11-Bibliografia Adicional- Ingenieria Genetica

43Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

II.-Captulo 3

Herramientas bsicas de ingenieragentica

Gmez, Marisa; Echenique, Viviana

1 Introduccin

Hasta aproximadamente 1970 el ADN erala molcula de la clula que planteaba msdificultades para su anlisis bioqumico. Exce-sivamente larga y qumicamente montona,la secuencia de nucletidos del ADN slopoda ser estudiada por caminos indirectos,tales como la determinacin de la secuenciade protenas, del ARN o por el anlisisgentico. Actualmente es posible separar re-giones determinadas del ADN, obtener can-tidades ilimitadas de esos fragmentos y de-terminar incluso la secuencia de esosnucletidos. Estos adelantos tcnicos formanparte de la tecnologa del ADN recom-binante, constituida por una mezcla de tc-nicas, algunas de las cuales son nuevas, perootras son adaptaciones de procesos natura-les de la gentica microbiana que han sidoestudiados y se conocen en profundidad.

2 Gentica microbiana

En los procariotas existen mecanismos deintercambio gentico que permiten tanto latransferencia de genes como la recombina-cin. La recombinacin gentica en procario-tas ocurre porque se transfieren fragmentosde ADN homlogos desde un cromosomadonador a una clula receptora por uno deestos tres procesos:

Transformacin: es un proceso porcual el ADN libre del medio ambiente se in-corpora en una clula receptora, trayendoaparejado un cambio gentico. Esto ocurreslo en algunas especies bacterianas. El mo-vimiento de las molculas de ADN a travsde la membrana y dentro del citoplasma dela clula receptora es un proceso activo, querequiere energa. Una clula que es capaz detomar una molcula de ADN y ser transfor-mada se dice que es competente. Estas clu-las secretan el factor de competencia, que es

una pequea protena que induce la sntesisde 8 a 10 nuevas protenas requeridas parala transformacin.

Transduccin: es un proceso por el cualel ADN se transfiere de una clula a otra pormedio de un virus (que en el caso dehospedadores bacterianos se denominafago). Puede ocurrir de dos maneras. En lallamada transduccin generalizada, unafraccin del ADN celular, que puede proce-der de cualquier porcin del genoma delhospedador, pasa a formar parte del ADNde la partcula vrica madura, reemplazandoal genoma del fago. En la transduccin es-pecializada, que ocurre slo en algunos fagosatemperados (aquellos que se integran en elgenoma como parte de su ciclo biolgico), elADN de una regin especfica del cromosomadel hospedador se integra directamente enel genoma del fago, reemplazando algunosde sus genes. En ambos casos, la partculavrica transductora es normalmente defectivacomo virus, ya que los genes vricos han sidoreemplazados. No todos los fagos puedentransducir, ni todas las bacterias sontransducibles. Pero el fenmeno est lo sufi-cientemente extendido para suponer quedesempea un importante papel en lastransferencias genticas que se producen enla naturaleza.

Conjugacin: es un proceso de trans-ferencia gentica que requiere contacto declula a clula y que est mediado por unplsmido. Consiste en la transferencia deuna copia de este plsmido al nuevohospedador. Sin embargo, otros elementosgenticos resultan a veces movilizados duran-te la conjugacin, como pueden ser otrosplsmidos o grandes bloques del cromosomadel hospedador. La conjugacin requiere unaclula donadora, que contiene un tipo parti-cular de plsmido conjugativo, y una clulareceptora que carece de l. El contacto serealiza a travs del filamento o pelo sexual,que permite el apareamiento especfico y queposeen slo las clulas donadoras. Constitu-ye un puente de conjugacin a travs delcual pasa el ADN.

3 La clonacin molecular

El desarrollo de la tecnologa del ADNrecombinante y la clonacin molecular han

44 GMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

aportado sofisticados procedimientos quepermiten el aislamiento, purificacin yreplicacin de fragmentos especficos deADN. La finalidad de la clonacin moleculares aislar gran cantidad de genes especficos,en forma pura. El procedimiento implica esen-cialmente dos etapas (Fig 1):

Creacin del ADN recombinante, queconsta de dos pasos:

1) Aislamiento del ADN de partida. Estepuede ser ADN genmico, ADN sintetizadoa partir del ARNm por transcripcin reversa(ADNc por copia), ADN amplificado porla reaccin en cadena de la polimerasa o sin-tetizado in vitro. Si se parte de ADNgenmico, generalmente se corta conenzimas de restriccin para obtener los frag-mentos a clonar.

2) Unin de los fragmentos de ADN a unvector de clonacin utilizando una ligasa deADN. Un vector es una molcula de ADN quevehiculizar al fragmento de inters. Losvectores de clonacin estn diseados deforma tal que permiten la recombinacin deADN forneo en un sitio de restriccin delvector, sin afectar su replicacin. A fin de se-leccionar las clulas que incorporaron el vector,el mismo lleva genes marcadores (por ejem-plo un gen de resistencia a antibiticos).

Introduccin del ADN en una clulahospedadora donde se replicar (amplifi-cacin): ste es realmente el verdadero even-to de clonacin, en el cual el ADNrecombinante es multiplicado para producirvarias copias idnticas. Involucra tres pasos:

1) Introduccin y mantenimiento delADN recombinante en un organismohospedador. La molcula de ADNrecombinante se introduce en el organismohospedador, que puede ser procariota (bac-terias) o eucariota (levaduras, clulas de ma-mferos cultivadas). En el caso de la utiliza-cin de sistemas bacterianos, la introduccinse realiza por los procesos naturales de lagentica microbiana (transformacin,transduccin, conjugacin) o modificacionesespecficas de los mismos. Tambin se utilizaampliamente la introduccin del ADN me-diante electroporacin (descargas elctricasque crean poros en la membrana celular per-mitiendo la introduccin del ADN).

2) Deteccin y purificacin del clon desea-do. La transferencia del ADN al hospedador

a menudo genera un grupo de clones queportan el vector. A fin de separar las clulasque incorporaron el plsmido de las que nolo hicieron se inoculan las clulas en un me-dio slido (agarificado) que contiene el anti-bitico al cual son resistentes las clulas queposeen el vector. Slo stas sobrevivirn. Lue-go deber buscarse especficamente aquellasclulas que poseen el fragmento de inters.Para ello puede utilizarse la reaccin en ca-dena de la polimerasa (PCR) o la hibrida-cin molecular con una sonda especfica.

3) Crecimiento y amplificacin de las c-lulas hospedadoras que incorporaron el ADNrecombinante deseado para su aislamiento,estudio, etctera

ADN forneoa insertar

Ligacin

Vectorplasmdico Gen de resistencia

a antibitico

Molcula de ADNrecombinante

Introduccin en laclula hospedadora

Seleccin de las clulas que contienen molculas de ADNrecombinante por crecimiento en presencia de antibitico

Figura 1: Pasos bsicos en la clonacin de unfragmento de ADN..... En primer lugar el ADN a clonar yel vector (plsmido) se cortan con la misma enzima derestriccin. Luego se ponen en contacto en presencia deuna ligasa para obtener una molcula de ADNrecombinante que se introduce en bacterias quemultiplicarn el plsmido junto con el fragmento deinters (Modificado de Watson y col., 1992).


4 Herramientas y procedimientosimplicados.

Endonucleasas de restriccinLa habilidad para clonar cualquier gen o

secuencia de ADN de inters, depende, engran medida, de un tipo especial de enzimasdenominadas endonucleasas de restriccin,que son enzimas que cortan la molcula deADN en sitios especficos denominados sitiosde restriccin. Estas enzimas reconocen se-cuencias especficas de 4 a 8 bases. Las di-ferentes endonucleasas de restriccin sonproducidas por distintos microorganismos,para los cuales constituyen un mecanismo dedefensa contra el ataque de fagos. Cuandoel ADN de un fago ingresa en la clulabacteriana, sta lo degrada gracias a su ba-tera de enzimas de restriccin. Para prote-ger su propio ADN, las bacterias contienenenzimas (metilasas) que se encargan demodificar (metilar) ciertas bases en los sitiosque reconocen sus propias enzimas de res-triccin, de manera que ya no pueden reco-nocer dichos sitios de clivaje. La metilacinocurre rpidamente despus de la replicacin,catalizada por metilasas producidas por elmicroorganismo.

Las enzimas de restriccin se denominanutilizando la primera letra del gnero y lasdos primeras letras de la especie que la pro-duce, seguidas por un nmero que indica elorden en que han sido identificadas lasenzimas correspondientes a la misma espe-cie (Tabla 1). Una interesante caractersticade las enzimas de restriccin es que comn-

mente reconocen secuencias de ADN que sonpalndromes (conjunto de caracteres que selee de igual manera de derecha a izquierdaque de izquierda a derecha). Adems produ-cen cortes en las dos cadenas. Muchasenzimas de restriccin estn compuestas dedos unidades idnticas, cada una de las cua-les reconoce y corta una de las cadenas.Como las secuencias reconocidas son relati-vamente cortas y frecuentemente palindr-micas, tales enzimas siempre hacen cortes enADN bicatenarios y tales cortes no estn su-jetos a correccin por enzimas de reparacin.Gracias a este mecanismo pueden destruir elADN extrao.

Ciertas enzimas como EcoRI producencortes escalonados que crean colas cortas decuatro bases de cadena simple en cada ex-tremo del fragmento. Estas colas tienden aasociarse a una cadena complementaria porapareamiento de bases, por eso se denomi-nan extremos cohesivos o pegajosos(sticky ends) (Fig. 2 A). Los extremoscohesivos pueden unirse permanentementea secuencias complementarias de otro frag-mento con colas producidas de la mismamanera (corte con la misma enzima), adicio-nando la enzima ADN ligasa, que cataliza laformacin de nuevos puentes fosfodisteresy las apropiadas condiciones de renaturaliza-cin. Esta cohesividad permite unir fragmen-tos de ADN no homlogos, una caractersti-ca de relevancia para la creacin del ADNrecombinante.

Existe otro tipo de enzimas de restriccin,como HindII, que cortan el ADN en el centro

Organismo Designacin Secuencia Nota

Bacillus subtilis BsuRI 5..GGCC..33..CCGG..5

Genera extremos romos

Escherichia coli EcoRI 5..GAATTC..33..CTTAAG..5

Genera extremoscohesivos

Escherichia coli EcoRII 5..CCAGG..33..GGTCC..5

No palindrmica

Escherichia coli EcoRV 5..GATATC..33..CTATAG..5

Genera extremos romos

Haemophilusinfluenzae

HindII 5..GTPyPuAC..33..CAPuPyTG..5

Pu: cualquier purinaPy: cualquier pirimidina

Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restriccin de diferentes endonucleasas de restriccin


de la secuencia de reconocimiento (en el mis-mo punto, en ambas cadenas) produciendoextremos romos (blunt-ends), es decir quelas bases estn apareadas en sus extremos,y por lo tanto no presentan tendencia paraunirse con las bases complementarias (Fig. 2B). Esto puede solucionarse adicionando ex-tremos cohesivos por medio de la transfera-sa terminal, enzima que permite adicionarcolas de poliA o poliT, que se comporta-rn como extremos cohesivos (Fig. 2 C).

Vectores de clonacinComo se mencionara ms arriba, un

vector es una molcula de ADN quevehiculizar al fragmento de inters y permi-tir su amplificacin. Los vectores declonacin ms utilizados derivan del genomaviral o de plsmidos bacterianos. Un vectorde clonacin tiene tres componentes esen-ciales:

1. Un origen de replicacin2. Un gen marcador fcilmente seleccio-

nable3. Al menos un sitio nico de restriccin

Los vectores de clonacin de ltima ge-neracin son muy prcticos y sencillos demanejar. Incluyen un sitio mltiple declonacin o sitio de restriccin mltiple(polylinker), que es un segmento corto deADN con muchos sitios de restriccin diferen-tes, cada uno de ellos nico para el vector(Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte delmarco abierto de lectura (ORF) de un genresponsable de alguna caractersticafenotpica, por lo que resulta sencillo confir-mar si tras la restriccin y ligado se ha inser-tado efectivamente un fragmento de ADN,ya que la inclusin de este interrumpe la se-cuencia del vector, lo cual redunda en la pr-dida de funcionalidad del gen medianteinactivacin por insercin.

Los vectores pueden clasificarse de la si-guiente manera:

A) Plsmidos: son molculas de ADN cir-cular, de doble cadena, extracromosmicas,presentes en las bacterias, que poseen pro-piedades muy tiles como vectores de clona-cin:

Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restriccin..... a. Corte en secuencias palindrmicasoriginando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de laenzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporacin de extremos cohesivos a un fragmento deextremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992).


1. Pequeo tamao que permite mayorfacilidad de aislamiento y manipulacin.

2. Son circulares, lo que hace que el ADNsea ms estable durante su aislamiento qu-mico.

3. Su replicacin transcurre independien-temente del ADN nuclear en la clula bacte-riana.

4. Existen mltiples copias en la clula,dependiendo del plsmido y de la especiehospedadora, puede haber de varias a nu-merosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copiasde pBR322 por clula).

5. La presencia de genes de resistenciaa los antibiticos que actan como marca-dores seleccionables facilita la deteccin yseleccin de los clones que los contienen.

6. El tamao de los insertos que se pue-den clonar puede ser considerable; sin em-bargo, si son mayores de 10 kb, el plsmidose hace generalmente inestable.

Figura 3: Vectores de clonacin. a. Sitio de restriccinmltiple: corto segmento de ADN con varios sitios derestriccin, cada uno de ellos nico para el vector. b.Plsmido pBR322 con los sitios de restriccin de BamHIy PstI dentro de los genes marcadores (genes deresistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente).(Modificado de Watson y col., 1992).

Aunque en el ambiente natural losplsmidos conjugativos generalmente setransfieren por contacto clula a clula, losplsmidos vectores de clonacin generalmen-te han sido modificados a fin de evitar sutransferencia por conjugacin y as lograr sucontencin biolgica. Sin embargo, en ellaboratorio es posible realizar la transferen-cia a la clula hospedadora por transforma-cin, utilizando choque de calor, o porelectroporacin.

Los primeros plsmidos utilizados comovectores de clonacin existan en forma na-tural. El plsmido pBR322 constituye una ge-neracin posterior de vectores construidos invitro (Fig 3 B). En este plsmido, el sitio derestriccin de BamHI est dentro del gen deresistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstIest dentro del gen de resistencia a laampicilina. Si se inserta un trozo de un ADNen uno de estos sitios, la resistencia al anti-bitico conferida por el gen que contieneeste sitio se pierde (inactivacin por insercin).Por tanto, cuando pBR322 es digerido conBamHI y se liga a un ADN, y luego se aslanlos clones transformados, aquellostransformantes que posean resistencia a latetraciclina y ampicilina no portan ningnADN clonado. Aquellas clulas que continansiendo resistentes a la ampicilina pero sensi-bles a la tetraciclina, contienen el plsmidocon el fragmento del ADN clonado. Como laresistencia a la ampicilina y a la tetraciclinapueden determinarse independientementeen placas con agar, resulta fcil aislar bacte-rias que contengan los clones deseados y eli-minar las clulas que no los contengan.

B) Bacterifagos o fagos:Fago : tiene un mapa gentico comple-

jo. Se conoce la secuencia completa de sus48.502 pares de nucletidos y la funcin desus genes. El tercio central del cromosomacontiene genes que son requeridos para lalisogenia (estado integrado) pero no para elciclo ltico (ciclo productivo de nuevas part-culas virales). Esa parte central (de aproxima-damente 15 kb) del cromosoma puede sercortada con enzimas de restriccin y subs-tituida por un fragmento de ADN forneo(Fig. 4 A). La molcula resultante de ADNrecombinante puede ser empaquetada enlas cabezas del fago in vitro. Las partculas


del fago pueden inyectar el ADNrecombinante en E. coli, que se replica pro-duciendo colonias bacterianas que contienenlos fragmentos a clonar.

El fago l silvestre no es indicado comovector de clonacin porque tiene demasia-dos sitios para enzimas de restriccin. Paraobviar esta dificultad se han construdo fagosl modificados (Charon), en los cuales los si-tios de restriccin no deseados han sido al-terados de manera tal que la correspondien-te enzima no los reconozca.

Es un vector de clonacin particularmen-te til porque:

1. Se conoce bien su estructura, secuen-cia y funcionamiento

2. Puede insertar mayor cantidad de ADNque la mayora de los plsmidos (entre 10 y20 kb)

3. El ADN puede ser eficientemente em-paquetado in vitro dentro de las partculasdel fago

4. Las partculas del fago son mucho mseficientes en la infeccin de las clulashospedadoras (transfeccin) que la trans-formacin.

Fago M13: es un fago filamentoso quecontiene ADN monocatenario y se replica sinmatar a su hospedador. Para poder utilizarlocomo vector de clonacin es necesario dis-poner de una forma bicatenaria, ya que lasenzimas de restriccin slo trabajan sobreADN de doble cadena. El ADN bicatenariode M13 puede obtenerse de clulas infecta-das, donde se encuentra en formareplicativa bicatenaria. La mayor parte delgenoma del tipo silvestre contiene informa-cin gentica esencial para la replicacin. Exis-te, sin embargo, una pequea regin llama-da secuencia intergnica que puede ser uti-lizada como sitio de clonacin. Es posibleclonar ADN de longitudes variables (hasta5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADNmonocatenario de M13 y de sus vectoresderivados ha sido extremadamente til parasecuenciar ADN.

Tanto en el fago l como en M13 se hainsertado un fragmento funcional de lacZ, elgen de E. coli que codifica para la enzima -galactosidasa (-gal), que es utilizado comogen marcador. En el inicio de este gen se hainsertado un sitio mltiple de clonacin. Porlo tanto, los fragmentos de ADN clonadosen el polylinker interrumpen el gen lacZ y

anulan la actividad de la -galactosidasa.Cuando esta enzima hidroliza un compues-to qumico denominado X-gal, se libera uncolorante azul relativamente insoluble. El X-gal se incorpora al medio de cultivo en placade Petri, donde crecern las clulashospedadoras del ADN recombinante. Si elADN clonado se insert en el polylinker ydesactiv la -galactosidasa, no se produci-r pigmento azul y las clulas formarn co-lonias que se vern blancas en la placa dePetri. En caso contrario, las colonias de lasclulas hospedadoras se vern de color azul.

Figura 4: Vectores de clonacin..... a. Utilizacin delfago. 1. Dos sitios de restriccin EcoRI en el ADN delfago. 2. Regin central no esencial del fago 3. El ADNforneo puede reemplazar al segmento no esencial delADN del fago 4. Unin con ADN ligasa, se eligen lascondiciones para que el ADN hbrido tenga la longitudadecuada para ser empaquetada dentro de la partculadel fago y 5. Empaquetamiento del ADN hbridoaadiendo extractos celulares que contengan laspartculas de la cabeza y cola para permitir la formacinde partculas viables del fago. b. Cromosoma artificialde levadura (YAC). ARS: origen de replicacin, CEN:centrmero, TEL: telmeros, URA. gen marcadorseleccionable par el desarrollo en medio con uracilo.Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomasartificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith etal., 2000).

a

C


C) Csmidos:Son vectores hbridos, que combinan las

caractersticas ventajosas de los plsmidosbacterianos y del fago . Cos proviene desitio cohesivo (cohesive site), en referen-cia a las secuencias terminales de simple ca-dena de 12 bases complementarias en elcromosoma de maduro. El sitio cos es re-conocido por el sistema de empaque-tamiento de ADN de , que hace cortes es-calonados que originan los extremoscohesivos complementarios en el cromosomamaduro del fago. Poseen la habilidad delplsmido para replicarse autnomamente enlas clulas de E. coli y la capacidad deempaquetamiento in vitro del cromosomade . Contienen el origen de replicacin y losgenes de resistencia a los antibiticos de suplsmido parental. La principal ventaja de loscsmidos como vectores es su habilidad parainsertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.

D) Fsmidos (fagmidos):Son vectores que combinan las caracte-

rsticas de un fago filamentoso (M13) y unplsmido (pBR323) y contienen tanto el ori-gen de replicacin del fago como delplsmido. Normalmente la replicacin depen-de del plsmido, pero cuando una clula quecontiene un fsmido se infecta con un fagode tipo silvestre, el origen del fago es respon-sable de la replicacin y se generan copias

monocatenarias. Este ADN monocatenarioes empaquetado en viriones y puede aislar-se fcilmente y ser utilizado para secuenciar.Habitualmente, los fsmidos pueden trans-portar de forma estable un fragmento deADN clonado mayor que un vector tpicoderivado de M13.

E) Cromosomas artificiales:Estos vectores se desarrollaron con el

objetivo de clonar grandes segmentos decromosomas eucariticos. En la preparacinde mapas fsicos de genomas se utilizanvectores como los csmidos, los YAC(cromosomas artificiales de levaduras), losBAC (cromosomas artificiales de bacterias) ylos PAC (cromosomas artificiales basados enel fago P1).

Los YAC son minicromosomas de leva-dura creados por ingeniera gentica quepueden contener insertos de ADN de 200 a500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen dereplicacin y un centrmero de levadura, dostelmeros en los extremos del cromosoma,un marcador seleccionable y un sitio mlti-ple de clonacin.

Los BAC se basan en el plsmido F de7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BACy los PAC aceptan fragmentos menores quelos YAC tienen algunas ventajas:

Figura 5: Mtodo de hibridacin de Southern. a. Inclusin del ADN en el gel de agarosa. b. las molculas de ADNmigran a travs del gel dependiendo de su tamao y forma, c. transferencia de las molculas de ADN del gel a unamembrana por capilaridad (S. Solucin tampn, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P:papel de filtro y peso), d. incorporacin de la sonda e hibridacin con las molculas de ADN, f: deteccin porautorradiografa, contacto de la membrana con el filme autorradiogrfico, g: revelado de la autorradiografa,observacin de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).


1. Son menos complejos y por lo tantoms fciles de construir. Pueden amplificarseen bacterias y manipularse con la tecnologabsica de los plsmidos bacterianos.

2. Contienen menor cantidad de insertoshbridos (insertos compuestos por dos o msfragmentos no contiguos en el genoma) quelos YAC. Estos insertos hbridos pueden en-torpecer los intentos de ordenar los clones

Por estos motivos los BAC han reempla-zado a los YAC como vectores en la construc-cin de mapas fsicos de cromosomas ente-ros.

Estos vectores simplifican mucho el pro-ceso de secuenciacin, ya que an organis-mos simples como el nemtodoCaenorhabditis elegans poseen enormescantidades de ADN (100 Mb). En este casose necesitaran 2.500 csmidos para conte-ner el genoma completo (el inserto prome-dio de un csmido es de 40 kb). Los YACpueden aceptar 1Mb, por lo cual el procesose simplifica.

5 Anlisis molecular de ADN, ARN yprotenas: hibridacin.

La hibridacin es la construccin artifi-cial de un cido nucleico bicatenario porapareamiento (emparejamiento) de basescomplementarias de dos cidos nucleicosmonocatenarios. Para que exista la formacinde hbridos estables debe haber un alto gra-do de complementaridad. Se define formal-mente como sonda (probe) a un fragmen-to determinado de ARN o ADN marcadoqumica o radiactivamente, utilizado para lo-calizar determinadas secuencias de cidosnucleicos mediante hibridacin.

Anlisis de ADN por hibridacionesSouthern Blot

La electroforesis en gel es una podero-sa herramienta para separar macromolculasde diferentes tamaos y cargas. Las molcu-las de ADN tienen esencialmente una cargaconstante por unidad de masa, por lo tan-to se pueden separar en geles de agarosa oacrilamida, casi completamente, sobre la basede su tamao o conformacin. Los geles deagarosa o acrilamida actan como tamicesmoleculares, retardando el pasaje de lasmolculas ms grandes en relacin con lasms pequeas. Los geles de agarosa actan

como mejores tamices para las molculas msgrandes, mientras que los de acrilamida se-paran mejor las molculas pequeas. Los pro-cedimientos utilizados, para separar cidosnucleicos y protenas tienen el mismo princi-pio, pero involucran algunas diferencias detcnicas debidas a las caractersticas particu-lares de cada clase de molculas.

En 1975 E. M. Southern, public un nue-vo procedimiento que permiti a los investi-gadores ubicar los genes y otras secuenciasde ADN sobre fragmentos de restriccinseparados por electroforesis en gel. La prin-cipal caracterstica de esta tcnica es la trans-ferencia de las molculas de ADN que hansido separadas por electroforesis en gel a unamembrana de nylon o nitrocelulosa. Estatransferencia se denomina Southern Blot, enhonor al cientfico que desarroll la tcnica(Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnatura-lizado (abierto en sus dos cadenas), sea an-tes o durante la transferencia, ubicando elgel en una solucin alcalina. Una vez comple-tada la transferencia, el ADN es inmovilizadosobre la membrana por exposicin a eleva-da temperatura o a radiacin UV. Una son-da de ADN conteniendo la secuencia de in-ters es entonces incubada con el ADN in-movilizado. La sonda slo va a hibridar conmolculas de ADN que contienen la secuen-cia de nucletidos complementaria a su se-cuencia. El excedente de sonda no hibridadase elimina mediante repetidos lavados de lamembrana. Las sondas pueden marcarse pordiferentes mtodos: con elementos radio-activos, por mtodos qumicos que produ-cen color o luminiscencia, etc. Luego de lahibridacin, la membrana se somete a dife-rentes procedimientos para poner en eviden-cia la sonda, de acuerdo al mtodo con elque haya sido marcada.

Anlisis de ARN por transferencia ehibridacin: Northern Blot

De manera similar al tratamiento realiza-do con las molculas de ADN, las molculasde ARN tambin pueden ser separadas porelectroforesis en geles de agarosa, transferi-das a membranas y analizadas. La transfe-rencia de ARN se denomina Northern blot,en reconocimiento al hecho de que el proce-dimiento es la imagen de espejo de la tcni-ca Southern blot.

Ambos procedimientos son esencialmen-


Figura 6: Reaccin en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva latemperatura de la reaccin para separar las hebras de ADN (1) y a continuacin la temperatura baja nuevamente, loque permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entoncesse ensamblan, actuando como lmites de la regin de la molcula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva latemperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nuevacomplementaria (4). Despus de varios ciclos se obtienen mltiples copias del fragmento en cuestin. b) La PCR esuna reaccin donde el nmero de copias del gen de inters crece exponencialmente. c) Verificacin de un productode PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases(bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 fall la amplificacin y en la calle 5 se hanformado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en ms de un sitio en el genoma.


te idnticos. Sin embargo, las molculas deARN son muy sensibles a la degradacin porARNasas. Por lo tanto, se debe tener muchaprecaucin para evitar la contaminacin delos materiales con estas enzimas. Adems, lamayora de las molculas de ARN contienenestructuras secundarias (producidas porapareamiento complementario intracade-nas), por lo tanto deben mantenerse des-naturalizadas durante la electroforesis parapoder separarlas sobre la base de su tama-o. La desnaturalizacin se provoca incorpo-rando formaldehdo u otro qumicodesnaturalizante a la solucin tampn (bu-ffer) utilizada en la electroforesis. Despusde la transferencia a la membrana apropia-da, las molculas de ARN pueden hibridar consondas de ADN o ARN.

Anlisis de protenas por transferen-cia e inmunodeteccin o Western Blot

La electroforesis en gel de poliacrilamidaes una herramienta muy importante para laseparacin y caracterizacin de protenas.Debido a que muchas de las protenas estncompuestas por dos o ms subunidades, lospolipptidos individuales son separados porelectroforesis en presencia del detergentedodecil sulfato de sodio (SDS), que desna-turaliza las protenas. Los polipptidos sepa-rados por electroforesis tambin pueden sertransferidos del gel a una membrana de ni-trocelulosa y pueden ser detectados utilizan-do anticuerpos especficos. Esta transferen-cia de protenas se denomina Westernblotting y se realiza utilizando una corrienteelctrica para trasladar las protenas del gel ala superficie de la membrana. Despus de latransferencia, la protena de inters es iden-tificada colocando la membrana con las pro-tenas inmovilizadas en una solucin que con-tiene un anticuerpo contra esa protena. Elanticuerpo est conjugado (marcado) ya seacon istopos radioactivos, que permiten ladeteccin por autorradiografa, o conenzimas que producen un producto visiblecuando se adiciona el sustrato correspondien-te.

6 La reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)

La PCR es una tecnologa poderosa queinvolucra la sntesis enzimtica in vitro de

millones de copias de un segmento espec-fico de ADN. La reaccin se basa en la hibri-dacin y extensin de un par de oligonu-cletidos, sintetizados artificialmente, utiliza-dos como iniciadores o cebadores (primers)que delimitan una secuencia de ADN de do-ble cadena que se desea amplificar.

Un ciclo de PCR comprende tres etapas(Fig. 6): desnaturalizacin de la doble ca-dena, unin de una secuencia de ADN (pri-mer) a la hebra simple y replicacin delADN a partir del primer. La doble cadenade ADN se desnaturaliza por elevacin de latemperatura a 92-95C. Luego la tempera-tura se baja rpidamente a 35-60C, depen-diendo del tamao y secuencia del oligonu-clotido utilizado, permitiendo la hibridacinADN-ADN de cada primer con las secuenciascomplementarias que flanquean la reginobjetivo. Luego, se eleva la temperatura a72 C para que la Taq polimerasa (una ADNpolimerasa termoresistente aislada deThermus aquaticus, bacteria que vive enfuentes termales) realice la replicacin a par-tir de cada extremo 3 de los primers. Esteciclo es repetido por algunas decenas de ve-ces y, como el producto de cadapolimerizacin sirve como molde para el si-guiente, cada ciclo duplica la cantidad deproducto del anterior. El resultado de la re-accin es un fragmento de ADN de doblecadena, cuyos extremos corresponden a losextremos 5 de los primers y su tamao a ladistancia entre los mismos. A pesar de quese forman molculas ms largas a partir delmolde original en cada ciclo, se acumulan soloa una tasa lineal y no contribuyen signifi-cativamente a la masa final de secuencia blan-co.

Despus de apenas 20 ciclos se logra msde un milln de veces la cantidad inicial dela secuencia de inters. Esta escala de ampli-ficacin permite, por lo tanto, iniciar el pro-ceso con cantidades mnimas de ADN (delorden de pico o nanogramos) y terminar lareaccin con grandes cantidades de una se-cuencia de inters. La versatilidad de estareaccin es enorme y la combinacin de laPCR y la secuenciacin constituye una pode-rosa herramienta para el anlisis de genes.

La tecnologa de PCR es de suma utilidadpara amplificar ADN a partir de fragmentosclonados en distintos vectores. Solo se nece-


sita un par de iniciadores complementarios alos sitios del vector que flanquean el fragmen-to para amplificar cualquier fragmento inde-pendientemente de su secuencia. Puedeamplificarse ADN de material embebido enparafina por varios aos, de material momi-ficado, de restos fsiles, etc. Se utiliza paradetectar enfermedades genticas, determi-nar el sexo en embriones humanos, paraclonar genes, para mutagnesis in vitro y paramapeo y secuenciacin de genomas, entreotras aplicaciones.

RT-PCRLa reaccin de PCR en unin con la trans-

cripcin reversa (RT-PCR) puede ser utiliza-da para el estudio de ARNm casi a nivel deuna clula individual. Esta tcnica puede utili-zarse para determinar la presencia o ausen-cia de un transcripto, para estimar el nivelde su expresin y para el clonado de ADNcsin la necesidad de construir una genoteca.Consiste en la sntesis de una cadena de ADNa partir de ARNm por medio de latranscriptasa reversa (enzima extrada devirus tumorales cuyo material gentico esARN), que utiliza ARN como molde para sin-tetizar una hebra de ADN. La cadena com-plementaria se sintetiza por PCR .Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten te-ner cantidades apropiadas del ADNc paradiversas manipulaciones genticas.

PCR cuantitativaLa clave en la PCR cuantitativa es la posi-

bilidad de detectar el nivel de amplificacinde una secuencia de inters, con el objetode estimar la cantidad de esa secuencia en lamuestra original. Para llevar a cabo esta de-teccin existen varios mtodos pero casi to-dos basados en la utilizacin de otro frag-mento de ADN (sonda) complementario auna parte intermedia del ADN que se quiereamplificar. Esta sonda lleva adherida unamolcula fluorescente y otra molcula queinhibe esta fluorescencia (quencher), detal forma que slo cuando la sonda es des-plazada de su sitio por accin de la ADNpolimerasa la molcula fluorescente se libe-ra de la accin del quencher y emite fluo-rescencia al ser iluminada con un lser. Lafluorescencia detectada durante cada ciclode la PCR ser proporcional a la cantidadde ADN que se est amplificando. En gene-

ral para que sea vlida esta tcnica requiererealizar en paralelo una curva patrn en lasmismas condiciones para conocer la cantidadtotal de ADN que se est amplificando. Exis-ten varios tipos de PCR cuantitativa. La msmoderna y sofisticada es la llamada PCR entiempo real.

PCR en tiempo realLa PCR en tiempo real es una tcnica que

ha ganado mucha importancia en los ltimosaos debido a que ofrece la posibilidad decuantificar el nmero de copias de untransgen incorporadas en un genoma.Como se explicara ms arriba, se basa en ladeteccin de un informador fluorescentecuya seal aumenta en proporcin directacon la cantidad de producto de PCR en lareaccin. Se emplea un ciclador trmico quetiene acoplado un sistema de deteccin ca-paz de captar y cuantificar la seal emitidapor el informador al final de cada ciclo. Sepueden utilizar diferentes reactivosfluorescentes como agentes intercalantes(SYBR green) que se unen a la doble cade-na de ADN dando un incremento de la fluo-rescencia a medida que aumenta la cantidaddel producto de PCR. Tambin se puedenemplear sondas que tienen unidas unfotocromo informador y un fotocromoquencher (TaqMan). Cuando ambosfotocromos estn unidos a la sonda, el infor-mador no emite seal, pero cuando stahibrida con la secuencia de inters, durantela reaccin de PCR, la enzima Taq polimerasa,mediante su actividad de exonucleasa, clivaal fotocromo informador, liberndolo delresto de la sonda y permitiendo la emisinde una seal fluorescente. Se monitorea estaseal que se va acumulando en los sucesivosciclos de PCR. De este modo, es posible es-timar la cantidad de la secuencia originalexpresada en nmero de copias porgenoma o en unidad de masa.

En la Parte IX, Captulo 4, se detalla mseste punto y se aplica esta tcnica para ladeteccin de organismos genticamentemodificados (OGM).

7 Genotecas

Una genoteca (gene library) es unacoleccin de fragmentos de ADN clonadosque representan en su conjunto el ADN to-


tal de un organismo de inters o bien elADNc, que representa el conjunto de genesque se estn expresando en un rgano otejido determinado o bajo una situacin par-ticular o momento de crecimiento o desarro-llo. En el primer caso hablamos de unagenoteca genmica, donde se encuentrantodas las secuencias que se expresan y no seexpresan en el organismo y en el segundode una genoteca de ADNc, donde se en-cuentran slo las secuencias expresadas.

Estas genotecas carecen de un catlogoa travs del cual se pueda saber cul es el clonque contiene una secuencia de inters. Porello es necesario realizar un relevamiento detodas las colonias utilizando una sonda conla secuencia de cido nucleico que tenga quesea complementaria a la secuencia o genbuscados. Parte de esta secuencia puede serconocida o puede deducirse de la secuenciade aminocidos de la protena purificada.Alternativamente, puede buscarse la prote-na producida por un gen clonado usandoanticuerpos contra la protena o a travs deun anlisis funcional.

Una de las principales dificultades en elclonado de ADN genmico es que algunassecuencias estn representadas una sola vezen el genoma y es difcil hallarlas. Para obviaresta dificultad puede clonarse directamenteel ADNc, ya que el nmero de copias delARNm en el tejido es ms elevado. El proble-ma se plantea cuando no se sabe en qu cir-cunstancias o en qu tejido se expresa un genen particular. Pero existen varias formas dedeterminarlo. Actualmente es posible clonarun ADNc a partir de mensajeros poco abun-dantes en la clula, con concentraciones de1 a 2 molculas por clula.

Genotecas de ADNcEl primer paso en la construccin de una

genoteca de ADNc consiste en el aislamien-to del ARN del cual es posible separar elARNm tomando ventaja de la caractersticacola de poliadeninas que posee en su extre-mo 3. Para ello se empaqueta en una co-lumna de celulosa a la cual se unenoligonucletidos compuestos slo pordesoxitimina oligo(dT), a travs de la cualpasa el ARN quedando el mensajero unido ala timina a travs de la cola de poliA. Este esluego eluido de la columna utilizando unasolucin tampn adecuada.

Estas colas de poliA tambin son utiliza-das en el prximo paso de clonado. La reac-cin consiste en poner en contacto el ARNmaislado con oligo(dT) de 12 a 20desoxitiminas que actan como cebadores oprimers para la transcriptasa reversa. El pro-ducto de la reaccin es un hbrido ARN-ADN.El problema que tiene esta tcnica es que siel ADNc es muy largo, al comenzar en el ex-tremo 3, muchas veces no se llega al extre-mo 5. Para salvar esta dificultad existe otratcnica donde se utilizan primers al azar. Es-tos constan de 6 a 10 nucletidos de longi-tud y estn confeccionados de manera derepresentar muchas secuencias diferentes,por lo que la reaccin comienza a partir demuchos sitios diferentes, no slo del extre-mo 3. Por cualquiera de los dos mtodos seobtiene un hbrido ARN-ADN, a partir del cualse obtienen molculas de ADN de doble ca-dena que puede clonarse en el vector apro-piado.

El primer mtodo desarrollado para ob-tener la segunda cadena tomaba ventaja deuna vuelta o giro que da la hebra recinsintetizada, como un efecto de cambio derumbo de la transcriptasa reversa al llegar alfinal de la cadena de ARN. Este artefacto pro-vee un cebador adecuado para la sntesis dela segunda cadena de ADN y puede eliminar-se una vez obtenida la segunda cadena, conuna nucleasa S1, perdindose parte de lasecuencia correspondiente al extremo 5 delmensajero.

Existe una segunda tcnica, que presen-ta dos ventajas sobre la anterior. Una es quegenera molculas de ADNc ms largas y lasegunda es que contiene prcticamente todala secuencia correspondiente al extremo 5.Se basa en la utilizacin de la enzima RNasaH,que reconoce molculas hbridas ARN-ADN ydigiere la cadena de ARN dejando trozospequeos que permanecen unidos a la pri-mera cadena del ADNc y sirven como primerspara la ADN polimerasa I, que usa el ADNcoriginal como molde para sintetizar la hebracomplementaria de ADN. Slo queda un pe-queo segmento de ARN en el extremo 5.La segunda cadena de ADN tiene algunos sec-tores no unidos que son sellados por unaligasa de ADN.

Estas molculas de ADNc de doble cade-na estn listas ahora para ser insertadas en


un vector, que puede ser unplsmido o un derivado delfago l. Para ello se utiliza latransferasa terminal, queadiciona colas de poliA opoliT, o se agreganadaptadores, que son sitiosartificiales de reconoci-miento de alguna enzima derestriccin que se unen a losextremos de la secuencia. Setrata de oligonucletidos ar-tificiales (8-12 bp) que seunen al fragmento utilizan-do una ligasa de ADN y soncortados con la enzima derestriccin apropiada (Fig. 7a). Ambos procedimientossirven para generar extremoscohesivos a fin de unir el frag-mento al vector, que poseeextremos cohesivos cortadospor la misma enzima.

Los plsmidos son intro-ducidos en bacterias portransformacin (choque tr-mico o electrofusin), y se se-leccionan por la caractersti-ca del gen marcador delplsmido. Si se trata defagos, los vectores son em-paquetados in vitro paraformar partculas vricas, queintroducirn su ADN en elhospedador apropiado porinfeccin de un csped debacterias crecido sobre la su-perficie de una placa de agar(Fig. 7 a). Si bien los vectoresplasmdicos son ms fcilesde manipular, las genotecasconstruidas en los fagos po-

Figura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadenasimple complementarias a los sitios de restriccin del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con unaenzima de restriccin, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNclos adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa,que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restriccin, a fin de protegerlo de la accin de la enzima. Losadaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADNdel fago, cortado con la misma enzima. Se genera as una serie de molculas recombinantes dispuestas en tandem,flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partculas infecciosas del fago, quese utilizarn para infectar un csped de bacterias. Esto se visualizar como placas o calvas. Cada placa surge de unamolcula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construda la genoteca puedelocalizarse un gen en la misma por hibridacin con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson etal., 1992).


seen fragmentos de mayor tamao.Como resultado del cultivo en placa

(plaqueo) de la genoteca, se obtienen cien-tos de miles a un milln de placas de fagos(zonas claras o de lisis resultado de la pro-duccin de particulas vricas) o, en el caso devectores plasmdicos, colonias bacterianas,cada una conteniendo un fragmentoclonado, distribuidas sobre la placa de agar.A fin de realizar la bsqueda de un gen parti-cular (screening), la genoteca es replicadaen membranas de nylon o nitrocelulosa, demanera tal que el patrn de placas en la cajaoriginal se vea exactamente reproducido enla membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B).

Bsqueda del gen clonado: Eleccin dela sonda

La bsqueda se lleva a cabo por hibrida-cin con una sonda de cido nucleico, locual requiere un conocimiento previo de lasecuencia de inters. En algunos casos, don-de parte del gen ha sido clonado, este seutiliza para buscar las partes faltantes. Si seusa una sonda donde la homologa es com-pleta, el screening puede realizarse en con-diciones de alta rigurosidad (es decir, conlavados ms fuertes, temperatura elevada yconcentracin salina baja, que tienden a des-pegar lo que se ha unido inespecficamente).Si la sonda no es completamente homlogael screening deber realizarse a menorestemperaturas y utilizando concentracionessalinas ms elevadas en los lavados. Si no setiene conocimiento previo de la secuenciapuede construirse una sonda a partir de lasecuencia de aminocidos de la protena.Cuando se utiliza esta estrategia, el tamaomnimo de la sonda debe ser de 15 a 16nucletidos (que permite encontrar secuen-cias nicas en genotecas de ADNceucariticos. Generalmente se utilizan sondasde 17 a 20 nucletidos (correspondientes a6 aminocidos contiguos). Otra consideracina tener en cuenta cuando se construye lasonda es que existe ms de un codn otriplete para definir la mayora de losaminocidos (es lo que se conoce como ladegeneracin del cdigo gentico), por loque un aminocido puede estar especifica-do por hasta 6 codones diferentes. Por ello,estas sondas oligonucleotdicas estn consti-tuidas por una mezcla de todas las combi-naciones posibles. Una de ellas corresponde-

r a la secuencia correcta del gen buscado. Elproblema de esta estrategia es el elevadonmero de falsos positivos que pueden darlas secuencias adicionales. Una variante con-siste en usar un menor nmero deoligonucletidos o uno solo pero de mayorlongitud (35-75 nucletidos), eligiendo unaregin de la protena que contenga el me-nor nmero posible de codones degenera-dos, utilizando el conocimiento de loscodones ms probables para la especie enestudio.

Existen otras tcnicas para localizar genesen las genotecas de ADNc, como hibridacindiferencial, si se trata de genes expresadosen diferentes tejidos o la utilizacin de son-das de regiones conservadas en familias deprotenas para encontrar genes relacionadoso bien la utilizacin de vectores de expre-sin.

Genotecas GenmicasUn genoteca genmica puede obtenerse

de cualquier tejido, ya que todas las clulasde un organismo tienen la misma constitu-cin gentica. Como se mencionara previa-mente, se encuentran en ella no slo secuen-cias expresadas y no expresadas sino tam-bin las correspondientes secuenciasregulatorias.

Pueden utilizarse fagos como vectores,pero sucede que muchos de los genomaseucariotas son muy grandes, por ejemplo elde mamferos contiene 3x109 pb de ADN. Siel promedio tpico de inserto es de 15.000pb, se necesitarn unos 200.000 fagos paracontener el genoma completo. Para asegu-rar que todas las secuencias estn represen-tadas al menos una vez, los clculos estads-ticos dicen que debern analizarse aproxima-damente de 1 a 2 millones de fagos.

Muchos genes eucariticos tienen ms de1000 kb, por lo que deben ser clonados comoun conjunto de fragmentos parcialmentesuperpuestos. Para esto pueden utilizarsecsmidos, que pueden contener unas 45 kb.Para hacer una genoteca con estos vectoresel ADN se corta con enzimas de restriccinde manera de dejar fragmentos de tamaoapropiado. El csmido se empaqueta in vitroen fagos que se usan para infectar E. coli .Una vez dentro de la clula el csmido se re-plica y puede recuperarse de la clula comoun plsmido.


Cuando se trata de genomas muy gran-des, como es el caso del humano o de variasespecies vegetales y animales la utilizacin decsmidos resulta ineficiente. Por ello en es-tos casos se utilizan los YAC y BAC.

A) Genotecas genmicas en cromo-somas artificiales

La capacidad de clonar fragmentos dems de 100 kb es crucial para la genmicaestructural, funcional y comparativa de or-ganismos complejos. El primer sistema declonado de grandes fragmentos de ADN fue

informado en 1987 por Burke y colaborado-res. Este sistema estaba basado en YAC, quepermitan clonar y mantener fragmentos dems de 1000 kb en levaduras. Debido a estaventaja el sistema fue rpidamente adopta-do para los proyectos de genmica. Sin em-bargo, tienen algunos problemas que limitansu utilizacin, como el alto nivel dequimerismo o insertos hbridos (artefactoque resulta de la unin de fragmentos nocontiguos en el genoma original en un mis-mo clon), la inestabilidad de los insertos y la

dificultad de purificar losinsertos clonados.

Para minimizar estosproblemas se desarrollaronsistemas alternativos queutilizan bacterias en lugarde levaduras: los BAC y losPAC, que son vectores declonacin de copia simple.Cuando se los utiliza paratransformar plantas se losllama BIBAC. BAC y PACpueden contener estable-mente fragmentos mayo-res de 300 kb en E. coli.

Para preparar unagenoteca genmica, el ADNse corta con enzimas derestriccin o, para evitar lapresencia de fragmentosdemasiado largos o cortos,se fragmenta al azar. Unpaso crtico en el proceso esel aislamiento de molculasintactas de ADN de eleva-do peso molecular, esen-cialmente ADN cromosmi-co. Para ello las clulas seembeben en bloques deagarosa de baja tempera-tura de gelificacin y setratan con en-zimas y otros

Figura 8: Bsqueda de imgenes en una genoteca genmica. Utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasapara buscar un gen especfico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen ungenoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismofiltro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos.El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers especficos para el gen de inters. Comocontrol positivo se utiliza un ADN vegetal, tambin amplificado por PCR. La reaccin se analiza sobre un gel deagarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genmico del vegetal y tambin en uno de losclones. En este caso en el conjunto que contena los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales seencuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos darla posicin exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de inters (Modificado de Watson et al.,1992).


reactivos para separar el ADN de las prote-nas celulares y del RNA. La funcin del blo-que de agarosa es proteger a las grandesmolculas, que, embebidas en esta matriz,se someten a la digestin con enzimas derestriccin que realicen cortes poco fre-cuentes (rare cutters). La preparacin deADN de alta calidad en plantas es ms com-plicada que la correspondiente para el casode animales debido a la presencia de la pa-red celular, que dificulta el embebido enagarosa de bajo punto de gelificacin. Paraobviar esta dificultad se aslan los ncleos yse trabaja con ellos directamente. Si se de-sea separar estos fragmentos porelectroforesis, los bloques de agarosa conte-niendo el DNA digerido pueden ser directa-mente embebidos en la matriz del gel quese correr.

B) Separacin de grandes trozos deADN: electroforesis de campo pulstil

Las tcnicas estndares de separacin deADN en geles de agarosa no son adecuadaspara molculas mayores de 10 kb. Esta limi-tacin ha sido subsanada con una tcnica lla-mada electroforesis de campo pulstil, porla cual el campo elctrico que conduce a lasgrandes molculas de ADN a travs del gelcambia peridicamente de orientacin. Deesta manera pueden separarse molculas tangrandes como los cromosomas de levaduras(200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separacin delas molculas de este tamao depende desu relativa facilidad o dificultad para reorien-tarse en respuesta a direcciones cambiantesde un campo elctrico. Esta tcnica puedeutilizarse para hacer mapas fsicos a gran es-cala.

C) Preparacin de una genoteca de BACEl procedimiento consiste en 4 pasos,

preparacin del vector, aislamiento y diges-tin del ADN y seleccin de los fragmen-tos por tamao, transformacin de las bac-terias y ensamblado de la genoteca

El vector debe estar bien purificado, di-gerido y defosforilado (cuando se corta conuna sola enzima, se eliminan los fosfatos ter-minales, para evitar la recircularizacin). Ladigestin del ADN es crtica para obtener frag-mentos adecuados para clonar. Los fragmen-tos son seleccionados por electroforesis decampo pulstil y se separan de la matriz deagarosa por digestin de la misma con

agarasa o gelasa, o por elucin del ADNdesde el gel. Esto permite construirgenotecas con fragmentos de tamaos simi-lares, de aproximadamente 150 kb.

Estas genotecas de grandes insertos sonconsideradas recursos de largo plazo para in-vestigacin genmica y deben ser manteni-das continuamente, especialmente cuandoson utilizadas para proyectos de secuenciadoy mapeo a gran escala. En general, cuandose va a construir una genoteca debe elegirsecuidadosamente el genotipo de la especieutilizada como fuente de ADN, el tipo de in-serto, etc. ya que la misma puede utilizarsepara variados propsitos. Si en lugar de unagenoteca de BAC se hace una de BIBAC, setiene la ventaja adicional de poder usar di-rectamente los fragmentos para transformarplantas utilizando Agrobacteriumtumefaciens

En la Fig. 8 se esquematiza la bsquedade un gen en una genoteca de BAC. Msdetalles acerca del ensamblado de los distin-tos fragmentos clonados pueden encontrar-se en el captulo correspondiente a genmica.

Genotecas de cromosomas especfi-cos o de segmentos de cromosomas

Cuando se busca un gen que se sabe estubicado en un cromosoma especfico simpli-fica mucho el trabajo hacer una genoteca deese cromosoma solamente. Se trata de unatcnica que permite separar cromosomasmetafsicos teidos con un colorante fluo-rescente (Hoechst 33258) (para regiones ri-cas en AT) y cromomicina A (para regionesricas en GC) y tratados de manera que el ADNno se desnaturalice. Los cromosomas teidosfluorescern cuando se expongan a luz UV(de longitudes de onda de 361 y 363 nm)(Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A).Las cantidades y proporciones de colorantesvaran para cada cromosoma y una compu-tadora reconoce el patrn fluorescente tpi-co de cada cromosoma. Algunoscromosomas son muy similares, por lo queno pueden ser separados. Se necesita unmilln de cromosomas para hacer unagenoteca. Equipos automticos pueden ha-cer este trabajo en unas pocas horas.

Tambin puede microdisectarse uncromosoma, tomando un segmento del mis-mo que tenga la regin de inters. En princi-pio se utiliz esta tcnica para cromosomas


grandes, fcilmente distinguibles pormicroscopa de contraste de fase. Actual-mente, la combinacin con PCR posibilita laaplicacin de la tcnica a cualquiercromosoma. Estos son teidos con Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son cortadascon agujas de vidrio ultrafinas y clonadas.Primers posicionados en el vector permitenamplificar secuencias desconocidas. El ADNamplificado se clona en un vector apropiadoy la localizacin cromos-mica de cada clonse determina utilizando hibridacin in situ(ver III.5)

8 Secuenciacin

Una vez que se ha obtenido el clon conel fragmento de inters, el paso siguiente essecuenciarlo. La determinacin de la secuen-cia puede realizarse por el mtodo qumicode Maxam y Gilbert o por el mtodoenzimtico de Sanger. El primero consisteen la utilizacin de un compuesto que des-truye selectivamente una o dos de las 4bases que constituyen el ADN. Se realizan4 reacciones de sntesis de ADN, marcandoun extremo de las molculas, dependiendode la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De estaforma, se generan fragmentos de distintotamao en funcin de la distancia de la basedestruida al extremo marcado radiactiva-mente del fragmento a secuenciar. Los pro-ductos de las 4 reacciones se corren lado alado en un gel de poliacrilamida y la secuen-cia del fragmento se determina a travs delpatrn de bandas, despus de efectuada unaautorradiografa para revelarlas.

El mtodo de Sanger, se basa en el mis-mo principio y consiste en preparar 2,3-didesoxinucletidos (ddNTP) de cada unade las 4 bases. Estas molculas pueden serincorporadas al ADN por el ADN polimerasade E.coli porque tienen un 5trifosfato nor-mal, pero no pueden formar un enlacefosfodister con el nucletido siguiente,por lo que el crecimiento de la cadena sedetiene. En la mezcla de la reaccin se inclu-ye la cadena a secuenciar, una proporcincontrolada de uno de los 4 ddNTP con sudesoxinucletido normal y los otros 3 dNTP.Cuando se agrega polimerasa la reaccincomienza a partir del primero hasta que seintroduce en la cadena un ddNTP, con lo

cual su crecimiento cesa. Con una propor-cin correcta ddNTP:dNTP, se generan unaserie de fragmentos de distinta longitud,dependiendo de la distancia de la ltima baseincorporada al extremo marcado del ADN.Estos fragmentos son separados en un gelde poliacrilamida, donde, previa autorradio-grafa, se determina el patrn de bandas, querefleja la secuencia del ADN. Al principio, laposicin de cada banda revelada en la pel-cula radiogrfica se anotaba manualmente,luego, los digitalizadores de imgenes posi-bilitaron la lectura directa de la pelcula. Exis-ten actualmente secuenciadores automti-cos que realizan la electroforesis en gel y de-terminan autom-ticamente la secuencia uti-lizando un sistema de deteccin con lser.

Messing desarroll una serie de vectoresde clonado basados en el fago filamentosoM13, muy tiles para el secuenciadoenzimtico. La ventaja es que slo una delas cadenas del vector es empaquetada enlas cabezas del fago (ver Vectores declonacin). Este ADN de simple cadena esideal para utilizar con el mtodo de Sanger.Clonando el inserto en M13, en las dosorientaciones posibles, se obtiene una o laotra hebra del ADN a secuenciar. Para ello seutiliza un primer que se posiciona en un lu-gar adyacente a la regin de policlonado deM13, que se llama primer universal, ya quese puede utilizar para secuenciar cualquierclon recombinante.

Actualmente se utilizan fsmidos (verVectores de clonacin). La adicin de unfago ayudante (helper phage) a las c-lulas que lo contienen, hace que el ADN delmismo, de simple cadena, sea replicado,empaquetado y extrado de la clula. Al serde menor tamao (aprox. 3000 bp) que M13permite la insercin de fragmentos de ADNms largos.

Los proyectos de secuenciacingenmica han requerido mtodos desecuenciado ms veloces y econmicos. Paraello se ha desarrollado una tcnica llamadaMultiplex, que permite manejar mayor can-tidad de muestras en menor tiempo. Se utili-zan 20 vectores plasmdicos que permitenconstruir 20 genotecas diferentes a partir delmismo ADN. Cada vector lleva dos secuen-cias nicas que flanquean al sitio declonado, que pueden ser usadas como eti-


quetas (tags) para el ADN clonado y esta-rn presentes sobre cada fragmento a sersecuenciado. Se toma un clon de cada unade las genotecas plaqueadas (20 colonias) yse mezclan. Se hace crecer el cultivo, se aslael ADN y se secuencian los plsmidos utilizan-do el mtodo Maxam y Gilbert. Los produc-tos de 12 conjuntos de reacciones desecuenciacin se corren en un gel y se trans-fieren a una membrana de nylon. El filtro sehibrida secuencialmente (es decir, se despe-ga una sonda para luego hibridar con las si-guiente y as sucesivamente), utilizando comosonda la etiqueta de cada uno de los 20vectores. En cada caso se van leyendo lassecuencias correspondientes a cada uno delos distintos vectores. De esta manera, unasola reaccin produce datos de 20 clones ala vez.

Actualmente existen equipos robotiza-dos que pueden llevar a cabo dos de las re-acciones ms limitantes en el proceso desecuenciado: la deteccin de las bandas deADN y la traduccin de un patrn de ban-das en uno de secuencia. Estos equipos uti-lizan nucletidos marcados con fluorocromos.Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al serexitados por lser emiten luz de diferentelongitud de onda. Los colorantes puedenutilizarse para marcar el primer universal desecuenciacin de M13 o cada uno de los 4terminadores de cadena didesoxi. En estecaso, cada mezcla de reaccin con unterminador diferente se marca con un co-lorante diferente. Cuando la reaccin es com-pletada, los productos de las 4 reacciones semezclan y se corren en una sola calle de ungel, en un secuenciador automtico. A medi-da que los fragmentos pasan a travs del l-

ser, sus marcas fluorescentes se excitan yemiten luz que se detecta mediante unfotomultiplicador. Despus de ser procesadapor una computadora, la secuencia es mos-trada como una serie de picos o cromatogra-ma, donde cada uno de los 4 colores repre-senta a un nucletido diferente (rojo:timina, verde: adenina, negro: guanina yazul: citosina).

9 Lecturas Recomendadas

FTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.;MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL,G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.;WANG, Z.Y. 1995. Standard Molecular Techniques forthe Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer toPlants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer LabManual.

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11-Bibliografia Adicional- Ingenieria Genetica