UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO SANCHEZ CARRION

BIOQUIMICA

ENZIMAS 2012 - II Parte

Mg. SOLEDAD LLAÑEZ BUSTAMANTE

HUACHO – 2012

B. Modelo del ajuste inducido.D. K 1958

A. Modelo de la llave y la cerradura.E.F.1894 E.Fisher1894

Los modelos de enzimas

CINETICA ENZIMÁTICA

ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTENECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

Vo = Vmax [S]

Km + [S]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción v = k3 [ES] = constante OV. Estado estacionario = Estado de equilibrio de sus reacciones . La concentración de los intermediarios permanece mientras que la concentración de los materiales de partida y productos van cambiando La velocidad catalítica es igual a la concentración del complejo ES y K3 V = K3 [ES]

DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL

Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S]

Se factoriza 1 = Km * 1 + [S] vo Vmax [S] Vmax[S]

Se simplifica: 1 = Km * 1 + 1 vo Vmax [S] Vmax

: y = a * x + b

TRANSFORMACIÓN DE LOS DOBLES RECÍPROCOS

(LINEWEAVER-BURK)

UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (U):

La UIB - EC : Unidad de mol/seg, en vez de umol /min, a 25 0C, en las condiciones de medida óptima. También es común el uso de Katal ,mKtal,uKtal nkatal, pKatal)

ACTIVIDAD ESPECÍFICA:

Es el N° de U de una E / mg de proteína.Es decir: una medida de la pureza de la E.Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.

NÚMERO DE RECAMBIONo. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo, por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)

Enzima No. de Recambio

Anhidrasa carbónica 36 000 000B-Amilasa 1 000 000B-Galactosidasa 12 000Fosfoglucomutasa 1 240

Catalasa 2,5 00 000Citrocomo c, a 38° C 1.4 X 103

Carboxilasa a 30° C 1x10 3

Este número de recambio, en algunas ocasiones, es muy elevado, como sucede con la catalasa que a 0° C., tiene un número de recambio de 2.5 millones; es decir, un mol de enzima es capaz, en un minuto, de desdoblar dos y medio millones de moles de H2O2

La KM es un parámetro de Actividad Enzimática

• La KM es inversamente proporcional con la actividad de la enzima.

• Valor de KM grande, baja actividad• Valor de KM pequeño, alta actividad • los valores de esta constante, coinciden

aproximadamente con la concentración intracelular de sustratos.

Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

Km de algunas enzimas

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)

Isoenzimas o Isozimas• Son formas moleculares diferentes de una misma enzima• Catalizan la misma reacción• Ejemplo: Lactato deshidrogenasa• Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH• M4, M3H1, M2H2, M1H3 y H4

• Se diferencian por su movilidad electroforética•Usadas en clínica: sueros normales y sueros con alguna patología•Las ISOENZIMAS poseen diferentes KM, aunque catalicen la misma reacción.

Caso : Alcohol DH AcetDH en Japoneses y Chinos Etanol… Acetaldehido……. Aceton ( hep .Mitocondrial) Asiáticos Isoenzima (Hep citopl )de mayor Km. Aumenta la sensibilidad al alcohol

Significado de la constante Vmax

1. Velocidad asintótica para s

2. Directamente proporcional a la concentración de enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k3)

3. Mide función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

EFICIENCIA CATALÍTICA DE LAS ENZIMAS Kcat/Km

1. Valor elevado del Kcat/Km de una E = Gran Capacidad de transformación del S en P y una elevada afinidad por el S

2. Mayor eficacia con un elevado valor del cociente Kcat/Km

ENZIMA SUSTRATO Kcat(S-1 ) Km (M) Kcat/Km M-1 S-1

Fumarasa Fumarato Malato

8x102 9x102

5x10-6

2.5x10-51.6x108

3.6x107

Métodos de linealización para determinación parámetros cinéticos

Método Eje Y Eje X InterceptoEje Y

InterceptoEje x

Pendiente

Lineweaver-Burke

1/v 1/s 1/V -1/K K/V

Hanes s/v s K/V -K 1/V

Eadie-Hofstee

v v/s V V/K -K

Cuantificación AE por Espectrofotometría

1. Forma más rápida para cuantificar la AE

2. S o P es coloreado o absorbe la luz en el UV: Aparición o desaparición de uno de ellos que absorbe la luz es seguido por el espectrofotómetro

Ejm. Deshidrogenasa alcohólica que transfiere electrones del alcohol etílico NAD+

para formar NADH+H que absorbe luz UV en 340nm mientras que alcohol, NAD+

y el

acetaldehído, no absorben. Se incrementara Abs. de Luz

Se puede usar un sistema de Rx. Acoplada a DH para las q no absorven Luz y es necesario la presencia de la coenz NAD

+ o NADP +.

Factores que contribuyen Eficacia catalítica

1. Proximidad y orientación del sustrato: Orientación

Orbital2. Catálisis Covalente3. Catálisis Acido básica (General y especifica )4. Factor de tensión en la catálisis enzimática: Relación de

la conformación de la enzima y la Actividad Catalítica

1. Proximidad y orientación del sustrato : Orientación Orbital

Bruice: Hidrólisis de esteres monofenilicos (Ac. Dicarboxilicos) Catalizador CARBOXILATO LIBRE

Storm y Koshland: Orientación del S y grupo catalítico del E orbitales alineados …..ES

El objetivo es formar el intermediario covalente el mismo que rebaja la barrera de energía de activación de los implicados en la transferencia de grupos

2. Catálisis Covalente

Catálisis Covalente (Base de SHIFF) Aldolasa

3. Catálisis Acido básica ( General y especifica)

+

LISOZIMA

Mecanismo de acción catalítica de la LISOZIMA Hidrólisis D Y E c-1 NAM con c-4 del NAG

Mecanismo de acción de la Lisozima

En principio la enzima se une a la molécula de glúcido en conformación "silla" (a), que luego pasa a otra forma (b) al formar el complejo ES. En el estado de transición, actúa un resto glutámico del Sitio Activo de la enzima, que genera un carbocatión en el anillo D, provocando el colapso del enlace.

4.- Factor de tensión en la catálisis enzimática: Relación de la conformación del Enzima y la Actividad Catalítica

Factor de

¿A qué grupo corresponden?

Factores que afectan la velocidad

TIEMPO CONCENTRACION DE REACTANTES pH del

medio

PRESENCIA DE INHIBIDORES/ CATALIZADORES

TEMPERATURA

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

MOLECULAS

MOLECULAS COLISIONANDO Y PRODUCIENDO UN VALOR ELEVADO DE ENERGIA

MOLECULAS EN ESTADO DE TRANSICION

PRODUCTO

ENERGIA

• Efecto de la Temperatura

37ºC

Tº óptima

Desnaturalización% Act. Máxima

100--

FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD ENZIMATICA

• El pH

4 9 pHpH

A E AE

1 3 7 11 14 pH

Vo

Pepsina 1.5

Tripsina 7.7

Catalasa 7.6

Arginasa 9.7

Fumarasa 7.8

Ribonucleasa 7.8

Enzima pH óptimo

• Efecto del tiempo de Incubación

Producto formado

T I

Efecto de la (E) sobre la velocidad de RxEnzimática

(E)

Vo

Vo & (E)

Efecto de los Catalizadores

Sustancias que en pequeñas cantidades modifican la velocidad de reacción, acelerando (CAT. +) o retardando (CAT. -), a éste último también se le llama “Inhibidor”.

Con inhibidor

Sin catalizador

Con catalizador

EnergíaKCal

Avance de la Rx

C + D

INHIBICIONES ENZIMATICAS

Inhibidores

Reactivos químicos específicos que pueden inhibir a la mayor parte de las enzimas.

INHIBIDORESINHIBIDORES

Irreversibles

Reversibles

Inhibidor Irreversible

• Inhibición permanente

• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.

• Modificaciones químicas de los gps. catalíticos.

• Modificada la enzima, está siempre inhibida.

Para distinguirlo de los reversible se someten a diálisis y si no se separan enzima e inhibidor, éste es permanente.

Inhibidor IrreversibleFluorofosfato de diisopropilo

(DFP)

Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

Acetato + Colina

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Inhibidor Irreversible

Malatión

Acetilcolinesterasa

Tripsina

Elastasa

Fosfoglucomutasa

Cocoonasa (larvas de gusanos de seda

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

• La unión del inhibidor y la enzima es reversible.

• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad.

Hay 3 tipos:

Competitiva

No Competitiva

Acompetitiva  (Alostérica)

Inhibidor Reversible

Antibióticos

Insecticidas

Herbicidas

Venenos

Diferentes MedicamentosDolor

Inflamación

Infecciones virales

Cáncer

Inhibición enzimática

Inhibidores Competitivos

• Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima

• Se une solo a la enzima libre• V máx no se altera y K M cambia

Inhibición Competitiva

E ES

EI

I

S

E + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

Ki = [E] [I]

[EI]

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

Ejemplo Inhibidor Competitivo

• Ácido succínico + FAD = ácido fumárico + FADH2 • El inhibidor competitivo es el ácido malónico• Es un análogo estructuralmente al ácido

succínico

Ácido Fólico y Sulfanilamida

• La sulfanilamida es un análogo estructural del ácido p - aminobenzoico (PABA)

• PABA es el punto de partida para la síntesis de ácido fólico en las bacterias

• El ácido fólico es una vitamina esencial para la proliferación (división) bacteriana

• Sulfanilamida se usa en el tratamiento algunas infecciones

METOTREXATO Y DIHIDROFOLATO

• El ácido fólico en sus formas de dihidro y tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa

• Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA

• Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA

Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto

Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Captopril y Enalopril Antihipertensores

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer

Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Captopril y Enalopril Antihipertensores

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer

Inhibidores Competitivos

Inhibidor No Competitivo

• Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima

• Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato

• Por acción del inhibidor disminuye la Vm pero el valor de Km no se altera

Inhibidor NO competitivoEl inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio

diferente del sitio activo

E ES

EI

I

S

E + PI

ESI

SInhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

El inhibidor NO se une al sitio activo

Inhibición No Competitiva

NO se puede revertir con un exceso de sustrato

Inhibición acompetitiva

I

El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora

La subunidad catalítica une al sustrato y cataliza la reacción

Inhibidor IncompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centro activo pero solo después de que el sustrato lo haya hecho y, por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera, aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda la enzima esté como complejo ES, el inhibidor puede enlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.

Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, por tanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima, disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI no conduce a productos y Vm disminuye.

Inhibidor Incompetitivo

• Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima

• Se une sólo al complejo enzima-sustrato• Los efectos que tiene: disminuye el valor de Km

y también el de Vmáx

E ESS

E + PI

ESI

InhibiciónAnticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo

Modelo Kap Vap

Inh comp Km(1+i/Ki) Vm

Inh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)

Inh anticomp Km/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)

Determinación de parámetros cinéticos de inhibición

Mecanismo de ping-pong para una reacción enzimática. La unión de los sustratos A y B tiene lugar en un orden definido y secuencial, por medio de un intermediario enzimático modificado, E*. Entre las enzimas con este tipo de mecanismo podemos encontrar alguna oxidorreductasa, como la tiorredoxima peroxidasa, transferasas, como la acil-neuraminato citidil transferasa, y serin proteasas, como la tripsina y la quimiotripsina.

Las serin-proteasas conforman una diversa familia de enzimas muy comunes, que incluyen enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina y elastasa), varias enzimas del proceso de coagulación y muchas otras. En las serin-proteasas, el estado intermedio E* es una especie acilada en una serina del centro catalítico de la enzima.

Enzimas Alostéricas• Son enzimas cuya estructura proteica está formada

de varias subunidades• No se rigen por la cinética de M - M• Además del sitio o centro activo tienen sitios

alostéricos o de regulación• Sitio activo/sustratos; • Sitio alostérico/moduladores o reguladores• La relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea

Enzimas alostéricas

• Las enzimas alostéricas presentan estructura cuaternaria.

• Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molécula de sustrato

• La unión del sustrato es cooperativa

• la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal

Concepto de Cooperatividad

• La unión de los sustratos al sitio activo de una subunidad produce un cambio conformacional que por contacto físico se transmite a las subunidades vecinas, facilitando las interacciones

• Modelos de unión: secuencial y concertado• Ejemplos: unión Hb-O2, enzimas alostéricas y sus

sustratos

Moduladores Alostéricos

• También reciben el nombre de efectores y pueden ser positivos o negativos

• Se unen al sitio alostérico que puede estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatorias

• Su unión produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo

Las Isoenzimas o isozimas

•Tienen secuencias de aminoácidos semejantes pero no idénticas.

Todas las formas presentan actividad enzimática y catalizan la misma reacción bioquímica, pero pueden diferenciarse por tener distintas propiedades cinética (diferente KM y Vmax), reguladoras (diferentes efectores); preferencias por las coenzimas, incluso por su distribución celular

FIN