Appunti di Genetica Medica

“GENETICA MEDICA”: CHE COSA E’?La genetica medica è la scienza che studia le applicazioni della genetica alla pratica clinica. Spesso ci sono delle opinioni errate sulle malattie genetiche, ad esempio l’assenza di altri individui in famiglia non significa automaticamente che quella malattia non è genetica, i traumi mentali e fisici della madre durantela gravidanza non causano malformazioni nel bambino ecc… Nello studio delle malattie genetiche importanti sono i concetti di :

Prevalenza = percentuale di persone che, in un dato omento ed in una data popolazione presenta una certa patologia

Incidenza = percentuale con la quale si verificano nuovi casiAlcune malattie genetiche e relative prevalenze: cromosomica monogenica = prevalenza 6-9 x 1000; autosomica dominante = prevalenza 3-9,5 x 1000; autosomica recessiva = prevalenza 2-2,5 x 1000;legata all’x = prevalenza 0,5-2 x 1000;difetti congeniti = prevalenza 20-50 x 1000.Le malattie genetiche possono manifestarsi durante differenti fasi della vita: durante la vita prenatale, prima o dopo la nascita, durante il primo anno di vita,alla pubertà.

IL CICLO CELLULAREGENOMAIl genoma è l’intero patrimonio genetico dell’organismo ed è contenuto nel DNA. Una molecola di DNA è costituita da uno zucchero pentoso(il deossiribosio), un gruppo fosfato e le basi azotate: adenina(A) e guanina(G) sono basi purine e timina(T) e citosina(C) sono basi pirimidine. Esse si appaianocon la regola di complementarietà delle basi: adenina con timina e citosina con guanina. Così il genoma è simile ad una sequenza di lettere, circa 3,2 miliardi erappresenta il patrimonio genetico di ognuno di noi: l’informazione genetica tradue individui è uguale al 99,9%, il loro DNA differisce quindi solo per una lettera su mille. In realtà il DNA presente in ogni cellule srotolato sarebbe lungopiù di un metro e tutto il DNA dell’uomo srotolato riuscirebbe a coprire superficienormi: il DNA delle cellule eucariotiche è “impacchettato” in delle strutture proteiche, i nucleosomi: ciascun nucleosoma è composto da otto proteine istoniche attorno alle quali si avvolge il DNA. I nucleosomi si condensano a loro volta in nucleofilamenti che si associano in anse su una struttura polisaccarica detta Scaffold. Nell’RNA la costituzione è simile: uno zucchero pentoso (il ribosio), un gruppo fosfato e le basi azotate: adenina si lega con l’uracile(U) e citosina con guanina. Il codice genetico contiene l’informazione genetica;il materiale genetico fornisce informazioni anche per la sintesi proteica: il codice genetico è costituito da una sequenza di nucleotidi di DNA, organizzati in triplette chiamate codoni. Poiché i nucleotidi sono 4, i possibili codoni sono 4^3=64, gli amminoacidi presenti in natura sono 20. Ogni tripletta quindi specifica un solo amminoacido mentre ogni amminoacido può essere codificatoda più triplette: il codice si dice quindi “degenerato”. Le fasi della sintesi proteica sono:

Trascrizione = cioè il trasferimento dell’informazione genetica dal DNAall’RNA messaggero;

Splicing = l’informazione genetica è contenuta all’interno dei geni, deisegmenti di DNA costituiti da moltissimi nucleotidi; la posizione delgene sul cromosoma è il locus e le forme alternative dei geni sono glialleli. I geni hanno delle sequenze codificanti, gli introni e dellesequenze non codificanti, gli esoni. Durante lo splicing si verifical’eliminazione delle parti non codificanti e l’assemblamento degliintroni. I geni rappresentano circa il 10 % di DNA,la restante parte haun ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica.

Traduzione = l’informazione genetica viene tradotta dall’RNAmessaggero a una proteina.

Il DNA è contenuto all’interno dei cromosomi: negli uomini i cromosomi sono 46raggruppati in 23 coppie(corredo cromosomico diploide); le cellule germinative hanno invece un corredo cromosomico aploide, cioè dimezzato.

IL CICLO CELLULARE Il ciclo cellulare comprende due fasi:

1) Interfase = la cellula si accresce; comprende tre sottofasi:a) sottofase g1(gap): la cellula si accresce;b) sottofase s(sintesi): continua l’accrescimento cellulare e vengono

duplicati i cromosomi. All’inizio della fase s ogni cromosoma è singolo, alla fine di questa fase ogni cromosoma è formato da una coppia di cromatidi fratelli:

c) sottofase g2: termina l’accrescimento, la cellula si prepara alla divisione cellulare.

1) Fase mitotica(M) = la cellula si divide. La fase M si compone di :a) Mitosi: è il processo di divisione cellulare mediante la quale da una

cellula diploide si creano due cellule figlie diploidi geneticamente identiche tra loro e rispetto alla madre. Le fasi della mitosi:

Interfase = la cellula ha duplicato il DNA durante la sottofase s; i cromosomi però non sono ancora distinti e si trovano sotto forma di cromatina;

Profase = la cromatina comincia a spirlizzarsi, involucro nucleare e nucleoli scompaiono e cominciano a distinguersi i cromosomi. Ogni cromosoma è costituito da due cromatidi fratelli uniti all’altezza del centromero; comincia a formarsi il fuso mitotico;

Metafase = i cromosomi si dispongono lungo il piano equatoriale della cellula costituendo la piastra equatoriale;

Anafase = i due cromatidi di ciascun cromosoma si separano improvvisamente e nello stesso momento a livello del centromero e si dirigono ai poli opposti della cellula; la cellula comincia ad allungarsi;

Telofase e citodieresi = continua l’allungamento della cellula, ai due poli si formano i due nuclei, i cromosomi assumono nuovamente la forma di cromatina, riappaiono i nucleoli. Si forma il solco equatoriale lungo il quale la cellula progressivamente si divide in due cellule figlie e avviene la citodieresi, cioè la distribuzione equa del citoplasma. Quindi si sono formate due cellule diploidi con corredo cromosomico n=46.

a) Meiosi: è il processo mediante la quale da una cellula diploide(patrimonio genetico 2n) si formano quattro cellule aploidi, i

gameti (rispettivamente con patrimonio genetico n, quindi con un corredo cromosomico dimezzato). La meiosi è distinta in

Meiosi I : è la prima divisione meiotica al termine della quale si formano due cellule aploidi. Comprende:

Profase I = i cromosomi omologhi si appaiano e formano le tetradi (4 cromatidi): i cromatidi si scambiano segmenti in un processo detto “crossing over” in dei siti definiti chiasmi visibili al microscopio. L’involucro nucleare si frammenta;

Metafase I = le tetradi si allineano lungo il piano equatoriale della cellula e rimangono unite nei chiasmi;

Anafase I = i cromosomi migrano ai due poli opposti della cellula (a differenza della mitosi i cromatidi rimangono uniti a livello del centromero);

Telofase I = i cromosomi raggiungono i due poli opposti della cellula e ognuno è ancora formato dai due cromatidi fratelli uniti nel centromero. Si formano due cellule figlie aploidi.

Meiosi II: è la seconda divisione meiotica attraverso la quale si formano quattro cellule figlie aploidi. Comprende:

Profase II = i cromosomi tornano a condensarsi; non si verifica duplicazione del DNA perché si è già verificata precedentemente.

Metafase II = i cromosomi si allineano lungo il piano equatoriale della cellula;

Anafase II = i cromatidi fratelli si separano e migrano ai poli opposti della cellula;

Telofase II e citodieresi = ai poli opposti della cellula si formano i nuclei e si divide equamente il citoplasma. Si sono formate cosi quattro cellule aploidi con corredo cromosomico dimezzato(in ciascunan=23).

Meiosi e riproduzioneLa riproduzione sessuata ha bisogno di due genitori e si compone di due processi: la meiosi e la fecondazione. La riproduzione sessuata aumenta la variabilità genetica grazie a differenti meccanismi come: -l’assortimento indipendente dei cromosomi omologhi nella prima divisone meiotica: l’allineamento all’equatore dei due cromosomi è casuale e il numero delle combinazioni possibili è uguale a 2 elevato alla potenza del numero di paia di cromosomi. Se ad esempio si allineano 3 paia di cromosomi si possono ottenere 2^3=8 gameti differenti. -ricombinazione e crossing over tra cromosomi omologhi;-casualità della fecondazione di una cellula uovo da parte di uno spermatozoo. Esempio: dati 23 paia di cromosomi con l’assortimento indipendente si possonoottenere 2^23=8 milioni di gameti; durante la fecondazione(unione di una cellula uovo con uno spermatozoo) si otterranno 8 milioni x 8 milioni= 64 trilioni di combinazioni zigotiche possibili. Aggiungendo anche il crossing over le possibilità saranno infinite!! La meiosi genera quindi variabilità genetica (unica eccezioni sono i gemelli monozigoti).Questi meccanismi mescolano i geni degli individui di una popolazione, ma a creare la vera diversità sono le mutazioni(modificazioni nella sequenza di DNA).Mitosi e meiosi differiscono perché: la mitosi avviene nelle cellule somatiche, lameiosi nelle cellule germinali; la mitosi è caratterizzata da una sola divisione

cellulare, la meiosi da due divisioni meiotiche; la mitosi non vede l’appaiamento dei cromosomi omologhi né la ricombinazione, la meiosi si.

“CITOGENETICA”: CHE COSA E’?CITOGENETICA=STUDIO DEI CROMOSOMI I cromosomi sono visibili nella cellula soltanto durante la divisione; nel tempo i cromosomi sono stati studiati in diversi modi: fino al 1970 essi venivano classificati solo in base a dimensione e posizione del centromero, con la scoperta di diverse tecniche di bendaggio è stato possibile uno studio più accurato.Le colture cellulari devono essere allestite osservando una completa asepsi.I terreni di coltura contengono sali, glucosio, amminoacidi essenziali, vitamine, nucleotidi e in genere un indicatore(rosso fenolo)L’ambiente di lavoro è costituito da una cappa a flusso laminare verticale, fornita di lampada ad ultravioletti che viene utilizzata per la sterilizzazione notturna. I piani di lavoro vanno puliti periodicamente con soluzioni antisettiche; si utilizzano guanti sterili, pipettatori automatici, bisogna usare cautela nel manipolare cellule e terreni e bisogna inoltre cambiare frequentemente le pippette. Colture di sangue periferico: il sangue è il tessuto più utilizzato per la diagnosi del cariotipo costituzionale, i campioni di sangue sono ottenuti con prelievo venoso(in genere 5ml). Il cariotipo è l’assetto cromosomico di un individuo: analizzare il cariotipo significa analizzare il corredo cromosomico. Il cariotipo umano contiene 46 cromosomi, suddivisi in 23 coppie: 22 coppie di autosomi e 1 coppia di gonosomi, da cui dipende la differenziazione del sesso; i gonosomi nel maschio sono XY e nella donna XX. Un cariotipo maschile sarà descritto come 46,XY e un cariotipo femminile sarà descritto come 46,XX. I cromosomi vengono classificati per dimensioni(ordine decrescente di grandezza), posizionedel centromero e colorazione. Dopo aver prelevato il sangue si seminano pochegocce, si aggiunge il mitogeno e il tutto viene incubato a 37°C per un paio di giorni. I mitogeni vengono utilizzati perché le cellule del sangue periferico non sono in divisione spontanea e il mitogeno serve proprio a stimolare la loro divisione(in genere si usano delle proteine come la fitoemoagglutinina);si usa poi la calcemide per 1-2 ore per bloccare la mitosi in metafase; si trasferiscono prima le cellule in provette da centrifuga e poi in provette contenenti un fissativo; i cromosomi vengono colorati per bande, si pone una goccia sul vetrino si osserva al microscopio. L’immagine viene fotografata.

Tipi di bandeggio: bandeggio g: i cromosomi metafisici vengono sottoposti ad una parziale digestione delle proteine quindi colorati con il colorante Giemsa e osservati al microscopio;le bande g sono quindi colorate di scuro;bandeggio q: i cromosomi metafisici vengono trattati con la mostarda chimica eil bandeggio fluorescente è osservabile con un microscopio speciale a luce ultravioletta; le bande che si colorano con il bendaggio g emettono fluorescenza se illuminati con luce ultravioletta;bandeggio r: i cromosomi metafisici sono sottoposti ad alte temperature per ottenere la denaturazione del DNA e vengono colorati con Giemsa e osservati al microscopio: le bande scure r corrispondono alle bande chiare del bandeggio g;

bandeggio c: i cromosomi metafisici sono trattati chimicamente affinché il DNA venga estratto dai bracci e non dal centromero, viene utilizzata la colorazione Gemsa e poi vengono osservati al microscopio. Si colora di scuro il centromero che corrisponde ad una regione di eterocromatina costitutiva.Come si leggono le bande citogenetiche:

LE MALATTIE GENETICHELE PATOLOGIE CROMOSOMICHETra le malattie genetiche vi sono le patologie cromosomiche, che si distinguonoin:

Numeriche : trisomie, monosomie, triploidie, tetraploidie. Le anomalie cromosomiche numeriche sono caratterizzate da un cambiamento del numero di cromosomi senza rotture cromosomiche. Possono essere :

a) Poliploidie: copie extra di tutti i cromosomi; comprendono a loro volta triploidia (dovuta a fecondazione di un singolo ovulo da parte di due spermatozoi, dispermia, o dalla fecondazione che coinvolge un gamete diploide anomalo) e tetraploidia (dovuta al non completamento della prima divisione zigotica).

b) Aneuploidie: guadagno o perdita di alcuni cromosomi. Comprendono a loro volta monosomie (un cromosoma in meno) e trisonomie (un cromosoma in più). Le cause delle aneuploidie sono: la non-disgiunzione, ovvero l’incapacita dei cromosomi separati di appaiarsi durante la prima divisione meiotica o dei cromatidi fratelli di separarsi nella seconda divisione meiotica che provocano una diseguale distribuzione del materiale genetico alle cellule figlie e il ritardo anafisico, ovvero una ritardata migrazione del cromosoma durante l’anafase con conseguente perdita del cromosoma che provoca la mancata incorporazione di un cromosoma nel nucleo di una delle cellule figlie.

c) Mixoploidie: due o più linee cellulari che differiscono per il numero dei cromosomi. Si differenziano in: mosaico (differenti linee cellulari che derivano da un unico zigote) distinte a loro volta in mosaico poliploide(diploide/triploide) e mosaico aneuploide(normale/trisomia 21) e in chimera (differenti linee cellulari che derivano da zigoti differenti).

Strutturali : traslocazioni, inversioni, delezioni, duplicazioni. Le anomaliecromosomiche strutturali sono dovute a vari tipi di rottura del cromosoma

Braccio corto= p

Banda 2

Sottobanda 1

Braccio lungo= q

Banda 2

Sottobanda 3

I cromosomi hanno oltre al centromero, anche i telomeriche sono le estremità del cromosoma. Essi possono essere classificati in base alla posizione del centromero: si avranno quindi delle 23 coppie di cromosomi nell’uomo, cromosomi metacentrici (1,3,16,19,20) con ilcentromero nel mezzo, cromosomi acrocentrici (13, 14, 15, 21, 22) con il centromero in prossimità di una delle due estremità e cromosomi submetacentrici (gli altri) con il centromero spostato verso una delle due estremità.

con conseguente modificazione della sua forma caratteristica. Possono avvenire:

a) Un singolo evento di rottura in un cromosoma: il frammento acentrico viene perso; si verifica quindi una delezione, ovvero la mancanza di un frammento del cromosoma, si parla in questo caso di delezione terminaleperché viene persa la parte terminale.

b) Due eventi di rottura in un cromosoma: che comportano inversioni(la regione tra i due punti di rottura è invertita; l’inversione può essere paracentrica se la rottura avviene su uno stesso braccio cromosomico e pericentrica se la rottura avviene su due bracci cromosomici differenti), delezione interstiziale(la regione tra i due punti di rottura viene persa e leestremità cromosomiche si risaldano), cromosoma ad anello( la regione tra i due punti di rottura forma un anello risultante dalla fusione delle dueestremità telomeriche).

c) Due eventi di rottura su due cromosomi differenti: che comportano una trasclocazione, ovvero il traferimento di una regione di un cromosoma in un’altra posizione dello stesso cromosoma o di un altro. La traslocazione può essere: traslocazione reciproca (scambio bilanciato di segmenti tra due cromosomi;es:46,XY,t(2;12) indica che in un uomo c’è stata una traslocazione reciproca tra il cromosomi 2 e 12; 46,XX,t(7;22) indica che in una donna c’è stata una traslocazione reciporca tra i cromosomi 7 e 22); la t nel cariotipo indica una traslocazione; e traslocazione robertisoniana (un intero cromosoma si attacca ad un altro a livello del centromero; questo tipo di traslocazione è la più frequente ed interessa i bracci lunghi dei cromosomi acrocentrici, il braccio corto viene perso; i portatori hanno un cariotipo con 45 cromosomi; es: 45,XY,der(13;14) e 45,XY,der(15;21); der nel cariotipo significa cromosoma derivato da un riarrangiamento.

d) Tre rotture di cui almeno due sullo stesso cromosoma: che comportano traslocazioni inserzionali (la regione compresa tra i due punti di rottura diun cromosoma si salda con l’estremità di un terzo punto di rottura sul medesimo cromosoma o su un cromosoma differente).

Le anomalie cromosomiche possono essere bilanciate se non c’è una acquisizione o perdita netta di materiale cromosomica, nella maggior parte dei casi non sono correlate ad un fenotipo anomalo e sbilanciate se c’è, invece, acquisizione o perdita netta di materiale cromosomico, sono correlate ad un fenotipo anomalo (malformazioni, ritardo mentale). La frequenza delle malattie cromosomiche alla nascita è 0.65 % :tra le trisomie, la trisomia 21 è la più diffusa con lo 0.12%, altre trisomie sono la trisomia 18 e la trisomia 13, meno diffuse però; le monosomie hanno una frequenza dello 0.024%, le trisomie bilanciale dello 0.2% e quelle sbilanciate dello 0.05%. Ritardo mentale e di accrescimento, malformazioni, sterilità, aborti ripetuti, morte prenatale sono tutte conseguenze di anomalie cromosomiche. Il fenotipo delle malattie cromosomiche è molto variabile(varia da grave a quasi inosservato), in genere sono colpiti molti organi ed è dovuto a molteplici meccanismi patogenetici. La gravità delle malattie cromosomiche dipende dal tipo di cromosoma colpito e dalla quantità di geni interessati: quanto più gravi sono questi elementi prima si verifica l’interruzione della gravidanza.ANOMALIE CROMOSOMICHE

NUMERICHE:

Sindrome di Down(Trisomia 21)La sindrome di Down è descritta nel 1866 da Down; è una patologia che ha unafrequenza pari a 1:700 nati, non è letale, è il quadro malformativo più frequente nell’uomo ed è correlata all’età della madre(con la frequenza di 1 su 38 nelle donne gravide oltre i 45 anni). E’ causata dalla presenza di un terzo cromosoma o di una sua parte nella 21esima coppia: per questo è conosciuta come cariotipo nell’uomo 47,XY,+21 o nelle donne 47,XX,+21. La sindrome di Down può manifestarsi con diversi tipi di alterazioni: libera, mosaicismo, traslocazione robertisoniane… La sindrome di Down familiare è causata dal materiale genico supplementare del cromosoma 21 che può essere dovuto a una traslocazione robertsoniana nel cariotipo di uno dei genitori: il braccio lungo del cromosoma 21 si fonde al braccio lungo del cromosoma 14 o 15. Il cariotipo quindi può essere 46,XX,t(15q,21q) oppure 46,XX,t(14q,21q) o ancora46,X,+21. Nelle traslocazioni se la madre è portatrice il rischio è del 10%, se è portatore il padre il rischio è del 2%. La sindrome di Down ha delle caratteristiche comuni a tutti gli individui che ne sono affetti: per esempio bassa statura, occipite piatto, epicanto, ritardo mentale, senescenza precoce, plica palmare unica, rima palpebrale obliqua e cardiopatia nel 60% dei casi. Sindrome di Patau(Trisomia 13)Viene descritta per la prima volta nel 1657 e poi riscoperta nel 1960 da Patau; ha una frequenza pari a 1:5000 nati vivi; è correlata all’età della madre, maggiore è l’eta della madre più elevato è il rischio; la sopravvivenza è letale: la morte si verifica solitamente nel primo anno di vita. E’ una patologia che colpisce principalmente le femmine e il cariotipo è indicato come 46, XX, +13: quindi vi sono tre copie del cromosoma 13. Tra le anomalie della trisomia 13: oloprosencefalia, microcefalia con fronte sfuggente, microftalmia, labiopalatoschisi, polidattilia, tallone sporgente, alterazioni cardiache, alterazioni dei genitali, rene a ferro di cavallo.Sindrome di Edwards(Trisomia 18)Viene descritta nel 1960 e prende il nome dallo studioso che per primo la studiò, Edwards. Ha una frequenza pari a 3:1000 nati vivi, i bambini che nascono con la trisomia 18 hanno una sopravvivenza molto limitata: il 50% di essi muore entro i 2 mesi di vita, solo il 10% vive più di un anno di età. Nella coppia 18 di cromosomi, anziché 2, ci sono tre copie del cromosoma 18: il cariotipo pertanto sarà 47,XY,+18. Tra le anomalie della trisomia 18: occipite sporgente, micrognazia,mani a pugno,ernia inguinale o ombelicale,alterazioni cardiache,genirali,ipertonia…Sindrome di Turner(“disgenesia gonadica”)Questa sindrome ha la frequenza di 1:8000 femmine alla nascita: al momento del concepimento uno zigote su 100 ha cariotipo 45,X; di questi il 99% va incontro ad aborto spontaneo.Il 25% ha cariotipo a mosaico (46,XX/45,X) e il restante 25% ha un cromosoma X anomalo. Si verifica nelle donne, e la caratteristica di tale sindrome è l’assenza totale o in parte di un cromosoma X(monosomia X),per cui il cariotipo sarà 45,X; nell’80% dei casi il cromosoma Xperso è quello paterno. Le anomalie della sindrome di Turner sono: pterigio del collo, bassa statura(non più di 150 cm) torace a scudo, gomito valgo, mammelle iposviluppate, malformazione della valvola aortica, edema del dorsodelle mani e dei piedi dalla nascita, attaccattura posteriore dei capelli a tridente. E’ nota anche come “disgenesia gonicadica” in quanto è caratterizzata da amenorrea, genitali esterni di tipo femminile ma immaturi,

infantilismo dell’utero e delle tute di Falloppio, ovaio fibroso privo di tessuto germinale, scarso o assente lo sviluppo mammario.Sindrome di KlinefelterSi presenta negli uomini con un’incidenza di 1:500, tale sindrome ha cariotipo 47,XXY o in alcuni casi 48,XXXY o 49,XXXXY: gli individui affetti hanno quindi almeno due cromosomi X e almeno un cromosoma Y. In chi ne è affetto si verifica dopo la pubertà: sterilità(da azoospermia), ginecomastia vera, ialinizzazione dei tubuli seminiferi, ipoplasia testicolare(testicoli piccoli e duri), alta statura, lieve ritardo mentale o difficoltà d’apprendimento.Altre anomalie numeriche47,XXX: vi è una copia eccedente del cromosoma X nelle donne; può comportare sterilità, lieve ritardo mentale.47,XYY: negli corredo cromosomico degli uomini oltre ai cromosomi X e Y, è presente un cromosoma soprannumerario Y. La frequenza di questa anomalia è di 1:1000 maschi ;è stata in passato associata a disturbi di comportamento e comporta in alcuni casi sterilità.

STRUTTURALI:Sindrome del Cri du ChatViene descritta per la prima volta nel 1963 dal genetista Jerome Léjeune. L’incidenza varia tra 1:15.000 e 1:50.000 nati vivi. E’ dovuta alla delezione di una parte del braccio corto del cromosoma 5 (5p-), è una delle più comuni sindromi da delezione cromosomica nell’uomo. Nella maggior parte dei casi è una delezione “de novo”(80%), la restante percentuale è dovuta in parte a una traslocazione cromosomica familiare e in parte a rare alterazioni citogenetiche. La delezione può essere più o meno ampia, quindi può interessare l’intero braccio corto o solo una banda di esso. I segni clinici principali della sindrome del Cri du Chat: pianto acuto e flebile da cui la sindrome prende il nome, microcefalia, sella nasale ampia, epicanto, micrognazia, anomalie dei dermatoglifi, ritardo psicomotorio e ritardo mentale.Sindrome di Wolf-Hirschorn(delezione del 4p)Viene scoperta nel 1965, ha un quadro clinico ampio e variabile. Le cause vanno individuate in una piccola perdita di materiale genetico(microdelezione) a carico della parte alta del braccio corto di uno dei cromosomi 4. Allo stato attuale non si sa ancora se vi è una correlazione tra quantità di materiale genetico perso e gravità della malattia. Gli individui affetti presentano problemidi accrescimento sia nella vita prenatale che postnatale, ritardo delle tappe tipiche dei bambini e successivo ritardo intellettivo; gli affetti hanno occhi distanziati, coloboma dell’iride, naso prominente, orecchie grandi, alterazioni cardiache, ritardo mentale; essi tendono in generale a somigliarsi molto e la conformazione di fronte, occhi e naso è detta ad elmo di guerriero greco.

GENETICS TIMELINE1858: Darwin elabora la sua teoria sull’evoluzione della specie1865: Mendel effettua i suoi esperimenti sui piselli dimostrando la tesi dell’assortimento indipendente dei caratteri e facendo decadere l’ipotesi erratadi Darwin del rimescolamento dei caratteri1869: Viene per la prima volta isolato il DNA1879: Viene osservata la mitosi1900: Vengono riscoperte le tesi di Mendel fino a quel momento ignorate

1952: I geni sono frammenti del DNA1953: Watson e Crick elaborano un modello di DNA a doppia elica; i geni contengono l’informazione genetica.1955: Uno studio dimostra che l’uomo possiede 46 cromosomi raggruppati in 23 coppie1958: La duplicazione del DNA è un modello semiconservativoRivoluzione citogenetica:1970: Tecniche di bandeggiamento1980:Alta risoluzione cromosomi(>4 Mb)1990: Citogenetica molecolare, FISH (40-100 kb)2000: CGH-array e CGH-microarray (1Mb-5kb)2001: Il progetto Genoma Umana annuncia il sequenziamento del DNA

CITOGENETICA CLASSICA E MOLECOLAREMentre la citogenetica classica permette di identificare riarrangiamenti cromosomici coinvolgenti non meno di 5 Mb (milioni di basi), la citogenetica molecolare combina l’analisi del DNA, tipica della biologia molecolare con la struttura cromosomica oggetto della citogenetica classica.

LE TECNICHE UTILIZZATE DALLA CITOGENETICAMOLECOLARE

Le tecniche di citogenetica molecolare sono:FISH(fluorence in situ hyubridization),PRINS(primed in situ labeling),PCR in situ(polymerase chain reaction in situ),CGH(comparative genomic hybridization),Array CGHFISH(fluorence in situ hyubridization): Dopo la fissazione di metafasi e nuclei in interfase su vetrino, grazie a questa tecnica è possibile identificare sequenze di acidi nucleici attraverso sonde marcate in maniera non isotopica e grazie all’utilizzo di fluorocromo che emettono a diverse lunghezze d’onda. La sonda è costituita da una specifica sequenza di DNA marcato capace di legarsi ad una sequenza complementare presente sul cromosoma.Innanzitutto bisogna preparare la sonda, poi si pone il preparato cromosomico sul vetrino, si applica la sonda al DNA del cromosoma, avviene la denaturazione(i due filamenti di DNA si staccano) e dopodiché si inizia l’ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati (accoppiamento tra la sequenza di DNA della sonda e la complementare sequenza di cromosomi) : il campione viene infine trattato con dei fluorescenti e osservato al microscopio. Possono esserci differenti tipi di sonde: per esempio sonde specifiche per un gene, sonde centromeriche, sonde telomeriche, sonde painting cromosomi. La tecnica di colorazione più usata è la tecnica multicolor. La FISH interfasica prenatale su amniociti non coltivati costituisce un rapido metodo, in 24-48 h, per rilevare trisomia 21, trisomia 18, trisomia 13, aneuploidia dei cromosomi sessuali: il liquido amniotico viene processato fino ad ottenere un preparato costituito da nuclei in interfase che vengono ibridati con sonde per i cromosomi21, 13, 18, X e Y. Dopodiché si valuta il numero di segnali specifici per il cromosoma di interesse.

FISH nelle diagnosi da microdelezione: Sindrome di Prader-Willi/ Angelman : delezione 15q11-q13 (nel 70% dei casi).E’ una malattia genetica dovuta a un difetto nella duplicazione cromosomica daimprinting genetico(l’imprinting è un meccanismo di regolazione genica che riguardo un ristretto numero di geni). Tra i geni sottoposti ad imprinting: Chr1(p73), Chr5 (U2AFBPL), Chr6 (MAS1; M6P/IGF2R..), Chr7 (GAMMA2-COP..), Chr11 (H19;IGF2;INS..), Chr13 (HTR2A), Chr14 (MEG3/GTL2), Chr15 (GABRA5;GABRB3;NDN;PAR1;PAR5;SNRPN;UBE3A), Chr18 (IMPACT), Chr19 (PEG3), Chr20 (GNAS1;NEURONATIN), ChrX (XIST). Le patologie associate a mutazioni dell’imprinting sono: diabete transitorio neonatale, nanismo di Silver-Russel, sindrome di Beckwith-Wiedemann, sindrome malformativa con ampio spettro fenotipico e sindromi PWS/AS. Nella sindrome di Angelman la microdelezione è sul cromosoma materno, nella sindrome di Prader-Willy la microdelezione è sul cromosoma paterno. I sintomi principali della sindrome di Angelman sono: ritardo mentale grave, ristae parossistiche inappropriate, capelli chiari (65%), microbrachicefalia, prognazia, denti spaziati, bocca larga con lingua protrudente, facies caratteristica, atassia, movimenti a scatto, convulsioni per lo più sporadiche. Tra i sintomi della sindrome di Prader-Willi: variabilità e severità della malattia, l’altezza degli indivui affetti comincia a diminuire a partire già dai primi due mesi di vita, obesità, rima palpebrale rivolta verso il basso, strabismo, ridotto diametro bifrontale, ritardo mentale (lieve, medio, grave), problemi comportamentali riguardo al cibo, problemi nell’articolazione del linguaggio, ipotonia alla nascita, mani e piedi piccoli, ipogonadismo.La sindrome di Angelman e di Prader-Willi possono essere dovute anche a disomia uniparentale: cioè nella coppia 15 di cromosomi omologhi, anziché unopaterno ed uno materno, nella sindrome di Angelman entrambi i cromosomi sono di derivazione paterna, nella sindrome di Prader-Willi entrambi i cromosomi sono di derivazione materna.Sindrome di George/Velocardiofacciale: delezione 22q11.2La prevalenza di tale sindrome è di 1:6000 nati vivi; è una malattia causata dalla delezione di una porzione del cromosoma 22. Tra le caratteristiche cliniche: anomalie facciali, difetti cardiaci, labiopalatoschisi, deficit immunitario,ipocalcemia neonatale, ritardo mentale.

I Markers o cromosomi marcatori, sono anomalie cromosomiche particolari di cui non si conosce l'espressività fenotipica, caratterizzate dalla presenza piccoliporzioni cromosomiche soprannumerarie di cui non si conosce l’origine, e cioè da quali cromosomi queste porzioni derivino. Nella diagnosi prenatale è importante l’accertamento dell’origine cromosomica di un marker e la rapidità di identificazione per poter stabilire la correlazione con eventuali effetti fenotipici. I marker cromosomici possono essere de novo o familiari, satellitati(acrocentrici) o non satellitati(non acrocenrici), omogenei o a mosaico.

La FISH è di grande applicazione ma il suo utilizzo è limitato, perché essa rappresenta uno strumento di indagine mirata in quanto la sua applicazione permette di poter individuare mutazioni specifiche a livello di precisi loci cromosomici.Array CGH (cariotipo molecolare): Se la FISH è uno strumento ad indagine mirata, la tecnica Array CGH (comparative genomic hybridization) permette invece di valutare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche numeriche

(aneuploidie) a livello dell’intero genoma in un unico esperimento, quindi a carico di tutte le coppie di cromosomi(sia dei 22 autossomi, sia della coppia di cromosomi sessuali). E’ utilizzata anche per valutare la presenza di eventuali variazioni del numero di copie (CNV) di cromosomi o di piccole porzioni di essi, di duplicazione/amplificazioni (presenza di copie in eccesso di segmenti di DNA)o delezioni (perdita di porzioni di genoma). Tali anomalie causano differenti patologie come sindromi malformative, ritardo mentale, autismo, epilessia e tumori. La tecnica è basata sulla comparazione quantitativa del DNA in esame (o DNA test estratto dalle cellule fetali nel caso di diagnosi prenatale e dal prelievo ematico del paziente nel caso di diagnosi postnatale) e del DNA genomico di riferimento proveniente invece da un individuo sano (reference DNA). I due DNA vengono marcati in maniera differente: con fluorocromo rosso il DNA test e con fluorocromo verde il reference DNA, vengono mescolati in pasrti uguali e viene effettuata l’ibridazione su microarray(supporto di vetro ricoperto da frammenti di DNA) noti come sonde o cloni. Ogni clone rappresenta una specifica regione del genoma umano fino a ricomprendere l’intero assetto cromosomico dell’uomo. Dopo l’incubazione, sia il DNA test che il reference DNA si legheranno ai cloni presenti sull’array e le intensità dei segnali saranno misurate con uno scanner. Attraverso l’immagine ottenuta si potranno comparare le intensità di fluorescenza emesse dai due DNA. L’elaborazione dei dati mediante un apposito software evidenzierà eventuali variazioni del numero di copie del DNA test. Riepilogo: PRINCIPALI OBIETTIVI DELLA CITOGENETICA MOLECOLARE-Confermare e caratterizzare una patologia identificata con tecniche standard(per es. definire i punti di rottura di una traslocazione)-Identificare riarrangiamenti criptici -Confermare sindromi genomiche sospettate e riconoscibili a livello clinico (per es. sindrome di George)-Caratterizzare i pazienti con ritardo mentale-Caratterizzare i feti affetti da difetti congeniti (per es. cardiopatie, ernia diaframmatica…)-Verificare se una traslocazione de novo in un feto sia bilanciata-Caratterizzare una patologia oncologica

MUTAZIONI DEL DNAIl DNA è dinamico, in quanto è soggetto a dei cambiamenti ereditari, le mutazioni, che insorgono casualmente e che sono alla base del processo evolutivo. Una mutazione modifica quindi il genotipo di un individuo(=insieme dei geni che compongono il DNA) e può eventualmente modificarne il fenotipo(=insieme delle caratteristiche osservabili dell’individuo). Le mutazioni determinano la variabilità genetica, ovvero quella condizione per cui gli individui differiscono fra di loro per uno o più caratteri. Un marcatore è polimorfico quando ha almeno due alleli comuni, un sito (locus) viene definito polimorfico se di esso si conoscono almeno due forma alleliche la più rara delle quali ha la frequenza almeno dell’1%(frequenza sufficientemente elevata da rendere improbabile l’origine casuale). Le mutazioni causano quindi polimorfismo nei nostri genomi. Il polimorfismo si verifica quando due o più fenotipi diversi esistono contemporaneamente nella stessa popolazione: si avranno alterazioni fenotipiche e alterazioni funzionali. Ma a determinare le mutazioni del DNA non è solo il caso, il tasso di mutazioni aumenta per

esempio anche con l’esposizione ad agenti mutageni.In base a ciò, quindi le mutazioni si differenziano in :

Mutazioni spontanee, causate da errori nei processi che si attuano sul materiale genetico, non avvengono di presenza di mutageni e non sono molto frequenti;

Mutazioni indotte da mutageni: i mutageni sono agenti fisici (come ad esempio raggi non ionizzanti: UV, raggi che provocano radiazioni ionizzanti: raggi gamma, raggi X, raggi cosmici) e agenti mutageni chimici ( sono delle molecole simili alle basi nucleotidiche, che si combinano con il DNA, venendo incorporate al posto delle basi e determinando cambiamenti chimici e errori di appaiamento, agenti alchilanti e agenti intercalanti).

Mutageni chimici: analoghi alle basiQuesti mutageni chimici sono simili nella strutture alle basi azotate, purine e pirimidine del DNA, ma sono difettosi nell’appaiamento; la replicazione avvienenormalmente, ma l’errore di appaiamento che si verifica si manifesta nel prossimo ciclo di replicazione: T:A e BrU : A. Il danno è la sostituzione delle basi.agenti alchilantiNitrosoguanidina, acido nitroso, idrossilamina sono responsabili di reazioni di metilazione, deanimazione ecc…Questi sono mutageni molto potenti e inducono mutazioni ad alta frequenza rispetto agli analoghi delle basi. Reagendo sul DNA sono in grado di introdurre cambiamenti anche in assenza direplicazione. agenti intercalantiGli agenti intercalanti(es. acridine: arancio di acridina, proflavina) sono delle molecole che si inseriscono tra le basi azotate del DNA separandole portando cosi microinserzioni e microdelezioni durante la replicazione.Mutageni fisici:radiazioni non ionizzanti: raggi UVLe basi degli acidi nucleici sono in grado di assorbire le radiazioni ultraviolette: il picco di assorbimento è a 269 nm anche se già a 260 nm la radiazione ultravioletta è letale. A causa del suo effetto nel DNA si formano dimeri di pirimidine( due citosine o timine vengono legate fra di loro): questo evento aumenta la probabilità che la DNA polimerasi inserisca in questa posizione un nucleotide errato. La radiazione UV è utile nell’isolamento dei mutanti.radiazioni ionizzantiSono delle radiazioni a lunghezza d’onda corta come raggi X, raggi gamma e raggi cosmici, più potenti rispetto ai raggi UV e molto penetranti. Le radiazioni ionizzanti generano forme di ossigeno reattive (O2, H2O2, OH) che ossidano la guanina con formazione di oxo-guanina.Diversi tipi di mutazioniIn generale le mutazioni non sono distribuite nel genoma in maniera uniforme, l’incidenza delle mutazioni nei loci dipende da vari fattori: ad esempio dalla dimensione del locus considerato, dalla capacità codificante o meno, dalle caratteristiche della sequenza. Questi siti in cui avvengono le mutazioni sono definiti hot spot mutazionali (punti caldi).Mutazioni cromosomicheSi parla di mutazioni cromosomiche o anomalie cromosomiche quando è la struttura di uno o più cromosomi ad essere alterata; si possono avere quindi

mutazioni nel numero di cromosomi dovute ad errori di segregazione(es. aneuploidia); mutazioni nella struttura dei cromosomi dovute ad errori di ricombinazione (es. duplicazioni, delezioni). Mutazioni geniche(o puntiformi)Riguardano un singolo gene o una sequenza di DNA. Sono dovute principalmente alla sostituzione di una base nucleotidica del DNA con un’altra; possono verificarsi mutazioni geniche però anche a causa di delezione o inserzione di una base nel filamento di DNA. Le mutazioni geniche portano alla formazioni di nuove forme geniche, e quindi di nuovi alleli, detti appunto alleli mutanti.Mutazioni somatiche o germinaliUna mutazione genica a sua volta si può distinguere in una mutazione somatica, se va a colpire un qualunque gene di una cellula somatica e in mutazione germinale, se va a colpire una cellula germinale. Una mutazione è patogena quando è influenzata dal tipo e dal numero delle cellule in cui l’allele mutante è espressa: una mutazione non letale germinale viene infatti trasmessa alle progenie, una mutazione somatica ha, invece, effetti e conseguenze solo sulla cellula che subisce la mutazione.Le mutazioni geniche avvengono per sostituzione, delezione o inserzione.Le mutazioni per sostituzione determinano lo scambio di un nucleotide con un altro: la sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno gravi sullaproteina finale. La gravità della mutazione dipende dalla somiglianza tra l’amminoacido sostituito e quello nuovo e dalla posizione in cui avviene la sostituzione. In base al tipo di conseguenze si distinguono tre tipi di di mutazioni per sostituzione:Mutazioni silenti si verificano quando avviene la sostituzione di una base del DNA ma questo non comporta cambiamenti nel codone a cui quella base appartiene: quella tripletta continuerà a codificare per lo stesso amminoacido con il risultato che la proteina ottenuta sarà la stessa. Le mutazioni silenti riguardano la terza base del codone.Mutazioni di senso si verificano quando avviene la sostituzione di una base in modo tale che la tripletta venga modificata: il nuovo codone codificherà quindi per un diverso amminoacido. La proteina ottenuta avrà quindi lo stesso numerodi amminoacidi ma differirà per un solo amminoacido rispetto alla proteina inziale che si sarebbe dovuto ottenere.Mutazioni nonsenso si verifica quando la sostituzione di una base comporta la trasformazione di un codone codificante per amminoacido in un codone di stop.Ad esempio la tripletta AAG, dopo la sostituzione di A con U, diventa il codone di stop UAG.Le mutazioni per delezione o inserzione di una base (mutazioni per spostamento della griglia di lettura –FRAMESHIFT) sono dovute all’inserimento di una base in più nella sequenza del DNA (inserzione) o alla perdita durante la replicazione o riparazione del DNA di una base (delezione). In entrambi i casi, ciò ha come conseguenza l’alterazione della lettura delle sequenza.Fortunatamente, però, esistono dei meccanismi di riparazione del DNA. Tra questi:-riparazione del mismatch: è un sistema di riparazione che rimuove errori di replicazione fatti da DNA polimerasi, si verifica quindi un errore di appaiamentotra il nuovo filamento e il filamento parentale. Il mismatch repair agisce durante il primo ciclo replicativo. Gli enzimi che intervengono sono MutS, MutL, MutH in E. Coli; MSH, MLH e PMS nell’uomo.

-fotoriattivazione: E’ un sistema deputato alla rimozione dei dimeri di timina indotti dalle radiazioni UV. Funziona tramite un enzima che sfrutta l'energia della luce visibile, la DNA fotoliasi, per riconoscere i dimeri e scinderne i legami covalenti, ripristinando così la situazione originaria. Il sistema è ubiquitario.-riparazione per escissione di basi: è un sistema deputato alla rimozione di basinon correttamente appaiate o danneggiate in vario modo (deaminazioni, ecc.); funziona tramite un enzima che rimuove le basi idrolizzando il legame tra base e zucchero, la DNA glicosilasi. Nel sito vuoto risultante può iniziare un processo di riparazione non programmata, oppure può direttamente rimpiazzare la base rimossa con quella idonea.-riparazione per escissione nucleotidica: è un sistema che riconosce i danni causati alla doppia elica da parte di dimeri di pirimidina e grossi addotti alle basi; gli enzimi coinvolti sono UvrA, UvrB, UvrC,UvrD in E. Coli e XPC, XPA, XPD,ERCCI-XPF e XPG nell’uomo.-riparazione di rotture a doppio filamento: il danno riguarda la rottura del doppio filamento; gli enzimi che intervengono sono RecA, recBCD in E. Coli.-sintesi del DNA per translesione: il danno è causato da dimeri di pirimidina e siti apurinici; l’enzima coinvolto è DNA pol tipo Y (UmuC in E. Coli).

LA GENETICA DI MENDELMendel comincia i suoi esperimenti nel 1854, li termina nel 1865, anno della loro pubblicazione. I risultati vengono, però, accantonati per qualche tempo e ripresi successivamente nel 1900. L’accoppiamento tra due individui è un incrocio(x); alla base della trasmissione dei caratteri monofattoriali (ovvero riguardanti un singolo gene) ci sono le leggi di Mendel.La prima legge di Mendel L’incrocio tra due individui della generazione parentale P, ognuno omozigote per due alleli diversi dello stesso gene (BBxbb), dà una generazione filiale F1 costituita da individui tutti identici tra di loro, quindi tutti eterozigoti(Bb).Quadrato di Punnet:

La seconda legge di Mendel (segregazione)Questa legge è strutturata in vari punti: la variazione dei caratteri ereditari è dovuta alla presenza di versioni alternative di un gene(dette alleli); per ogni caratteristica un individuo eredita due alleli, uno da ogni genitore, attraverso i gameti: questi alleli possono essere uguali(si parla allora di omozigote) o diversi (si parla allora di eterozigote); nel caso in cui i due alleli siano differenti, allora quello che esprime il carattere dominante è espresso nell’aspetto dell’organismo, ovvero nel fenotipo, mentre l’altro, quello che esprime il carattere recessivo non ha effetti rilevabili sull’espetto dell’individuo (genotipo); i tratti recessivi vengono comunque trasmessi alle generazioni successive; i due alleli di ogni caratteristica si separano durante la riproduzionedei gameti: ogni gamete, quindi, contiene un solo allele per ciascun gene.L’incrocio tra due individui eterozigoti (BbxBb) dà una progenia, chiamata seconda generazione filiale F2, in cui compaiono genotipi diversi in rapporti definiti e costanti.Quadrato di Punnet: Rapporti:

BB=25%Bb=50%Bb=25%

La terza legge di Mendel (assortimento indipendente L’incrocio tra due individui che differiscono per due caratteri controllaticiascuno da coppie alleliche localizzate su cromosomi diversi(BbSsxBbSs)porta alla formazione da ogni genitore gameti BS, Bs, Bs, bs con frequenza25%.Quadrato di Punnet:

EREDITA’ MENDELIANA NELL’UOMOI caratteri mendeliani sono specificati dal genotipo ad un singolo locus; l’ereditarietà segue le leggi di Mendel; vi è una corrispondenza biunivoca tra genotipo e fenotipo; molte malattie rare hanno eredità mendeliana. Per “malattie rare” si intendono quelle patologie che nella popolazione hanno una prevalenza inferiore a 1:2.000.

LE MALATTIE GENETICHE: LE PATOLOGIEMENDELIANE

Albero genealogico:

MALATTIE MONOGENICHE MENDELIANE

Ogni individuo riceve metà dei propri caratteri (geni) dal padre e metà dalla madre: ogni carattere quindi sarà espresso in “due dosi”, una sul cromosoma paterno, l’altra sul cromosoma materno. I geni quindi determinano un caratterespecifico ed occupano la stessa posizione su una coppia di cromosomi: queste forme alternative dei geni vengono definite alleli.Gli alleli ricevuti dai genitori possono essere identici (aa oppure AA): l’individuo sarà omozigote per quel carattere; oppure gli alleli trasmessi dai genitori possono essere diversi (Aa): l’individuo sarà eterozigote per quel carattere. Un carattere si può esprimere anche quando è presente su un solo cromosoma e viene definito dominante; alcuni caratteri si esprimono quando sono presenti su due cromosomi, cioè il soggetto è omozigote per quel carattere (aa) e vengono definiti recessivi. A questa regola fanno però eccezione i maschi emizigoti: gli individui di sesso maschile, infatti, sono caratterizzati dalla presenza di un solo cromosoma X, e quindi hanno un solo allele per tutti i geni portati da quel cromosoma, tranne i pochi eventualmente comuni all'Y. Il maschio è quindi emizigote per i geni localizzati sulla regione del cromosoma X, in quanto hanno una sola copia dei geni posti sull’X, anziché duplice. Le malattie monogeniche hanno una frequenza di 1/2000.Riepilogo:OMOZIGOTE: entrambe le copie di un determinato gene sono uguali ETEROZIGOTE: le copie di un determinato gene sono diverse per un determinato locusCARATTERE DOMINANTE: è espresso completamente nell’eterozigote (cioè anche in presenza di una sola copia dell’allele dominante)CARATTERE RECESSIVO: è espresso solo nell’omozigoteMALATTIA DOMINANTE: colpisce ogni individuo che possiede almeno una copia dell’allele mutatoMALATTIA RECESSIVA: eterozigote=portatore; omozigote=malato.

Le malattie monogeniche mendeliane sono causate dalla mutazione di un singolo gene. Le malattie monogeniche hanno una frequenza di 1/2000.Si differenziano in:-X-linked, dominanti e recessive;-autosomiche, dominanti e recessive.Tra le malattie monogeniche, quelle autosomiche dominanti hanno una frequenza tra 2-10(per 1000 soggetti), le autosomiche recessive hanno una frequenza pari a 2, quelle legate all’x hanno una frequenza tra 1-2.MALATTIE AUTOSOMICHE-DominantiUna malattia autosomica dominante è una malattia genetica causata dalla forma allelica dominante di un gene difettoso, che giace su un autosoma. Questo tipo di malattia è caratterizzato dal fatto che basta una singola copia dell'allele difettoso per far sì che essa si esprima. Un individuo affetto ha almeno un genitore affetto, vengono colpiti entrambi i sessi, ilfiglio di un individuo affetto ha la probabilità di 1/2 di essere affetto.

Eredità autosomica dominante: Quale è la probabilità che questa coppia abbia un figlio affetto?Maschio affetto Aa, femmina sana aa.Quadrato di Punnet:

La probabilità che la coppia abbia un figlio affetto è del 50%: della prole ½ saranno eterozigoti affetti e ½ non affetti.L’eredità autosomica dominante ha come caratteristiche di trasmissione:

Basta un solo allele mutato per determinare la patologia L’allele mutato può essere trasmesso verticalmente nell’albero

genealogico(trasmissione verticale=il carattere si presenta in tutte le generazioni)

Possono essere colpiti sia maschi che femmine in uguale rapporto Il 50% dei figli nati da una coppia, in cui almeno uno dei genitori è

affetto, sarà affetto.Quando un individuo eredita il gene mutato, significa automaticamente che eredita la malattia(il gene mutato dominante è indicato in grassetto: Aa; in un incrocio tra un sano aa e un affetto Aa, la prole sarà ½ omozigote sana, ½ eterozigote affetta. Quindi tutti i malati sono eterozigoti!).La malattia ricorre quindi quando nella coppia vi è almeno un genitore affetto: ciò genera il rischio di trasmettere la malattia alla metà della prole; non vi è alcun rischio se, invece, entrambi i genitori sono sani. Spesso però nella trasmissione autosomica ci possono essere delle irregolarità, come “apparenti” salti di generazione, quali: non paternità, mutazione “de novo”, espressività variabile (quando si vuole intendere che i sintomi della malattia possono manifestarsi nel soggetto in un grado variabile, che dipende dall’interazione tragene mutato e gli altri geni) penetranza (l’espressività è talmente bassa che la malattia non appare per nulla, questo significa che apparentemente il soggetto malato mostra un fenotipo sano, ma in realtà il gene mutato è contenuto in quell’individuo: si parla di non penetranza o penetranza incompleta), anticipazione(es. distrofia miotonica), insorgenza tardiva (es. Corea di Huntington).Tra le malattie cromosomiche dominanti:

Distrofia Miotonica: è una malattia genetica neuromuscolare degenerativa a carattere autosomico dominante, caratterizzata da un

Dati due genitori, il maschio sano aa, la femmina affetta Aa, dall’incrocio, generanodue figli: un maschio sano aa e una femmina malata Aa. La figlia malata Aa si accoppia con un individuo sano aa, dall’incrocio generano una prole: un maschio aa sano e una femmina affetta Aa. La risultante di questo incrocio genera quindi il 50% di figli omozigoti normali e il 50% di figli eterozigoti mutati.

quadro clinico ampiamente variabile e da un decorso lentamente progressivo, il cui esordio può avvenire a qualunque età. Rappresenta la seconda forma di distrofia muscolare più diffusa dopo la distrofia muscolare di Duchenne. Il quadro clinico è caratterizzato da contrazione prolungata dei muscoli(miotonia), indebolimento muscolare(atrofia), cataratta, difetti di conduzione cardiaca, ipogonadismo.

Ipercolesterolemia familare: è una malattia caratterizzata da un aumentodei livelli di colesterolo plasmatico legato alle lipoproteine LDL(low density lipoproteins, comunemente definite come “colesterolo cattivo”)che si associa ad aterosclerosi(ostruzione delle arterie) aumentando l’incidenza di malattie coronariche; questo difetto genetico è dovuto alla mancanza negli individui affetti del recettore per le LDL il quale è situato sul cromosoma 19.

Rene policistico: è una malattia causata dalla mutazione del gene PDK1 nella maggior partre dei casi o del gene PDK2; i sintomi sono: cisti renali, ridotta funzionalità renale, ipertensione; l’età di esordio è variabile.

Corea di Huntington: è una malattia neurodegenerativa che colpisce la cordinazione muscolare comportando movimenti involontari(corea), problemi psichiatrici, demenza; l’insorgenza è tardiva.

Neurofibromatosi tipo 1: è caratterizzata da diverse manifestazioni a livello cutaneo, oculare e nervoso e neurofibromi multipli dei nervi periferici.

Retinoblastoma familiare: è una patologia oculare che comporta tumori alla retina.

Acondroplasia: è una forma di nanismo che comporta quindi bassa statura di tipo disarmonico, colpisce gli arti, quindi braccia e gambe crescono notevolmente meno rispetto al resto del corpo.

Malattie del collageno: sono quelle malattie che colpiscono il sistema connettivo (comprese elastina, fibrillina e proteoglicani), tra esse: sindrome di Ehlers Danlosm osteogenesi imperfetta, sindrome di Marfan.

Sindrome di Marfan: consiste in un difetto del tessuto connettivo a livello scheletrico, oculare, rotture alle arterie. La frequenza di questa malattia è di 1/5.000 nati vivi. E’ causata da mutazioni del gene della fibrillina-1(FBN1, la quale è una glicoproteina, nonché un componente fondamentale delle fibre elastiche presenti nel tessuto connettivo) sul cromosoma 15q21 o su 3p25.2. Le mutazioni del gene FBN1 sono numerosissime e ad oggi è ancora difficile effettuare una diagnosi precisa. Gli individui affetti dalla sindrome di Marfan hanno un aspetto longilineo, gli arti appaiono lunghi e sottili, le articolazioni sono lasse, presentano molte lussazioni, spesso hanno i piedi piatti, deformità allagabbia toracica e problemi alla spina dorsale(scoliosi, lordosi). I disturbi più gravi che manifestano gli affetti sono comunque di tipo cardiovascolare: il problema maggiore è quello di un’insolita dilatazione dell’aorta, la quale avviene progressivamente nel tempo tanto che può passare inosservata in quanto è asintomatica. Quando le pareti dell’aorta si dilatano si parla di aneurisma aortico, ci può essere il rischio di rottura. Le persone affette dalla sindrome di Marfan

sono spesso alte e agili, anche se questa malattia è una delle principali responsabili di morte improvvisa negli atleti, è vitale quindi la diagnosi precoce e la personalizzazione della malattia.

-RecessiveUna malattia autosomica recessiva è una malattia genetica dovuta a un gene difettoso presente su un autosoma. Questo tipo di malattie può esprimersi fenotipicamente solo quando il genotipo è omozigote per il gene che controlla quel carattere. Sono definiti “portatori” gli individui che presentano per un datogene, un allele sano e uno mutato, con la possibilità di trasmettere un allele difettoso ai propri figli.

Eredità autosomica recessiva: Quale è la probabilità che questa coppia abbia un figlio affetto? I genitori sono entrambi portatori sani, maschio Aa, femmina Aa.Quadrato di Punnet:

La probabilità che la coppia abbia un figlio omozigote normale è del 25%, un figlio eterozigote non affetto è del 50%, un figlio omozigote affetto è del 25%.L’eredità autosomica recessiva ha come caratteristiche di trasmissione:

Sono necessari per causare la malattia due copie dell’allele mutato(=entrambi i genitori sono portatori sani); i genitori sono obbligatoriamente eterozigoti(es. Aa)

I portatori hanno il 25% di probabilità di avere figli affetti: gli individui malati sono omozigoti

Maschi e femmine possono essere ugualmente affetti La trasmissione della malattia nell’albero genealogico è

orizzontale(=sono interessati fratelli e sorelle) Spesso vengono coinvolti geni che codificano per enzimi I figli eterozigoti portatori sani se si accoppiano con un individuo sano

generano una prole caratterizzata da figli non affetti, ma comunque portatori sani

La consanguineità dei genitori è un potenziale fattore di rischio: questo perché i consanguinei hanno antenati comuni, quindi sono più a rischio di essere portatori sani della stessa mutazione genetica. Ciò accade per esempio tra cugini di 1 grado(aumento del rischio dal 3% al 6% di avere un figlio omozigote affetto), 2 grado, tra zio e nipote oppure tra consanguinei di 1 grado(incesto).

Legge di Hardy-Weinberg

In una coppia, i due genitori sono portatori sani: il maschio Aa e la femmina aA.Dal loro incrocio ¼ della prole sarà omozigote normale(AA), ½ eterozigote portatore (Aa e aA) e ¼ omozigote malato

Hardy e Weinberg attraverso questa legge dedussero quali fossero le condizioni necessarie perché la struttura genetica di una popolazione si mantenga invariata nel tempo. Una popolazione all’equilibrio è un’entità astratta, non soggetta a evoluzione; una popolazione resta in equilibrio solo se si verificano determinate condizioni: gli accoppiamenti devono essere casuali, non devono verificarsi mutazioni, non deve esserci flusso di geni(ovvero fenomeni di immigrazione ed emigrazione), la popolazione deveessere di grandi dimensioni, non si deve verificare selezione naturale quindi tutti i genotipi devono possedere le stesse capacità adattive e riproduttive. Se ci sono queste condizioni le frequenze alleliche entro una popolazione rimarranno costanti entro un certo tempo. Tale equilibrio è espresso dalla seguente equazione: p + q = 1 da cui (p + q)^2 = p2+ 2pq + q2= 1. Dove pè l’allele selvatico(comune) e q e l’allele mutato(raro), la loro somma deve essere sempre uguale al 100% degli alleli di quel particolare gene, quindi p+q=1. Data una generazione filiale F1 il cui genotipo è: AA(omozigote sano), Aa(eterozigote portatore), aa(omozigote malato). Se p è la frequenza allelica di A e q è la frequenza allelica di a, le frequenze genotipiche saranno: p2 ,   2 pq , q2 . L’omozigote malato è q2 (frequenza della malattia nella

popolazione), l’omozigote sano è p2 , l’eterozigote portatore è 2 p q . Per

calcolare il numero degli eterozigoti il punto di partenza è la frequenza della malattia nella popolazione. Se ad esempio una malattia ha frequenza 1/2500= q2 , per calcolare q si fa la radice quadrata di q2 :

√(1/2500)=1/50=0,02. Conoscendo q, è possibile ora calcolare la frequenza di p, infatti poiche q+p=1, allora p=1-q cioè p=1-0,02=0,98. Il valore di p è molto vicino ad 1, ad eccezione delle malattie molto comuni. Il valore di 2pq=2 x 0,98 x 0,02= 0,0392= 1/25. Nel caso quindi delle malattie autosomiche rare, la frequenza degli eterozigoti corrisponde a circa il doppiodella radice quadrata di q(q=0,02, p è uguale a circa il doppio di q=2q=0,02x 2= 0,04).

Tra le malattie autosomiche recessive: Fenilchetonuria Galattosemia Beta-Talassemia Fibrosi cistica: è una malattia poli organo dovuta a mutazioni del gene

CFTR che codifica per una proteina,”cystic fibrosis transmembrane conductance regulator”: si verificano delle alterazioni delle funzioni di trasporto elettrolitico a livello di membrana cellulare. Il gene della fibrosi cistica è localizzato sul braccio lungo del cromosoma 7. E’ una delle malattie più diffusa, colpisce infatti nella popolazione di razza bianca circa il 4%, ed è la malattia più diffusa nelle popolazioni di origine caucasica. La manifestazione piena della patologia si verifica soltanto negli individui omozigoti (che presentano cioè mutazioni in entrambi gli alleli del gene CFTR). La sintomatologia, che coinvolge differenti organi interni, è riconducibile all'anomalia nell'escrezione del cloro, normalmente mediata dalla proteina codificata dal gene CFTR. Tale alterazione porta alla secrezione di muco molto denso e viscoso e quindi poco scorrevole. Il Cl viene trasportato verso le cellule

nelle ghiandole sudoripare(test del sudore) e verso il lume nell’epiteliorespiratorio e intestinale(secreto più denso). Gli organi più colpiti dalla fibrosi cistica sono le vie aeree(ostruzione ed infezione), pancres(occlusione dei dotti e insufficienti enzimi digestivi), intestino(occlusione fecale), apparato riproduttivo(nei maschi vi è l’assenza dei dotti deferenti), ghiandola sudoripara(eccesso di cloro nel sudore, per cui è necessario il test del sudore). La proteina CFTR oltre a funzionare come canale del cloro, serve anche per il trasporto di HCO3(acido carbonato). Sono state ritrovate numerosissime mutazioni nel gene responsabile di questa malattia: la frequenza delle mutazioni è variabile in base all’area geografica, per questo è fondamentale, attraverso l’analisi genetica di I livello, ricercare le mutazioni più frequenti nella popolazione. In un frammento del gene CFTR, l’introne 8, si trova il tratto Poli-T, soggetto ad una certa variabilità(polimorfismo, che è una variazione nella sequenza del DNA,la presenza nella maggior parte dei casi non produce malattia): in questo tratto la sequenza del DNA del gene è costituita da una serie ripetuta di timina. Nella popolazione l’80% degli individui possiede la variante 9T(viene prodotta una quantità di CFTR normale), il 15% la variante 7T(viene prodotta una quantità variabile tra il 50% e il 100% della proteina CFTR) e il 5% la variante 5T(viene prodotta una quantitàdi CFTR variabile tra 5% e 30%). Quindi le varianti 7T e 9T sono definite innocenti, la 5T ha invece degli effetti sul funzionamento del gene producendo una sorta di mutazione. Tale effetto non è sempre evidente per cui 5T si considera una mutazione con penetranza variabile, che può essere accompagnata da infertilità(negli uomini si parla quindi di atresia congenita dei vasi deferenti).

Malattia di Tay-Sachs Atrofia muscolare spinale Rene policistico tipo II autosomico recessivo Deficit di Alfa-1-antitripsina Malattia di Wilson Alcune mucopolisaccaridosi (Hurler, Sanfilippo, Maroteaux-Lamy) Atassia di Friedreich

Differenze tra eredità autosomica e eredità recessivaAUTOSOMICA DOMINANTE:carattere espresso anche nell’eterozigoteil 50% dei figli (sia maschi che femmine) è affettoespressione variabiletrasmissione verticaleeffetto dell’età paterna sulle nuove mutazioniAUTOSOMICA RECESSIVA:carattere espresso nell’omozigotebasso rischio per i figli, entrambi i sessi colpiti con la stessa frequenzaespressione intra-familiare costantetrasmissione orizzontaleimportanza della consanguineità

MALATTIE LEGATE ALL’X:La trasmissione dei cromosomi sessuali dai genitori avviene in questo modo: tutti i figli ricevono un cromosoma X dalla madre; il padre trasmette un cromosoma X a tutte le figlie e un cromosoma Y a tutti i figli. Il cromosoma sessuale contenuto nello spermatozoo determina il sesso del futuro bambino. Poiché la femmina ha due cromosomi XX, per un gene localizzato sul cromosoma X potrà presentare tre genotipi: omozigote dominante X A X A ;

omozigote recessivo Xa Xa , eterozigote   X A Xa. Un maschio, invece poiché ha solo

un cromosoma X(è emizigote), può avere solo due genotipi:   X A Y oppure Xa Y.

Questo significa che un maschio manifesterà il carattere contenuto sul cromosoma X, indipendentemente dal fatto che l’allele sia dominante o recessivo, il carattere legato al sesso, quindi si manifesterà con maggior frequenza nei maschi che nelle femmine.-Recessive legate all’x

L’eredità recessiva legata all’X ha come caratteristiche di trasmissione: Colpisce con maggiore frequenza i maschi (i maschi sono malati solo se

la mamma è malata, infatti la malattia non si trasmette da maschio a maschio)

I maschi affetti nascono di solito da genitori sani Le femmine possono essere affette solo se il padre è affetto e la madre è

eterozigote, altrimenti possono essere portatrici e manifestare la malattia nei loro figli maschi.

Tra le malattie recessive legate all’X: Cecità ai colori: è una malattia meglio conosciuta come daltonismo, è

caratterizzata dall’incapacità di capire i colori completamente o in parte

Ritardo mentale Ritardo mentale con X fragile: è una comune forma di ritardo mentale

associata a costrizione all’estremità del braccio lungo del cromosoma X

Distrofia muscolare di Duchenne: è una comune forma di distrofia muscolare letale di solito entro i 20 anni. In generale sotto il termine distrofia muscolare si raccolgono un gruppo di gravi malattie neuromuscolari a carattere degenerativo, determinate geneticamente e che causano atrofia progressiva della muscolatura scheletrica; tra

In una coppia di genitori, il maschio èsano XY, la donna invece XX, è eterozigote per malattia recessiva legata all’X(portatrice sana). Dal loro incrocio la prole sarà: 25% una femmina omozigote sana,25% un maschio emizigote normale, 25% una femmina eterozigote portatrice e25% un maschio emizigote affetto. Quindi il 50% dei figli maschi è affetto, il 50% delle figlie femmine è portatore.

queste distrofie muscolari, vi sono le distrofinopatie (distrofia di Duchenne e distrofia di Becker). Questa malattia è stata una delle prime malattie legate all’X ad essere studiata; ha un incidenza pari a 1/3500 nati vivi maschi. In un incrocio i figli maschi sono malati se e solo se la madre è malata/portatrice in quanto le malattie recessive legate all’X non si trasmettono tra padre e figlio, le femmine eterozigoti sono sane o portatrici e sono malate se e solo se il padre è malato e la madre eterozigote. La distrofia di Duchenne comporta una progressiva perdita del tono muscolare, colpisce nella maggior parte dei casi i maschi e si manifesta in genere dopo i primi due anni di età. Segni caratteristici sono: braccia portate all’indietro, fuoriuscita dell’addome, muscoli delle gambe deboli, perdita di equilibrio(andatura anserina). Dopo l’infanzia è necessaria la sedia a rotelle, non colpisce i muscoli oculomotori, può comportare a volte un deterioramento intellettivo, ci può essere coinvolgimento del cuore e dei muscoli lisci. Un altro tipo di distrofia muscolare è la distrofia di Becker, la quale è una variante allelica della distrofia di Duchenne: è caratterizzata da mutazioni dello stesso gene che producono una ridotta quantità di distrofina, una proteina presente nel tessuto muscolare, che risultando troncata non riesce a mantenere l’integrità del sarcolemma. La differenza tra la distrofia di Duchenne e quella di Becker consiste nel fatto che il difetto nella prima è quantitativo(mancanza della proteina=lenta morte muscolare) e nella seconda qualitativo(la proteina risulta alterata; questa distrofia è meno grave ed ha un esordio più tardivo, intorno ai 5-25 anni di età). Le sedi interessate dalla distrofia muscolare di Becker sono le stesse diquella di Duchenne. Il gene della distrofina si trova localizzato sul cromosoma Xp21.1, è uno dei geni di maggiori dimensioni che si conoscono nell’uomo i cui introni sono costituiti da sequenze molto lunghe(l’elevata lunghezza è alla base della sua elevata mutabilità). Le mutazioni che riguardano la distrofia di Duchenne sono: delezione(nella maggior parte dei casi), duplicazione, mutazione splicing, mutazione non-senso, mutazione frame-shift; la mutazione della distrofia di Becker è una delezione in frame.

Emofilia A: è un difetto di coagulazione del sangue causata da un deficit del fattore VIII, di cui ne era affetta la famiglia imperiale russa dello zar Nicola II.

Ittlosi legata all’X: comporta la formazione di squame cutanee Agammaglobulinemia legata all’X: è un difetto di gamma globulina, un

fattore importante della difesa delle infezioni Emofilia B: è un difetto di coagulazione del sangue causato da deficit del

fattore IX.Inattivazione del cromosoma X(Lyonizzazione): L'inattivazione del cromosoma X, detto anche effetto Lyon o lyonizzazione, è un normale processo biologico che interessa tutte le femmine di mammifero e che consiste nella disattivazione di uno dei due cromosomi sessuali X presenti nelle loro cellule. Tale cromosoma viene silenziato e trasformato in un'unità densa di eterocromatina a formare nei nuclei la cromatina sessuale definita corpo di Barr. Le femmine di mammifero, infatti, possiedono due copie di cromosoma X in ciascuna cellula e la trascrizione dei geni presenti in entrambi porterebbe

dare origine ad una pericolosa sovra-espressione dei loro prodotti, che viene così evitata inattivandone uno dei due. Nella quasi totalità dei mammiferi, il cromosoma da disattivare viene scelto a caso fra i due disponibili. Da ciò derivaquindi la compensazione della dose genica ovvero l’uguale quantità dei geni dell’X nel maschio e nella femmina(effetto dose). In circa metà delle cellule è inattivo l’X materno e nell’altra metà delle cellule è inattivo l’X paterno: le cellule che si originano dalla cellula con uno specifico tipo di attivazione/disattivazione, hanno le stesse caratteristiche, per questo ogni femmina a livello somatico è un mosaico. Una femmina portatrice di una malattia recessiva legata all’X, potrebbe esprimere il fenotipo patologico(quindimanifestare la malattia) se, durante lo stadio embrionale, venisse disattivato il cromosoma X portatore dell’allele normale.-Dominanti legate all’XL’eredità dominante legata all’X ha come caratteristiche di trasmissione:

L’incidenza della malattia è maggiore nelle femmine La donna affetta può trasmettere la malattia ai figli maschi e alle figlie

femmine con la stessa probabilità(50%) Il maschio affetto trasmette la malattia a tutte le figlie femmine, i figli

maschi, invece, saranno tutti sani Non vi è trasmissione tra padre e figlio

In generale l’eredità legata all’X si identifica nelle femmine eterozigoti attraverso l’albero genealogico, il calcolo probabilistico, analisi biochimiche, citogenetiche e molecolari.

ANALISI DEL DNA METODICHE DI BASEEstrazione del DNALe sorgenti da cui il DNA viene estratto sono il sangue, i tessuti, la saliva o qualsiasi altro materiale biologico che contenga cellule nucleate.PCR (Polymerase Chain Reaction)E’ uno strumento di amplificazione del DNA in milione di copie pe un breve periodo di tempo attraverso la replicazione di una molecola stampo; questo processo utilizza sets di oligonucleotidi specifici, definiti primers, sintetizzati in vitro per innescare la sintesi di DNA. Lo stampo di DNA viene sottoposto ad un’alta temperatura a livello della quale il DNA si denatura, vi è una successiva localizzazione dei primers sulle sequenze complementari di stampo(a bassa temperatura) e sintesi di nuovo DNA sullo stampo(alta temperatura)mediata dalla DNA-polimerasi in presenza di nucleotidi. Il tutto è stato automatizzato attraversp una polimerasi termostabile, la Taq polimerasi.Enzimi di restrinzioneTagliano il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze, questi enzimi hanno ilcompito di riconoscere le sequenze palindromiche ovvero quelle zone della struttura primaria del DNA costituite da due successioni di basi ripetute ed invertite(es. CCC GGG GGG CCC).Gel di elettroforesiDopo la digestione da parte di enzimi di restrizione, il DNA viene ridotto in frammenti. L’elettroforesi su gel permette di separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campo elettrico. Il DNA carico – a pH neutro, migra verso il polo opposto +.

IbridizzazioneUna sequenza di DNA si appaia con una sequenza nucleotidica complementare,il DNA appaiatosi, viene portato ad alte temperature e si denatura; ma, riducendo, nuovamente la temperatura le sequenze complementari si ri-appaiano.SequenziamentoServe a determinare l’ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l’acido nucleico. Viene utilizzato il DNA sequencing automatizzato.

EREDITA’ CODOMINANTELa codominanza è un particolare fenomeno genetico che si riscontra quando due alleli ad uno stesso locus genico, si manifestano entrambi in modo completo a livello fenotipico negli individui eterozigoti. Nell'eterozigote un allele(dominante) può prevalere sull'altro (recessivo) ed il fenotipo è determinato solo da un allele (quello dominante). In alcuni casi la dominanza può non essere completa (dominanza incompleta) e a livello fenotipico si manifesta una miscela dei caratteri coinvolti. In altri casi si può manifestare la codominanza: entrambi gli alleli si manifestano nel fenotipo, un allele non sopraffà l’altro.Il gruppo sanguigno di un individuo è determinato dalla presenza o assenza di specifiche componenti di membrana degli eritrociti, chiamate agglutinogeni. I principali sono A, B, D(R h). Di conseguenza i differenti gruppi sanguigni saranno:-sangue ti tipo A, con l’agglutinogeno A, A può ricevere sangue da A e da 0 e può donare ad A e AB; genotipo AO oppure AA, fenotipo A.-sangue di tipo B, con l’agglutinogeno B, B può ricevere sangue da B e da 0 e può donare a B e AB; genotipo BO oppure BB, fenotipo A. -sangue di tipo AB, con entrambi gli agglutinogeni A e B, può ricevere sangue da tutti i gruppi sanguigni, ma può donare solo ad AB; genotipo AB, fenotipo AB. Questo gruppo è un esempio di codominanza infatti è costituito da 3 alleli (IA, IB e I0), la cui combinazione determina 4 fenotipi (gruppi sanguigni): tipo A (IAIA o IAI0), B (IBIB o IBI0), 0 (I0I0) ed AB (IAIB), gli IA e IB sono dominanti su I0e dominanti fra loro.-sangue di tipo 0, con nessun agglutinogeno, può ricevere sangue da 0 e donare a tutti i gruppi sanguigni se si tratta di 0-, altrimenti può donare solo ad A+, B+,0+,AB+ se si tratta di 0+.Ovviamente i vari gruppi sanguigni possono presentare o meno il fattore Rh: la presenza è indicata come Rh positivo(quindi A+,B+,AB+,0+), quando invece questo fattore è assente, si parla di A-,B-,AB-,0-.

EREDITA’ NON MENDELIANAPer “eredità non mendeliana” si intende quel processo in cui ciascuno dei due componenti non segrega secondo le leggi di Mendel: l’eredità non mendeliana riguarda, quindi, i geni extranucleari.L’anticipazione è un caso particolare di espressività variabile e descrive la tendenza di alcune malattie genetiche di diventare più gravi o avere un aumento della penetranza nelle generazioni successive. Questo fenomeno viene spiegato con l’instabilità di certeripetizioni di trinucleotidi che espandendosi possono causare malattie (X-fragile, distrofia miotonica, malattia di Hungtington) dette “mutazioni dinamiche”. La gravità della malattia e la sua insorgenza sono correlate alla lunghezza del repeat.SINDROME DELL’X-FRAGILELa sindrome dell'X fragile (o sindrome di Martin-Bell o FRAX) è una malattia genetica causata dalla mutazione del gene FMR1 sul cromosoma X; la

mutazione di questo gene è correlata alla manifestazione di ritardo mentale: è infatti la seconda causa di ritardo mentale dopo la Sindrome di Down; è una patologia legata all’X. Nei maschi la frequenza è più elevata, si parla di 1/4000 maschi e di 1/8000 femmine. Normalmente il gene FMR1 contiene tra 6 e 53 ripetizioni del codone CGG (ripetizioni di trinucleotidi). Negli individui affetti dalla sindrome dell'X fragile, l'allele FMR1 ha più di 230 ripetizioni di questo codone. Questo grado di espansione provoca un vero e proprio silenziamento dell'espressione del gene FMR1. La metilazione del locus FMR1, che è situato nella banda cromosomica Xq27.3, provoca in quel punto la rottura e la fragilità del cromosoma X, fenomeno che dà il nome alla sindrome. Gli affetti manifestano le seguenti caratteristiche: ritardo mentale(20<IQ>70)più grave nei maschi che nelle femmine, deficit di memoria a breve termine, ritardo nel linguaggio, ridotte abilità visuo-spaziali, ipersensibilità agli stimoli, iperattività, comportamento autistico, macrocefalia con fronte, mento e orecchie sporgenti, anomalie connettivali(es. piedi piatti, articolazioni lasse), disfunzioni ipotalamiche. Se la donna è affetta o portatrice sana può trasmettere la malattia ai figli maschi, per il paradosso di Sherman (modalità di trasmissione della sindrome X-fragile, per cui il rischio di manifestazioni cliniche aumenta nelle generazioni successive secondo il fenomeno dell'anticipazione), invece le figlie dei maschi trasmettitori sono sempre normali ma i loro figli possono essere malati, le figlie di portatori dell’X-fragile sono quindi più a rischio rispetto alle loro nonne di avere figli con ritardo mentale: la penetranza, infatti, aumenta con le generazioni. Nel passaggio da una generazione all’altra, soprattutto nel caso di trasmissione materna, il numero di triplette ripetute tende ad aumentare quindi i maschi figli di portatrici avranno un numero di triplette più elevato rispetto alle madri(oltre le 200 ripetizioni: affetti; inferiore alle 200 ripetizioni:sani). I maschi che ricevono l’allele premutato lo trasmettono invariato alle loro figlie: le figlie di maschi portatori saranno sì normali, ma potranno trasmettere la malattia a loro volta ai loro figli in quanto hanno un maggior numero di ripetizioni(>200) e sono quindi più a rischio rispetto alle loro nonne di avere figli con ritardo mentale.

MALATTIE AD EREDITA’ MITOCONDRIALELe malattie mitocondriali sono quei disturbi causati da alterazioni nel funzionamento dei mitocondri. I mitocondri sono degli organelli a doppia membrana presenti all’interno della cellula, hanno la funzione di produrre ATP convertendo l’energia chimica degli alimenti(respirazione cellulare). La maggiorparte dell’energia utilizzata dal nostro organismo è prodotta proprio dai mitocondri. All’interno della matrice mitocondriale è contenuto il DNA mitocondriale(a doppia elica con forma circolare). Il DNA mitocondriale circa l’1% del DNA cellulare, ha un sistema di replicazione, trascrizione e traduzione indipendente dal DNA nucleare. I due filamenti di DNA mitocondriale sono diversi nella composizione nucleotidica, entrambi vengono trascritti e tradotti, nei geni non vi sono gli introni, il codice genetico è differente dal codice genetico nucleare: il codone UGA, normalmente codone di stop nel codice genetico nucleare, codifica per il triptofano nel codice genetico mitocondriale. Non esiste nel DNA mitocondriale un sistema di riparazione delle mutazioni, seppure esso abbia un’elevata percentuale di mutazione, circa 5-10 volte superiore rispetto al DNA nucleare. Oltre ad essere più sensibile al danno ossidativo, il DNA mitocondriale al momento della fecondazione viene tramesso

esclusivamente per via materna in quanto il citoplasma, in cui sono compresi i mitocondri, proviene solo dall’ovocita.Eredità mitocondrialeTutti i mitocondri dello zigote derivano, quindi, dall’ovocita: la modalità di trasmissione delle mutazioni mitocondriali differisce dalla modalità di trasmissione medeliana classica, infatti la madre portatrice trasmette la mutazione a tutta la progenia(il rischio che le sue figlie femmine siano portatrici è del 50%), ma solo le figlie femmine possono, a loro volta, trasmetterla ai loro figli(i quali non tutti manifesteranno il fenotipo-malattia). I mitocondri paterni, invece, sono distrutti nello zigote e diluiti con i mitocondri dell’ovocita. I maschi affetti o portatori non trasmettono la mutazione a nessuno dei loro figli.Malattie mitocondrialiI mitocondri sono presenti in tutti i tessuti del nostro organismo, quindi le malattie mitocondriali possono colpire qualsiasi organo(sistema nervoso, occhi,cuore fegato, ossa, tratto digestivo, pancreas,reni. Tra le malattie mitocondriali:

Neuropatia ottica ereditaria di Leber, ha come sintomatologia la cecità per degenerazione del nervo ottico

Sindrome di Leigh, ha come sintomatologia la degenerazione dei gangli della base con conseguente perdita delle capacità motorie e verbali

Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and strole-like episodes(MELAS), è caratterizzata da una disfunzione del tessuto cerebrale con conseguente demenza, epilessia, miopatia mitocondriale, acidosi lattica

Chronic progressive external ophtalmoplegia(CPEO), caratterizzata da miopatia mitocondriale e paralisi dei muscoli motori dell’occhio

Molti studi suggeriscono che il DNA mitocondriale sia correllato a patologie degenerative quali la SLA, il Parkinson, l’Alzheimer infatti reperti comuni a queste patologie sono particolari mitocondri abnormi, delezioni del DNA mitocondriale e compromissione della respirazione mitocondriale.

MALATTIE POLIGENICHELe malattie poligeniche sono causate dall’azione di due o più geni e dalla lorointerazione con l’ambiente; hanno una frequenza superiore ad un affetto ognimille individui. Sono dette “malattie poligeniche complesse” quando si verificaquesta interazione tra fattori ambientali e fattori genetici (alcuni esempi sonoautismo, asma, obesità, cancro, diabete).Eredità dei caratteri complessiAlcuni caratteri si ritrovano con maggior frequenza in alcune famiglie rispettoad altre, non mostrando quindi la normale segregazione mendeliana. Ciò èdovuto a due fattori spesso contemporanei:-il carattere è poligenico, ovvero la sua espressione è determinata da uninsieme di fattori genetici,-il carattere è multifattoriale, cioè la sua espressione è determinatadall’interazione di fattori genetici con fattori ambientali.In particolare i caratteri poligenici, che derivano, come abbiamo detto, dall’interazione di più geni, possono presentare una variazione continua

nell’intensità della loro manifestazione. La teoria poligenica dei caratteri quantitativi sostiene che quando un carattere ha una variazione continua (quindi è quantitativo) può essere spiegato dall’azione mendeliana di un

gruppo di geni, ciascuno dei quali dà un certo contributo quantitativo alla determinazione del carattere. Nel caso dei caratteri quantitativi, quindi, ogni singolo gene non determina se quel carattere è presente o meno, ma fornisce un piccolo contributo alla intensità di presentazione di quel carattere, e solo la somma dei contributi dei diversi geni coinvolti determina effettivamente il valore reale osservabile per quel carattere. Un esempio semplice, basato sul classico esempio dell'altezza, si può fare immaginando un gruppo di geni A, B, C... tutti determinanti l'altezza. Ciascun gene potrebbe presentarsi in due formealleliche, tali che ogni allele "collabori", schematicamente, per 5 cm aggiuntivi all'altezza finale se presente nella forma dominante, e causi la perdita di 5 cm di altezza se presente nella variante recessiva. Gli individui che posseggono più di due copie di alleli che conferiscono un aumento di altezza saranno spostati verso valori maggiori della media. Al contrario, meno alleli vantaggiosi possederà l’individuo,minore sarà il valore presentato dal carattere "altezza".Aggiungendo altri alleli degli stessi geni, o altri geni, al gruppo di alleli checontribuisce a determinare il carattere, e in più considerando anche unavariabilità aggiuntiva legata all’ambiente, il grafico tende ad assomigliarerapidamente ad una curva a campana (curva di Gauss), un tipo di distribuzionedei valori che mostra l’assenza di valori che il carattere non può assumere.Nella curva sono comprese tutte le persone e su quella variabile continua èpossibile collocare tutti i caratteri quantitativi continui di ogni persona, la curvaa campana della distribuzione continua rappresenta il numero di fattori checontribuiscono a quel fenotipo. I caratteri discontinui quantitativi sono presentiin quelle persone che si collocano alle code della curva e che hanno pochi(codasinistra) o molti(coda destra) fattori di sensibilità, mentre la maggior parte dellepersone(centro della curva) ha un numero medio di fattori. La discontinuità delfenotipo viene spiegata con un meccanismo a soglia, cioè sviluppano quelfenotipo solo le persone che hanno un numero di fattori di suscettibilitàsuperiore al livello soglia definito come “incidenza di quel fenotipo nellapopolazione”. Ovviamente i consanguinei presenteranno un numero di fattori disuscettibilità maggiore. I fattori che condizionano il rischio di ricorrenza di uncarattere discontinuo sono-gravità del fenotipo-numero di consanguinei affetti-grado di consanguineità con una persona affetta-sesso della persona(ma questo solo per alcuni caratteri).I caratteri normali che mostrano eredità multifattoriale sono invece:circonferenza cranica, colore della pelle, degli occhi, dei capelli, statura,dermatoglifi(numero delle creste sui polpastrelli delle dita), peso corporeo,pressione sanguigna, intelligenza. Tra i difetti congeniti a eredità multifattorialeci sono: cardiopatie congenite, difetti del tubo neurale, labio/palatoschisi,lussazione congenita dell’anca, piedi torti, stenosi ipertrofica del piloro; tra lemalattie ad eredità multifattoriale invece ci sono: asma, cardiopatieischemiche, diabete mellito, ipertensione, obesità, osteoporosi, malattieinfiammatorie croniche dell’intestino, schizofrenia.Il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) è un gruppodi geni polimorfici costituito da 30 unità, localizzato sul braccio corto delcromosoma 6.Le più conosciute codificano per proteine espresse sullamembrana cellulare le quali hanno la funzione di farsi riconoscere da partedei linfociti T. Nell'uomo l'MHC prende il nome di Human leukocyteantigen (HLA). Si è verificato statisticamente che esistono alcune malattie che

risultano colpire con maggiore frequenza individui con un certoaplotipo(=combinazione di varianti alleliche lungo un cromosoma) HLA. Peralcune l'associazione è piuttosto forte, per altre più sfumata. Non sono noti imotivi di questo fatto. Fra le malattie che presentano questa associazione sipossono segnalare l’artrite reumatoide, la celiachia, il diabete insulino-dipendente, l’epatite cronica, la narcolessia….

PREVENZIONE DELLE MALATTIE GENETICHELa prevenzione si articola in-prevenzione primaria: l’obiettivo è non far avvenire la procreazione di individui ammalati; la prevenzione primaria comprende: prevenzione preconcezionale(prima del concepimento), prevenzione prenatale(prima della nascita; in caso di malformazioni o somministrazioni terapeutiche in utero la prevenzione prenatale è anche secondaria),-prevenzione secondaria: l’obiettivo è evitare che la malattia si manifesti.Alla base della prevenzione delle malattie genetiche vi sono una consulenza genetica e test genetici.La consulenza genetica è un processo di comunicazione tra medico e paziente che verte sull’insorgenza e rischio di un disordine genetico nella famiglia, e che ha come obiettivo quello di mettere il paziente in grado di compiere scelte informate e consapevoli. La consulenza comprende le seguentifasi: -raccolta delle informazioni, tramite l’anamnesi personale e familiare, possono essere utili cartelle cliniche, fotografie di familiare;-ricostruzione dell’albero genealogico è una ricostruzione grafica che permette di raccogliere le informazioni genetiche riguardanti l’intera famiglia.Dopo l’analisi genetica si comunica l’esito al paziente, si valuta il rischio e le eventuali azioni preventive.I test genetici sono delle analisi particolari mirate ad individuare la presenza, l’assenza o la mutazione di un cromosoma. Sono diversi dalle solite analisi di laboratorio perché i risultati per l’individuo sono permanenti, possono essere eseguiti con finalità diagnostiche o preventive, i risultati potrebbero avere delleconseguenze anche per gli altri familiari, potrebbero rilevare informazioni non desiderate come la paternità. Test genetici tradizionali sono:-test diagnostici, rivolti alle persone che hanno o sospettano una malattia poiché ne presentano i sintomi; eseguiti durante la vita prenatale o duranti il corso della vita;-test di identificazione portatori sani, i quali individuano mutazioni comuni in determinati gruppi etnici(es. la fibrosi cistica);-test presintomatici, applicati a persone che non hanno sintomi clinici ma sono a rischio di sviluppare una patologia con esordio tardivo(es. Corea di Huntington);-test predittivi o di suscettibilità, hanno la funzione di identificare i genotipi che non causano la malattia ma resistenza o suscettibilità di svilupparla, in seguito a esposizione a determinati fattori ambientali favorenti o altri fattori genetici scatenanti; il risultato quindi può solamente predire il rischio aumentato o diminuito di contrarre una certa malattia;-test farmacogenetici, con il compito di fornire indicazioni sulla risposta individuale ai farmaci.Ovviamente questi test devono rispettare le raccomandazioni della Società Europea di genetica umana(diritto ad essere informati, qualità del test, utilità

clinica, supporto, protezione delle persone incapaci di esprimere il loro consenso, rispetto dei principi etici). In generale quindi i test genetici servono adiagnosticare una malattia, a identificare il portatore sano di una malattia recessiva, effettuare una diagnosi pre-sintomatica, riconoscere una certa suscettibilità del paziente ad ammalarsi di una certa malattia, diagnosticare malattie gravi in vita pre-natale. I risultati dei test genetici possono essere di due tipi:-mutazione presente: comprende a sua volta due casi particolare:

o Aumento del rischio di malattia: la presenza della mutazione indica quindi un rischio aumentato di sviluppare la malattia;

o Variante di significato sconosciuto: la presenza della mutazione nonindica necessariamente l’associazione alla malattia, in questo caso si parla di una variante innoqua e quindi di polimorfismo.

-mutazione assente: comprende a sua volta due casi particolari:o Risultato del test negativo: nell’individuo è assente la mutazione;o Risultato del test non informativo: nell’individuo non è presente la

mutazione, anche se il quadro familiare della famiglia suggerisce una base genetica della malattia; questo potrebbe significare che leattuali tecnologie non sono in grado ancora di captare quella mutazione, c’è un altro gene non identificato che potrebbe causare la malattia in quell’individuo, una mutazione non identificata è presente nella famiglia ma non è stata identificata dall’individuo, nonostante la storia familiare l’occorrenza della malattia è un evento casuale.

La diagnosi prenataleEsempi di diagnosi prenatale sono:

Screening ecografico della trisomia 21 nel I trimestre di gravidanza(11-14settimane): translucenza nucale(NT), serve ad identificare il rischio di trisomia 21; alcune carattestiche del feto affetto da trisomia 21 sono la plica nucale>6mm, osso nasale non evidenziabile, cisti plessi corioidei, ipercogenicità intestinale, femore corto, omero corto; oltre a questo test, si effettua un test combinato che include free-beta HGG, pregnancy-associated plasma protein A(PAPP-A). A 15-16 settimane si effettua un triplo test per verificare effettivamente la presenza della sindrome di Down: se il feto ne è affetto, nella mamma i valori di alfaproteine sono bassi, diminuiscono i livelli di estriolo non coniugato e aumentano quelli di hCG totale. Il test integrato poi, integra appuntoi dati ecografici(NT,osso nasale…), i dati del bitest e quelli del tritest fornendo un unico risultato e facendo in modo che così facendo il test sia più efficace.

Amniocentesi: è una procedura che consente il prelievo transaddominaledi liquido amniotico(20 ml) dalla cavità uterina; è la metodica più diffusa per ottenere campioni biologici utili al fine di effettuare una diagnosi prenatale; si effettua tra la 16esima e la 18esima settimana di gravidanza; può comportare contrazioni, perdita ematica,perdita di liquido, infezione; si verifica l’aborto nello 0.05% dei casi. Faparte della diagnosi prenatale invasiva. Viene eseguito in laboratorio, si eseguono esami preliminari come l’identificazione del gruppo sanguigno e fattore Rh perché si trattano le donne cRh- con immunoprofilassi. Le procedure con cui si esegue l’amniocentesi sono

innanzitutto la disinfezione cutanea, dopo di che viene infisso un ago sterile tramite la tecnica a “mano libera”, ovvero il medico tiene in una mano la sonda e nell’altra l’ago per poter dirigere il fascio di ultrasuoni, oppure tramite la tecnica “ago-guidata” in cui l’ago è fiddato al trasduttore e percorre una traiettoria fissa. Comunque giunto in cavità l’ago, viene effettuata con una siringa sterile il prelievo di liquido amniotico, dopo di che si estrae l’ago e si controlla ilbattito cardiaco fetale. Il materiale esaminato sono cellule di liquido amniotico provenienti da sacco amniotico, epidermide, mucosa del tubo digerente, tratto respiratorio e urogenitale. Le metodologie di indagine sono di due tipi: cloni in situ, in cui l’analisi avviene per colonie, con cui vi è una migliore valutazione diagnostica e i tempi di coltura sono più brevi; metodo in fiasca, si perde l’individualità dei cloni, vi è una maggiore crescita cellulare.

Villocentesi: è il prelievo dei villi coriali (20 mg), ha un approccio transaddominale, si fa in ambulatorio con alcuni esami preliminari(gruppo sanguigno e fattore Rh), in quanto si somministra una terapia di immunoprofilassi nelle donne Rh-. Serve a rintracciare malattie mendeliane come talassemia, fibrosi cistica, distrofia muscolare di Duchenne, emofilia. Può comportare dolori crampiformi, perdita ematica, infezione; l’aborto si verifica nel 3% dei casi. Fa parte della diagnosi prenatale invasiva. Grazie alla villocentesi è possibile anche effettuare un’analisi del cariotipo fetale: vengono infatti esaminate le cellule del trofoblasto(è un tessuto cellulare che nutre l’embrione, vengono analizzate le cellule del trofoblasto perché si parte dalla considerazione che trofoblasto e feto originano dallo stessotessuto). La metodologia di indagine con cui si può analizzare il trofoblasto può essere: una coltura diretta in cui si analizzano le mitosispontanee presenti nel trofoblasto dopo 48-72 h dal prelievo, è una metodica rapida, con minori rischi per le cellule materne; una coltura a lungo termine in cui vengono allestite le colture previo trattamento dei villi con enzimi proteolitici per disgregare le cellule, può avvenire però la contaminazione con cellule materne.

L’analisi citogenetica prenatale standard non consente di stabilire una precisa correlazione cariotipo-fenotipo in alcuni casi(mosaici, piccoli cromosomi markersoprannumerari, inversioni de novo, aneuploidie dei cromosomi sessuali, traslocazioni reciproche e complesse de novo). Per mosaicismo si intende la presenza in uno stesso individuo di due o più linee cellulari a cariotipo diverso; il mosaicismo può derivare da anomalie in vitro o derivate da tessuti extraembrionali(livello I=pseudomosaicismo a singola cellula, livello II =pseudomosaicismo a cellule multiple) oppure può derivare da un’anomalia cromosomica in almeno 2 fiasche di coltura indipendenti(livello III=mosaicismo vero). L’approfondimento diagnostico può essere: di base(vengono esaminate 20 cellule provenienti da 2 colture indipendenti, una delle quali può contenere la colonia anomala), moderato(devono essere esaminate 20 cellule da una coltura supplementare), ampio(devono essere esaminate 20 cellule da ciascuna di 2 ulteriori colture, escludendo la coltura con l’osservazione iniziale).Altri esempi di diagnosi prenatale:Cordocentesi: è il prelievo di sangue fetale dal cordone ombelicale; si può effettuare dalla 12esima settimana ma in genere si preferisce farlo dopo la

18esima settimana. E’ in grado di determinare rapidamente il cariotipo fetale, anche se la risposta diagnostica è piuttosto rapida (48-72h), sono maggiori i rischi di complicanza ed è maggiore la difficoltà di esecuzione.Diagnosi genetica pre-impianto: si tratta di un prelievo allo stadio di divisione di8-12 settimane di cellule senza creare alcun tipo di danno all’embrione, dopo ladiagnosi qualora non ci sia alcun tipo di disordine genetico gli embrioni selezionati possono essere trasferiti in utero, altrimenti possono essere scartati se è presente un disturbo genetico. Le indicazioni per poter eseguire questo tipo di diagnosi: l’età materna deve essere maggiore o uguale a 35 anni, deve essere nato un precedente figlio affetto da malformazioni o alterazione dei cromosomi, genitori con alterazione dei cromosomi sessuali, patologia fetale ecoevidenziata, indicazioni biochimiche, malattie mendeliane, altre indicazioni particolari. Il DNA fetale è individuabile già a partire dalla 4 settimana e utilizzabile dalla 9, ovviamente aumenta con l’avanzare della gravidanza e scompare subito dopo il parto.NIPT, non invasive prenatal testing: non è una tecnica di diagnosi invasiva; milioni di frammenti di DNA materno e fetale vengono sequenziati simultaneamente tramite tecniche Next Generation Sequencing(NGS): ognuno di questi frammenti viene assegnato al cromosoma di partenza, se ci sono aneuploidie ci sarà un eccesso o un difetto del DNA libero per il cromosoma interessato. Questo è un test innovativo, semplice e sicuro per il feto e non invasivo; può identificare le principali anomalie come trisomia 21, 18, 13 e monosomia X.

In generale, un paziente con un risultato positivo ad uno dei test deve essere indirizzato verso la consulenza genetica e la diagnosi prenatale invasiva per poter avere conferma dei risultati positivi dei precedenti test.

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