S., Peltier G., Kovacs K.L. Hydrogen independent expression of hupSL genes in Thiocapsa

roseopersicina BBS. // FEBS J. - 2005a. – V.272(18). – P.4807-4816.

140. Kovacs A.T., Rakhely G., Browning D.F., Fulop A., Maroti G., Busby S.J.W.,

Kovacs K.L. An FNR-type regulator controls the anaerobic expression of Hyn hydrogenase in

Thiocapsa roseopersicina. // J. Bacteriol. - 2005b. - V.187. – P.2618–2627.

141. Kovacs K.L., Kovacs A.T., Maroti G., Meszaros L.S., Balogh J., Latinovics D.,

Fulop A., David R., Doroghazi E., Rakhely G. The hydrogenases of Thiocapsa roseopersicina. //

Biochem. Soc. Trans. - 2005c. - V.33(1). – P.61-63.

142. Kramer T., Kampa M., Lubitz W., van Gastel M., Neese F. Theoretical spectroscopy

of the Ni(II) intermediate states in the catalytic cycle and the activation of [NiFe]-hydrogenases.

// Chembiochem. – 2013. – V.14(14). – P.1898-1905.

143. Kupletskaya M.B., Netrusov A.I. Viability of lyophilized microorganisms after 50-

year storage. // Microbiology. - 2011. - V.80(6). - P.850-853.

144. Lane D.J. 16S/23S sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics.

Edited by Stackebrandt E., Goodfellow M. Chichester: John Wiley & Sons. Ltd. - 1991. – P.115-

175.

145. Lapage S.P., Shelton J.E., Mitchell T.G., Mackenzie A.R. Culture collections and

preservation of bacteria. In: Methods in Microbiology. London:Academic Press. – 1970. - P.135-

227.

146. Laska S., Lottspeich F., Kletzin A. Membrane-bound hydrogenase and sulfur

reductase of the hyperthermophilic and acidophilic archaeon Acidianus ambivalens. // Microbiol.

Read. Engl. – 2003. – V.149. - P.2357–2371.

147. Laurinavichene T.V., Rakhely G., Kovacs K.L. The effect of sulfur compounds on

H2 evolution/consumption reactions, mediated by various hydrogenases, in the purple sulfur

bacterium, Thiocapsa roseopersicina // Arch. Microbiol. - 2007. - V.188. - P.403–410.

148. Lee P.A., Tullman-Ercek D., Georgiou G. The bacterial twin-arginine translocation

pathway. // Annu. Rev. Microbiol. – 2006. – V.60. – P.373–395.

149. Lemon B.J., Peters J.W. Fe-only Hydrogenases. In: Handbook of Metalloproteins.

Edited by Messerschmidt A., Huber R., Poulos T., Wieghardt K. Chichester: John Wiley &

Sons.– 2001. – P.738-750.

150. Lenz O., Bernhard M., Buhrke T., Schwartz E., Friedrich B. The hydrogen-sensing

apparatus in Ralstonia eutropha. // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2002. – V.4. – P.255–262.

151. Long M., Liu J., Chen Z., Bleijlevens B., Roseboom W., Albracht S.P.J.

Characterization of a HoxEFUYH type of [NiFe]-hydrogenase from Allochromatium vinosum

126

and some EPR and IR properties of the hydrogenase module. // J. Biol. Inorg. Chem. – 2007. –

V.12. – P.62–78.

152. Lowe C.R. Biosensors. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. – 1989. -V.324.

–P.487-496.

153. Lu Y., Xia Y., Pan M., Wang X., Wang S. Development of a surface plasmon

resonance immunosensor for detecting melamine in milk products and pet foods. // J. Agric.

Food Chem. – 2014. – V.62(51). - P.12471-12476.

154. Lubitz W., Ogata H., Rudiger O., Reijerse E. Hydrogenases. // Chem. Rev. – 2014. –

V.114(8). – P.4081-4148.

155. Lutz B.J., Fan Z.H., Burgdorf T., Friedrich B. Hydrogen sensing by enzyme-

catalyzed electrochemical detection.// Anal. Chem. – 2005. - V.77(15). – P.4969-4975.

156. Lyon E.J., Shima S., Buurman G., Chowdhuri S., Batschauer A., Steinbach K.,

Thauer R.K. UV-A/blue-light inactivation of the 'metal-free' hydrogenase (Hmd) from

methanogenic archaea. // Eur. J. Biochem. - 2004. - V.271. - P.195–204.

157. Malik K.A. A new method for liquid nitrogen storage of phototrophic bacteria under

anaerobic conditions. // Journal of Microbiological Methods. – 1984. – V.2. – P.41-47.

158. Malik K.A., Claus D. Bacterial Culture Collections: Their Importance to

Biotechnology and Microbiology. // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. - 1987. - V.5(1). - P.137-198.

159. Malik K.A. A new freeze-drying method for the preservation of nitrogen-fixing and

other fragile bacteria. // Journal of Microbiological Methods. – 1988a. - V.8. - P.259-271.

160. Malik K.A. Long-term preservation of some Rhodospirillaceae by freeze-drying.

Journal of Microbiological Methods. – 1988b. - V.8. - P.273-280.

161. Malik K.A. Use of activated charcoal for the preservation of anaerobic phototrophic

and other sensitive bacteria by freeze-drying. // Journal of Microbiological Methods. - 1990. -

V.12 - P.117-124.

162. Maroti G., Fodor B.D., Rakhely G., Kovacs A.T., Arvani S., Kovacs K.L. Accessory

proteins functioning selectively and pleiotropically in the biosynthesis of [NiFe]-hydrogenases in

Thiocapsa roseopersicina. // Eur. J. Biochem. – 2003. – V.270. – P.2218-2227.

163. Maroti J., Farkas A., Nagy I.K., Maroti G., Kondorosi E., Rakhely G., Kovacs K.L.

A second soluble Hox-type NiFe enzyme completes the hydrogenase set in Thiocapsa

roseopersicina BBS. // Appl. Environ. Microbiol. – 2010. - V.76(15). - P.5113-5123.

164. Maroti G., Rakhely G., Maroti J., Doroghazi E., Klement E., Medzihradszky F.K.,

Kovacs K.L. Specificity and selectivity of HypC chaperonins and endopeptidases in the

molecular assembly machinery of [NiFe]-hydrogenases of Thiocapsa roseopersicina. // Int. J.

Hydrogen Energy. – 2010. – V.35. - P.3358-3370.

127

165. Marques M.C., Coelho R., De Lacey A.L., Pereira I.A., Matias P.M. The three-

dimensional structure of [NiFeSe]-hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough: a

hydrogenase without a bridging ligand in the active site in its oxidised, "as-isolated" state. // J.

Mol. Biol. – 2010. – V.396(4). – P.893-907.

166. Mas J., Van Gemerden H. Storage products in purple and green sulfur bacteria. In:

Anoxygenic Photosynthetic Bacteria. Edited by Blankenship R.E., Madigan M.T., Bauer C.E.

Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. – 1995. – P.973–990.

167. Matias P.M., Soares C.M., Saraiva L.M., Coelho R., Morais J., Le Gall J., Carrondo

M.A. [NiFe]-hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: gene sequencing,

three-dimensional structure determination and refinement at 1.8 A and modelling studies of its

interaction with the tetrahaem cytochrome c3. // J. Biol. Inorg. Chem. – 2001. – V.6(1). - P.63-

81.

168. Massanz C., Friedrich B. Amino acid replacements at the H2-activating site of the

NAD-reducing hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. // Biochemistry. – 1999. – V.38(43). –

P.14330-14337.

169. Mege R.M., Bourdillon C. Nickel controls the reversible anaerobic

activation/inactivation of the Desulfovibrio gigas hydrogenase by the redox potential. // J. Biol.

Chem. - 1985. – V.260. - P.14701-14706.

170. Mehrvar M., Abdi M. Recent developments, characteristics, and potential

applications of electrochemical biosensors. // Anal. Sci. – 2004. – V.20(8). – P.1113-1126.

171. Meyer J. [FeFe]-hydrogenases and their evolution: a genomic perspective. // Cell.

Mol. Life Sci. – 2007. – V.64. – P.1063–1084.

172. Mohtadi R., Lee W.-k., Cowan S., Van Zee J.W., Murthy M. Effects of hydrogen

sulfide on the performance of a PEMFC. // Electrochem. Solid-State. Lett. - 2003. - V.6(12). -

P.272-274.

173. Montet Y., Amara P., Volbeda A., Vernede X., Hatchikian E.C., Field M.J., Frey

M., Fontecilla-Camps J.C. Gas access to the active site of [Ni-Fe]-hydrogenases probed by X-ray

crystallography and molecular dynamics. // Nat. Struct. Biol. – 1997. – V.4(7). - P.523-526.

174. Morgan C.A., Herman N., White P.A., Vesey G. Preservation of microorganisms by

drying. // J. Microbiol. Methods. - 2006. - V.66. - P.183-193.

175. Morozov S.V., Vignais P.M., Cournac L., Zorin N.A., Karyakina E.E., Karyakin

A.A., Cosnier S. Bioelectrocatalytic hydrogen production by hydrogenase electrodes. // Int. J.

Hydrogen Energy. – 2002. – V.27. – P.1501–1505.

128

176. Morozov S.V., Voronin O.G., Karyakina E.E., Zorin N. A., Cosnier S., Karyakin

A.A. Tolerance to oxygen of hydrogen enzyme electrodes. // Electrochemistry Communications.

- 2006. - V.8(5). - P.851–854.

177. Moyo M., Okonkwo J.O., Agyei N.M. Recent advances in polymeric materials used

as electron mediators and immobilizing matrices in developing enzyme electrodes. // Sensors

(Basel). – 2012. – V.12(1). – P.923-953.

178. Mulder D.W., Shepard E.M., Meuser J.E., Joshi N., King P.W., Posewitz M.C.,

Broderick J.B., Peters J.W. Insights into [FeFe]-hydrogenase structure, mechanism, and

maturation. // Structure. – 2011. – V.19(8). - P.1038-1052.

179. Nakamura H., Karube I. Current research activity in biosensors. // Anal. Bioanal.

Chem. – 2003. – V.377(3). – P.446-468.

180. Nath K., Das D. Improvement of fermentative hydrogen production: various

approaches. // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – V.65. – P.520–529.

181. Newman J.D., Setford S.J. Enzymatic Biosensors. // Molecular biotechnology. -

2006. - V.32. – P.249-268.

182. Nicolet Y., de Lacey A.L., Vernede X., Fernandez V.M., Hatchikian E.C.,

Fontecilla-Camps J.C. Crystallographic and FTIR spectroscopic evidence of changes in Fe-

coordination upon reduction of the active site of the Fe-only hydrogenase from Desulfovibrio

desulfuricans. // J. Am. Chem. Soc. – 2001. – V.23(8). – P.1596-1601.

183. North J.R. Immunosensors: anhbody-based biosensors. // Trends in Biotechnology. -

1985. - V.3. - P.180-186.

184. Palagyi-Meszaros L.S., Maroti J., Latinovics D., Balogh T., Klement E.,

Medzihradszky K.F., Rakhely G., Kovacs K.L. Electron-transfer subunits of the NiFe-

hydrogenases in Thiocapsa roseopersicina BBS. // FEBS J. – 2009. – V.276(1). – P.164-74.

185. Pandelia M.E., Ogata H., Lubitz W. Intermediates in the catalytic cycle of [NiFe]-

hydrogenase: functional spectroscopy of the active site. // Chemphyschem. – 2010. –V.11(6). -

1127-1140.

186. Parkin A. Understanding and harnessing hydrogenases, biological dihydrogen

catalysts. // Met. Ions. Life. Sci. – 2014. – V.14. - P.99-124.

187. Peters J.W., Schut G.J., Boyd E.S., Mulder D.W., Shepard E.M., Broderick J.B.,

King P.W., Adams M.W. [FeFe]- and [NiFe]-hydrogenase diversity, mechanism, and

maturation. // Biochim. Biophys. Acta. – 2015. – V.1853(6). – P.1350-1369.

188. Pohanka M., Skladal Р. Electrochemical biosensors – principles and applications. //

J. Appl. Biomed. – 2008. – V.6. – P.57–64.

129

189. Pohorelic B.K., Voordouw J.K., Lojou E., Dolla A., Harder J., Voordouw G. Effects

of deletion of genes encoding Fe-only hydrogenase of Desulfovibrio vulgaris Hildenborough on

hydrogen and lactate metabolism. // J. Bacteriol. – 2002. - V.184. – P.679-686.

190. Prakash O., Nimonkar Y., Shouche Y.S. Practice and prospects of microbial

preservation. // FEMS Microbiol. Lett. - 2013. - V.339. - P.1-9.

191. Puchkova N.N., Imhoff J.F., Gorlenko V.M. Thiocapsa litoralis sp. nov., a new

purple sulfur bacterium from microbial mats from the White Sea. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

– 2000. – V.50(4). - P.1441-1447.

192. Putzbach W., Ronkainen N.J. Immobilization techniques in the fabrication of

nanomaterial-based electrochemical biosensors: a review. // Sensors (Basel). - 2013. - V.13(4). -

P.4811–4840.

193. Qian D., Nakamura C., Wenk S., Ishikawa H.i, Zorin N., Miyake J. A hydrogen

biosensor made of clay, poly(butylviologen), and hydrogenase sandwiched on a glass carbon

electrode. // Biosensors and Bioelectronics. - 2002. - V.17. - P.789-796.

194. Rakhely G., Colbeau A., Garin J., Vignais P.M., Kovacs K.L. Unusual organization

of the genes coding for HydSL, the stable [NiFe]-hydrogenase in the photosynthetic bacterium

Thiocapsa roseopersicina BBS. // J. Bacteriol. - 1998. – V.180. - P.1460–1465.

195. Rakhely G., Kovacs A.T., Maroti G., Fodor B.D., Csanadi G., Latinovics D.,

Kovacs K.L. Cyanobacterial type, heteropentameric, NAD+ reducing [NiFe]-hydrogenase in the

purple sulfur photosynthetic bacterium Thiocapsa roseopersicina. // Appl. Environ. Microbiol. –

2004. – V.70. – P.722-728.

196. Rakhely G., Laurinavichene T.V., Tsygankov A.A., Kovacs K.L. The role of Hox-

hydrogenase in the H2 metabolism of Thiocapsa roseopersicina. // Biochim. Biophys. Acta. –

2007. – V.1767(6). – P.671-676.

197. Ramanathan K., Danielsson B. Principles and applications of thermal biosensors. //

Biosens. Bioelectron. - 2001. – V.16. – P.417–423.

198. Reshetilov A.N. Biosensor development in Russia. // Biotechnol. J. – 2007. – V.2. –

P.849–862.

199. Robson R. Biodiversity of hydrogenases. In: Hydrogen as a fuel: learning from

nature. Edited by Cammack R., Frey M., Robson R. London: Taylor & Francis. - 2001. - P.9-33.

200. Rogers K.R., Valdes J.J., Eldefrawi M.E. Acetylcholine receptor fiber-optic

evanescent fluorosensor. // Anal. Biochem. – 1989. – V.182(2). – P.353-359.

201. Rother M., Resch A., Wilting R., Bock A. Selenoprotein synthesis in archaea. //

BioFactors. - 2001. - V.14. – P.75–83.

130

202. Safronova V.I., Novikova N.I. Comparison of two methods for root nodule bacteria

preservation: lyophilization and liquid nitrogen freezing. // J. Microbiol. Methods. - 1996. -

V.24. - P.231-237.

203. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1977. – V.84. – P.5463-5467.

204. Sassolas A., Blum L.J., Leca-Bouvier B.D. Immobilization strategies to develop

enzymatic biosensors. // Biotechnol. Adv. – 2012. – V.30(3). - P.489-511.

205. Schmidt K., Pfennig N., Jensen S.L. Carotenoids of Thiorhodaceae IV. The

carotenoid composition of 25 pure isolates. // Arch. Mikrobiol. – 1965. – V.52(2). – P.132-146.

206. Schut G.J., Nixon W.J., Lipscomb G.L., Scott R.A., Adams M.W. Mutational

analyses of the enzymes involved in the metabolism of hydrogen by the hyperthermophilic

archaeon Pyrococcus furiosus. // Front. Microbiol. – 2012. – V.3(163). – P.1-6.

207. Secundo F. Conformational changes of enzymes upon immobilisation. // Chem. Soc.

Rev. – 2013. – V.42(15). – P.6250-6261.

208. Siegbahn P.E., Tye J.W., Hall M.B. Computational studies of [NiFe]- and [FeFe]-

hydrogenases. // Chem. Rev. – 2007. – V.107(10). – P.4414-4435.

209. Silva P.J., van den Ban E.C., Wassink H., Haaker H., de Castro B., Robb F.T.,

Hagen W.R. Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus. // Eur. J. Biochem. –

2000. – V.267(22). - P.6541-6551.

210. Silveira C.M., Almeida M.G. Small electron-transfer proteins as mediators in

enzymatic electrochemical biosensors. // Anal. Bioanal. Chem. – 2013. – V.405(11). –P.3619-

3635.

211. Shafaat H.S., Rudiger O., Ogata H., Lubitz W. [NiFe]-hydrogenases: a common

active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. // Biochim. Biophys. Acta. – 2013.

– V.1827(8-9). – P.986-1002.

212. Sharma H., Mutharasan R. Rapid and sensitive immunodetection of Listeria

monocytogenes in milk using a novel piezoelectric cantilever sensor. // Biosens. Bioelectron. –

2013. – V.45. – P.158-162.

213. Sherman M.B., Orlova E.V., Smirnova E.A., Hovmoller S., Zorin N.A. Three-

dimensional structure of the nickel-containing hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina. // J.

Bacteriol. – 1991. – V.173(8). – P.2576-2580.

214. Shima S., Pilak O., Vogt S., Schick M., Stagni M.S., Meyer-Klaucke W., Warkentin

E., Thauer R.K., Ermler U. The crystal structure of [Fe]-hydrogenase reveals the geometry of the

active site. // Science. - 2008. - V.321. - P.572–575.

131

215. Shima S., Thauer R.K. A third type of hydrogenase catalyzing H2-activation. //

Chem. Rec. – 2007. – V.7(1). – P.37-46.

216. Stiebritz M.T., Reiher M. Hydrogenases and oxygen. // Chem. Sci. – 2012. – V.3. –

P.1739-1751.

217. Szilagyi A., Kovacs K.L., Rakhely G., Zavodszky P. Homology modeling reveals

the structural background of the striking difference in thermal stability between two related

[NiFe]-hydrogenases. // J. Mol. Model. – 2002. – V.8(2). – P.58-64.

218. Szori-Doroghazi E., Maroti G., Szori M., Nyilasi A., Rakhely G., Kovacs K.L.

Analyses of the large subunit histidine-rich motif expose an alternative proton transfer pathway

in [NiFe]-hydrogenases. // PLoS One. – 2012. – V.7(4). – P.1-11.

219. Sun J.H., Arp D.J. Aerobically purified hydrogenase from Azotobacter vinelandii:

activity, activation, and spectral properties. // Arch. Biochem. Biophys. – 1991. – V.287(2). –

P.225-233.

220. Sweeney W.V., Rabinowitz J.C. Proteins containing 4Fe-4S clusters: an overview. //

Annu. Rev. Biochem. – 1980. - V.49. – P.139-161.

221. Tamagnini P., Leitao E., Oliveira P., Ferreira D., Pinto F., Harris D.J., Heidorn T.,

Lindblad P. Cyanobacterial hydrogenases: diversity, regulation and applications. // FEMS

Microbiol. Rev. – 2007. - V.31. - P.692–720.

222. Tank M., Thiel V., Imhoff J.F. Phylogenetic relationship of phototrophic purple

sulfur bacteria according to pufL and pufM genes. // Int. Microbiol. – 2009. – V.12(3). - P.175-

185.

223. Tengolics R., Meszaros L., Gyori E., Doffkay Z., Kovacs K.L., Rakhely G.

Connection between the membrane electron transport system and Hyn-hydrogenase in the purple

sulfur bacterium, Thiocapsa roseopersicina BBS. // Biochim. Biophys. Acta. – 2014. –

V.1837(10). – P.1691-1698.

224. Tedeschi R., De Paoli P. Collection and preservation of frozen microorganisms. In:

Methods in Biobanking. Edited by Dillner J. New York: Springer. – 2011. - V.675. – P.313-326.

225. Thakur M.S., Ragavan K.V. Biosensors in food processing. // J. Food Sci. Technol.

– 2013. – V.50(4). – P.625–641.

226. Thauer R.K. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson.

Marjory Stephenson Prize Lecture. // Microbiology. – 1998. – V.144. – P.2377-2406.

227. The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria. Edited by Dworkin M.,

Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K., Stackebrandt E. A. New York: Springer. - 2006. - V.6. -

1193 p.

132

228. Thorneley R.N. A convenient electrochemical preparation of reduced methyl

viologen and a kinetic study of the reaction with oxygen using an anaerobic stopped-flow

apparatus. // Biochim. Biophys. Acta. – 1974. – V.333(3). - P.487-496.

229. Tran-Betcke A., Warnecke U., Bocker C., Zaborosch C., Friedrich B. Cloning and

nucleotide sequences of the genes for the subunits of NAD-reducing hydrogenase of Alcaligenes

eutrophus H16. // J. Bacteriol. - 1990. – V.172. – P.2920–2929.

230. Tsygankov A.A., Minakov E.A., Zorin N.A., Gosteva K.S., Voronin O.G., Karyakin

A.A. Measuring the pH dependence of hydrogenase activities. // Biochemistry (Moscow). -

2007. - V.72(9). – P.968-973.

231. Turner A.P.F. Biosensors: sense and sensibility. // Chem. Soc. Rev. – 2013. –

V.42(8). - P.3184-3196.

232. Verma N., Bhardwaj A. Biosensor technology for pesticides - a review. // Appl.

Biochem. Biotechnol. – 2015. – V.175(6). – P.3093-3119.

233. Vignais P.M., Colbeau A., Willison J.C., Jouanneau Y. Hydrogenase, nitrogenase,

and hydrogen metabolism in the photosynthetic bacteria. // Adv. Microb. Physiol. – 1985. –

V.26. – P.155-234.

234. Vignais P.M., Billoud B., Meyer J. Classification and phylogeny of hydrogenases. //

FEMS Microbiol. Rev. – 2001. – V.25(4). – P.455-501.

235. Vignais P.M., Colbeau A. Molecular biology of microbial hydrogenases. // Cur. Iss.

Mol. Biol. - 2004. - V.6. - P.159–188.

236. Vignais P.M. H/D exchange reactions and mechanistic aspects of the hydrogenases.

// Coordination Chemistry Reviews. - 2005. – V.249. - P.1677-1690.

237. Vignais P.M., Billoud B. Occurrence, classification, and biological function of

hydrogenases: an overview. // Chem. Rev. - 2007. – V.107. - P.4206-4272.

238. Vignais P.M. Hydrogenases and H(+)-reduction in primary energy conservation. //

Results. Probl. Cell. Differ. – 2008. – V.45. – P.223-252.

239. Vincent K.A., Parkin A., Armstrong F.A. Investigating and exploiting the

electrocatalytic properties of hydrogenases. // Chem. Rev. - 2007. – V.107. - P.4366-4413.

240. Volbeda A., Garcin E., Piras C., De Lacey A.L., Fernandez V.M., Hatchikian E.C.,

Frey M., Fontecilla-Camps J.C. Structure of the [NiFe]-hydrogenase active site: evidence for

biologically uncommon Fe-ligands. // J. Am. Chem. Soc. – 1996. – V.118. –P.12989–12996.

241. Volbeda A., Montet Y., Vernede X., Hatchikian E.C., Fontecilla-Camps J. C. High-

resolution crystallographic analysis of Desulfovibrio fructosovorans [NiFe]-hydrogenase. // Int.

J. Hydrogen Energy. – 2002. – V.27. – P.1449-1461.

133

242. Volbeda A., Fontecilla-Camps J.C. Structure–function relationships of nickel–iron

sites in hydrogenase and a comparison with the active sites of other nickel–iron enzymes. //

Coordination Chemistry Reviews. - 2005. – V.249. – P.1609-1619.

243. Volbeda A., Martin L., Cavazza C., Matho M., Faber B.W., Roseboom W., Albracht

S.P., Garcin E., Rousset M., Fontecilla-Camps J.C. Structural differences between the ready and

unready oxidized states of [NiFe]-hydrogenases. // J. Biol. Inorg. Chem. – 2005. – V.10(3). –

P.239-494.

244. Volbeda A., Amara P., Iannello M., De Lacey A.L., Cavazza C., Fontecilla-Camps

J.C. Structural foundations for the O2-resistance of Desulfomicrobium baculatum [NiFeSe]-

hydrogenase. // Chem. Commun. – 2013. – V.49(63). – P.7061-7063.

245. Weyman P.D., Vargas W.A., Chuang R.-Y., Chang Y., Smith H.O., Xu Q.

Heterologous expression of Alteromonas macleodii and Thiocapsa roseopersicina [NiFe]-

hydrogenases in Escherichia coli. // Microbiology. – 2011. – V.157. – P.1363–1374.

246. Wollenberger U., Spricigo R., Leimkuhler S., Schrpoder K. Protein electrodes with

direct electrochemical communication. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. – 2008. – V.109. –

P.19-64.

247. Yagi T., Goto M., Nakano K., Kimura K., Inokuchi H. New assay method for

hydrogenase based on an enzymic electrode reaction. Enzymic electric cell method. //

J. Biochem. - 1975. - 78(3). - P.443-454.

248. Yagi T., Higuchi Y. Studies on hydrogenase. // Proc. Jpn. Acad. Ser.B. – 2013. –

V.89(1). - P.16-33.

249. Yaropolov A.I., Karyakin A.A., Varfolomeyev S.D., Berezin I.V. Mechanism of H2-

electrooxidation with immobilized hydrogenase. // Bioelectrochem. Bioenerg. - 1984. - 12(3-4). -

P.267-277.

250. Yao T., Rechnitz G.A. Potentiometric biosensor for riboflavin based on the use of

aporiboflavin-binding protein. // Anal. Chem. – 1987. – V.59(17). – P.2115-2118.

251. Yeh P., Kuwana T. Reversible electrode reaction of cytochrome c. // Chem. Lett. –

1977. - V.6(10). – P.1145–1148.

252. Zadvorny O.A., Zorin N.A., Gogotov I.N. Transformation of metals and metal ions

by hydrogenases from phototrophic bacteria. // Arch. Microbiol. – 2006. –V.184. – P.279–285.

253. Zhukov V.G. Formation of ribuloso-1,5-diphosphate carboxylase by Thiocapsa

roseopersicina under different growth conditions. // Mikrobiologiia. – 1976. – V.45(5). – P.915-

917.

134

254. Zorin N.A., Dimon B., Gagnon J., Gaillard J., Carrier P., Vignais P.M. Inhibition by

iodoacetamide and acetylene of the H-D-exchange reaction catalyzed by Thiocapsa

roseopersicina hydrogenase. // Eur. J. Biochem. – 1996. – V.241(2). – P.675-81.

135

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Зорину Н.А. (ИФПБ РАН) и к.б.н.

Динариевой Т.Ю. (МГУ им. М.В. Ломоносова) за совместную работу по выделению и

очистке белка, благодарит Jörg Kahnt (Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology,

Marburg, FRG) за проведение МАЛДИ масс-спектрометрии. Автор искренне благодарит

сотрудников лаборатории электрохимических методов кафедры аналитической химии

химического факультета МГУ, в особенности к.х.н. Воронина О.Г. за помощь и ценные

рекомендации.

Особую благодарность автор выражает научному руководителю д.б.н. Нетрусову

А.Н., искренне благодарит сотрудников лаборатории к.б.н. Митрофанову Т.А., к.б.н.

Абрамова С.М., к.б.н. Садраддинову Э.P. и Шестакова А.И. за переданные знания, опыт

практической работы и всестороннюю поддержку.

136

ПРИЛОЖЕНИЕ 1.

Последовательность гена 16S pPHK.

TTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACG

CGAAAGTCCTTCGGGGCGAGTAGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCATGGGAATCC

ACCTCGACGTGGGGGATAACCCGGGGAAACCCGGGCTAATACCGCATACGACCTAC

GGGTGAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCGTCGAGACGAGCTCATGTCCGATTAGCTAG

TTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAT

CAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA

ATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC

TGCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAAGAAAGCCTCGGGGCGAATACCCTCGG

GGGTTGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT

AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCG

GCAACGTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCCGGGAACGGCATTTGAGAC

TGCGTCGCTCGAGTCTGAGAGAGGGGGGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC

GTAGAGATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGCTCAAGACTGACG

CTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC

GTAAACGATGTCGACTAGCCGTGGGGTCCATTTAAGGGCTTCGTGGCGCAGCTAAC

GCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTG

ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA

CCTTACCAGCCCTTGACATCCTCGGAATTCGGCGGAGACGTCGGAGTGCCTTCGGGA

GCCGAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA

AGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGCCCTTAGTTGCCAGCGCGTCATGGCGGGAACT

CTAAGGGGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCA

TGGCCCTTATGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCC

AACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAAACCGGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTG

CAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGT

GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTGCAC

CAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGTCAATGACT

GGGGTGAAGTCGTAACA