104

7. ELECTROPHORESE CAPILLAIRE OBJECTIFS • Comprendre les principes d’une séparation par électrophorèse • Connaître les paramètres principaux qui décrivent la séparation et l’efficacité de la

séparation • Savoir le rôle de la physicochimie du milieu sur la séparation • Connaître les applications principales de l’électrophorèse capillaire 7.1 Introduction Le principe de l’électrophorèse capillaire repose sur la migration des espèces en solution, porteuses d’une charge électrique globale, soumises à l’effet d’un champ électrique, et au contact d’un support approprié. La mise en œuvre consiste à utiliser un tube capillaire ouvert à ses extrémités, en verre de silice de très faible diamètre (15 à 150 µm). Ce capillaire, d’une longueur L variant entre 20 et 80 cm, est rempli de la même solution aqueuse d’électrolyte tampon que les deux réservoirs situés de part et d’autre. On applique aux électrodes une différence de potentiel pouvant atteindre 30 kV. L’intensité ne doit pas dépasser 100 µA (soit une puissance dissipée d’environ 3 W maximum), pour éviter l’échauffement du capillaire qu’il est préférable néanmoins de placer dans une enceinte thermostatée. Les espèces, qu’elles soient chargées positivement ou négativement, migrent en général vers la cathode. Un système de détection est placé avant l’extrémité aval du capillaire. En mode UV par exemple, le capillaire coupe le trajet optique entre la source et le photomultiplicateur, ce qui permet de mesurer l’absorbance de la solution en évitant tout volume mort. Il en est de même pour la détection électrochimique. De minuscules électrodes sont, dans ce cas, insérées dans le capillaire.

105

7.2. Capillaires

• « silice fondue » • SiOH → SiO- (pH > 3) • Double couche

• couche diffuse (mobile) • couche fixe

7.3 Principes •••• La vitesse et la direction dépendent des tailles et des charges des ions (magnitude et signe) •••• Séparation d’anions ou de cations mais pas d’espèces neutres

ζπδε

=4 e

ζ = différence de potentiel (couche mobile, couche fixe) e = charge par unité de surface εεεε = constante diélectrique du tampon δδδδ = épaisseur de la double couche • L’épaisseur de la double couche est inversement proportionnelle à la concentration du

tampon En électrophorèse capillaire, on observe que les constituants d’un mélange se séparent par effet de deux facteurs principaux appelés mobilité électrophorétique et flux ou écoulement électro-osmotique, qui se manifestent aussi bien pour les ions que pour les molécules ou les micelles.

106

cations →

espèces neutres

anions ←

7.4 Electro-osmose 7.4.1 Mobilité électro-osmotique Un facteur important qui contrôle généralement la migration des solutés est la mobilité électro-osmotique, µΕO, due à l’écoulement de l’électrolyte ou flux électro-osmotique qui apparaît aussi bien en électrophorèse sur bande par effet du support, qu’en électrophorèse capillaire par effet de la paroi interne du capillaire. La paroi de silice est tapissée de groupements silanols qui se déprotonnent si le pH est supérieur à 2. Elle forme alors une couche polyanionique fixe. Par contre, en vis-à-vis, la couche polycationique (positive) de l’électrolyte, dont les ions H3O+, se met en mouvement dès qu’un champ électrique est crée dans le capillaire, entraînant toutes les espèces présentes. Ce déplacement linéaire de l’électrolyte produit par la charge des ions et le champ tangentiel appliqué, peut être contrôlé, voire inversé, en modifiant la surface, le pH, ou en ajoutant des surfactants ioniques.

µεξπηEO =

4

η = viscosité du tampon

E : champ électrique (V . cm-1)

107

• dépendant du tampon

- constante diélectrique - viscosité

-ζ (pH, concentration) • dépendant de la composition du capillaire

- ζ 7.4.2 Débit électro-osmotique

VE

EO =εζπη4

ou E est le champ électrique (V . cm-1)

EVL

=

V : potentiel appliqué L : longueur du capillaire 7.4.3 Facteurs qui influencent l’électro-osmose

• potentiel appliqué • pH • température • solvants organiques • modification de la paroi du capillaire

7.4.3.1 Effet du potentiel appliqué • Une augmentation du potentiel

- ↑ vEO (débit) - ↓ temps de migration (temps d’analyse)

Mais aussi,

- ↑ I (courant) - ↑ P (puissance) = VI

(On utilise la «puissance » comme indicateur de chauffage par effet ‘Joule’) • dépendant des conditions du tampon

- composition - pH - I

108

• dépendant du capillaire - diamètre - longueur

Exemples : • ↓ diamètre

- ↑ R - ↓ I (V = IR) - ↓ P (P = VI)

(donc, on peut augmenter V max) • ↓ longueur (↓ L)

- ↑ E (E = V/L) - ↓ R (V = IR) - ↑ I - ↑ P (P = VI) ≈ chauffage

7.4.3.2 Effet du pH • H2SiOHSiOHSIOH2

+−++ ↔+↔ • pH : normalement optimisé pour la séparation et non pas le débit électroosmotique.

109

7.4.3.3 Effet de la concentration du tampon/force ionique

ζπδε

=4 e

• ↑ Concentration

- ↑ adsorption dans la couche de Stern - ↓ δδδδ - ↓ ξξξξ - ↓ vEO

et si la température d’est pas contrôlée, une augmentation de I :

↑ I (courant) ≡ ↑ T : ↓ η • Limitations : la concentration du tampon devrait excéder la concentration de l’échantillon

(10-100x)

Chauffage dans les capillaires

- pics plus larges - ↓ viscosité du tampon (donc ↑ I) - ébullition du tampon - décomposition de l’échantillon

Il vaut mieux utiliser un maximum de voltage sans excès de chauffage 7.4.3.4 Effet de la température • ↑ 1° C (20° → 21° C) ↓ 2.4 % η et puisque

VE

EO =εξπη4

• ≈ ↑ 2-4 % VEO • mais aussi ↓ 0.5 % ε (cte. diélectrique)

• En générale, ↑ T ↓ VEO S’il y a trop de chauffage, il en résulte : • décomposition de l’échantillon • ↑ diffusion (↑ largeur des pics) • ébullition du tampon

110

7.4.3.5 Effet des solvants organiques • difficile à prévoir, il y a des effets sur :

- la viscosité - la constante diélectrique

Exemple : • MeOH - la viscosité augmente jusqu'à 50 % v/v (puis diminution → 100% v/v) 7.4.3.6 Modification chimique du capillaire • On peut réduire, éliminer ou inverser VEO

- liaison covalente (i.e. polyacrylamide) - modification dynamique

surface cationique (CTAB) surfactant non-ionique (TWEEN) surfactant zwitterionique (TRIS) • pH normalement optimisé pour la séparation et non pas le débit électroosmotique. 7.4.4 Inversion du débit EO Exemples : • Bromure de tetradecyltrimetyl ammonium

111

• avec addition de α - lactalbumin (protéine : pI ≈ 4.3)

7.4.5 Résumé : Electroosmose • Pour modifier le débit électroosmotique (DEO) :

- ↑ V : ↑ DEO - ↑ pH (tampon) : ↑ DEO - ↑ [tampon] : ↑ I tampon : ↓ DEO - ↑ T : ↑ DEO

7.4.6 Détermination du débit électro-osmotique • ajout d’un composé neutre • VEO = l / t

l = longueur du capillaire jusqu’au détecteur (pas L ≡ longueur totale du capillaire) t = temps

• le composé doit être :

- neutre (pH du tampon) - soluble - inerte - sensible à la détection employée e.g. phénol, MeOH, benzène

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7.5 Electrophorèse 7.5.1 Mobilité électrophorétique Dans toute expérience d’électrophorèse, un composé porteur d’une charge électrique migre, sous influence du champ électrique appliqué E à une vitesse appelée vitesse de migration électrophorétique VEP qui dépend de sa mobilité électrophorétique µµµµEP. µµµµEP est définie à partir de sa vitesse de migration VEP observée dans un électrolyte supposé immobile et du champ électrique

VEP = µEP . ΕΕΕΕ

µEP = V

LVr6q

EP⋅=πη

r = rayon hydrodynamique q = charge (q = 0 : aucune séparation) L désigne la longueur totale du capillaire et V le potentiel appliqué à ses extrémités. On verra plus loin qu’on peut obtenir µµµµEP(cm2.V-1.s-1) à partir d’un électrophorégramme, de manière indirecte. On affecte à la mobilité électrophorétique un signe (+ ou -) selon la nature cationique ou anionique de l’espèce ; µµµµEP est nulle pour une espèce globalement neutre. Ce paramètre dépend, non seulement de la charge de l’espèce, mais de son diamètre et la viscosité de l’électrolyte. • Facteurs influençant la mobilité électrophorétique

Charge : - pH important (macromolécules !)

e.g. R-CHCOOH ↔R-CHOO- ↔ RCHCOO- | | | NH3 NH3 NH2 + + e.g. Zn2+ + EDTA4- ↔ Zn - EDTA2-

Viscosité :

- Modifications de température ou de solvant (ajout d’un modificateur organique)

Rayon hydrodynamique de l’ion

113

7.5.2 Détermination de µΕΕΕΕΡΡΡΡ

= temps

cetandistVR

EP!

( ) ( )

EOobsEP ttV !! −=

Ε=µ VEPEP

( )LVΕ

( ) ( ) VL

tt EOobsEP

−=µ !!

7.6 Optimisation de la séparation Les performances de l’électrophorèse capillaire sont comparables à celles de la chromatographie liquide qu’elle complète utilement pour les séparations de biopolymères ; la mise au point d’une séparation revient à trouver un milieu tampon adapté au problème à résoudre ; cependant la reproductibilité des analyses est plus difficile à maîtriser ; la sensibilité est très grande : on connaît des exemples de détection de quelques milliers de molécules vraies. La quantité requise d’échantillon est très faible et la consommation de réactifs ou de solvants est négligeable. Les électrophorégrammes permettent de calculer les paramètres de séparation (facteurs de capacité, sélectivité, résolution) comme en chromatographie. Quatre paramètres sont importantes pour la séparation :

• Temps ( t )

• Résolution ( R )

• Efficacité ( N )

• Sélectivité ( α )

7.6.1 Temps de séparation

V)(Lt

OP ⋅µ+µ=

ΕΕ!

• Pour diminuer le temps :

- ↓ L - ↑ µobs - ↑ V

114

7.6.2 Résolution ( R )

D)V)(177.0R

EOmoy2EP1EP µ+µµ−µ=

Pour augmenter la résolution : ↑ V i.e. R f V= ( )

µmoy = µΕΕΕΕO mais

↑µ+µ=

Ε V)(Lt

Omoym !

7.6.3 Efficacité (≈≈≈≈ N) L’efficacité théorique N, qui peut atteindre 106 plateaux au mètre, d’une colonne de longueur totale L et de longueur effective l, peut être calculée à partir du coefficient de diffusion D (cm2.s-1) du soluté choisi, donné par la loi d’Einstein (σ2 = 2Dtm) et de son temps de migration tm à partir des deux expressions équivalentes :

DT2

Nm

2!=

LVD2N app !µ=

( ) 2

2/1

2

wt54.5w

t16N

==

( )D2

VN .

.OP µ+µ

= ΕΕ

Pour augmenter l’efficacité de la séparation :

- ↑ V - ↑ µ OBS - ↓ D (∴ séparation des petits solutés - moins efficace)

115

7.6.4 Sélectivité (αααα) • HPLC :

α =−−

t tt t

m

m

2

1

• EC :

α =−−

t tt t2 0

1 0

α =

f

VV

2

1

αµµ

=

f 2

1

116

7.7 Détection

117

7.8 Comparaison entre l’électrophorèse capillaire et la chromatographie liquide

• Techniques complémentaires

• Pics plus étroits en EC

• potentiels de 20'000 à 60'000 V

• N

- 100'000 - 200'000 (EC) - 5'000 - 100'000 (HPLC)

7.9 Exemple d’une séparation EC