OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS A TRAVS DEL MICROSCOPIO

MICROSCOPIO PTICOEntorno de trabajo del microscopio ptico

UNIDAD 1Los microscopiosTipos de microscopios Las clulas que componen los organismos no son visibles a simple vista, por lo que, para poder estudiarlas, es necesario emplear instrumentos que aumenten las imgenes. Estos instrumentos son los microscopios, que son, principalmente, de dos tipos:MICROSCOPIO PTICOMICROSCOPIO ELECTRNICO

TIPOS DE MICROSCOPIOS

Microscopio estereoscpico o lupaAparato simple que forma una imagen aumentada. (app. 540 veces)Mayor poder de penetracin que el microscopio de luz

Microscopios CompuestosPoseen dos lentes que producen una imagen ampliada, vertical e invertida al objetoMicroscopio ptico, fotnico o corrienteEs de campo claro ya que la luz que llega perpendicular a la preparacin, la atraviesa y penetra el sistema ptico, permitiendo un campo bien iluminado.Clula de Pisum, coloracin: safranina-fast-greenTraqueidas del leo de Pinus

El microscopio ptico tiene un lmite resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m). Las clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar vivas o fijadas y teidas.

UNIDAD 1Los microscopiosEl microscopio ptico Est formado por un sistema de lentes y emplea para iluminar un haz de luz. Aumenta las imgenes hasta 1000 veces. Sus principales componentes son:

MICROSCOPIO PTICOLos aumentos del objetivo en usose multiplican...por los aumentos del ocular

MICROSCOPIO PTICODependiendo del objetivo escogido obtendremos mayor o menor campo de visin y, en correspondencia, mayor o menor profundidad de campoObjetivo menor mayor campo, mayor profundidad de campo o de enfoqueObjetivo mayor menor campo, menor profundidad de campo o de enfoqueSi cerramos el diafragma mayor profundidad de campo, pero menos luzSi abrimos el diafragma menor profundidad de campo, pero ms luz

MICROSCOPIO PTICOMoviendo el tornillo micromtrico (nunca ms de una vuelta) alternativamente hacia delante o hacia atrs, podremos apreciar nuevos detalles en la preparacinAqu, por ejemplo, logramos ver los cloroplastos de estas clulas vegetales al mover ligeramente hacia atrs o hacia delante el tornillo micromtrico

UNIDAD 1IMGENES OBTENIDAS CON EL MICROSCOPIO PTICO Este tipo de microscopio permite observar clulas vivas y los movimientos que realizan mantenindolas en su medio.Protozoos

UNIDAD 1 Tambin permite observar tejidos en finos cortes, pero en este caso hay que fijar las muestras, de manera que las clulas estn muertas. Para ver mejor las muestras pueden teirse con colorantes especficos que destaquen estructuras como el ncleo o la pared celular. CLULAS ANIMALESCLULAS VEGETALESIMGENES OBTENIDAS CON EL MICROSCOPIO PTICO

Microscopio de Hooke (1665)UNIDAD 1 Los primeros microscopios datan de 1610. Fueron inventados por Galileo Galilei. Algunos cientficos de la poca, como Malpighi o Hooke, los utilizaron.HISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO

UNIDAD 1 A mediados del siglo XVI, el holands Anton van Leeuwenhoek fabric microscopios con lentes esfricas. Con ellos realiz numerosas observaciones. Algunos de aquellos microscopios superaban los 200 aumentos.Microscopio de LeeuwenhoekHISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO

Poco a poco, los microscopios fueron sufriendo mejoras que permitieron hacer nuevos descubrimientos en el campo de la biologa celular.Microscopio del siglo XIXHISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO

UNIDAD 1 Los microscopios pticos modernos permiten aumentar la imagen ms de mil vecesMicroscopio actualHISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO

Microscopio ptico de campo oscuroEl microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen.El objeto iluminado dipersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada.Las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes.Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia.

Microscopio de contraste de fasesSe usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear. Es ideal para espcimenes delgados, o clulas aisladas Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective

Microscopio de contraste de fasesEs un microscopio ptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad.Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminacin de tal manera que vaya en diferentes rutas a travs de las distintas partes de una clula.El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.Con este mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras.Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.

Microscopio de contraste de fases

Microscopio de fluorescencia Usa luz U.V. con una longitud de onda (100 y 380 nm) menor que la luz blanca (380 a 750 nm). Esta luz excita ciertas sustancias que emiten radiaciones (mayor a 380 nm) que las hace visibles. Algunos materiales no requieren colorantes pues tienen fluorescencia propia y otros deben ser teidos con colorante fluorescente, es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos luminosos.Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo (azul), microtubulos (verdes), actina (rejo).

Microscopa de FluorescenciaEl microscopio de fluorescencia es una variacin del microscopio ptico, dotado de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda.Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo.Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.

Diagrama de Microscopio de Fluorescencia

Est formado tambin por un sistema de lentes complejo pero emplea para iluminar un haz de electrones en vez de luz. Aumenta las imgenes hasta un milln de veces. Sus principales componentes se encuentran en el interior del sistema y son:Objetivos. Lentes que aumentan el tamao de la imagen (internos).Iluminacin. Can de electrones que genera un haz que puede atravesar la muestra o rebotar en ella (interno).EL MICROSCOPIO ELECTRNICO

UNIDAD 1 Este tipo de microscopio slo permite observar clulas muertas, pero la ventaja es que permite estudiar las estructuras internas de los orgnulos celulares y por tanto de las clulas. En este caso las muestras deben ser muy finas para que puedan ser atravesadas por los electrones y tambin tienen que estar deshidratadas.IMGENES OBTENIDAS CON EL MICROSCOPIO ELECTRNICO

Microscopio electrnico Posee mejor poder de resolucin y aumento que los microscopios antes mencionados.Permite visualizar la ultraestructura celular

El microscopio electrnico de transmisin (MET) tiene un limite de resolucin de cerca de 2 nm. Un MET permite observar profundidades despus de haber sido fijadas y teidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a travs de una fina seccin del espcimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.

El microscopio electrnico de barrido (MEB) tiene un limite de 2nm. El MEB permite observar la superficies de las muestras, despus de haber sido fijadas y teidas con iones de metales pesados. Con esta tcnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espcimen.

Microscopios electrnicos: Estos microscopios son grandes y complejos. Utilizan electrones en vez de luz y aumentan los objetos hasta 250.000 veces. Las imgenes que se producen son en blanco y negro y muchas veces tienen colores falsos.

Microscopio ElectrnicoTransmisinBarrido

Microscopio electrnicoEn el Microscopio Electrnico la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (con vaco para mejorar el paso de los electrones).Permite la observacin de las estructuras interiores de las clulas.Sirve para visualizar virus.Tiene una resolucin de 10 A (se pueden ver objetos muy pequeos, incluyendo algunas molculas).

Microscopio electrnicoUn haz de electrones es lanzado por un can en el que se establece una diferencia de potencial, entre el ctodo y el nodo.El chorro de electrones pasa a travs de la muestra a observar, que est colocada en una rejilla.Los electrones chocan con la muestra y se desvan, y estas desviaciones son recogidas por la pantalla.Observamos la imagen a travs de una pantalla que es excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo similar a la televisin). Las imgenes las recogemos mediante una placa fotogrfica que es impresionada directamente por los electrones.

El Microscopio Electrnico de Transmisin(MET) El microscopio electrnico de transmisin (MET) tiene un limite de resolucin de cerca de 2 nm. Un MET mira a replicas de clulas muertas , despus de haber sido fijadas y teidas con ones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a travs de una fina seccin del espcimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.

El microscopio electrnico de transmisin (MET) trabaja iluminando, un ejemplar en la platina con un haz de electrones y enfocando y aumentando la imagen con lentes magnticas. Esta imagen electrnica, que es invisible, se transforma en una imagen normal, visible mediante una pantalla especial.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN

El Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)

El microscopio elctrnico de barrido (MEB) tambin tiene un limite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a clulas muertas, despus de haber sido fijadas y teidas con ones de metales pesados. Con esta tcnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espcimen.

El microscopio electrnico de barrido (MEB) sirve para examinar la superficie de los objetos. Produce imgenes de gran aumento (ms de cien mil veces) y muestra la forma real de los objetos. Adems de mostrar increbles figuras, el microscopio electrnico investigador muestra detalles que pueden ser de vital importancia para cientficos en muchas reas, como la medicina. Trabaja examinando la superficie de un objeto con un delgado haz electrnico.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO

Microscopio de Campo ClaroAlga verde(eucariota)Microscopio deFluorescencia

Bacteria filamentosaTeida con naranja de acridinaMicroscopaConfocal por Lser

CianobacteriafilamentosaMicroscopio de Contraste de FasesSaccharomyces cerevisiae

Observa detenidamente las siguientes fotos tomadas mediante microscopio (micrografas) y seala qu tipo de microscopio se utiliz en cada caso. Justificaa. Ameba, organismo formado por una sola clula (unicelular), que mide cerca de 50 micronesb. Clulas del interior de una trompa de Falopio. Cada uno de los pelitos que se ven mide 10 micrones de largo y se llaman cilios c. Espermio acercndose a un vulo. El vulo humano es una clula que mide poco ms de 100 micrones

d. Ncleo de una clula animal, de alrededor de 5 micrones de dimetro e. Corte transversal de una hoja f. Poros de salida de glndulas gstricas. Por una de ellas sale un chorro de jugo gstrico

Para obtener el mximo aprovechamiento de la observacin microscpica, debe poder relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y composicin qumica de las diferentes partes de la anatoma bacteriana.Los colorantes utilizados en Microbiologa son compuestos orgnicos que contienen grupos cromforos y auxocromos unidos a anillos aromticos.TINCIONES :COLORANTES

TINCIONES :COLORANTESLos colorantes son un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpoSegn su origen;NaturalesSintticos, o artificialesSegn sus propiedades qumicas:cidosBsicosNeutros Indiferentes

La distincin entre colorantes cidos y bsicos depende de la carga de la parte de la molcula responsable del color.

Si es negativa se trata de un colorante cido y si es positiva se trata de un colorante bsico.

Esta diferencia es importante debido a que, segn sean cidos o bsicos, los colorantes tendrn afinidad por diferentes zonas de la anatoma celular.

Algunos colorantes utilizados comnmente en Microbiologa son fucsina bsica, cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.COLORANTES

En algunas coloraciones se utilizan sustancias capaces de formar complejos insolubles con los colorantes y que ayudan al proceso de coloracin: los mordientes. Ejemplos de mordientes comnmente usados son el Lugol, el cido tnico y algunas sales.MORDIENTES

VENTAJAS DE LOS COLORANTESFacilitan la identificacin de clulas, bacterias y objetos microscpicos en general

Los colorantes tien de forma parcial, total o gradual las diferentes estructuras que integran los objetos y principalmente los productos que se desea observar

PREPARADOS PARA MICROSCOPIA OPTICA. PROCEDIMIENTO GENERAL.

Los pasos fundamentales previos a una coloracin son: extendido, secado y fijado.a) Extendido: se coloca una pequea porcin de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el asa en forma de valo. Para muestras provenientes de medios slidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos.b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero.c) Fijado: la fijacin tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloracin as como tambin preservar la forma original de los microorganismos.El procedimiento ms comn es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta tcnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos ms suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetrxido de osmio, cido pcrico, etc.Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloracin, los preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporos. Por consiguiente siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaucin.

Observacin en fresco y coloracin vital.Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una observacin en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diluidos como por ejemplo cristal violeta 1/5000. Con esta tcnica podr observarse la morfologa y agrupacin de las bacterias as como tambin la movilidad.Observacin en fresco.Tcnica.1- Sobre un portaobjetos colocar con el ansa una gota de agua y realizar una suspensin de la muestra en estudio. No extender.2- Colocar un cubreobjetos.3- Observar con poca luz.

Coloracin vital.El procedimiento es similar al de la observacin en fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de solucin diluda de colorante en lugar del agua.Existen portaobjetos especiales para realizar estas observaciones en los cuales es posible colocar una mayor cantidad de lquido. Son los portaobjetos de Boettcher y de Ranvier.Coloracin simple.Esta coloracin permite la observacin de la morfologa y agrupacin de los microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes ms utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y el azul de metileno. En general se utilizan en soluciones acuosas al 1 %.Tcnica.1- Extender, secar y fijar por calor.2- Aplicar solucin de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de la coloracin depende de la concentracin y del colorante utilizado. 3- Lavar con agua corriente.4- Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersin.

TINCIN SIMPLE

Tincin negativa.Para esta coloracin, se utilizan sustancias que no penetran en la clula y por lo tanto se tie el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamao de las bacterias observadas por esta tcnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medicin de microorganismos.Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa. Con este mtodo pueden observarse morfologa y agrupacin as como tambin estraucturas extracelulares como la cpsula.Tcnica.1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una solucin acuosa de nigrosina al 10 %.2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma de valo.3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersin.

COLORACIONES ESPECFICAS.Coloracin de Gram.Esta coloracin fue ideada por el bacterilogo dans Christian Gram en el ao 1883 y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonmica.En esta tcnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) sern las que resulten violetas luego del procedimiento de coloracin de Gram mientras que las Gram (-) se vern rojas.La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+) y G(-), debe buscarse en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana.

TINCIN DIFERENCIAL

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