1. การศกษาชนดและสรรพคณของใบขล การเรยนรนาสงตางๆรอบตวมาใชในการดาเนนชวตมมาตงแตยคโบราณ เรมตนจากการลองผดลองถก การใชตนไมใบหญารอบตว การลาสตว หรอกระทงการเพาะปลก แหลงอาราย-ธรรมแหงแรกของโลก คอ บรเวณวงโคงแหงความอดมสมบรณ บรเวณนมความอดมสมบรณเนองจากมแมนาใหญ 4 สายไหลผาน คอ แมนาไทรกรส, แมนายเฟรตส, แมนาจอรแดน และ แมนาไนล ทาใหกลายเปนบรเวณทเหมาะสมแกการเพาะปลก เนองจากกระแสนาพดพาเอาปยธรรมชาตมาทบถมไว บรเวณนจงเปนแหลงเกษตรกรรมแหงแรกของโลก (ศรนทพย, ม.ป.ป.) นอกจากเรยนรการเพาะปลกแลว มนษยยงศกษาและปรบตวใหเขากบสงแวดลอม ทาใหมนษยสามารถววฒนาการขนจวบจนปจจบน

การนาสมนไพรและพชชนดตางๆมาใชเปนอกววฒนาการหนง ทเปนการอานวยความสะดวกในการดาเนนชวต มพชสมนไพรหลายชนดทถกนามาใชในการรกษาโรค เชน กระเทยม ขง เปนตน (กรรณกา, ม.ป.ป.) จงเปนการเปดกวางในการศกษาพชและสมนไพร เพอนาไปใชประโยชนในดานตางๆ

1.1 ลกษณะทวไปและคณสมบตของขล ขลมชอวทยาศาสตร คอ Pluchea indica L. อยในวงศ COMPOSITAE พบได

ในบรเวณดนทมความชนสง เชน ตามทลมชนแฉะ รมหวยหนอง หาดทราย ปาชายเลน เปนตน ขลเปนพชใบเลยงเดยว เรยงตวแบบสลบ แผนใบรปชอน ใบกวาง 1-3 เซนตเมตร ยาว 2-6 เซนต -เมตร ปลายใบมนหรอกลม ฐานใบเรยว ขอบใบหยกแบบฟนเลอย มขนปกคลมเลกนอย กานใบสนมาก ใบมกลนหอมฉน ตนมความสงประมาณ 0.5-2 เมตร แตกกงกานมาก มดอกทปลายกงแบบชอกระจกแนน กานชอดอกยาว 0.3-0.5 เซนตเมตร ใบประดบเปนรประฆง ฐานกลม เรยงตวเปนแถว ฐานดอกเกลยง กลบดอกรปเสนดายขนาด 0.3 เซนตเมตร มสมวงออน ผลเกลยงเปนแบบผลแหงเมลดออน รปทรงกระบอกขนาดกวาง 0.1 เซนตเมตร ยาว 0.4 เซนตเมตร (ดวงจนทร, 2535)

จากภมปญญาชาวบาน มการนาใบขลไปใชเพอรกษาเบาหวาน มะเรง ความดนโลหตสง กระเพาะปสสาวะอกเสบ หรอตาใบสดเพอพอกแผล (เกรยงศกด, 2549) นอกจากนยงมงานวจย ทแสดงวาในตนขลมกรดคลอโรจนก (chlorogenic acid), สาร sesquiterpene (ดวงจนทร, 2535) และสารประกอบเกลอโซเดยมคลอไรด (ชมนมแพทยแผนไทยและสมนไพรแหงชาต, ม.ป.ป.) ทางการแพทยพบวา chlorogenic acid มฤทธในการตอตานมะเรง (ยากยะห, 2550) นอกจากประโยชนทางการแพทยแลว ยงมการนาตนขลไปใชในงานดานการเกษตร คอ ใชปรบปรงสภาพดนเคม เนองจากขลเปนพชทสามารถทนตอดนเคมไดในระดบหนง (สมพงษ, ม.ป.ป. ; อรณ, ม.ป.ป.)

1.2 สรรพคณของกรดคลอโรจนก (chlorogenic acid) ในตนขล

กรดคลอโรจนกเปนแทนนนเทยม (pseudotannin) (ชวลต, 2539) ซงมขนาดโมเลกล

เลกกวาแทนนนแท (true tannin) แตมสมบตบางอยางคลายแทนนนแท มสรรพคณหลายดาน ดงน

1.2.1 ฤทธในการตอตานมะเรง กรดคลอโรจนก (chlorogenic acid) จะจบกบ ไนไตรทแลวขจดออกจากรางกาย กอนทไนไตรทจะจบกบเอมนกลายเปนไนโตรซามน (N-nitrosamine) ซงเปนสารทกอมะเรง (แปม, 2546) 1.2.2 เปนสารตานอนมลอสระทมประสทธภาพสง โดยทาหนาทลดการเสอมสภาพของเซลลทเกดจากอนมลอสระ 1.2.3 ลดการกระตนเซลลสรางเมดสจากอนมลอสระ ทาใหลดการเกดฝาและกระ ชวยบารงผวพรรณและทาใหผวดขาวเนยนขน เพราะกรดคลอโรจนกมคณสมบตพเศษในการชวยฟนฟสภาพผวจากการแตกตวของคอลลาเจน (collagen) ซงเปนสาเหตทาใหผวเสอมสภาพ นอกจากนนกรดคลอโรจนกยงชวยลดเลอนรวรอยรองลก และชวยปกปองผวจากแสงแดดและมลภาวะตางๆ (สตร, 2551)

1.2.4 ชวยลดการดดซบนาตาลกลโคสในลาไสเลก

1.2.5 ชวยยบยงการเปลยนแปลงไกลโคเจนเปนกลโคสในตบ เพอลดความ เสยงของโรคเบาหวาน

1.2.6 ชวยปองกนไมใหกลโคสเขาสกระแสเลอด

1.2.7 ชวยลดระดบนาตาลในเลอด

1.2.8 ชวยทาหนาทเปน fat burning คอ ชวยในการเปลยนไขมนสวนเกนให เปนพลงงาน

1.2.9 ชวยทาใหกลามเนอกระชบขน (Tom, 2006)

1.2.10 ชวยตานการเกดปฏกรยาออกซเดชนในรางกาย (อษาวด และนธยา, 2549)

1.3 สรรพคณของ sesquiterpene ในตนขล

1.3.1 ขบลม, ฆาเชอโรค sesquiterpene มฤทธในการขบลมในกระเพาะ และม ฤทธฆาเชอได ตวอยางสมนไพรทม sesquiterpene เชน กระเทยม ขง (ยทธนา, 2545) เปนตน นอกจากน sesquiterpene เปนสารจาพวกนามนหอมระเหย เมอนาไปอบแหงหรอควแลวจะมกลนหอมคลายใบชา ใชชงรบประทานเพอผอนคลาย (รชฎาวรรณ, 2548)

1.3.2 ฤทธในการตานเชอมาลาเรย เชอมาลาเรยเปนโรคทเกดจากเชอ protozoa ทถายทอดผานยงใน genus Anopheles sesquiterpene จะยบยงการแบงนวเคลยสของเชอมาลาเรย (bloods chizontocide) ทาใหเชอแบงตวในเลอดไมได (สภญญา, ม.ป.ป.)

1.4 สรรพคณของสารประกอบเกลอโซเดยมคลอไรด (NaCl) ในตนและใบขล

1.4.1 เปนยาขบปสสาวะ แกอาการขดเบา การปสสาวะจะขบคลอไรดไอออน ออกมาดวย ดงนนเมอรบประทานสารประกอบเกลอโซเดยมคลอไรดแลว จะเปนการกระตนใหรางกายขบคลอไรดไอออนออกทางปสสาวะ (วระสงห, 2535) การรบประทานตนและใบขลจงชวยใหรางกายขบปสสาวะบอยขน

1.4.2 เปนยารกษาโรคความดนโลหตสง สาเหตหนงของโรคความดนโลหตสง คอ รางกายไมสามารถขบเกลอโซเดยมทเขาสรางกายไดดเทาคนปกต ซงการรบประทานยาขบปสสาวะมสวนชวยใหรางกายขบโซเดยมไดดขน จากการศกษาทดลองในสตวทดลองและในคนปกตพบวา ยาชงจากตนขลมประสทธภาพขบปสสาวะได ไมวาเปนตนสดหรอแหง (ชมนมแพทยแผนไทยและสมนไพรแหงชาต, ม.ป.ป. ) 2. จลนทรยทเปนสาเหตของโรค

2.1 โรคผวหนงอกเสบ

โรคผวหนงอกเสบเปนโรคทพบเหนอยบอยครง การอกเสบเกดจากหนงชนนอกสด ถกทาลายไป ซงหนงนนจะทาหนาทรกษาความชนของผวไว เมอหนงชนนอกถกทาลาย ผวหนงจะสญเสยคณสมบตในการปองกนการซมของสารเคมเขาสผวหนงในชนตอไป ทาใหเกดการตดเชอจากภายนอก ผวหนงอกเสบเปนโรคทางผวหนงทพบบอยทสด เกดจากสาเหต 2 ประการ คอ

ก. สาเหตจากภายในรางกาย หมายถง การเปลยนแปลงบางอยางภายใน รางกาย แลวทาใหเกดอาการทางผวหนงขน

ข. สาเหตจากภายนอกรางกาย หมายถง การทผวหนงสมผสกบบางอยาง แลวทาใหเกดอกเสบขน อาจเปนสารทมฤทธระคายเคองตอผวโดยตรง เชน กรดหรอดางทม ความเขมขนสง จะทาใหเกดอาการบวม, แดง หรอพอง

จลนทรยททาใหเกดโรคผวหนงอกเสบทสาคญม 2 ชนด คอ Bacillus subtilis และ Staphylococcus aureus (สชาดา, 2549) บางครงอาจพบลกษณะของโรคทตางกน ขนอยกบ ชนดของแบคทเรยทตดเชอ เชน ผวหนงอกเสบตมพพอง เกดจาก Staphylococcus aureus เปนตน (นตยสารใกลหมอ, 2542)

Bacillus subtilis เปนแบคทเรยแกรมบวก (Gram-positive) หายใจโดยใชออกซเจน

B. subtilis อยในกลมแบคทเรยทมรปรางเปนแบบแทง (rod-shaped group) capsules มลกษณะ เปนเสน ประกอบดวยสารพวก carbohydrate หรอสาร polysaccharide หรออาจมสารพวก D-glutamic acid subunit และ L-glutamic acid subunit ผนงเซลล (cell walls) สรางจากสาร พวก peptidoglycan และมสารพวก meso diaminopimelic acid (DAP) อยดวย ชนดของ flagella จะเปน peritrichous flagella (flagella อยรอบตว) (Frandberg and Schnurer, 1994)

Staphylococcus aureus เปนแบคทเรยแกรมบวก อยใน Class Schizomycetes,

Order Eubacteriales จดอยในตระกลไมโครคอกคาซ (Micrococcaceae), Genus Stephylococ เมอสองดดวยกลองจลทรรศนจะเหนเปนแบคทเรยทมลกษณะรปรางกลม เรยงตวเปนกลมคลายพวงองน หรอเปนค หรอเปนสายสนๆ ไมเคลอนท ไมสรางสปอร เซลลมเสนผาศนยกลางประมาณ 0.5-1.5 ไมโครเมตร โคโลนมสเหลองหรอสทอง S. aureus เจรญเตบโตไดดในสภาพอากาศทมออกซเจน ชวงอณหภมทเหมาะสมในการเตบโต คอ 35-40 องศาเซลเซยส ชวง pH (ความเปนกรด-ดาง) ทเหมาะสมในการเตบโตอยท 7.0-7.5 คา Aw (ปรมาณนาอสระในอาหารท จลนทรยนาไปใชในการเตบโต) ตาสดสาหรบการเตบโตในสภาพมออกซเจนประมาณ 0.86 และคา Aw ตาสดในสภาพไมมออกซเจนประมาณ 0.90 (ตวนซอบารยะห, ม.ป.ป.)

ภาพท 3 ลกษณะทางสณฐานวทยาของ Bacillus subtilis (แดง) และ spore (เขยว) (3ก) และการเจรญของ Bacillus subtilis บนอาหารเลยงเชอ (3ข)

ทมา: Prescott (1993); Liao (n.d.)

3ก 3ข

ตามปกต S. aureus เปนแบคทเรยทไมกอโรค พบไดตามผวหนงและตามรางกาย แตหากกลไกการปองกนตวเองเสยหาย เชน มแผลทผวหนง เชอจะเขาสรางกายและทาใหเกดโรคหลายชนด เชน ผวหนงอกเสบ ฝ ปอดอกเสบ ลนหวใจอกเสบ เปนตน (วทยาลยพยาบาลบรมราช-ชนน, 2550)

โรคผวหนงอกเสบเปนโรคทไมรายแรงหากรกษาไดอยางถกวธ ในปจจบนมยา

รกษาดานนโดยเฉพาะ ไมวาจะเปนการใชยาทา ยาปฏชวนะ หรอสมนไพร เพอยบยงการเจรญเตบโตของเชอทกอโรค การศกษาสารสกดจากธรรมชาตกเปนอกทางเลอกหนงทนาสนใจ เพราะจากงานวจยพชสมนไพรหลายชนด พบวาสารสกดจากสมนไพรมฤทธในการยบยงเชอ B. subtilis และ S. aureus อยางไดผล เชน วานพระฉม (วชรนทร, 2543 ), ชมเหดเทศ (Cassia- alata Linn.) เปนตน ใบขลเปนสมนไพรอกชนดหนงทชาวบานใชรกษาแผลอกเสบ โดยตาใบสดพอก (เกรยงศกด, 2549) จงเปนทนาศกษาถงประโยชนของขลอยางละเอยดในดานยารกษาโรค เพอใหสมนไพรไทยพฒนาและนาไปใชประโยชนไดอยางแพรหลาย

2.2 โรคสวอกเสบ

สวเปนโรคทพบในมนษยชวงอายระหวาง 12-15 ป มกจะรนแรงสดในชวงอาย

ภาพท 4 ลกษณะทางสณฐานวทยาของ Staphylococcus aureus (4ก) และการเจรญของ Staphylococcus aureus บนอาหารเลยงเชอ (4ข)

ทมา: Tambe (2548); Anonymous (n.d.)

4ก 4ข

17-21 ป ประมาณ 90 % ของคนทเปนสวจะเรมหายเมออาย 25 ป และมจานวนนอยทเปนสวจนถงอาย 45 ป

2.2.1 สาเหตการเกดสว

โดยธรรมชาตของมนษยเมออยในชวงอาย 12-25 ป จะเรมมการสราง ฮอรโมนทเรยกวา “ แอนโดรเจน ” (Androgen) ตอมไขมนจะเรมตอบสนองตอฮอรโมนชนดน ทาใหมการหลงไขมนมากขน นอกจากนแอนโดรเจนยงกระตนใหมการสรางเซลลชนขไคลของ รขมขน ทาใหเกดลกษณะทเรยกวา “ ไมโครโคมโดน ” (microcomedone) ซงเปนตนเหตของสว microcomedone นอาจจะหายเอง หรอพฒนากลายเปนสวลกษณะตางๆไดขนกบปจจยรวมบางอยาง หากมการสะสมของไขมนและเซลลชนขไคลมากขนเรอยๆ จะทาใหเกดเปนสวอดตน (closed- comedone) หรอสวหวเปด (open comedone) แตถามแบคทเรย Propionibacterium acne หรอถกเซลลภมคมกนหลงสารบางชนด จะทาใหเกดการอกเสบของ microcomedone กลายเปนสวอกเสบทมลกษณะแดง นน เปนหนองได (วชรย, 2549)

สวอกเสบเกดจากแบคทเรย Propionibacterium acne หลงเอนไซม hyaluronidase, low molecular weight chemotactic factor และ protease สารเหลานจะทาใหเกดกระบวนการอกเสบขน จานวนเชอ P. acne ขนกบปรมาณไขมน เพราะ P. acne จะแบงตวบรเวณไขมน จากนนจะหลงเอนไซม lipase เพอยอยไขมนเปน free fatty acid ดงนน คนผวมนจงมโอกาสเกดสวอกเสบมากกวาผวธรรมดา (เพญวด, 2536; รศน, 2540)

2.2.2 การรกษาสวดวยยารบประทาน

ภาพท 5 ลกษณะการเกดสวชนดตางๆ ตามปจจยรวม ทมา: วชรย (2549)

ก. ยาในกลมกรดวตามนเอ (isotretinoin) เปนยาทรกษาสวไดด แตมกใชในผปวยทเปนสวทรนแรงหรอไม

ตอบสนองตอการรกษาดวยยาอน ๆ เพราะเปนยาทมผลกระทบมาก เชน หามใชในหญงตงครรภ เพราะมโอกาสเกดความพการของทารกในครรภ เมอใหในผปวยหญงวยเจรญพนธ ตองใหคาแนะนาแกผปวยถงการคมกาเนดอยางมประสทธภาพ ทงในขณะกนยาและหลงหยดยาอยางนอย 1 เดอน ควรงดบรจาคโลหตระหวางการรกษาและหลงการรกษาอยางนอย 3 เดอน ไมควรใชในเดกอายตากวา 18 ป เพราะมผลตอความสงของเดกได ข. ยาในกลมของฮอรโมนหรอยาคม

จะลดความมนของหนาไดประมาณ 20-30 % ไมควรใชในเดกทม ความเสยงตอการเกดลมเลอดในหลอดเลอดและหวใจ รวมถงผทมความเสยงตอมะเรงเตานมดวย นอกจากนนยาอาจจะมผลตอเรองนาหนกตว ความดนโลหตสง และอาจมผลกระตนอาการปวดศรษะขางเดยว (ไมเกรน)ได ค. ยากลมยาปฏชวนะ

ยากลมนมหลายชนด เชน tetracyclin, doxycycline, erythromycin, clindamycin, co-trimoxazole การทางานของยาจะออกฤทธโดยการทาลายเชอแบคทเรย P. acnes จงเหมาะทจะใชในสวประเภทอกเสบ สวหวชาง ยากลมนควรใชในรปยาทาดกวายากน เพราะการทาผวหนงจะไดผลเฉพาะท ไมมผลเสยตอรางกาย และใชไดเปนเวลานาน เพอเปนการทาความ-สะอาด (sterile) ผวหนา แตถาใชในรปยากนเปนเวลานาน อาจทาใหเกดเชอราในชองคลอดได (เพญวด, 2536; รศน, 2540)

P. acne นอกจากทาใหเกดสวแลว ยงทาใหเกดการอกเสบดวย โครงงาน นจงศกษาการอกเสบทเกดจากสวควบคกบผวหนงอกเสบ เพอขยายผลการทดลองใหครอบคลมยงขน เพราะการรกษาสวดวยการใชยาปฏชวนะ จะมขอจากดและผลกระทบของยาตอผใชมาก ปจจบนจงมการสนบสนนงานวจยจากสมนไพรมากขน เชน สารสกดจากเปลอกมงคดแหง (มลลกา, 2549) ใบขอบชะนางแหง (พยดา, ม.ป.ป.) เปนตน เพอลดการใชสารเคมทมผลกระทบตอผอปโภคและตอสงแวดลอม

2.3 โรคแอนแทรคโนส (anthracnose)

Colletotrichum sp. คอ เชอราทมความสาคญดานโรคพชสกลหนง เพราะเปน สาเหตโรคพชทเรยกกนโดยทวไปวา “ โรคแอนแทรคโนส ” (anthracnose) เขาทาลายไดเกอบ ทกสวนของพชตงแตตนกลา ใบ กานใบ ลาตน ดอก และผล พบในพชมากถง 470 สกล (Sutton, 1980) เชน โรคแอนแทรคโนสในระยะกลาของฝาย โรคแอนแทรคโนสบนใบและผลอโวกาโดและมะมวง (Holliday, 1980 ; Waller, 1992) โรคแอนแทรคโนสของพชในประเทศไทยเกดจากเชอราหลายสายพนธ เชน Colletotrichum gloeosporioides, C. capsici เปนตน มรายงานการศกษาอนกรมวธานรา Colletotrichum sp. โดยใชลกษณะทางสณฐานวทยา พบวา C. higginsianum, C. truncatum, C. capsici, C. fulcatum และ C. sublineolum ทาใหเกดโรคกบผกกวางตง ออย ถวเขยวเมลดดา มะเขอเทศ ขาวฟาง ตามลาดบ และ C. gloeosporioides ทาใหเกดโรคกบพรกไทย ถวเหลอง กยชาย หนอไมฝรง มะมวงหมพานต และสมโอ (วรช, 2528)

Colletotrichum sp. เปนเชอราทจดอยใน Subdivision Deuteromycotina, Class Coelomycetes, Order Melanconiales, Family Melanconiaceae (Ainswort, 1973) ลกษณะทวไปของรา คอ สรางเสนใยฝงอยในผวพช เสนใยไมมสหรอสนาตาลออนจนถงนาตาลแก มผนงกนโคนเดย (conidia) เกดบนกานชโคนเดย (conidiophore) ซงเกดจาก stromatic cell ของโครงสรางสบพนธแบบไมอาศยเพศทเรยกวา “ อเซอวลส ” (acervulus) ใตชน epidermis ของพช เมอแกจะดนผวพชใหแตกออก โคนเดยจะถกปลอยออกมาเปนกลมในลกษณะแหงหรอของเหลวขนสเหลองออนหรอสมอมชมพ เมอนารามาเลยงบนอาหารเลยงเชอ ราจะสรางโคนเดยเปนกลมบน stromatic-

cell คลาย sporodochium การสงเกตลกษณะของอเซอวลสจงตองดจากสภาพธรรมชาตหรอบนพชอาศย บางครงพบการสราง sclerotia บนอาหารเลยงเชอ มลกษณะเปนโคนเดยเดยวๆ และไมมส

Colletotrichum sp. เปนเชอราเซลลเดยว ผนงบาง เรยบ ลกษณะรปรางเปนรป ไขหรอยาวรตรงหรอโคง อาจม guttule อยภายใน มการสราง sterile hypha สนาตาล ผนงหนาเรยบ ปลายแหลมคลายหนามเรยกวา “ setae ” เกดบรเวณขอบของอเซอวลส หรอปะปนอยกบกานชโคนเดย ลกษณะการสราง setae ของรานเปนลกษณะทไมคงทเปลยนแปลงไดตามสภาพของอาหารเลยงเชอ appressoria สนาตาล ผนงสนาตาลเขม ลกษณะรปรางคอนขางกลมรคลายกระบองหรอรปรางไมแนนอน บางครงผนงมรอยหยก (lobe) สรางเดยวๆ หรอเกดตดกนเปนกลม teleomorph state ของรา Colletotrichum จดอยในสกล Glomerella (Sutton, 1980; วจย, 2546)

โรคแอนแทรคโนสสงผลกระทบตอผลผลตหลายชนด ในปจจบนจงพบวา มราย- งานการวจยการสกดสารจากพชสมนไพรเพอใชยบยง Colletotrichum sp. เชน กระเทยม หอมใหญ เปนตน (กรรณกา, ม.ป.ป.)

การควบคมเชอราอาจทาโดยการทาลายเสนใยของเชอราทอยในชนผวพช

(subcuticular layer) โดยใชสารเคมทมคณสมบตเปน antibiotic ทสามารถซมผานชนของ cuticle และ epidermal ได เชน สารในกลม alkaloid, coumarins, flavanoid, saponins, steroids, tannins, triterpene และ anthraquinones ดงนน ถาสามารถแยกสารสกดทออกฤทธใหบรสทธ (purified- active constituent) และอยในสภาพทเสถยร (stability) จะทาใหสามารถใชควบคมเชอ Colleto- trichum sp. ไดอยางมประสทธภาพ และไมมผลตอผบรโภคและสงแวดลอม (ณรงค, ม.ป.ป.)

7ก

3. การสกดสารจากพชสมนไพรดวยตวทาละลาย

การสกดดวยตวทาละลาย คอ การแยกสารโดยการใสตวทาละลายทเหมาะสมลงไป ตวทาละลายจะละลายสารออกมาพรอมตวทาละลาย แลวระเหยเอาตวทาละลายออกไปจะไดสารทตองการ (Kikug, 2550)

การเลอกชนดตวทาละลายเปนสงสาคญสาหรบการสกดสาร เนองจากตวทาละลายแตละ

ชนดจะสกดสารไดตางกน เชน ถาตองการสกดสารทมสภาพขวตา จะใชตวทาละลายทมขวตา เชน ไดคลอโรมเทน หรอเฮกเซน เปนตน แตถาตองการสกดสารทมขวสงมาก อาจใชแอลกอฮอลหรอนา ดงนน การสกดสารดวยตวทาละลายจะเปนการแบงสภาพขวของสารเบองตน ซงสามารถนาไปใชประโยชนในการเลอกวธการทดลองทเหมาะสม

3.1 การเลอกชนดตวทาละลาย

8ก 8ข ภาพท 8 โรคแอนแทรคโนสทเกดกบกระเทยม (8ก) และเกดกบมะเขอเทศ (8ข) ทมา: Anonymous (n.d.); Epidermis (n.d.)

โดยทวไปการสกดสารดวยตวทาละลายจะใชตวทาละลายทแตกตางกน ขนกบชนดของสารทสกด ถาทราบชนดของสารทตองการแนนอนแลว สามารถเลอกใชตวทาละลายทมความจาเพาะตอชนดของสารนนๆ เชน การสกดสารไลโคพนจากมะเขอเทศ โดยใชคารบอนได- ออกไซดวกฤตยงยวดเปนตวสกด และใชเอทานอลเปนตวทาละลายรวม (สมใจ, 2549) การเลอกตวทาละลายมหลายแบบ ทนาสนใจและงาย คอ การไลสภาพขวของตวทาละลาย เนองจากตวทาละลายทมสภาพขวเหมอนสาร จะสามารถละลายสารชนดนนออกมาได (Anonymous, 2550) จากการศกษาวจยการสกดใบฝรงดวยนาในอตราสวนใบฝรง 1 กรม : นา 2 มลลลตร (ชลดา, ม.ป.ป. ) พบวาใบฝรงมนามนหอมระเหยและสารแทนนน (tannin) เปนองคประกอบ แทนนนเปนสารทพบไดในพชเกอบทกชนด จดอยในสารกลม polyphenolic compounds มโมเลกลใหญ โครงสรางสลบซบซอน แยกใหบรสทธไดยากเพราะไมตกผลก สวนใหญจะพบในรปของ glycoside แทนนนแบงไดเปน 2 กลมใหญ คอ แทนนนแท (true tannin) มนาหนกโมเลกล 1000-5000 และแทนนนเทยม (pseudotannin) ซงมนาหนกโมเลกลนอยกวา แตมสมบตบางอยางคลายแทนนนแท ตวอยางแทนนนเทยม ไดแก gallic acid, catechin, chlorogenic acid และ ipecacuanhic acid แทนนนละลายไดในนา สารละลายดางเจอจาง แอลกอฮอล อะซโทน (ภาควชาเภสชวนจฉย, 2534)

3.2 ชนดตวทาละลาย

ตวทาละลายแตละชนดสามารถสกดสารออกมาไดตางกน การเลอกตวทาละลายจงจาเปนตองใชแหลงขอมลอางอง เพอใหไดสารทมปรมาณมากพอ และไดสารชนดทตองการ

3.2.1 แอลกอฮอล

แอลกอฮอลเปนสารทนยมนามาเปนตวทาละลายชนดหนง เนองจากเปนสารทหาไดงาย เปนอนตรายนอย และละลายสารไดหลายชนด เชน โครงงานวทยาศาสตรชนหนงทดลองโดยนาสวนตางๆของตนกระเจยบแดง ไดแก ดอกแหง ดอกสด ลาตน และใบ มาทาใหละเอยดแลวสกดดวยเอทานอล จากนนเทสารละลายออกมา แลวนาไประเหยเอาเอทานอลออกดวย

เครองมอระเหยสารละลาย (evaporator) พบวา เอทานอลสามารถสกดสารไดด (วนชพร, 2548) นอกจากน เอทานอลยงใชในการสกดรากและลาตนของพชวงศขง 17 ชนด พบวา สารสกดหยาบจากขงและไพล เขมขน 10000 ppm สามารถยบยง C. capcisi, C. gloeosporioides สารสกดหยาบจากกระชายและเรว เขมขน 25000 ppm สามารถยบยงการงอกของสปอรราไดทกชนด (สภทรา, ม.ป.ป) หรอใชแอลกอฮอลตางชนดกนสกดสารอพแกลโลแคทชนแกลเลตจากใบชาเขยว พบวา เมทานอลสามารถสกดสารไดมากกวาเอทานอล และเอทลอะซเตด ตามลาดบ (อนรกษ, 2547)

แอลกอฮอลเปนตวทาละลายทนยมใชสกดสารจากพชเกอบทกชนด จงเปนทางเลอกหนงทจะนามาสกดสารจากใบขล

3.2.2 เฮกเซน (hexane)

เฮกเซนเปนของเหลวไมมส มกลนออน ๆ ไมมขว มสตรโมเลกล คอ C6 H14 มคา LD50 (ปรมาณสารทไดรบแลวทาใหสตวทดลองตายเปนจานวนครงหนง) เทากบ 28710 มลลกรม/นาหนกหน 1 กโลกรม จดเดอด 69 C° จดเยอกแขง -95 C° ความถวงจาเพาะ 0.66 และละลายนานอยมาก (เอกสารขอมลความปลอดภยเคมภณฑ, ม.ป.ป.) เฮกเซนเปนตวทาละลายทไมมขว สามารถละลายสารทไมมขวหรอขวนอยออกมาไดด เชน บทความหนงกลาววา “ ในการสกดสารทมนามนหอมระเหย จะใชนามนเปนตวทาละลาย นยมใชเฮกเซนเปนตวทาละลายเพอดงนามนหอมระเหยออกมา จากนนใหกลนเพอแยกเฮกเซนออกจากนามน ” (Vivi, 2549) นอกจากน เฮกเซนยงสามารถนามาสกดพชนาเคมบางชนด เชน สารภทะเล พบวา สามารถสกดไดสารสวนทไมเคยมรายงานมากอน จากนนนาไปตกผลกไดของแขงทเปนผลกสขาวใส และมนวาว (ประภา, ม.ป.ป.) ไมเพยงเทาน ยงมการใชเฮกเซนในการสกดสารจากราสกลคโตเมยม (Chaetomium sp.) พบวา สารสกดสามารถใชยบยงเชอวณโรค เชอมาเลเรย และเชอมะเรงชนด NCI-H187 ได (นชนาฏ, 2548) จากงานวจยตางๆพบวา เฮกเซนสามารถสกดสารจากพชและราไดด นอกจากน ถาตองการสกดสารทไมมขว ขวนอย หรอสารประเภทนามน เหมาะทจะใชเฮกเซนเปนตวทาละลาย ซงพบวา ในใบขลเปนพชทมสารพวกนามนหอมระเหย เฮกเซนจงเปนตวทาละลายชนดหนงทนาสนใจ

3.2.3 นา นานบวาเปนตวทาละลายทดชนดหนง เนองจากนาสามารถละลายสารไดหลายชนด แตการสกดดวยนาไมสามารถนาสารละลายมาระเหยเอาตวทาละลายออกไดโดยตรง เพราะนามจดเดอดสง คอ 100 C° การใชอณหภมสงในการระเหยตวทาละลาย อาจมผลทาใหสารบางชนดทไมเสถยรในสารสกดสญเสยไป ดงนนเมอสกดสารดวยนาแลวจาเปนตองสกดใหม (re-extraction) ดวยตวทาละลายทมขวตางกน เพอใหสารทมในนาละลายอยในชนของตวทาละลายอนทรย จากนนใหตงทงไวเพอใหชนนาและตวทาละลายอนทรยแยกออกจากกน โดยใชกรวยแยก ดงแสดงในภาพท 9 แลวจงนาไประเหยตวทาละลายออก เพอเกบสารสกดไวทดสอบตอไป (นรนาม, ม.ป.ป.) ชนลาง (สารละลายทมความถวงจาเพาะนอย) ไขออกทาง stopcock ชนบน (สารละลายทมความถวงจาเพาะมาก) รนออกทางดาน stopper ภาพท 9 สวนประกอบตางๆ ของกรวยแยก ทมา: นรนาม (ม.ป.ป.) จากงานวจยหนง ทาการทดลองสกดเนอเยอใบของพชสมนไพร 8 ชนด ประกอบดวย เสลดพงพอนตวเมย ทองพนชาง สาบเสอ พะยอม เปลาใหญ กระเจยบแดง ฝรง และชะพล ในอตราสวน ใบพช 1 กรม : นา 2 มลลลตร จากนนทดสอบการยบยงเชอแบคทเรยสาเหตโรคพช 12 สายพนธ พบวา สารสกดจากฝรง พะยอม และกระเจยบแดง สามารถยบยงเชอแบคทเรยไดดตามลาดบ (ชลดา, ม.ป.ป. )

stopcock

stopper

ใบฝรงมสารบางชนดคลายใบขล จงมความเปนไปไดทจะใชนาเปนตวทาละลายอกชนดหนง นอกจากน นาเปนตวทาละลายทมคณสมบตในการละลายสารไดหลายชนด และไมมอนตรายอกดวย

3.2.4 เอทลอะซเตด (ethyl acetate)

เอทลอะซเตด มสตรโครงสราง คอ CH3COOCH2CH3 เปนสารทม สภาพขวปานกลาง ลกษณะทวไป คอ เปนของเหลวใส มกลนหอม จดเดอด 77.2 C° จดหลอม- เหลว -83 C° ความถวงจาเพาะ 0.9018 ละลายนาไดเลกนอย แตละลายไดดในแอลกอฮอล อเทอร กลเซอรน มคา LD50 (ปรมาณสารทไดรบแลวทาใหสตวทดลองตายเปนจานวนครงหนง) เทากบ 5620 มลลกรม/นาหนกหน 1 กโลกรม ปจจบนใชทาเครองสาอาง และเปนตวทาละลาย (เอกสารขอมลความปลอดภยเคมภณฑ, ม.ป.ป.)

เอทลอะซเตดเปนตวทาละลายใชกนอยางแพรหลาย เหมาะสาหรบสกด สารทมสภาพขวปานกลาง เชน การใชเอทลอะซเตดในการสกดรา Aschersonia samoensis I 4593 เพอนามาทดสอบทางชวภาพ (รสสคนธ, 2544)

4. การแยกและวเคราะหสารโดยวธโครมาโทกราฟ (Chromatography)

การแยกและวเคราะหสารโดยวธโครมาโทกราฟประกอบดวยเฟสทสาคญ 2 เฟส (phase) คอ เฟสคงท (stationary phase) และเฟสเคลอนท (mobile phase) ในสวนของเฟสคงทจะเปนสวนทไมเคลอนท สารทนยมใชในเฟสน คอ ซลกาเจล และอะลมนา สวนเฟสเคลอนทจะเปนสวนของตวทาละลายทใชในการพาสารใหเคลอนทไป ตวทาละลายนจะเคลอนทไปในเฟสคงทพรอมสารตวอยาง เนองจากสารทมโครงสรางตางกน จะไดรบแรงดงและแรงผลกดนตางกนดวย ดงนนสารแตละชนดจงเคลอนทในอตราทแตกตางกน สารทถกดดซบไดดกวาจะเคลอนทไดชา จงทาใหเกดการแยกของสารขนเปนแถบๆ เรยกวา “ chromatogram ” เฟสคงทจะทาหนาท 2 ลกษณะ คอ รบโมเลกลของสารเขามาสมผสกบตวมน เรยกวา “ adsorption ” และปลอยใหโมเลกลของสารเคลอนทตอไป เรยกวา “ desorption ” เฟสคงทมหลายชนด ในการเลอกใชจงตองเลอกใหเหมาะ- สมกบสารทตองการแยก เฟสคงททดจะตองไมละลายในเฟสเคลอนท ไมทาปฏกรยากบสารทตองการแยก และตองไมเปนตวเรงของปฏกรยา (นรนาม, ม.ป.ป.)

สงทสาคญอกอยางหนง คอ ความมขวของสาร ซงจะมผลตอความสามารถในการละลาย

ของสารในเฟสเคลอนท แรงนจะสงผลตออตราเรวในการเคลอนทของสารตวอยาง กลาวคอ ถาสารตวอยางมขวใกลเคยงกบตวพาสาร สารตวอยางจะละลายและเคลอนทไปพรอมกบตวพา ทาใหอตราเรวในการเคลอนท (Rf) สง ในทางกลบกนถาสารตวอยางมขวตางกบตวพามาก ทาใหไมละลายในตวพา อตราเรวในการเคลอนท (Rf) จะตา นอกจากความมขวของตวพาทมผลตอคา Rf แลว ความสามารถในการดดซบของเฟสคงทกมผลตอคา Rf ดวยเชนกน คอ ถาตวดดซบสามารถดดซบสารไดมาก สารจะเคลอนทไปในเฟสคงทชา (Rf ตา) การเลอกตวพาสารและตวดดซบจงเปนหลกสาคญในการวเคราะหดวยวธโครมาโทกราฟ (พทธรกษา, ม.ป.ป.)

อยางไรกตาม เรายงสามารถเพมประสทธภาพของการแยกไดโดยการเพมความสงของเฟส คงท เพอใหระยะทางในการเคลอนทของสารมากขน นอกจากการเพมประสทธภาพของการแยกสารแลว ความชานาญของผทาการทดลองกมสวนสาคญ ดงนน การศกษาหลกการ วธเลอกตวทาละลาย อตราเรวในการเคลอนท ขอดขอเสย และวธแกไข จะชวยใหไดผลการทดลองทเทยงตรงและถกตอง การแยกสารโดยวธโครมาโทกราฟเพอวเคราะหสารขนตนทนยม คอ วธโครมาโทกราฟแบบแผนเคลอบ (Thin Layer Chromatography, TLC) และวธคอลมนโครมาโทกราฟ (Column Chromatography) ซงทงสองชนดจะใชหลกการแยกแบบเดยวกน

4.1 โครมาโทกราฟแบบแผนเคลอบ (Thin Layer Chromatography, TLC)

เปนโครมาโทกราฟแบบดดซบ หรอ solid-liquid chromatography ของผสมทถกแยกจะถกดดซบโดยเฟสคงททเปนของแขง เฟสคงททนยมใช คอ ซลกาเจล (silica gel, SiO2 .XH2O, X คอ จานวนโมลของนาทลอมรอบ) และ alumina gel (Al2O3) สวนเฟสเคลอนทเปนของเหลวทมสภาพขวทเหมาะสมกบการแยกสารแตละชนด เพอสามารถแยกสารไดมประสทธภาพทสด กระบวนการโครมาโทกราฟเกดขน เนองจากสารทตองการแยกมการเคลอนทในอตราทแตกตางกน ซงเนองมาจากแรง 2 ชนด คอ

ก. แรงผลกดน (propelling forces) เกดเนองจากการไหลของตวเฟส เคลอนท หรอความสามารถในการละลายของสารในตวเฟสเคลอนท

ข. แรงดง (retarding forces) หมายถง แรงทเฟสคงทดงดดสารไว เชน แรงวานเดอวาลส แรงพนธะไฮโดรเจน เปนตน (นรนาม. ม.ป.ป.)

เฟสเคลอนททใชในการวเคราะหดวยโครมาโทกราฟมหลายชนด ซงเรยงลาดบ

ความเปนขวจากตาไปหาสง ดงน เฮกเซน < คารบอนเตตราคลอไรด < เบนซน < อเทอร< ไดคลอ-โรมเทน < คลอโรฟอรม< เอทลอะซเตด < อะซโตน< เอทานอล < นา (William and Poone, 2548)

คาทสาคญในการวเคราะหดวยโครมาโทกราฟอกคาหนง คอ อตราการเคลอนทของสาร (Rate of flow, Rf ) การหาคา Rf หาไดจากสมการ

Rf = ระยะทางทสารเคลอนทได/ระยะทางทตวพาเคลอนท

ภาพท 10 เฟสตางๆ และลกษณะการเคลอนทของสารบนแผน TLC ทมา: เอกสารประกอบรายวชาชวเคมทางสตวแพทย

การวดระยะทางทสารเคลอนท จะวดทระยะทางจากจดเรมตนถงกงกลางของระยะทางทสารตวอยางเคลอนท ซงคา Rf จะมสมบต ดงน

ก. คา Rf ไมมหนวย และหาไดจากการทดลองเทานน ข. คา Rf มคาไมเกน 1 ขนอยกบชนดของสารและชนดของตวทาละลาย

ค. คา Rf เปนคาเฉพาะคาคงทของแตละสาร (ประจวบ, ม.ป.ป. )

เมอแยกสารโดยวธ TLC แลว การตรวจหาตาแหนงของสารทถกวธ จะชวย ใหผลการทดลองออกมาอยางมประสทธภาพ การหาตาแหนงของสารทมสสามารถทาไดโดยตรง แตถาเปนสารทไมมส จะตองใชเทคนคบางอยางชวย เชน

ก. สองดวยแสงอลตราไวโอเลต (UV) ในกรณทสารนนเรองแสงได ข. ใชสารเคมบางอยางพน เพอใหเกดปฏกรยาไดสารทมสเกดขน เชน พนดวยไอของไอโอดนหรอนาไปใสในภาชนะปดทมไอโอดน สารบางชนดจะใหสนาตาลของสารประกอบเชงซอนไอโอดน หรออาจจะพนดวยสารละลายนนไฮดรน (ninhydrin) ในกรณทสารนนเปนพวกกรดอะมโน จะเกดสนาเงนปนมวงขน (ประจวบ, ม.ป.ป. )

4.2 คอลมนโครมาโทกราฟ (Column Chromatography)

เปนวธทใชแยกสารใหบรสทธมากขนโดยใชหลกการแยกแบบเดยวกบโครมาโท- กราฟแบบแผนเคลอบ แตคอลมนโครมาโทกราฟจะใชตวทาละลายทมากกวา และใชสารตวอยางมากกวาโครมาโทกราฟแบบแผนเคลอบ

ในการแยกสารโดยวธคอลมนโครมาโทกราฟ สวนมากจะใชตวพาสาร (ตวชะ) หลาย ชนด การเลอกตวพาสารจะใชเทคนคการไลขวสาร เพราะสารตวอยางจะประกอบดวยสารหลาย ชนดซงมขวตางกน ดงนนการใชตวทาละลายชนดเดยวจงไมสามารถไลสารออกไดหมด จงควรเรมใชตวพาทมขวตากอนทจะไลขวใหสงขน เชน เรมจากเฮกเซน (ขวตา), เอทลอะซเตด (ขวปาน-กลาง) และเมทานอล (ขวสง) ตามลาดบ บางครงอาจทดสอบหาตวทาละลายผสมทแยกสารไดดทสดดวย TLC กอน จากนนคอยนามาใชเปนตวพาสารในการแยกสารโดยวธคอลมนโครมาโท- กราฟกได (ประจวบ, ม.ป.ป.)

ในปจจบน มการนาวธโครมาโทกราฟแบบแผนเคลอบและแบบคอลมนไปประยกต

ใชในงานหลายดาน เชน การวเคราะหดานไบโอดเซล (Sathi, 2549) การวเคราะหดานยา สมนไพร หรอการสกดสารจากธรรมชาต (ปนดดา, 2550) เนองจากเปนวธแยกสารทงาย ราคาถก และใชเวลานอย เราจงพบวา ปจจบนงานวจยในหลายดาน จะใช 2 วธนเปนวธแยกสารเบองตนกอน จากนนจะนาไปแยกเชงลกดวยวธวเคราะหทละเอยดและซบซอนมากขน เชน HPLC (High Performance Liquid Chromatography) เปนตน 5. การทดสอบการยบยงเชอจลนทรยของสารสกด ปจจบนการศกษาสารสกดเพอใชยบยงเชอจลนทรยทกอโรคตางๆ เรมพฒนาอยางแพรหลาย เหตผลททาใหเรมมการใชสารสกดจากธรรมชาตแทนสารเคม เชน เพอเปนการลดคาใชจาย ลดอนตรายและสารตกคางในสงแวดลอม เปนตน งานวจยหลายชนพบวา สารสกดธรรมชาตสามารถยบยงเชอทกอโรคไดเปนอยางด และมสารตกคางทนอยกวาสารเคม เชน งานวจยทศกษาการยบยงเชอแบคทเรยทกอใหเกดโรคพช 12 สายพนธ 3 จนส (genus) พบวา สารสกดของใบฝรงยบยงเชอแบคทเรยทกอใหเกดโรคพชไดทกสายพนธ (ชลดา, ม.ป.ป.) การทดสอบการยบยงเชอนนตองเพาะเลยงเชอใหบรสทธกอน เพราะตามปกตจลนทรยในธรรมชาตจะอยรวมกนหลายชนด การจะเพาะจลนทรยใหอยในสภาพแวดลอมใหม จาเปนทจะ ตองสรางสภาวะแวดลอมทสมบรณ ซงประกอบไปดวยปจจยทเหมาะสมและจาเปนตอการเจรญ เตบโตของเชอนน โดยเฉพาะเพอเปนการคดเลอกเชอทเจรญใหบรสทธ อาหารเลยงเชอ (culture medium) หมายถง อาหารทมสวนประกอบทเอออานวยให จลนทรยเจรญและแบงเซลล โดยจลนทรยตางชนดกนจะตองการสารอาหาร pH ของอาหารตางกน ดงนนอาหารจงสามารถใชแยกเชอจลนทรยขนตนได 5.1 อาหารเลยงเชอทวไป มคณสมบตดงน

ก. มธาตอาหารและความเขมขนทเหมาะสมกบการเจรญของจลนทรย ข. ม pH ทเหมาะสมกบการเจรญของจลนทรย

ค. ปราศจากสารพษทมผลตอการเจรญของจลนทรย ง. ไมมสงมชวตใดอยในอาหารเลยงเชอนน (กญจนา, 2547)

5.2 การแบงชนดของอาหารเลยงเชอตามลกษณะการใชงาน

ก. synthetic medium เปนอาหารเลยงเชอททราบชนดและปรมาณแนชด ข. complete medium เปนอาหารเลยงเชอทประกอบดวยสารอาหารเพยงพอตอการเจรญของจลนทรย ค. enriched medium อาหารเลยงเชอทสวนใหญเปนของเหลว ใชเพอเพมปรมาณเซลลของจลนทรยชนดทตองการ โดยใชอาหารทเออตอการเจรญเตบโตของจลนทรยเปนพเศษ ง. selective medium อาหารเลยงเชอทใชเพอคดเลอกจลนทรย คอ จะใชอาหารทจลนทรยทตองการเจรญไดเทานน จ. differential medium อาหารเลยงเชอทใหจลนทรยเฉพาะชนดเจรญ สามารถเหนความแตกตางของลกษณะการเจรญได (กญจนา, 2547) 5.3 อาหารเลยงเชอตามชนดจลนทรย ก. แบคทเรย ใชอาหาร complete media คอ Nutrient Agar (NA) ประกอบดวย beef extract 3 กรม peptone 5 กรม นากลน 1 ลตร และ agar 15 กรม เพอใหเปนอาหารแขง อกชนดหนง คอ Nutrient Broth (NB) ประกอบดวยสารชนดเดยวกบ NA แตไมเตม agar ดงนน NB จงเปนอาหารเหลว ข. เชอรา ใชอาหาร complete media คอ Potato Dextrose Agar (PDA) ประกอบดวย นาจากมนฝรง 200 กรม นาตาลกลโคส (เดกซโทรส) 20 กรม และ agar 15 กรม ในนา 1 ลตร (กญจนา, 2547) ค. ยสต ใช Yeast extract Peptone Dextrose (YPD) ประกอบดวย yeast extract 5 กรม peptone 20 กรม และ dextrose 20 กรม ละลายในนากลน 800 ml ปรบปรมาตรเปน 1000 ml เตม agar 15 กรม (กลยา, ม.ป.ป. )

5.4 การทดสอบการยบยงเชอจลนทรย

5.4.1 การทดสอบการยบยงเชอ Staphylococcus aureus และ Bacillus subtilis Agar diffusion method เปนวธทดสอบเชอจลนทรยโดยวดความขนของ

เชอ เมอเพาะเชอทว plate อาหารเลยงเชอแลว เชอจะขนเปนสขาวขน จากนนจะใชกระดาษกรอง sterile (ผาน autoclave ท 121 องศาเซลเซยส ความดนไอ 15 ปอนด/ตารางนว เปนเวลา 15 นาท) ตดเปนวงกลมแลวชบสารสกด ถาสารสกดมฤทธยบยงเชอจลนทรยจะเหนเปนวงกลมใส ทเรยกวา “ clear zone ” ขนาดเสนผานศนยกลางของ clear zone จะบอกความสามารถในการยบยงเชอของสารสกด ถาเสนผานศนยกลางกวางแสดงวามฤทธยบยงเชอไดด (กญจนา, 2547)

5.4.2 การทดสอบการยบยงเชอ Propionibacterium acne Paper disc diffusion method เปนวธทดสอบโดยวางแผน TLC ท

มสารสกดลงในจานเลยงเชอ (petri dish) เทเชอทผสมกบอาหาร Brain heart infusion (BHI) หลอมเหลวลงในจานเลยงเชอ ทงใหแขง เกลยเชอลงบนอาหาร แลวนาไปบมท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 7 วน (สมนก, 2550)

5.4.3 การทดสอบการยบยงเชอ Colletotrichum gloeosporioides เตรยม inoculum ของเชอ Colletotrichum gloeosporioides โดยเตรยม

อาหารเลยงเชอ PDA เทใสจานเลยงเชอ (plate) จานละประมาณ 20 มลลลตร ทงใหเยน ยายชนวนทมเชอโดยใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 เซนตเมตร มาวางไวบน plate ทมอาหาร PDA เลยงเชอทอณหภมหอง ประมาณ 5-7 วน (สาหรบการทดสอบสารสกดอาจใชการขดรองหรอเจาะรใสสารสกด เพอดการยบยงเชอ) (กรรณกา, ม.ป.ป.)