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Genetica dei Procarioti - 1

Dipartimento di Scienze della VitaCdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)

Prof. Laura Marriricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail

A.A. 2014-15

Struttura e funzione degli acidi nuleiciGenomi batterici e analisi metagenomicaReplicazione del cromosoma e divisione cellulareRiparazione del DNA: risposta SOSOrganizzazione genica

Mutazione e variazioneVariazione ed evoluzioneTipi di mutazioniIsolamento e identificazione dei mutanti

continua …

Contenuti del corso

Regolazione dell’espressione genicaControllo trascrizionaleControllo traduzionaleQuorum Sensing

PlasmidiTipi di plasmidiSistemi di classificazione

Trasferimento genicomeccanismi di trasferimento genicoHGT in situ

Plasticità genomicaElementi trasponibiliVariazione di Fase

Sfruttamento del potenziale microbico

Ingegneria genetica per l'ottimizzazione di espressione di proteine in batteri (plasmidi, promotori, fusioni, etc.)

Metodi di mutagenesi e protein engineering per l'ottimizzazione dell'attività catalitica di enzimi di interesse industriale

Dr. Immaculada Margarit Y Ros - Novartis

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Testi consigliati per la consultazione

G. Dehò & e. GalliBIOLOGIA DEI MICRORGANISMI2a Ed. CEA, 2014

Madigan, Martinko, ParkerBROCK, BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI voll.1, 2, 3Pearson Italia Milano-Torino, 2012

J.W. Dale & S.F. ParkMOLECULAR GENETICS OF BACTERIA5th Ed. Wiley, 2010

Testi consigliati per la consultazione

Articoli scientifici

http://www.blackwellpublishing.com/trun/default.htm

N. Trun & J. Trempy FundamentalBACTERIAL GENETICS Wiley-Blackwell, 2003

Modalità di esame

scritto, domande a risposta breve.

9 giugno21 luglio8 settembre

10 ottobre

N.B.: Le date riportate sono suscettibili di modifiche

Appelli 2015

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1866 Mendel scopre I geni

1943 il DNA è IL materiale genetico

1951 prima sequenza di una proteina (insulina)

1953 struttura del DNA

1959 struttura della mioglobina

1960s delucidazione del codice genetico

1977 sequenziamento del DNA

1975-79 primi clonaggi di geni umani

1986 sviluppo di un sistema di seq. aut. del DNA

1995 primo genoma completo (Haemophilus influenzae)

1997 Genoma di Escherichia coli

1999 primo cromosoma umano (Chr #22)

2000 Drosophila / Arabidopsis genomi

2001 genomi dell’uomo e di topo

Mice injected with live R cells plus heat-killed S cells die. Live S cells in their blood.

R S

Mice injected with live cells of harmless strain R do not die. Live R cells in their blood.

Mice injected with live cells of killer strain Sdie. Live S cells in their blood.

Mice injected with heat-killed S cells do not die. No live S cells in their blood.

R

Griffith’s Experiments, 1929

S-Type Carbohydrates Destroyed

S-Type Lipids

Destroyed

S-Type Proteins

Destroyed

S-Type RNA Destroyed

S-Type DNA Destroyed

Conclusion:

DNA was the transforming factor! 32P remains

inside cells

Virus particlecoat proteinslabeled with 35SDNA beinginjected intobacterium

Virus DNAlabeled with 32P

Labeled DNAbeing injectedinto bacterium

35S remainsoutside cells

Hershey and Chase’s Experiments, 1952

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insieme delle informazioni genetiche chesono costituite dai geni, dalle lorosequenze regolative e dalle sequenze diDNA non codificanti

Genoma

INFORMAZIONE GENETICA NEI PROCARIOTI.

L’informazione genetica della cellula procariotica ècostituita dal DNA cromosomale (uno o piùcromosomi) e dal DNA extracromosomale (plasmidi).

Cromosomi e plasmidi possono essere sotto forma dimolecole sia circolari sia lineari.

I due tipi di DNA possono essere portatori di diverseclassi di elementi genetici (genomi virali, plasmidi etrasposoni).

La lisi della cellula batterica, con trattamenti delicati, libera il cromosoma sotto forma di molecola continua di DNA di dimensioni molto superiori alla lunghezza del batterio.

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How many base pairs are there in the E. coli chromosome?

kb (= kbp) = kilo base pairs = 1,000 bpMb = mega base pairs = 1,000,000 bp

Prokaryotic Chromosomes Eukaryotic Chromosomes

Many prokaryotes contain a single circular chromosome

Eukaryotes contain multiple linear chromosomes

P. chromosomes are condensed in the nucleoid via DNA supercoiling and the binding of various architectural proteins

E. chromosomes are condensed in a membrane-bound nucleus via histones

Transcription and translation occur simultaneously

Transcription occurs in the nucleus, and translation occurs in the cytoplasm

Most prokaryotes contain only one copy of each gene (i.e., they are haploid).

Most eukaryotes contain two copies of each gene (i.e., they are diploid).

Nonessential prokaryotic genes are commonly encoded on extrachromosomal plasmids

Extrachromosomal plasmids are not commonly present in eukaryotes.

P. genomes are efficient and compact, containing little repetitive DNA.

E. contain large amounts of noncoding and repetitive DNA.

La figura illustra in modo approssimativo le dimensioni del DNA non compattato rispetto alle dimensioni della cellula.

LE PRINCIPALI PROTEINE ASSOCIATE AL NUCLEOIDE.

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Science, 1995, Vol 269:496-512

Mar. 2014: 3654 citazioniMar. 2015: 3769 citazioni

1.83 Mbp

Bacterial chromosomes ranges from 0.6 Mbp to over 10 MbpArchael chromosomes range from 0.5 Mbp to 5.8 MbpBacterial chromosomes ranges from 0.6 Mbp to over 10 MbpArchael chromosomes range from 0.5 Mbp to 5.8 Mbp

Brook, Biologia dei microrganismi – 1 Microbiologia generale

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project disease strain genome size

plasmid(s)* status updated

E. coli K-12 non-pathogen;reference strain

MG1655 4.6 Mb (none) published (1997) June 10, 2004

E. coli O157:H7(EHEC)

haemorrhagic colitis, haemolytic uremic syndrome

EDL933 5.4 Mb 2 published (2001) Feb 13, 2001

uropathogenicE. coli(UPEC)

cystitis, pylonephritis

CFT073 5.2 Mb (none) published (2002) Dec 5, 2002

E. coli K1(NMEC)

septicemia, neonatalmeningitis

RS218 5.2 Mb 1 finishing (assembly in 3 contigs)

May 17, 2006

I genomi procarioti sequenziati hanno dimensioni che vanno da 0,16 Mbp a 13 Mbp, e sono noti genomi anche di dimensioni maggiori.

Il più piccolo genoma procariote ha dimensioni minori di quelle del genoma virale più grande.

I genomi procarioti più grandi hanno più geni di alcuni genomi eucarioti.

Il contenuto genico nei procarioti è caratteristicamente proporzionale alle dimensioni del genoma.

Molti geni possono essere identificati attraverso la loro similitudine di sequenza con i geni che si trovano in altri organismi.

Una significativa percentuale di geni sequenziati, però, è ancora a funzione sconosciuta.

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Genome sequencing is just the beginning to appreciate biocomplexity

Genes with unknown function: ~60%

Genes with known function: ~ 40%

In ogni genoma esaminato circa

¼“ipotetico”

Escherichia coli: 1000 geni /4300 totali

Mesorhizobiumloti

mollicutes

N. of genes (ORFs) plotted against genome size for 44 fully sequenced genomes, including ten Archaea (squares) and 34 Bacteria.

Summary of the shifts in gene content with genome size in prokaryotic genomes.

Konstantinidis K T , and Tiedje J M PNAS 2004;101:3160-3165

Brook, Biologia dei microrganismi – 1 Microbiologia generale

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R.F. DOOLITTLE Nature 416, 697 - 700 (2002)

Stages of genome reduction in host-restricted bacteria for which small population sizes and an asexual life cycle result in mutation fixation.

Note that some symbionts and pathogens (such as Rhizobium spp. and Vibrio fischeri) that can persist in the outside environment and that re-infect hosts frequently do not undergo these genomic changes

Pelagibacter ubique

1,308,759 bp, 30% of the cell volume

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Genes involved in informational processing are in blue, those involved in vitaminor amino acid biosynthesis are in maroon, ribosomal RNA genes are in green,other genes are light grey and breaks are non-coding regions.

the gene set that is sufficient for life underlenient (nutrient-rich and stress-free) conditions

Minimal genome is defined as

Il concetto si è sviluppato dalla metà degli anni ‘90

How Simple Can Life Get? . . . It’s complicated

The total number of prokaryotic cells on earth has been estimated to be approximately 4-6 × 1030

In a particular environment, the sum of all microbial genes corresponds to the METAGENOME.

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Metagenomica

Metagenomica (detta anche genomica ambientale) è lo studio dei genomi recuperati da ambienti piuttosto che da singoli organismi

Comunità intestinali, comunità marine (es. i batteri del mar dei Sargassi), biofilm …..

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"whole-genomeshotgun sequencing"

Sargasso Sea, Bermuda

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J. C. Venter et al., Science 304, 66 -74 (2004)

Fig. 1. MODIS-Aqua satellite image of ocean chlorophyll in the Sargasso Sea grid about the BATS site from 22 February 2003

1700 litri

filtri:0.1-3.0 micron

"whole-genome shotgun sequencing"

Sargasso Sea, Bermuda

1.045 miliardi bp di sequenze non ridondanti analizzate

1800 specie, di cui 148 sconosciute

1.2 milioni di geni

L’analisi metagenomica del terzo segmento dell’intestino posteriore delle termiti ha rivelato la presenza di 12 Phyla e 216 filotipi (nessuno collocabile nel dominio Archaea)

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Metagenomi: 547

Complete Genome Projects

Of the 395 bacterial phylotypes, 244 (62%) were novel and 80% represented sequences from species that have not been cultivated

MetaHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract)January 1, 2008 - June 30, 2012

March 4 2010

project financed by the European Commission under the 7th FP program. The consortium gathers 13 partners from academia and industry, a total of 8 countries. Its total cost has been evaluated at more than 21,2 million €

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Why bacteria matter in animal development and evolution

BioEssaysVolume 32, Issue 7, pages 571-580, 11 JUN 2010 DOI: 10.1002/bies.200900192http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bies.200900192/full#fig2

Why bacteria matter in animal development and evolution

BioEssaysVolume 32, Issue 7, pages 571-580, 11 JUN 2010 DOI: 10.1002/bies.200900192http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bies.200900192/full#fig6

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Trends in BiotechnologyVolume 28, Issue 12, December 2010, Pages 611-618Number of publicly available genome sequences for selected bacterial pathogens

SpeciesN. of draft (or “in progress”) genomes

N. of finishedgenomes

Bacillus anthracis 20 6

Bacillus cereus 43 9

Borrelia burgdorferi 12 5

Chlamidia trachomatis 23 20

Clostridium botulinum 8 11

Escherichia coli 270 38

Haemophilus influenzae 25 4

Listeria monocytogenes 24 6

Mycobacterium tuberculosis 71 5

Salmonella enterica 62 18

Staphylococcus aureus 69 21

Streptococcus pneumoniae 186 12

Yersinia pseudotuberculosis (batterio del suolo)

Yersinia pestis

Yersinia pestis è considerato un clone diY. pseudotuberculosis comparso negli ultimi 1.500 – 20.000 anni in seguito all’acquisizione dei plasmidi pMT1 & pPCP1

3 PANDEMIE

6th sec., Africa/Asia

14th sec., Europa (1/3 popolazione europea)

19th/20th sec., Asia

~ 200 milioni di morti

Negli ultimi 20 anni ci sono stati da 1000 a 5000 casi di peste e da 100 a 200 decessi all’anno (WHO)

(A) Map showing countries with known presence of plague in wild reservoir species(B) Annual number of human plague cases over different continents, reported to WHO

1954–2005. (C) Cumulative number of countries that reported plague to WHO since 1954.

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East Smithfield

(fossa comune scavata tra il 1348 e il 1349 per seppellire le vittime della pandemia)

The ancient sequence is surprisingly similar to modern Y. pestis strains. It differed from modern strains at only 97 positions all of which matched the ancestral genes from Yersinia psuedotuberculosis.

tight genetic conservation in this organism over the last 660 years

The genes of the Black Death clones do not have significant genetic differences that would make the ancient clone(s) more virulent than modern strains.

“genomics era” ‘population genomics era’

collection of multiple genomes of a bacterial species (or another discrete taxonomic unit)

PAN-GENOME

A pan-genome is the sum of all genomes of similar strains; each having similar (core genome) or distinct (cenomes) sets of nonpersistent genes. ∼500 persistent genes form the paleome.

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Pan-genome of 5 members of Thermotogales.

Zhaxybayeva O et al. PNAS 2009;106:5865-5870

©2009 by National Academy of Sciences

For the time being, the pan-genome of E. coli is composed of roughly 20000 genes, the majority of which (80%) is often colocalized on genomic islands. For a particular E. coli strain with a genome of 4500 genes the cenome alone would be about 4000 genes

1 MEGABASE PROKARYOTIC DNA = 1000 ORFs

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PhenotypeEnsable of observable characteristics of an organism

Mutationprocess by which genes undergo a structural change

GenotypeOrganism’s genetic material

Genediscret unit of genetic information

OPERONE

unità che coordina e regola la trascrizione nei batteri

Un operone comprende:

un set di geni strettamente correlati che sono regolati da un singolo operatore e trascritti insieme

OPERONE

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P O Gene A Gene B Gene C T

mRNA

A B Cproteine

5‘ 3‘

Regolatore: codifica per una proteina regolatriceOperatore: regione dove si lega la proteina regolatricePromotore: sequenza riconosciuta dalla RNA pol. DNA dip.Geni strutturali: uno o più geni codificanti attività correlate

OPERONE

Regulons, as groups of transcriptionally co-regulated operons, arethe basic units of cellular response systems in bacterial

A bacterial regulon is a group of operons that are transcriptionally co-regulated by the same regulatory machinery, consisting of transregulators (transcription factors or simply TFs) and cis regulatorybinding elements in the promoters of the operons they regulate.

gene1 gene2 gene3

gene regolatore

P

“activator binding site”

TF

REGULONS

attivatore

Operationally, a regulon contains operons regulated by onesame transcription factor.

REGULONS

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Since the term regulon was first proposed in 1964, 173 regulons have been fully or partially identified in E. coli K12 and numerous more in other bacteria e.g. B. subtilis.

Regulons can be categorized into two classes:

LOCAL: consisting of only a few component operons GLOBAL: having a relatively large number of operons

REGULONS

The intersection contains those TFs that are directly regulated by CRP and which work as co-regulators with CRP.

CRP: cAMP receptor proteino CAP: catabolite gene activator protein

REGULATED GENES AND CO-REGULATORS OF CRP