Limit Deteksi

PREPARASI SAMPEL & VALIDASI METODE by : Agung Tri PrasetyaPengambilan SampelPengambilan sampel dari populasi dilakukan sedemikian rupa sehingga sampel mewakili populasi secara representatif.

Preparasi SampelPelarutan sampelSampel untuk analisis dengan AAS nyala harus dilarutkan terlebih dahulu.Pelarut yang sering digunakan:Air dingin, panasHCl encer dingin, panaspekat dingin, panasHNO3 encer dingin, panaspekat dingin, panasAqua regia (HNO3 : HCl = 3 : 1) dingin, panasCampuran beberapa asamJika sampel mengandung Si maka perlu ditambah dengan HF.

Pemisahan analit dari interferen Jika diperlukan, analit yang akan diukur konsentrasinya dengan AAS dipisahkan dari interferen dengan cara:Gravimetri EkstraksiPerlu dilakukan optimasiKromatografi, dll Perlu studi literatur:Komposisi dari sampel, ada interferen/tidakKemungkinan penyebab interferensi jika diukur dengan AAS (bisa dilihat dalam manual alat)

Analisis Ca dengan AASInterferensi:Ionisasi dapat dicegah dengan penambahan garam alkali (0.1% atau lebih CaCl2 ke dalam sampel dan standar)Reduksi absorbansi oleh adanya garam oxy yang stabil penambahan 0.1-1.0% La atau Sr

Analisis Cd dengan AASInterferensi:Adanya silikat yang tinggi dapat menyebabkan interferensi Cd

Analisis Co dengan AASInterferensi:Adanya logam berat dan transisi yang berlebihan dapat menurunkan absorbansi Co, modifikasi matriks sangat penting.Analisis Cr dengan AASInterferensi:Adanya Ni dan Fe dapat menaikkan absorbansi Cr. Interferensi dari Fe dapat diatasi dengan penambahan NH4Cl 2% ke sampel dan standar.Adanya pospat dapat menurunkan abs Cr, yang dapat diatasi dgn penambahan Ca.

Analisis Cu dengan AASInterferensi:Penggunaan lampu multi elemen dapat terganggu oleh Ni atau Fe.

Analisis Fe dengan AASInterferensi:Adanya logam Co, Cu dan Ni dapat menurunkan absorbansi Fe.Adanya silikon dapat menurunkan absorbansi Fe, dapat diatasi dengan penambahan 0.2% CaCl2

Analisis Mg dengan AASInterferensi:Adanya Al, Si, Ti dan pospor dapat menurunkan absorbansi Mg, dapat diatasi dengan penambahan 0.2% LaCl2Interferensi ionisasi 0.1% KCl dalam sampel dan standar

Analisis Mn dengan AASInterferensi:Adanya Si, dapat menurunkan absorbansi Mn, dapat diatasi dengan penambahan 0.2% CaCl2Adanya unsur lain yang berlebihan dapat menyebabkan interferensi (contoh Fe 10000 ppm dapat menaikkan signal Mn)

Analisis Ni dengan AASInterferensi:Adanya Fe, Cr yang tinggi dapat menaikkan absorbansi Ni, dapat diatasi dengan penggunaan bahan bakar N2O asetilen tetapi sensitivitas menurun.Analisis Pb dengan AASInterferensi:Adanya unsur lain yang berlebihan (misal Fe 10.000 ppm) dapat mengganggu signal Pb.Contoh Preparasi SampelAnalytical Methods for AA Spectroscopy (hal 142)VALIDASI METODEAdalah suatu proses untuk mengkonfirmasi bahwa suatu metode mempunyai unjuk-kerja (performa) yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode tersebut Suatu proses untuk membuktikan bahwa suatu metode uji layak (absah) dipergunakan, konfirmasi bahwa metode uji memenuhi persyaratan tertentu, sesuai dengan tujuan dari pengujian

Mengapa Metode Uji Perlu Divalidasi ?Laboratorium penguji menghasilkan data hasil uji yang absah atau validAbsah : akurasi dan presisi yang baik

Faktor yang mempengaruhi keabsahan hasil uji

PersonalPengetahuan (rekruitment), pelatihan, pengalaman, ketrampilan, motivasi

Sarana dan prasaranaPeralatan dan instrumentasi, bahan kimia dan bahan bantu lainnya (kualitas dan kontinuitas), lingkungan yang sesuai, penanganan sampel yang sesuai, bahan acuan /standard acuan

Metoda ujiMetoda standard, modifikasi validasiManfaat Validasi metode uji mengurangi / memperkecil terjadinya kesalahan dalam pengujianKesalahan - kesalahan mutlak - kesalahan sistematik- kesalahan acakKesalahan mutlak fatal tidak ada alternatif untuk mengatasimisal : sampel terbuang, kekeliruan pengambilan bahanKesalahan sistematikditimbulkan oleh faktor tetapmisal : hasil uji selalu lebih tinggi atau lebih rendahdisebabkan oleh : kelemahan metode uji, kelemahan pelaksana, kesalahan alat, standard tidak mampu telusurKesalahan acakterjadi secara kebetulanmisal disebabkan oleh : ketrampilan pelaksana, kondisi pelaksana, fluktuasi listrikMetode yang adaYang harus dilakukan labMetode resmi, telah divalidasi (collaborative study)Verifikasi untuk menunjukkan kemampuan labMetode resmi, tapi berbeda matrik sampleVerifikasi meliputi akurasi, presisi, sebaiknya juga limit deteksi Metode di terbitkan dalam majalah ilmiah, informasi cukup jelasVerifikasi meliputi akurasi, presisi,Metode di terbitkan dalam majalah ilmiah, informasi tidak jelasValidasi lengkap (full validation)In house method, modifikasi metodeValidasi lengkap (full validation)Kapan validasi metode uji harus dilakukan ?PARAMETER VALIDATION Accuracy (Kecermatan)Precision (Ketelitian)Detection LimitQuantitation Limit Linearity Range Recovery Robustness (Kekuatan)Specificity/Selectivity

ACCURACY Versus PRECISION

Accuracy is a combination of the bias and precision of an analytical procedure, which reflects the closeness of a measured value to a true value. (Standard Methods) For the purposes of laboratory certification, accuracy means the closeness of a measured value to its generally accepted value or its value based upon an accepted reference standard.

Akurasi : Kedekatan hasil yang diperoleh pada pengujian dengan nilai sebenarnya. Kesulitan utama yang dihadapi adalah fakta bahwa nilai sebenarnya dari komponen atau analit yang diuji dalam sampel tidak diketahui. Pendekatan untuk mengetahui akurasi : - uji pungut ulang (recovery study)- Uji terhadap CRM (Certified Reference Material) - Uji relatif terhadap metode baku atau metoda yang validAkurasi Yang Dilakukan Di Laboratorium

Uji Recovery (Uji Pungut Ulang)Menambah suatu jumlah tertentu dari standard analit yang diuji pada sampelMinimal 3 konsentrasi yang bertingkat, dan satu blanko sampel tanpa ditambah standard. 3 kali ulanganStandard yang ditambahkan pada sampel sebaiknya ada disekitar nilai batas persyaratan (spesifikasi produk), keatas dan kebawah nilai batas persyaratan, misal syarat kandungan nitrogen dalam pupuk Laboratorium perlu menetapkan syarat recovery dari pengujian (literatur) Untuk deteksi residu metode dianggap valid apabila recovery 80 % - 120 %

Uji terhadap CRM (Certified Reference Material)

CRM harus mempunyai komponen (analit) yang diuji dan matrik sampel yang sesuai. Langsung dibaca pada instrument tanpa pengenceran, karena kemungkinan ada kesalahan dalam pengenceran. Harga mahalBelum tentu ada CRM dengan matrik yang sesuaiBeberapa Kit menyertakan CRM dan ada pernyataan, CRM memberikan nilai tertentuStandard acuan untuk pengujian standard reference material sebagai pembanding dalam pengujianUji relatif terhadap metode baku atau metoda yang valid

Metode yang dikembangkan oleh laboratorium, kemudian metode tersebut akan dipergunakan untuk pengujian. Uji relatif terhadap metode baku, yang telah di verifikasi atau metode laboratorium (in house method), yang telah divalidasiSampel yang sama dianalisa dengan mempergunakan dua metodeHitung korelasi antara metode baku dengan metode yang dievaluasi Metode dianggap valid apabila R > 0,999, idealnya R = 1

Precision is a measure of the random error associated with a series of repeated measurements of the same parameter within a sample. Precision describes the closeness with which multiple analyses of a given sample agree with each other, and is sometimes referred to as reproducibility. Precision is determined by the absolute standard deviation, relative standard deviation, variance, coefficient of variation, relative percent difference, or the absolute range of a series of measurements. (Standard Methods)

Presisi kedekatan diantara beberapa individu hasil pengujian (seberapa dekat pengamatan yang satu dengan yang lainnya). Pendekatan PresisiReplicability : pelaksana, waktu, sampel, alat, laboratorium samaRepeatibility : pelaksana, sampel, alat, laboratorium sama, waktu beda Reproducebility : intra (dalam satu lab) : sampel, metode dan alat sama pelaksana yang berbeda, waktu bisa sama atau beda (rentang waktu tidak lama) inter (berbeda lab) : sampel dan metode sama, pelaksana dan alat beda, waktu bisa sama atau beda (rentang waktu tidak lama)Presisi Yang Harus Dilakukan Di Laboratorium

Pelaksana (analis) - Minimal 3 orang Sampel : standard dalam matrik atau sampel lapangan, jumlah minimal tertentuDihitung rata rata dan SD dari : pengujian pada hari yang sama, metode dan sampel sama tetapi pelaksana berbedaDihitung rata rata dan SD dari : pengujian pada hari yang berbeda, metode dan sampel sama tetapi pelaksana samaNilai Relatif SD harus 2 %

Limit Deteksi (LoD)Adalah konsentrasi terendah dari analit dalam contoh yang dapat terdeteksi,akan tetapi tidak perlu terkuantisasi,dibawah kondisi pengujian yang disepakati

Limit of Detection (LOD) or detection limit, is the lowest concentration level that can be determined to be statistically different from a blank (99% confidence). The LOD is typically determined to be in the region where the sign al to noise ratio is greater than 5. Limits of detection are matrix, method, and analyte specific.Note: For the purposes of laboratory certification, the LOD is approximately equal to the MDL for those tests which the MDL can be calculated.Detection limit:Concentration where 2 ~ 3 times of S/N ratioQuantitation is difficult

Lower quantitation limit:1) Concentration where 10 ~ 20 times of S/N ratio 2) 1% absorption concentrationConcentration where 0.0043 absorbance is obtained22Method Detection Limit (MDL ) is the minimum concentration of a substance that can be measured and reported with 99% confidence that the analyte concentration is greater than zero, and is determined from analysis of a sample in a given matrix containing the analyte. Pendekatan yang dapat dilakukanEvaluasi visual Berdasarkan ratio signal noise (S/N)Dari simpangan respon dan slope dari kurva kalibrasiLoD = 3 SD SlopeDari simpangan blanko LoD = Nrata2blk + 3 SD Signal to Noise Ratio (S/N ) is a dimensionless measure of the relative strength of an analytical signal (S) to the average strength of the background instrumental noise (N) for a particular sample and is closely related to the detection level. The ratio is useful for determining the effect of the noise on the relative error of a measurement. The S/N ratio can be measured a variety of ways, but one convenient way to approximate the S/N ratio is too divide the arithmetic mean (average) of a series of replicates by the standard deviation of the replicate results. (Skoog & Leary 1992)

The S/N Test : The MDL procedure recommends that the detection limit be estimated somewhere in the range where the signal to noise ratio is 2.5 to 5. The S/N is not only useful for estimating the initial detection limit, but it is also useful for evaluating the final MDL determination. The signal to noise ratio describes the effect of random error on a particular measurement, and estimates the expected precision of a series of measurements. Samples spiked in the appropriate range for an MDL determination typically have a S/N in the range of 2.5 to 10. A signal to noise ratio less than 2.5 indicates that the random error in a series of measurements is too high, and the determined MDL is probably high. In this instance, the samples should be spiked at a higher level to increase the signal. If the signal to noise ratio is greater than 10, the spike concentration is usually too high, and the calculated MDL is not necessarily representative of the LOD. In this case, the samples should be spiked at lower level. In some instances, especially with highly precise analytical techniques, the S/N may always be higher than ten. Again, the analyst's experience is crucial for determining when the S/N ratio is too high.

Limit Kuantisasi (LoQ)Atau biasa disebut juga limit pelaporan (limit of reporting) adalah konsentrasi terendah dari analit yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima,dibawah kondisi pengujian yang disepakati

Limit of Quantitation (LOQ ), or lower limit of quantitation (LOQ), is the level above which quantitative results may be obtained with a specified degree of confidence. The LOQ is mathematically defined as equal to 10 times the standard deviation of the results for a series of replicates used to determine a justifiable limit of detection . Limits of quantitation are matrix, method, and analyte specific.

Pendekatan yang dapat dilakukanSpike sampel dengan beberapa konsentrasi rendah (sekitar nilai LoD) Dari simpangan respon dan slope dari kurva kalibrasiLoQ = 10 SD SlopeDari simpangan blanko LoQ = Nrata2blk + 10 SD Sensitivity:

The change in the response of a measuring instrument divided by the corresponding change in the stimulus.

The sensitivity of a quantitative method is the proportion of target signal that can be detected;

In quantitative methods expressed as the gradient of the response curve, i.e. the change in instrument response which corresponds to a change in signal level.

A failure to detect the target when present is a false negative result and will lower the sensitivity of a test.

Linear rangeLinearity is the ability of the method when used with a given matrix to give results that are in proportion to the amount of analyte present in the sample.That is an increase in analyte corresponds to a linear or proportional increase in results or signal

Linear Calibration Range (LCR ), or Range of Linearity, is the region of a calibration curve within which a plot of the concentration of an analyte versus the response of that particular analyte remains linear and the correlation coefficient of the line is approximately 1 (0.995 for most analytes). Sensitivitas Liniaritas Kemampuan alat memberikan kenaikan respon sesuai dengan kenaikan konsentrasi. Berapa kenaikan respon alat, apabila konsentrasi naik secara bertingkat

yang umum dilakukan laboratorium Persiapkan deret standard dari komponen (analit) dalam pelarut yang biasa digunakan. Range konsentrasi dari deret standard sebaiknya berkisar pada nilai ketetapan yang diacu, nilai batas persyaratan (spesifikasi produk ) Harus bekerja dalam daerah linear Hukum Lambert BeerHitung korelasi antara respon dengan konsentrasi y = ax + b, dinyatakan dari kurva standard, Nilai R makin baik apabila mendekati 1konsentrasiAbs atau AUCRange konsentrasi / daerah kerja -- linearSelektivitas Kemampuan metode uji untuk memberikan respon dengan benar dari campuran komponen, tanpa ada interaksi antara komponen satu dengan komponen lain. Dapat menguji lebih dari 1 komponen, dan dapat membedakan komponen yang diujiMisal pengujian golongan tetrasiklin dengan HPLC, dapat memisahkan peak dari oksitetrasiklin, klortetrasiklin, dan tetrasiklin, atau pengujian aflatoksin dengan HPLC yang dapat membedakan aflatoksin B1, B2, G1 dan G2Resolusi antara peak >1.5

Selectivity (or Specificity)Spesifisitas Kemampuan metode uji dalam memberikan respon hanya pada satu komponen (analit)

Misal pada HPLC, puncak dari komponen uji harus terpisah dari puncak pengganggu dalam matrik sampel.Tidak ada senyawa lain dalam matrik yang memberikan peak pada RT yang sama dengan komponen (analit) yang diuji Detektor juga harus spesifik, misal LC-MS atau LC-MS-MSAAS adalah contoh pengujian yang sangat spesifik

Ruggedness /Robustness:

The sensitivity of the method for (small) changes in environmental conditions or method parameters during execution e.g. time and temperature of incubation, sources of supplies, purity and shelf-life of reagents,

Hasil validasi menentukan keabsahan hasil ujiMerupakan jaminan mutu hasil ujiLaboratorium perlu mempunyai kriteria atau batasan dalam menetapkan suatu metode uji validKesimpulan Contoh

Terima kasih