CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Y ANTIBIOGRAMA

esterilización

IntroducciónEl objetivo de la práctica es el cultivo de microorganismos en medios de cultivo preparados.Si hubiera tiempo, los prepararíamos nosotros mismos.Hay que asegurarse de tener un medio estéril y una superficie de trabajo limpia.La superficie de trabajo se limpiará con agua y jabón.Después de secarla se pasará un paño con una solución de etanol al 70%.Para esterilizar la zona de trabajo se utilizará un mechero de alcohol o gas.

IntroducciónLos medios de cultivo y material de vidrio se esterilizan en autoclave o en olla a presión, a 120 ºC durante 20-30 minutos.Los medios con nutriente sólido, gelificante, se disuelven a la temperatura de esterilización, pero solidifican al enfriar (42 ºC)Habrá que procurar pasar los utensilios (asas de siembra, objetos de vidrio, bocas de frascos) por la llama siempre que se considere necesario.

Medios de cultivo Se preparan disolviendo en agua (a poder ser destilada) una cantidad de extracto nutritivo en polvo (el fabricante indica en el envase la cantidad por litro de agua)Se utilizan extractos de proteína digerida enriquecida con vitaminas u otros nutrientes.Cada tipo de bacteria requiere una dieta por lo que utilizaremos medios ricos en nutrientes energéticos, estructurales, vitaminas, oligoelementos, etc que sirvan para un gran número de bacterias.Al tener poco tiempo, hemos utilizado medios de cultivo de los que vienen ya preparados en placas Petri.

Materiales

Placas Petri preparadas con agar y nutrientes.Matraces con líquido nutritivo, (nosotros, no).Asas de siembra y/o bastoncitos. Papel de filtro. Mecheros.Estufa.Sustancias antibacterianas.Distintos medios para

toma de muestras.

Materiales generales

Mechero de alcoholMechero de bombona

Mechero Bunsen

Toma de muestras y siembra

Toma de muestrasSe tomarán muestras de diferentes lugares:

Sarro dental con bastoncillo. Huella dactilar sobre el medio de cultivo sólido. De un pomo de puerta con bastoncillo.De cualquier superficie o sustancia (yogur, mucosa bucal, bolígrafo sobre cultivo, etc.)

Cada grupo de alumnos elegirá el lugar de la toma de muestra.Se apuntará el lugar, la fecha y la hora de la toma de muestra.

SiembraPara realizar la siembra, se ha de poner en contacto el algodón del bastoncillo (o la punta del bolígrafo o la huella dactilar, etc.) con el medio de cultivo (superficie gelatinosa de la placa Petri en nuestro caso; si el medio fuera líquido, se sumergiría el bastoncito en él)La siembra se hace moviendo el bastoncito (o lo que sea) sobre el medio de cultivo sólido en espiral o en zigzag.En cualquier caso, se debe trabajar cerca de una llama de mechero para evitar en lo posible la contaminación.Las placas o los matraces en el caso de medio líquido, se han de rotular, indicando tipo de medio, tipo de toma y fecha de inoculación.

Incubación y crecimiento

IncubaciónUna vez hechas las siembras, se introducen las placas, cerradas y boca abajo, en una estufa, a 37 ºC durante 48 horas.Si el cultivo es líquido hay que tener en cuenta que los matraces deberán estar aireados para bacterias aerobias y sin aireación, para bacterias anaerobias.Si las bacterias son aerobias y no se posee mecanismo de aireación, el crecimiento será más lento y la biomasa obtenida, menor.Si las muestras son del ambiente (pomo puerta, huella dactilar, etc.) en placa Petri, aparecerán distintas cepas de color, forma y textura diferente (policultivo)

CrecimientoDespués de la incubación el resultado será:

En medio sólido en placa Petri, se verán unas protuberancias o granitos de diferentes formas, texturas y colores, dependiendo de donde sea la muestra.En medio líquido en matraz aparecerá turbidez.

Si se ha obtenido un policultivo, se pueden extraer de él monocultivos tomando una muestra de las distintas cepas y sembrando cada una en una nueva placa Petri con un asa de siembra o con un bastoncito.

Crecimiento

Crecimiento

Sensibilidad a sustancias antimicrobianas:

antibiograma

MecanismoSe coge un poco de la cepa que queremos estudiar con un bastoncito o asa de siembra.Se diluye en un poco de agua.Se toma una gota y se distribuye por toda la superficie de una placa Petri con medio de cultivo.Sobre la superficie sembrada se ponen unos discos de papel de filtro, de unos 0,5 cm de diámetro, impregnados de distintas sustancias antibióticas.

MecanismoSe incuba a 37 ºC y al cabo de 18-21 horas (si son 24, no pasa nada) se observan las muestras.Si la cepa es sensible a la sustancia antibacteriana, aparecerá un halo sin crecimiento alrededor del papel de filtro con esa sustancia.Cuanto mayor es el halo, mayor sensibilidad.Si no aparece halo, no hay sensibilidad a esa sustancia.

AntibiogramaComo sustancias antibacterianas podemos usar:

Jugo de ajo machacado.Lejía.Algún colutorio bucal.Zumo de limón.Algún antibiótico diluido en un poco de agua.

Tinción GramCon los cultivos obtenidos vamos a realizar una práctica de tinción Gram.La tenéis en otra presentación por ser una práctica que se hace en otra sesión.