UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA - repository.uinjkt.ac.idrepository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/37917/1/RIAN... · 3.3.3 Preparasi Sampel ... Tabel 4 Distribusi Rata-rata

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN

SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI

PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS

UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN

REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

SKRIPSI

RIAN HIDAYAT

NIM: 1111102000096

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

2015/1436H

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN

SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI

PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS

UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN

REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

RIAN HIDAYAT

NIM: 1111102000096

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

2015/1436H

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Rian Hidayat

Program Studi : 1111102000096

Judul : Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA

Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk

Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain

reaction)

Status kehalalan pada cangkang kapsul keras masih diragukan statusnya. Dari tiga ribu

jenis obat baru ada tiga produk yang memiliki sertifikat halal. Analisis cangkang kapsul

keras gelatin simulasi telah berhasil dilakukan dengan metode Real Time PCR. DNA

cangkang kapsul keras gelatin simulasi diekstrasi dan diisolasi menggunakan kit

komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS

1%. Hasil ekstraksi dan isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®) dihasilkan DNA genom simulasi cangkang kapsul keras gelatin

sapi dan babi dan kemurnian berurut-turut adalah antara 8,70 – 19,01 ng/µl dengan

kemurnian 1.169 – 1.851 dan 2.30 – 9.54 ng/µl dengan kemurnian 1.310 – 2.013

sementara dengan cell lysis buffer SDS 1% adalah 13.30 – 15.39 ng/µl dengan

kemurnian 1.345 – 1.424 dan 20, 53 – 36.99 ng/µl dengan kemurnian 1.276 – 1.299.

Nilai konsentrasi dan kemurnian DNA genom dianalis dengan statistik yaitu uji t

dengan nilai p = 0.936 (konsentrasi) dan p = 0.003 (kemurnian) sehingga tidak ada

perbedaan yang signifikan rata-rata konsentrasi dan ada perbedaan yang signifikan rata-

rata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR

Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%. Berdasarkan hasil

tersebut disimpulkan bahwa metode kit komersial High Pure PCR Tamplate

Praparation lebih unggul daripada metode cell lysis buffer SDS 1%.

Kata Kunci : Gelatin, Real Time PCR, , Kit komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®), cell lysis buffer SDS 1%, Isolasi DNA, Kemurnian

DNA, Konsentrasi DNA

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Rian Hidayat

Major : Pharmacy

Title : Comparison of high Pure PCR Tamplate Preparation Kit and SDS

Method for Pig and Cow DNA Isolation from Hard Capsule Shell of

Gelatin for Halal Auntetication Use Real Time PCR (Polymerase

Chain Reaction)

Halal status on hard capsule shell has been hesitated it. Three of three thousand have

halal sertificate. Analysis of gelatin hard capsule shell was successfully done with Real

Time PCR method. DNA from gelatin hard capsule shell were extracted and isolated by

High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit and cell lysis buffer SDS 1%.

Result of extraction and isolation with High Pure PCR Template Preparation (Roche®)

kit from pig and cow gelatin hard capsule shell are approximately 8.70 – 19.01 ng/µl

(purity = 1.169 – 1.851) and 2.30 – 9.54 ng/µl (1.310 – 2.013) while with cell lysis

buffer SDS 1% are 13.30 – 15.39 ng/µl ( purity = 1.345 – 1.424) and 20, 53 – 36.99

ng/µl (purity = 1.276 – 1.299). DNA consentrations and purities value tested with

statistic were t test. P values concentration and purity are 0.936 and 0.003 so it is not

significance concentrations mean different and significance purity means both of them

methods. Based on result that High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit

method is the most better than cell lysis buffer SDS 1% method.

Keywords : Real Time PCR, gelatin, high pure PCR tamplate preparation, cell lysis

buffer SDS 1%, DNAconcentration, DNA purity

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan jalan

keluar bagi hamba Nya yang meminta jalan keluar. Atas rahmat Nya skripsi yang

berjudul “Perbandingan Dua Metode Isolasi DNA Babi dan Sapi dari Cangkang

Kapsul Keras Gelatin Simulasi untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time

PCR (Polymerase Chain Reaction)” ini berhasil penulis selesaikan. Sholawat beriring

salam semoga selalu tercurah limpah kepada baginda Rasulullah SAW, manusia terbaik

sepanjang zaman, teladan umat manusia menjalani kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat ujian akhir guna

mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta. Rampungnya penelitian dan penulisan skripsi ini pastilah atas bantuan berbagai

pihak, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang

sedalam-dalamnya kepada :

1. Bapak Dr. Arif Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I dan Ibu Ofa Suzanthi Betha,

M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang sudah membimbing dan memberikan

ilmu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan

skripsi ini.

3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt. dan Ibu Nely Suryani, Ph.D. Apt. selaku Ketua

Program Studi dan Sekretaris Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Kedua orang tua tercinta, ayahanda Sayat Hidayat dan ibunda Umi Sumiati yang

senantiasa ikhlas memberikan yang terbaik bagi putranya. Kakak-kakak dan

Adik-adik tercinta yang selalu memberikan keceriaan dan semangat bagi

penulis.

5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah memberikan

ilmu pengetahuan, bimbingan dan atau bantuan selama penulis menempuh

pendidikan farmasi di FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Teman-teman Farmasi “Beng-beng” yang telah menjadi memori berkesan

selama penulis menuntut ilmu.

7. Teman-teman Pendidikan Dokter, Kesehatan Masyarakat, dan Keperawatan

yang sudah mengispirasi dan menghiasi suasana kampus FKIK.

8. Kakak-kakak laboran Farmasi (Kak Rachmadi, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Tiwi,

Kak Liken, Mbak Rani) yang telah membantu penulis dalam melakukan

penelitian di Labolatorium.

9. Pak Deka, Mbak Helen, Kak Ayu yang telah bersedia berbagi ilmunya dan

membantu penulis dalam penyelesaian penelitian RT PCR.

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

10. Teman-teman seperjuangan Halal’s team (Kak Sulaiman, Kak Afifah, Kak

Yanti, dan Fathiyah) yang telah menginspirasi dan menjadi the best partners

dalam penelitian Real Time PCR.

11. Keluarga 3L (Liqoku, Liqomu, Liqota) Kak Sule, Kak Iyus, Suparman, Azmi,

Dendi dan Ali serta Sahabat-sahabat seperjuangan di jalan dakwah yang selalu

mendo’akan dimanapun dan kapanpun semoga Allah mempertemukan kita

dalam surga-Nya.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapat ganjaran terbaik di sisi

Allah SWT. Sekali lagi mohon maaf jikalau penulis hanya bisa memberikan ucapan

terima kasih yang sedalam-dalamnya. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi

pengembangan ilmu pengetahuan dan menjadi amal jariah bagi penulisnya. Amiin.

Jakarta, 29 Juni 2015

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS .............................................. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .......................................................... iv

ABSTRAK .......................................................................................................... v

ABSTRACT ....................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR ....................................................................................... vii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...................... viii

DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xii

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiv

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................... xv

DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ................................................................................. 1

1.1. Latar Belakang ............................................................................. 1

1.2. Rumusan Masalah ........................................................................ 3

1.3. Tujuan Penelitian ......................................................................... 3

1.4. Manfaat hasil Penelitian ............................................................... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 5

2.1. Gelatin ......................................................................................... 5

2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin ........................................... 6

2.1.2 Struktur dan Komposisi Kimia Gelatin .............................. 7

2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan Gelatin ..................................... 8

2.2. Kapsul .......................................................................................... 8

2.2.1 Cangkang Kapsul Keras ..................................................... 9

2.3. Deoxyribonuckeat Acid (DNA) ................................................... 9

2.3.1 Struktur Kimia DNA .......................................................... 10

2.3.2 Sifat Fisika DNA ................................................................ 12

2.3.3 DNAMitokondria ................................................................ 12

2.4 Isolasi DNA ...................................................................................... 14

2.5 Polymerase Chain reaction (PCR) .............................................. 17

2.5.1 Komponen PCR .................................................................. 17

2.5.2 Tahapan PCR ...................................................................... 19

2.6 Real-Time PCR ............................................................................ 20

BAB 3. METODE PENELITIAN .................................................................... 22

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian ...................................................... 22

3.1.1 Tempat ................................................................................ 22

3.1.2 Waktu .................................................................................. 22

3.2. Alat dan Bahan ........................................................................... 22

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.2.1 Alat ..................................................................................... 22

3.2.2 Bahan .................................................................................. 22

3.3. Prosedur Kerja ............................................................................. 23

3.3.1 Pembuatan Lembar Cangkang Kapsul Simulasi ................. 23

3.3.2 Pembuatan Larutan Stok ..................................................... 24

3.3.3 Preparasi Sampel ................................................................ 24

3.3.4 Isolasi DNA ........................................................................ 25

3.3.5 Pengukuran Kemurnian & Kuantitas DNA ........................ 26

3.3.6 Amplifikasi DNA dengan Metode Real-Time PCR ........... 27

3.3.7 Analisi Statistik ................................................................... 27

BAB 4. HASI DAN PEMBAHASAN ............................................................... 29

4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cngkang Kapsul Keras Gela

tin Sapi dan Babi ............................................................................. 29

4.2. Isolasi DNA ..................................................................................... 30

4.2.1 Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Tamplate

Preparation (PCR) ................................................................ 30

4.2.2 Isolasi DNA dengan Larutan Ekstraksi SDS 1% (Sodium

Dodecyl Sulphate) .................................................................. 31

4.2.3 Pengukuran Isolat DNA ......................................................... 33

4.2.4 Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika ..... 35

4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul

Keras Gelatin dengan Real Time PCR ............................................ 36

4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang

Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Sapi ............. 37

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang

Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Babi ............. 39

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 41

5.1. Kesimpulan ..................................................................................... 41

5.2. Saran ................................................................................................ 41

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 42

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Konversi Kolagen Menjadi Gelatin ............................................. 6

Gambar 2.2 Struktur Kimia Gelatin ................................................................ 7

Gambar 2.3 a. Ikatan 3’-5’ Fosfodiester .......................................................... 10

b. Rantai DNA yang Lebih Sedrhana .......................................... 10

Gambar 2.4 Perbedaan struktur DNA dan RNA ............................................. 11

Gambar 2.5 Struktur Mitokondria ................................................................... 13

Gambar 2.6 Struktur mtDNA .......................................................................... 13

Gambar 2.7 Tahapan PCR ............................................................................... 19

Gambar 2.8 Bentuk Kurva Real-Time PCR .................................................... 20

Gambar 4.1 a. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Sapi Simulasi ...... 29

b. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Babi Simulasi ..... 29

Gambar 4.2 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan Simulasi Cangkang Kapsul

Keras Gelatin pada Primer Sapi ................................................... 38

Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan Simulasi Cangkang Kapsul

Keras Gelatin pada Primer Babi .................................................. 39

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Urutan Basa Primer dan Probe ............................................................... 23

Tabel 2 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS ..................................... 33

Tabel 3 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®) .... 34

Tabel 4 Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan Simulasi Menurut

Konsentrasi DNA ................................................................................... 35

Tabel 5 Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan Simulasi Menurut

Kemurnian DNA .................................................................................... 36

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Kerangka Penelitian ..................................................................... 47

Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ...... 48

Lampiran 3. Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ........................ 49

Lampiran 4. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe serta Tm (Mel

Ting Temperature) Primer ........................................................... 51

Lampiran 5. Tabel Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure Pcr Tem

plate Preparation (Roche®) dan Campuran Reaksi Hydrolisis

Probe Mastermix ......................................................................... 52

Lampiran 6. Gambar Presipitasi Protein .......................................................... 53

Lampiran 7. Hasil Analisis Nilai Konsentrasi dengan SPSS ........................... 54

Lampiran 8. Hasil Analisis Nilai Kemurnian dengan SPSS ............................ 57

Lampiran 9. Bagan Metode Isolasi DNA ......................................................... 60

Lampiran 10. Gambar Bahan-bahan yang Digunkan dalam penelitian ............. 64

Lampiran 11. Gambar Alat-alatyang Digunakan dalam Penelitian ................... 65

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1

BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool

bp : Base pair

CP : Crossing Point

cyt b : Cytochorme b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP : Deoxyribonuleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythmidine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

FAM : Fluorescein Amidite

mtDNA : mitochondrial Deoxyribonucleic Acid

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NTC : No Template Control

PCR : Polymerase Chain Reaction

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction

RE : Retikulum Endoplasma

RNA : Ribonucleic Acid

Tm : Temperature Melting

Ta : Temperature Annealing

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

BLAST ; Basic Logical Aligment Search Tool merupakan program untuk

menganalisis kesejajaran urutan basa query (DNA atau protein)

dengan urutan basa DNA atau protein dari database NCBI

Blastn : Nucleotide Blast atau bisa disebut blastn merupakan salah satu

fasilitas dari program BLAST untuk menganalisis kesejajaran

nukleotida yang dimasukan pada query dengan nukleotida pada

database NCBI

CP : Crossing Point merupakan angka siklus yang menunjukkan awal

permulaan akumulasi amplikon telah memasuki peningkatan log-

linear

Fit Point : Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis threshold

dengan kurva amplifikasi

Garis Theshold : Garis horizontal penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat

sinyal Flourescent berada pada titik terendah

NCBI : National Ccenter for Biotechnology Information merupakan

suatu institusi yang dimiliki United States National Library of

Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan

biologi molekuler. Dari situs NCBI dapat diakses database

bioteknologi meliputi genebank, urutan basa DNA atau protein

juga publikasi-publikasi ilmiah

Second Derivative : Metode penentuan CP dalam instrument LightCycler 480

Maximum : Dimana CP diperoleh berdasarkan saat kurva amplifiaksi

mengalami kenaikan yang tajam

Query : Urutan basa yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk

diketahui kesejajarannya dengan data yang tersedia

Tm : Temperature Melting atau suhu lebar adalah saat dimana 50%

bagian DNA seolah terbuka menjadi untai tunggal

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Islam mengatur umatnya dalam dua perkara, yaitu halal dan haram.

Halal adalah segala sesuatu yang diperbolehkan dalam syari’at Islam

sedangkan haram adalah kebalikan dari halal (Al-Qardhawi, 1997). Pada

hadist keenam dalam hadist Arba’in dijelaskan “Sesungguhnya yang halal itu

jelas dan yang haram itu jelas. Di antara keduanya terdapat perkara-perkara

yang syubhat (samar-samar) yang tidak diketahui oleh orang banyak. Maka

siapa yang takut terhadap syubhat berarti dia telah menyelamatkan

agamanya dan kehormatannya. Dan siapa yang terjerumus dalam perkara

syubhat maka akan terjerumus dalam perkara yang diharamkan…” Salah

satu perkara syubhat saat ini adalah sumber bahan baku cangkang kapsul

keras dengan alasan baru ada 3 produk kapsul yang bersertifikat halal dari 3

ribu jenis obat yang ada di Indonesia (LPPOM MUI). Angka tersebut masih

kecil dibanding dengan jumlah penduduk muslim Indonesia yang mencapai

85% (BPS dalam Vivikananda, 2014)

Perkara syubhat dalam cangkang kapsul keras terletak pada sumber

bahan bakunya, yaitu gelatin. Gelatin saat ini umumnya berasal dari kulit,

tulang sapi dan babi (GMIA, 2012) karena gelatin yang dihasilkan memiliki

kualitas yang lebih baik dibandingkan dengan sumber lainnya seperti ikan.

Keragu-raguan dalam memilih produk cangkang kapsul keras bertambah

dengan diketahuinya bahwa produsen gelatin dunia masih didominasi oleh

negara-negara non muslim (Eropa Barat, Kanada, dan Meksiko) (Jamaludin,

et al., 2012). Oleh karena itu, analisis untuk membedakan cangkang kapsul

keras yang bersumber dari gelatin perlu dilakukan.

Beberapa peneliti telah melakukan analisis terhadap cangkang kapsul

keras yang bersumber dari gelatin dengan cara membedakan komposisi asam

amino menggunakan metode Fourier Transform Infrared (FTIR)

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Spectroscopy dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang

dikombinasikan dengan Principal Component Analysis (PCA), dan metode

SDS-PHAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrilamide Gel

Elektrophoresis) yang mampu mengidentifikasi fragmen gelatin hidrosilatnya

berdasarkan perbedaan bobot molekul (Saputra, 2014 & Syafiqoh, 2014).

Namun, metode ini belum bisa memberikan hasil yang maksimal dikarenakan

protein tidak stabil dalam suhu panas sehingga hasil yang didapatkan akan

berbeda-beda.

Pendeteksian gelatin babi dan gelatin sapi telah berhasil dilakukan

oleh Demirhan., et al (2011), Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015)

dengan mengidentifikasi DNA pada standar gelatin sapi dan babi dan produk

gelatin (marsmallows, gums drops, dan beberapa makanan orang turki)

dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction ). Analisis

menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) membutuhkan

DNA genom yang berkualitas baik secara jumlah maupun kemurnian. Gelatin

merupakan bahan olahan begitu pula cangkang kapsul keras gelatin yang

kemungkinan jumlah DNA relatif sedikit akibat adanya pengolahan

sebelumnya (Demirham, et al., 2011) sehingga diperlukan metode isolasi

DNA yang lebih unggul dari segi konsentrasi DNA genom yang didapat,

tingkat kemurnian yang tinggi, efisiensi waktu pengerjaan, keamanan dan

ekonomis.

Pada penelitian Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015) metode

ekstraksi gelatin yang digunakan adalah kit komersial High Pure PCR

Template Preparation (Roche®). Konsentrasi DNA genom yang didapatkan

masih sedikit dan dengan tingkat kemurniaan yang belum masuk dalam

kemurnian ideal terbukti tidak terbentuknya pita pada gel agarose. Namun,

DNA genom yang didapatkan dapat teramplifikasi pada Real-Time PCR

(Polyemerase Chain Reaction).

Metode ekstraksi lain (konvensional) yang sering digunkan dalam

analisis Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) adalah cell lysis

buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). DNA genom yang didapatkan

3


mampu terdeteksi oleh gel agarose tetapi penggunaan metode ini masih

terbatas dalam bentuk jaringan utuh (daging) dan olahannya (Rahmawati,

2012 & Mulyana, 2010). Oleh karena itu, penelitian selanjutnya akan

dilakukan pendeteksian gelatin sapi dan babi pada simulasi cangkang kapsul

keras dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) dengan metode

ekstraksi menggunakan kit (High Pure PCR Template Preparation (Roche®))

dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode yang paling cocok

untuk isolasi DNA antara kit (High Pure PCR Template Preparation

(Roche®)) dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang

akan diamplifikasi menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain

Reaction) dengan gen spesifik mitokondria sitokrom b Sapi dan Babi.

1.2 RUMUSAN MASALAH

1. Bagaimanakah perbandingan metode isolasi DNA dengan kit komersial

High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS

1% dalam mengisolasi DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras

berbahan gelatin babi dan gelatin sapi terhadap DNA genom yang

dihasilkan?

2. Apakah DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan

gelatin babi dan gelatin sapi yang diisolasi dengan kit komersial High

Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%

dapat teramplifikasi dengan RT-PCR?

1.3 TUJUAN PENELITIAN

1. Mengetahui perbandingan DNA genom yang dihasilkan dari simulasi

cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi dengan

metode isolasi DNA menggunakan kit komersial High Pure PCR

Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%

2. Menentukan kondisi optimal amplifikasi DNA genom dari cangkang

kapsul keras simulasi berbahan gelatin babi dan gelatin sapi dengan

primer sapi dan primer babi pada RT-PCR

4


1.4 MANFAAT PENELITIAN

Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberikan informasi metode

isolasi DNA babi dan DNA sapi dari cangkang kapsul keras simulasi

berbahan gelatin sapi dan gelatin babi sehingga dapat dijadikan referensi

dalam mendeteksi status kehalalan produk cangkang kapsul yang berbahan

gelatin.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gelatin

Gelatin merupakan suatu biopolymer yang dihasilkan dari hidrolisis

kolagen yang umumnya berasal dari kingdom hewan dan sebagian besar

penyusunnya adalah protein. (Bailey dan Paul, 1998). Kata gelatin sendiri

berasal dari Bahasa latin yaitu “gelare” yang artinya membuat beku dan

merupakan senyawa yang tidak terjadi secara alamiah (Glicksman, 1969).

Sifat gelatin yang dapat membeku (gelling agent) dan mengental (thickening

agent) menjadi keberadaanya sangat luas terutama dalam produk makanan

(Mariod dan Adam, 2013).

Kolagen merupakan bahan utama dalam pembentukan gelatin yang

sumbernya bisa dari hewan mamalia seperti tulang sapi dan kulit babi maupun

ikan dan serangga (Mariod dan Adam, 2013). Kolagen akan menjadi gelatin

dengan bantuan asam atau basa dan pemanasan yang bertujuan untuk

memutuskan ikatan hydrogen dari molekul tropokolagen sehingga rantai-

rantainya terpisah dan strukturnya rusak (Setiawati, 2009).

Perubahan kolagen menjadi gelatin dan gelatin menjadi gel dipengaruhi

oleh konsentrasi dan suhu seperti yang disajikan pada gambar 2.1. Menurut

Belitz dan Grosch (1999) gelatin akan terbentuk apabila kolagen dipanaskan

dengan suhu di atas suhu pengerutnya (T>Ts) di mana suhu pengerut (Ts)

untuk kolagen dari kulit mamalia berkisar antara 60-650 C sehingga ikatan

silang dari rantai triple helix pada kolagen akan terputus dalam jumlah yang

sangat besar dan struktur kolagen akan terpisah menjadi gulungan (coils)

secara acak yang larut dalam air. Pada saat konsentrasi rendah (C1), struktur

intramolekuler gelatin akan membentuk untaian/ikatan-ikatan tunggal (single-

strands). Namun, untuk kembali ke kondisi semula (pada kolagen) pada saat

konsentrasi tinggi (C2) dan proses pendinginan berjalan lambat (ΔT1), apabila

proses berjalan cepat, maka akan dihasilakan segmen-segmen helix dengan

ikatan-ikatan secara acak pada setiap struktur gulungannya (coils).

6


Gambar 2.1 Konversi kolagen menjadi gelatin (sumber : Belitz dan Grosch, 1999 dalam

Hasan, 2007)

Berdasarkan perlakuan pada saat pembuatan, gelatin dibedakan menjadi

dua perlakuan yaitu dengan asam atau basa. Gelatin dengan asam disebut

gelatin tipe A dan dengan basa disebut gelatin tipe B. Gelatin tipe A memiliki

titik isoelektrik pada pH 7-9 dan umumnya diperoleh dari kulit babi.

Sedangkan gelatin tipe B memiliki titik isoelektrik pada pH 4.8 – 5.2 dan

biasanya diperuntukan untuk bahan yang keras dan liat seperti kulit sapi

(Poppe, 1992).

2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin

Gelatin memiliki bentuk flakes, granul, maupun serbuk dengan

warna kuning, tidak berbau, dan tidak berasa. Gelatin larut dalam

gliserin dan air hangat (>300 C). Gelatin praktis tidak larut dalam

kloroform, etanol (95%), aseton, eter, dan methanol. Gelatin kering

stabil di udara dan dalam bentuk larutan dalam air juga stabil dalam

waktu lama jika disimpan di bawah kondisi sejuk tapi dapat terjadi

degradasi oleh bakteri (Rowe, Sheskey dan Owen, 2006). Namun,

menurut Montero, et al (2000), pemanasan yang dilarutkan untuk

melarutkan gelatin sekurang-kurangnya 490 C atau biasanya pada suhu

60-700 C. Pada temperature yang tinggi (di atas 500 C ), larutan gelatin

dapat terjadi depolimerisasi dan reduksi kekuatan gel. Kondisi ini akan

7


lebih cepat pada suhu 650 C dan kekuatan gel dapat berkurang setengah

kali semula ketika dipanaskan pada suhu 800 C selama 1 jam (Rowe,

Sheskey dan Owen, 2006).

Protein merupakan kandungan tertinggi pada gelatin, tetapi kadar

lemaknya rendah. Gelatin kering dengan kadar air 8-12% mengandung

protein sekitar 84% - 86%, lemak dan vitamin hampir tidak ada (Carr et

al, 1995). Bobot molekul gelatin termasuk tinggi sekitar 20.000 g/mol

sampai 250.000 g/mol (Fatimah, 2012). Adanya perbedaan bobot

molekul tersebut ini memberikan dampak pada kekuatan gel yang

dihasilkan. Semakin tinggi bobot molekul gelatin semakin tinggi bloom

(kekuatan gel) yang dihasilkan (Rabadiya, 2013). Kekuatan gel dapat

ditentukan dengan menggunakan metode Gomez-Guillen et al (2010)

dengan menggunakan analisis Tekstur Model TA-TX2 (Balti et al.,

2010).

2.1.2 Struktur dan Komposisi Kimia Gelatin

Sebagian besar kandungan gelatin adalah protein yang disusun

dari beberapa asam amino. Komposisi asam amino gelatin bervariasi

tergantung dari sumber kolagen, spesies hewan penghasil, dan jenis

kolagen (Setiawati, 2009). Menurut Grobben et al., (2004) dalam

Fatimah, (2009) gelatin terdiri dari 18 asam amino yang saling terikat

oleh ikatan peptida dan sebagian besar penyusunnya adalah glisin dan

prolin berturut-turut mencapai 30,5% dan 14,8% - 18%.

Glisin Prolin Y Glisin X Hidroksiprolin

Gambar 2.2. Struktur kimia gelatin (sumber: Poppe, 1992 dalam Setiawati, 2009)

8


Senyawa gelatin merupakan suatu polimer linier yang tersusun

oleh satuan terulang asam amino yaitu glisin-prolin-glisin dan glisin-

prolin-hidroksiprolin yang bergabung membentuk rangkaian polipeptida.

Seperti yang tunjukkan pada gambar 2.2 bahwa susunan asam amino

gelatin merupakan triplet peptide, yaitu glisin-X-Y, dimana X umumnya

adalah asam amino prolin dan Y umumnya adalah asam amino

hidroksiprolin. (Viro, 1992).

2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan Gelatin

Dalam produk pangan, gelatin menjadi bahan tambahan yang

sering digunakan baik sebagai pengental, penstabil, pengikat, dan

pengemulsi. Gelatin yang dicampurkan bervariasi mulai dari 0.015% -

9% tergantung fungsi keberadaannya dalam bahan campuran. Adapun

produk pangan berbahan gelatin adalah jelly, marshmallows, gummy,

wafer, dan cokelat. Selain digunakan dalam industri pangan, gelatin juga

sering digunakan dalam industri fotografi, industri farmasi, dan produk

kedokteran seperti cangkang kapsul keras dan lunak, pengikat pada

tablet, suppositoria, gelatin sponge, dan pengganti plasma (GMIA,

2012).

Beberapa tahun terakhir fungsi penting gelatin lainnya telah

diidentifikasi dan dikembangkan. Kemampuan gelatin yang mirip

dengan lemak terutama teksturnya, menempatkan gelatin sebagai

pengganti lemak pada beberapa aplikasi. Salah satu kelompok produk

utama dimana sifat ini digunakan adalah margarin makan rendah lemak

(Tahmid, 2005).

2.2 Kapsul

Bahan utama dalam pembuatan cangkang kapsul keras yaitu gelatin, air,

gula. Pewarna biasanya ditambahkan untuk membuat kapsul menjadi lebih

menarik dan khas. Selain itu, penambahan titan oksida juga diperlukan untuk

membuat cangkang menjadi tidak transparan dan tidak tembus cahaya.

Berdasarkan elastisitas dan komponen pembentuknya, kapsul dapat dibagi

9


menjadi dua kategori, yaitu kapsul keras (dua cangang) dan kapsul lunak (satu

cangkang) (Ansel, 2005 & Rabadiya, 2013).

Cangkang kapsul umumnya tidak berbau dan tidak berasa. Cangkang

kapsul gelatin dapat dibuat dengan berbagai ukuran dengan panjang dan

diameter yang bervariasi. Pemilihan ukuran tergantung pada berapa banyak isi

bahan yang akan dimasukkan ke dalam kapsul dan dibandingkan dengan

kapasitas isi dari cangkang kapsul. Karena kepadatan dan penekanan dari

serbuk atau campuran serbuk akan menentukan berapa jumlah yang dapat

ditampung dalam kapsul dan karena tiap bahan mempunyai sifat tersendiri,

maka tidak ada pengaturan yang ketat untuk menentukan ukuran kapsul yang

tepat. Untuk diberikan kepada manusia, cangkang kapsul kosong berkisar dari

000 yang terbesar sampai no. 5 yang terkecil (Ansel, 2005)

2.2.1 Cangkang Kapsul Keras

Cangkang kapsul keras gelatin harus dibuat dalam dua bagian,

yaitu badan kapsul dan penutupnya yang biasanya lebih pendek.

Biasanya kapsul dikategorikan sebagai kapsul keras atau lembut

dipengaruhi oleh keberadaan plasticizer seperti gliserol yang dapat

membuat kapsul lembut dan elastis. Kapsul keras dikatakan ideal jika

memiliki kekuatan elastisitas permukaan 200-300 bloom; viskositas (600

C / 6-23%b/b dalam air) 44-60 MP; pH 4,5-6.5 (Rabadiya, 2013).

2.3 Deoxyribonucleat Acid (DNA)

Asam nukleat adalah suatu molekul polimerik yang hanya terdiri dari

empat jenis unit monomerik, yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam

ribonukleat (RNA) yang berfungsi menyimpan dan menransmisikan informasi

genetik dalam sel (Champe, et al., 2011; Koolman & Roehm, 2005; dan

Murray, et al., 2012). DNA tidak hanya terdapat pada kromosom di nukleus

organisme eukariot, tetapi juga di mitokondria dan kloroplas tumbuhan.

Namun, pada organisme prokariot, yang tidak mempunyai nukleus,

mempunyai satu kromosom tetapi dapat pula mengandung DNA

nonkromosom dalam bentuk plasmid (Champe, et al., 2011). DNA berperan

dalam sintesisi RNA (transkripsi) yang bertujuan untuk sintesis protein dalam

sitoplasma (Stansfield et al., 2003 dalam Izzah, 2014).

10


2.3.1 Struktur Kimia DNA

Setiap nukleotida tersusun oleh tiga komponen, yaitu molekul gula

pentosa (deoxyribose untuk DNA dan ribose untuk RNA), gugus fosfat,

dan basa nitrogen. Semua nukleotida memiliki gula pentose dan gugus

fosfat dengan susunan dan bentuk yang identik, sedangkan untuk

penyusun basa nitrogen mempunyai susunan dan bentuk yang berbeda

dari satu nukleotida dengan satu nukleotida yang lainnya. Menurut

molekulnya, basa nitrogen dibagi dua, yaitu basa purin (Adenin dan

guanin) dan basa pirimidin (cytosin, uracyl, dan thimin). Pada DNA

penyusun basa pirimidin adalah sitosin dan timin, sedangkan pada RNA,

yaitu sitosin dan urasil. Basa-basa tersebut berpasangan satu sama lain,

yaitu pada DNA basa guanine berpasangan dengan basa sitosin

membentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan basa adenine berpasangan

dengan basa timin (pada RNA dengan urasil) membentuk dua ikatan

hidrogen. Sehingga jumlah dari masing-masing basa baik purin maupun

pirimidin akan selalu sama dalam molekul DNA (Muladno, 2010 dan

Purves et al., 2004).

a b

Gambar 2.3 a. Ikatan 3’ – 5’ fosfodiester,

b. Rantai DNA yang lebih sederhana (sumber: Champe, et al., 2011)

DNA merupakan poli-deoksiribonukleat yang mengandung

banyak mono-deoksiribonukleat yang dihubungkan secara kovalen

melalui ikatan 3’-5’-fosfodiester. Ikatan fosfodiester menghubungkan

11


gugus 5’-hidroksil deoksipentosa pada satu nukleotida dengan gugus 3’-

hidroksil deoksipentosa yang berdekatan melalui gugus fosfat (gambar

2.3).

Rantai panjang ini dengan ujung -5’ (ujung dengan fosfat bebas)

dan ujung -3’ (ujung dengan hidroksil bebas) yang tidak melekat pada

nukleotida lain. Urutan basa DNA yang diperlihatkan pada gambar 2.3

dibaca “timin, adenine, sitosin, guanin” (5’-TACG-3’). Ikatan

fosfodiester antara nukleotida (di DNA atau RNA) dapat diuraikan

secara hidrolisis oleh bahan kimia, atau dihidrolisis secara enzimatik

oleh famili nuklease: deoksiribonuklease untuk DNA dan ribonuklease

untuk RNA (Champe, et al., 2011). Selain dari basa pirimidin (timin

pada DNA dan urasil pada RNA) perbedaan antara DNA dan RNA

lainnya adalah pada DNA untaiannya berbentuk double helix (untai

ganda) sedangkan pada RNA single helix (untai tunggal) seperti pada

gambar 2.4.

Gambar 2.4 Perbedaan struktur DNA dan RNA

(sumber: National Human Research Institute)

12


Satuan panjang molekul DNA adalah pasang basa (pb). Satuan ini

adalah unit ukuran panjang terkecil. Apabila molekul DNA hanya

berbentuk serangkaian nukleotida tunggal (tidak berpasangan ), maka unit

satuannya basa (b) dan bukan pasang basa (pb) (Muladno, 2010).

2.3.2 Sifat Fisika DNA

Struktur untai ganda DNA dapat dipisahkan (dicairkan) menjadi

dua untai komponen dalam larutan dengan cara meningkatkan suhu

(>900 C) atau menurunkan konsentrasi garam. Akibatnya kedua

tumpukan basa tidak saling menjauh, tetapi tumpukan basa-basa itu

sendiri terurai meskipun masih berada dalam bentuk polimer karena

adanya jembatan fosfodiester. Karena penumpukan basa dan ikatan

hidrogen antar tumpukan, molekul DNA untai-ganda bersifat seperti

batang yang kaku dan dalam larutan, DNA berbentuk seperti material

kental yang akan kehilangan kekentalannya jika mengalami denaturasi.

(Murray, et al., 2012). Denaturasi DNA bersifat reversible dimana

proses renaturasi (pembentukan kembali struktur untai ganda dari

keadaan terdenaturasi) dapat berjalan apabila suhu mendekati 600 C

(Yuwono, 2009).

2.3.3 DNA Mitokondria

DNA mitokondria (mtDNA) adalah molekul DNA rantai ganda

yang berbentuk sirkuler yang ditransmisikan secara maternal dan

ukurannya relative sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom

intinya (Susmiarsih, 2010 dan Solihin, 1994). DNA mitokondria

merupakan DNA yang ada di Mitokondria yang berperan dalam sintesis

protein (Koolman, et al., 1994). Mitokondria adalah organel yang

terletak di dalam sitoplasma eukariota (gambar 2.5) yang diselaputi oleh

dua membrane dan dua kompartemen, yaitu membran dalam dan

membran luar, matriks mitokondria (yang diselimuti langsung oleh

membrane dalam) dan ruang antar membran (Susmiarsih, 2010).

13


Gambar 2.5 Struktur Mitokondria (sumber : Susmiarsih, 2010)

Struktur organisasi mtDNA bersifat stabil, sehingga mtDNA

hewan memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama (gambar 2.6), yakni

terdiri atas 13 gen yang menyandikan protein yaitu URF1, URF2, URF3,

URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrom Oxidase unit I,

Cytochrom Oxidase unit II, Cytochrom Oxidase unit III, Cytochrom b

dan ATPase 6 (terlibat dalam respirasi sel), 2 gen menyandikan rRNA

(12S dan 16S), 22 gen menyandikan tRNA dan beberapa daerah lain

yang tidak menyandikan protein D-loop (Control Region) dan daerah

intergenic (Moritz et al, 1987 dan Solihin, 1994).

Gambar 2.6 Sturktur mtDNA (Andaman, 1992 dalam Pratami, 2011)

14


DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam

keperluan analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu mtDNA mampu

meng-copy diri dalam jumlah yang tinggi (menjadikannya mudah

diisolasi dan dipurifikasi), ukuran yang relative kecil sekitar 14 kb

sampai 34 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh,

dan memiliki laju evolusi yang tinggi sekitar 5-10 kali lebih cepat dari

DNA inti (Hartati et al.,2004 dan Solihin, 1994).

2.4 Isolasi DNA

Analisis molekular merupakan suatu metode analisis yang lingkup

pengerjaanya sampai ke tahap molekul seperti analisis asam nukleat dan

protein. Salah satu analisis molekular adalah metode PCR (Polymerase Chain

Reaction) yang dalam tahapannya ada proses isolasi DNA. Isolasi DNA

adalah proses pemisahan DNA dari komponen-komponen penyusun sel

lainnya. Proses ini melibatkan penghancuran membran sel (lisis), pemisahan

DNA dari protein, dan pemurnian (purifikasi) DNA (Muladno, 2010).

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau

penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan

tahapan awal dari isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel

(Holme dan Hazel, 1998). Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan

memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim dan dikombinasikan dengan

EDTA (Etilendiamin tetraasetat), SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), sarkosil

dan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (Muladno, 2010 dan

Subandiyah, 2006).

Menurut Giacomazzi et al (2005) ada beberapa cara yang dapat

digunakan untuk menghancurkan sel atau jaringan, yaitu dengan cara fisik

seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam

nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi.

Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.

Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen

yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi

membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti

menggunakan proteinase K bertujuan untuk melisiskan membran pada sel

15


darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun

rantai polipeptida dalam komponen sel (Surzycki, 2000).

SDS merupakan deterjen kationik yang mampu melarutkan komponen

lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada

membran sel sehingga merusak struktur membran sel (Kesmen et al., 2009;

Maftuchah & Zainudin, 2006; Malisa et al., 2006). Metode isolasi dengan

SDS lebih dikenal dengan metode fenol-kloroform. Buffer lisis metode ini

biasanya terdiri atas EDTA, Tris HCL, NACL, dan SDS (Utami, et al., 2012).

Setelah struktur sel rusak, komponen-komponen yang ada di dalamnya, yaitu

RNA, DNA, lipid, dan karbohidrat akan keluar (Dale & Malcom, 2002).

Penggunaan EDTA dalam proses lisis berfungsi untuk melindungi

DNA dari aktivitas endogenous nucleases karena EDTA ini merupakan agen

pengkelat ion yang dibutuhkan sebagai kofaktor sebagian besar nucleases

dengan cara mengikat kation divalen (Muladno, 2010; Dale & Malcom, 2002;

Chawla, 2003). Kation divalen merupakan aktivator bagi DNAse yang dapat

memutuskan ikatan fosfodiester pada DNA sehingga dengan pengikatan

kation divalen oleh EDTA dapat menghambat aktivitas DNAse (Saili, 2006;

Weir, 1993; Muladno, 2010; Wilson & Walker, 2005 dalam Rahmawati,

2012 ). Selain EDTA dan SDS ada juga deterjen yang sifatnya sama untuk

menghancurkan membran sel, yaitu CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium

Bromide). CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan

membran plasma sel dan akan membentuk komplek dengan DNA. CTAB

adalah detergen yang berkation yang akan membentuk komplek presipitasi

dengan DNA ketika konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M.. Presipitasi DNA dari

buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan

massa bergelatin yang komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya

terlihat jelas dalam massa tersebut, tetapi sulit untuk memisahkannya,

sehingga untuk menghindari terbentuknya massa ini digunakan presipitasi

yang tidak menggunakan alkohol (Chawla, 2003). Setelah penambahan bufer

lisis larutan diinkubasi dan proses lisis berakhir dengan pemisahan komponen-

komponen hasil lisis dengan cara sentrifugasi (Muladno, 2010).

16


Tahapan isolasi DNA yang kedua adalah pemisahan DNA dengan

protein dengan cara penambahan fenol (mengikat protein dan sebagian kecil

RNA), kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan) dan

RNAse (Muladno, 2010 & Utami, 2012). Selain ketiga bahan kimia tersebut

ada pula dalam proses ini menambahkan isoamil alkohol (kloroform:isoamil

alkohol 24:1). Adanya isoamil alkohol bertujuan untuk mengurangi

pembentukan busa (anti foaming agent) (Marmur, 1961 & Restu et al., 2012).

Pada tahapan selanjutnya adalah purifikasi yang sebelumnya dilakukan proses

presipitasi DNA dengan penambahan garam (NaCl) dengan konsentrasi tinggi

sehingga dapat mengendapkan protein dikarenakan adanya proses salting out

(Kurniati, 2009). Pada salting out terjadi kompetisi antara protein dan garam

dalam menghidrasi dalam proses solvasi, sehingga protein dapat mengendap

(Plummer, 1971).

Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, metode isolasi

DNA dapat dilakukan dengan waktu pengerjaan yang lebih efisien. Hal ini

dikarenakan kegiatan preparasi larutan yang mendukung kerja isolasi dapat

diminimalkan atau tidak dilakukan. Salah satu pengembangan teknik isolasi

DNA, yaitu dengan penggunaan kit komersial yang semua larutannya sudah

tersedia dalam satu paket dengan pertimbangan untuk penggunaan beberapa

kali reaksi.

Pengukuran jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan dengan

mengukur melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi

sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam

larutan.penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada

panjang gelombang 260nm, sedangkan penyerapan oleh protein pada panjang

gelombang 280nm. Perbandingan absorbansi pada 260 nm dan 280 nm

(A260/A280) dapat memberikan validasi kemurnian DNA. Nilai rasio 1,8 – 2,0

menunjukkan sampel DNA yang murni (Muladno, 2010). Nilai rasio yang

lebih rendah dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi protein (Teare et al.,

1997; Gallagher, 1989), sedangkan nilai rasio melebihi 2,0 menunjukkan

adanya kontaminasi RNA.

17


2.5 Polymerase Chain Reaction PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik

perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah

spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida melalui bantuan

enzim dalam suatu thermocycler (Gaffar, S., 2007; Muladno, 2010; &

Sulistyaningsih, 2007). Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai

ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada

sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah

target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak

rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polimerase. Untuk

dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs

yang mencakup dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP (Muladno, 2010).

Menurut Gaffar (2007), PCR melibatkan banyak siklus yang masing-

masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai

DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan

pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh

DNA polymerase.

Keunggulan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan basa

nukleotida ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa

nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n

siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama

pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya

pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target

(Fatchiyah, 2008 dalam widiastika).

2.5.1 Komponen PCR

Ada 5 komponen penting dalam reaksi PCR, yaitu DNA

target/tamplate, sepasang primer, enzim Taq Polymerase,

deoxynucleoside triphosphate (dNTP), dan larutan buffer PCR (Gaffar,

2007 dan Muladno, 2010).

1. DNA Template

18


Dalam proses PCR, DNA template berfungsi sebagai cetakan

untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama atau molekul

DNA yang menjadi sekuen target yang akan diamplifikasi dan

biasanya berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen

DNA yang mengandung fragmen DNA target yang dituju.

Keberhasilan PCR tergantung dari ada atau tidaknya sekuen yang

sama dengan primer.

2. Primer

Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas

fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus

menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan

untuk proses eksistensi DNA. Pasangan primer terdiri dari 2

oligonukleotida yang mengandung 16 – 30 nukleotida dan

mempunyai 40 – 60 % basa G-C content. Sekuen primer kurang dari

16 basa dapat memicu amplifikasi produk PCR non spesifik. Untuk

ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming

(penempelan primer pada situs non-target) tinggi, ini akan

menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang

nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR.

3. dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates)

Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block

DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan

menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk

untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. dNTPs

merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin

trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin

trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat).

4. Buffer PCR dan MgCl2

Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium

karena reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu.

Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut

berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang

19


berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2

akan meningkatkan interaksi primer dengan template DNA.

5. Enzim DNA Polimerase

Enzim DNA polymerase berfungsi sebagai katalisis untuk

reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan

untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan

pada proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik

oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 950

C. Aktivitas polymerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari

mana bakteri tersebut diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu

polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai

aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik

enzim Taq polymerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus).

Penggunaan jenis polymerase DNA berkaitan erat dengan buffer

PCR yang dipakai.

2.5.2 Tahapan PCR

Adapun beberapa tahapan dalam proses PCR (gambar 2.7) adalah

denaturasi (pemutusan untai ganda menjadi untai tunggal melalui

pemanasan pada suhu 900 C – 950 C).

Gambar 2.7 Tahapan PCR (Sumber. www. faculty.unlv.edu)

Hal ini dikarenakan putusnya ikatan hydrogen diantara basa-basa

yang komplemen, annealing (penempelan primer reverse-forward pada

suhu 550 C-720 C akibat katalis enzim Taq Polymerase yang akan

20


berikatan dengan ikatan hydrogen pada suhu melting dimana separuh

jumlah primer menempel pada template), dan extension (pemanjangan

DNA dengan katalis enzim polymerase) (Gaffar, 2007; Muladno, 2010).

2.6 Real-time PCR

Real-time Polymerase Chain Reaction (RTPCR) merupakan salah satu

teknik analisis yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler

modern (Vaerman, 2004). Dibanding dengan teknik PCR konvensional (end-

point PCR), Real-time PCR memiliki berbagai keunggulan, yaitu amplifikasi

atau perbanyakan fragmen DNA yang dapat diamati seketika (secara realtime)

dan juga dapat menentukan konsentrasi target molekul DNA hasil amplifikasi.

Real-time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur adanya peningkatan

fluoroscent yang berpendar ketika terikat dengan doubled stranded DNA.

Fluoresensi yang dihasilkan sebanding dengan jumlah DNA template yang

teramplifikasi (Dooley et al., 2004). Dalam kurva amplifikasi ditunjukkan

adanya 3 fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial dan fasa plateau seperti pada

gambar 2.8 (Vaerman, 2004).

Gambar 2.8 Bentuk Kurva Real-time PCR (Sumber. Bio-rad.com)

Untuk menghindari masalah terkait dengan kespesifikan produk

amplifikasi PCR yang terdeteksi, satu atau lebih fluorescent probes dapat

ditambahkan dalam mix reaction. Probe dirancang sebagai komplemen

dalam sekuen target amplifikasi, dan produk PCR hanya akan terdeteksi jika

21


probe menempel pada situs target pada saat annealing. Apabila probe

menempel pada produk PCR selama langkah elongasi, aktivitas 5’-

exonuclease dari enzim polimerase akan memotong probe. Pemotongan

probe tersebut mengakibatkan terpisahnya reporter dari quencher yang

menyebabkan sinyal reporter tidak lagi diredam sehingga fluoresensi

reporter dapat terdeteksi (Velden et al.,2003). Prinsipnya, dalam setiap

siklus PCR, fragmen DNA baru diamplifikasi dengan enzim DNA

polimerase dengan bantuan primer forward dan primer reverse. Selama

amplifikasi, TaqMan probe menempel pada DNA template dan dirusak oleh

DNA polimerase, kemudian reporter melepaskan fluoresensi.


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Pangan dan

Obat Halal, Laboratorium Teknologi Sediaan Steril, dan Laboratorium

Penelitian II, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan-Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2015

hingga Juni 2015.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Real-Time PCR (LightCycler® 480.0-Roche), Sterofoam, tabung

mikrosentrifus volume 1.5 ml (Biogenix), High Pure Filter Tube dan

Collection Tubes (Kit High Pure PCR Tamplate Preparation-Roche®),

Plastic Wrap, Multiwell Plate 96 (Roche®), Sealing Foil (Roche®),

Mikropipet 0.5 – 10 µl (Biorad), Mikropipet 2 – 20 µl (Biorad),

Mikropipet 20 - 200 µl (Biorad), Mikropipet 100 – 1000 µl (Biorad),

Mikrotips volume 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl (Genfollower), Spatula,

Sentrifugator (5417R - Eppendorf), Vortex, Freezer, Digital Waterbath

(SB-100 Eyela), Autoklaf, batang pengaduk, gelas ukur, gelas beaker,

cawan penguap, kertas perkamen, plastik tahan panas, timbangan

analitik, kaca arloji, benang kasur, pipet tetes, Moisture Balance

Analyzer, dan Spektrofotometer UV DNA (BioDrop®).

3.2.2 Bahan

Gelatin babi [Sigma-Aldrich], gelatin sapi [Sigma-Aldrich], satu set kit

komersial High Pure PCR Template Preparation Roche® (meliputi:

Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor Removal

23


Wash Buffer, dan Elution Buffer), Tris Base, NaOH, NaCl, Sodium

Dodecyl Sulphat (SDS), Na2EDTA, Kloroform, Aquabidest [Roche],

Etanol Absolut [Merck], Etanol 70%, Isopropanol [Merck], LC TaqMan

Probe Master (terdiri dari: Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix,

MgCl2 6.4 mM) [Roche], dan Primer-probe (tabel 1).

Tabel 1. Urutan basa primer dan probe (Tanabe, et al., 2007 dengan modifikasi) Nama Primer Runutan Basa

Babi Forward 5'-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3'

Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3'

Probe 5'-(FAM)-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTACBHQ_1-3'

Sapi Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3'

Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3'

Probe 5'-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-BHQ_1-3'

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan lembar cangkang kapsul simulasi

a. Formulasi

Gelatin 30%

Sorbitol 5%

Pewarna 0.05%

Aquadest ad 100%

b. Cara Pembuatan

Sebanyak 9 gram masing-masing gelatin babi dan sapi

ditimbang dan dimasukkan ke dalam beaker glass dan ditambahkan

dengan 9 ml aquadest panas. Kemudian ditambahkan 1.5 ml

sorbitol, dan 0.015 gram pewarna. Campuran dihomogenkan dan

dicukupkan sampai 30ml dengan aquadest lalu dipanaskan sampai

membentuk larutan berwarna jernih. Campuran homogen

dituangkan ke dalam cetakan sehingga membentuk lapisan tipis.

24


Selanjutnya, lembaran simulasi cangkang kapsul keras disimpan

dalam wadah berisi silika gel.

3.3.2 Pembuatan Larutan Stok

Tahap pembuatan larutan stok cell lysis buffer SDS 1% (Sodium

Dodecyl Sulphate) terdapat di lampiran 2.

3.3.3 Preparasi Sampel

a. Gelatin

Sebanyak 100 mg standar gelatin sapi dan gelatin babi

ditimbang. Selanjutnya, masing-masing dimasukkan ke dalam

Microsentrifuge tube dan ditambahkan 200 μl aquabidest panas lalu

diinkubasi pada suhu 750 C selama 30menit. Selanjutnya

ditambahkan 250 μl Tissue Lysis Buffer (metode kit komersial High

Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 400 μl Cell Lysis

Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)] untuk melisiskan sel

dan 50 μl (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate

Preparation Roche®) dan 20 μl (metode cell lysis buffer SDS 1%)

larutan Proteinase K. Untuk menghomogenkan larutan tersebut

maka campuran di vortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu

57 0 C selama 21 jam (metode kit komersial High Pure PCR

Tamplate Preparation Roche®) dan 3 jam (metode cell lysis buffer

SDS 1%) dalam waterbath. Larutan gelatin yang dihasilkan

selanjutnya digunakan untuk tahap isolasi DNA.

b. Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi

Sebanyak 50 mg cangkang kapsul keras gelatin sapi dan

gelatin babi ditimbang. Selanjutnya, masing-masing dimasukkan ke

dalam Microsentrifuge tube dan ditambahkan 100 μl aquabidest,

250 μl Tissue Lysis Buffer (Roche®) dan 400 μl Cell Lysis Buffer

SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)] untuk melisiskan sel dan 50μl

(kit Roche®) dan 20 μl (SDS 1%) larutan Proteinase K. Untuk

menghomogenkan larutan tersebut maka campuran di vortex selama

1 menit dan diinkubasi pada suhu 570 C selama 21 jam (metode kit

komersial High Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 3

25


jam (metode cell lysis buffer SDS 1%) dalam waterbath. Larutan

gelatin yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk tahap isolasi

DNA.

3.3.4 Isolasi DNA

Metode 1 [Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR

Tamplate Preparation (Roche®)]

Meode isolasi DNA mengikuti metode Izzah (2014) dengan

modifikasi. Larutan (gelatin sapi, gelatin babi, simulasi cangkang

kapsul keras gelatin babi, dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin

sapi) hasil inkubasi ditambahkan 230 μl larutan Binding Buffer.

Campuran tersebut divortex selama 20 detik untuk menghomogenkan

dan diinkubasi pada suhu ± 70oC selama 10 menit pada waterbath.

Penambahan 150 μl isopropanol pada masing-masing tube

dan dihomogenkan dengan vortex selama 20 detik. Selanjutnya

campuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke filter tube yang

sebelumnya telah terpasang pada collection tube, kemudian tube

ditutup dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama

1 menit.

Proses selanjutnya, filter tube dilepaskan dari collection tube

dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan dengan collection

tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang

baru. Kemudian, ditambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer ke

dalam filter tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama

1 menit. Sama seperti sebelumnya setelah disentrifugasi filter tube

dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang

bersamaan dengan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali

dengan collection tube yang baru. Masing-masing tube ditambahkan

500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan

8000 rpm selama 1 menit. Pencucian dilakukan sekali lagi dengan

Wash Buffer seperti sebelumnya. Selanjutnya, filter tube dilepaskan

dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang. Filter

tube dipasang kembali dengan collection tube dan dilakukan

26


setrifugasi kembali selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm

diasumsikan agar tidak ada lagi wash buffer yang tertinggal pada filter.

Tahapan selanjutnya yaitu mengelusi DNA yang terdapat

pada filter tube dengan cara pisahkan collection tube dari filter tube

dan pasangkan dengan microsentrifuge tube yang bersih dan steril.

Kemudian ditambahkan 200 μl Elution Buffer yang sebelumnya telah

dihangantkan pada suhu 70oC selama 3 menit lalu disentrifugasi

selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Pada microsentrifuge tube

telah mengandung DNA terpurifikasi dan disimpan pada suhu 4oC

untuk dianalisa selanjutnya.

Metode 2 [Isolasi DNA dengan menggunakan Cell Lysis Buffer

SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)]

Metode yang digunakan mengikuti metode isolasi Zheng, et al.,

(1995) dalam Utami (2012) dengan modifikasi. Larutan (gelatin sapi,

gelatin babi, simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi, dan simulasi

cangkang kapsul keras gelatin sapi) hasil inkubasi disentrifugasi

dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 40 C.

Supernatan dipisahkan pada microtube baru dan ditambahkan 400 μL

kloroform dan divortex selama 20 detik. Sentrifugasi dilakukan pada

kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik pada suhu 40 C. Lapisan atas

yang terbentuk dipisahkan pada microtube baru dan ditambahkan 800

μL etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -350 C selama 1 jam.

Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 20 detik . Endapan berupa

pellet DNA ditambahkan 500 μL Etanol 70% dan disentrifugasi

kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik. Pellet yang

telah kering diresuspensi dengan 50 μL TE dan disimpan pada suhu -

350 C.

3.3.5 Pengukuran Kemurnian dan Kuantitas DNA

Kuantitas dan kemurnian DNA diukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV DNA (BioDrop®). Proses pengukuran mengikuti

protokol dari (BioDrop®) dengan cara pada layar spektrofotometer UV

27


DNA (Biodrop®) dipilih Nucleac Acid. Selanjutnya, sample port

dibersihkan dengan tisu steril. Elution Buffer (metode kit Komersial

High Pure PCR Template Preparation (Roche®)) dan Trish-EDTA

(metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

bertindak sebagai blangko. Sebanyak 2 µl sampel isolat dari masing-

masing metode diteteskan ke bagian sample port untuk diukur

kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol measure.

Tunggu beberapa detik akan muncul data kemurnian dan kuantitas

DNA.

3.3.6 Amplifikasi DNA dengan metode Real-Time PCR

Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 μM

dibuat dan dimasukkan ke dalam tube. Kemudian kedua larutan

tersebut dibuat menjadi primer dan probe konsentrasi 10 μM dan

disimpan ke dalam tube yang lain. Master Mix dibuat dengan volume

total 20 μL yang terdiri dari 5 μL template DNA, 1.4 μL Aquabidest, 1.6

μL primer forward konsentrasi 0.8 μM, 1.6 μL primer reverse

konsentrasi 0.8 μM, 0.4 μL probe konsentrasi 0.2 μM, dan 10 μL

LightCycler® 480 probe master (enzim FastStart Taq DNA Polymerase,

dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl2).

Master mix dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang

diinginkan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses

pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan

digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR

dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR

diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing

foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen real-

time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung

memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva.

3.3.7 Analisis Statistik

Data DNA genom yang telah berhasil diukur dengan

Spektrofotometer UV DNA (BioDrop®) pada serapan gelombang

260/280 nm dianalisis dengan menggunakan Software statistika, yaitu

28


IBM SPSS Statistics 20 dengan taraf kepercayaan 95% dengan Uji t

sehingga dapat diketahui apakah perbedaan rata-rata yang diperoleh

bermakna atau tidak.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan pengujian terhadap DNA simulasi

cangkang kapsul keras dengan Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction).

DNA didapatkan dari proses ekstraksi dan isolasi simulasi cangkang kapsul

keras dengan menggunakan kit komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl

Sulphate).

4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul Keras

Lembaran simulasi cangkang kapsul keras dibuat dari standar gelatin

sapi dan babi, sorbitol, aquadest, dan pewarna tartrazin. Penggunaan gelatin

sebagai bahan utama didasarkan atas pemanfaatan sifatnya yang sebagai

gelling agent (GMIA, 2012).

a b

Gambar 4.1 a. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi

b. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi

Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi yang

dihasilkan berupa lembaran tipis, sedikit transparan, dapat digulung,

berwarna kuning terang (asal gelatin babi) dan kuning cokelat (asal gelatin

sapi). Perbedaan warna yang dihasilkan tersebut akibat dari warna asal serbuk

gelatin (serbuk gelatin babi putih dan serbuk gelatin sapi kuning-cokelat).

Hasil simulasi cangkang kapsul keras ditunjukkan pada gambar 4.1.

Kandungan air dari lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin

sapi dan babi yang dihasilkan berturut-turut adalah 10.6 % dan 10.15 %.

Menurut Farmakope IV (1995) kandungan air dalam cangkang kapsul keras

adalah 10 – 15% sehingga dapat disimpulkan bahwa kandungan air dalam

lembaran simulasi cangkang kapsul keras yang dibuat memenuhi syarat.

30


4.2. Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dari gelatin sapi, babi, dan simulasi sapi dan

babi dengan cara mengekstraksinya. Metode ekstraksi yang digunakan ada

dua cara, yaitu menggunakan kit komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl

Sulphate). Prinsip metode tersebut intinya sama yaitu penghancuran

membran sel (cell lysis), pemurnian dari sel debris dan protein (purifikasi),

dan presipitasi DNA (Muladno, 2010 dan Rochec, 2007).

4.2.1. Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®)

Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)

terdiri dari lima larutan yang terpisah dan memiliki spesifikasi

masing-masing seperti yang terperinci dalam lampiran 4 Prinsip dari

kit ini adalah DNA sampel diabsorpsi oleh Silikon Dioksida (SiO2)

yang terdapat dalam filter tube dan selama pencucian dan pemusingan

DNA tetap terikat dengan fiber glass sehingga ini dapat

meminimalisir kehilangan DNA pada saat isolasi DNA (Izzah, 2014

dan Rochec, 2007).

Metode isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®) mengikuti metode Izzah (2014) dengan

mengalami modifikasi pada jumlah volume penggunaan Tissue Lysis

Buffer, Binding Buffer, dan Proteinase K. Peningkatan jumlah volume

penggunaan bahan tersebut berdasarkan arahan dari protokol Kit

Roche® apabila dalam penggunaan prosedur isolasi tidak memberikan

hasil yang memuaskan. Modifikasi pada penggunaan bahan tersebut

didasarkan pada peran masing-masing, yaitu Tissue Lysis Buffer

sebagai penghancur membrane sel dikarenakan adanya EDTA

(Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) sehingga dengan penambahan

jumlah penggunaannya maka semakin besar sel yang hancur

akibatnya semakin banyak pula DNA yang keluar dari sel, Binding

Buffer berperan dalam ikatan DNA dan Silikon Dioksida sehingga

dengan menambahkan jumlah volume pemakaiannya maka semakin

31


banyak DNA yang terikat kuat, dan Proteinase K yang mempunyai

peran untuk menghilangkan protein sehingga dengan begitu ketika

jumlah Proteinase K ditingkatkan maka jumlah kontaminan protein

dalam isolat DNA semakin kecil.

Keunggulan dari metode kit komersial High Pure PCR

Template Preparation (Roche®) adalah sederhana dan ekonomis.

Dikatakan sederhana karena dalam pengerjaannya tidak rumit (proses

presipitasi dihilangkan) dan aman (risiko terpapar bahan toksik dapat

dihindari seperti tidak adanya penggunaan kloroform dan deterjen).

Metode ini juga relatif ekonomis karena tidak membutuhkan banyak

pelarut namun kandungannya lengkap seperti diperlihatkan pada

lampiran 4. Dalam penelitian yang menjadi kelemahan dari metode

kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) adalah

relatif lama dalam pengerjaannya karena waktu proses lisis sel yang

dilakukan overnight dan hanya dapat digunakan untuk beberapa

reaksi saja.

4.2.2. Isolasi DNA dengan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl

Sulphate)

Salah satu metode konvensional untuk isolasi DNA adalah

dengan penggunaan deterjen dan agen pengkhelat dalam proses

lisisnya (Muladno, 2010). Deterjen yang digunakan dalam penelitian

adalah SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang merupakan deterjen

kationik yang memiliki kemampuan dapat melarutkan komponen lipid

dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada

membran sel sehingga struktur membran sel menjadi rusak (Kesmen,

et al., 2009; Maftuchah & Zainudin, 2006; dan Malisa et al., 2006).)

Keberadaan agen pengkhelat seperti EDTA (Ethylene Diamine Tetra

Acetic Acid) dalam penelitian dapat memutuskan ikatan fosfodiester

pada DNA dengan cara mengikat kation divalen yang merupakan

aktivator bagi DNAse (Saili, 2006 dalam Rahmawati, 2012). Tahapan

isolasi DNA mengikuti metode Utami, et al., (2012) dengan

modifikasi pada jenis sampel yang diisolasi dan penambahan

32


proteinase K. Sampel isolasi dalam penelitian ini adalah gelatin sapi

dan babi dan simulasi sapi dan babi. Penambahan proteinase K

bertujuan untuk menghilangkan kontaminan protein dalam isolat

DNA dan memberikan aktivitas dari SDS 1% menjadi lebih optimal

(Hilz, et al., 1975 dan Muladno, 2010).

Larutan yang digunakan dalam metode konvensional ini adalah

kloroform, etanol absolut, dan etanol 70%. Fungsi dari kloroform

adalah untuk presipitasi protein, sedangkan etanol absolut dan etanol

70% berturut-turut berperan sebagai presipitasi DNA dan purifikasi

DNA (Utami, et al., 2012). Pada saat presipitasi DNA terbentuk 3

lapisan seperti yang diperlihatkan pada lampiran 5 yaitu lapisan atas

adalah fase air, lapisan tengah adalah protein, dan lapisan bawah

adalah fase organik (kloroform). Kejadian ini terjadi karena adanya

perbedaan masa jenis. Masa jenis air lebih kecil (1 g/mL) dari masa

jenis kloroform (1.4474 g/mL) shingga air berada di lapisan atas dan

kloroform berada di lapisan bawah. Lapisan atas merupakan fase air

yang mengandung DNA terlarut akibat dari sifat keduanya yang

sama-sama polar. Sifat DNA yang polar dikarenakan adanya muatan

negatif pada rantai fosfat sedangkan protein berada pada pelarut

organik (kloroform) akibat sifatnya yang nonpolar (Rahmawati,

2002).

Proses presipitasi dilakukan dua kali yang bertujuan untuk

memperkecil DNA dari kontaminan protein. Adanya DNA pada fase

air maka lapisan ini diambil dan dipisahkan untuk proses presipitasi

DNA. Presipitasi DNA menggunakan etanol absolut dengan cara

membuat DNA menjadi kurang hidrofil sehingga DNA mengendap.

Pemisahan endapan (pellet) dan supernatan perlu kehati-hatian karena

akan menentukan pada kemurnian isolat yang dihasilkan.

Isolasi dengan metode SDS memiliki keuntungan, yaitu efisiensi

waktu pengerjaan yang relatif cepat dan dapat digunakan beberapa

kali reaksi. Pengerjaan yang relatif cepat dikarenakan proses lisis sel

33


yang hanya diperlukan 3 jam dalam penelitian sehingga total

pengerjaan kurang lebih 5 jam (lihat tabel 4.1).

Tabel 4.1 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS

Nama Metode Waktu Pengerjaan

Biaya (1xReaksi)

Tahapan

Kit Roche® ± 23 jam ± Rp 30.800 Sederhana (tidak ada tahap presipitasi protein dan DNA)

SDS ± 5 jam ± Rp101.500 Rumit (ada pembuatan larutan stok, ada tahap presipitasi protein dan DNA)

Namun, kekurangan metode ini adalah step-step pengerjaan

yang cukup rumit, membutuhkan ketelitian yang ekstra terutama

dalam hal pemisahan supernatan dan endapan (pellet) karena

kemungkinan kehilangan isolat lebih tinggi akibat dari pengulangan

tahapan tersebut dan tingkat keamanan yang harus diperhatikan

karena kontak dengan bahan-bahan yang toksik (serbuk SDS,

kloroform, etanol absolut) dalam jumlah yang cukup banyak serta

membutuhkan biaya yang mahal.

4.2.3. Pengukuran Isolat DNA

Isolat DNA yang dihasilkan diukur menggunakan alat

Spektrofotometer DNA (Biodrop®) pada panjang gelombang 260 nm

dan 280 nm. Hasil analisis diinterpretasikan pada tabel 4.1.

Analisis isolat DNA didapatkan nilai konsentrasi (jumlah DNA)

dan kemurnian. Pengukuran nilai konsentrasi didasarkan pada prinsip

iradiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein

dalam isolat. Secara maksimal penyerapan iradiasi oleh DNA dicapai

pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan untuk protein pada

panjang gelombang 280 nm (Muladno, 2010). Dari hasil yang

34


dengan metode cell lysis buffer SDS 1% berkisar 16.73 – 20.83 ng/ µl, 4.55 – 11.97 ng/ µl, 13.30 – 15.39 ng/ µl, dan 20.53 – 36.99 ng/ µl.

Hasil konsentrasi gelatin sapi dan babi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) yang

didapatkan lebih besar dari penelitian sebelumnya yang hanya sekitar 19.38 ng/ µl untuk gelatin sapi dan 13.63 ng/ µl untuk gelatin babi

(Izzah, 2014). Secara garis besar isolasi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) memperoleh

konsentrasi DNA yang lebih tinggi dibandingkan metode isolasi dengan cell lysis buffer SDS 1% karena pada metode kit tidak terjadi

proses presipitasi dan kandungan reagennya lebih banyak seperti adanya Urea dan Triton X namun pada simulasi babi sebaliknya metode

SDS yang lebih tinggi.

Tabel 4.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®)

Nama Sampel

Nama

Metode

Isolasi

Hasil

Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian (A260/A280)

I II III Rata-rata a

I II III Rata-rata a

Gelatin Sapi Kit Roche

® 27.84 31.63 48.77 36.08 ± 11.15 1.561 1.698 1.698 1.652 ± 0.079

SDS

16.73 20.83 19.26 18.94 ± 2.07 1.367 1.401 1.351 1.373 ± 0.026

Gelatin Babi Kit Roche

® 3.71 11.70 16.90 10.77 ± 6.64 1.369 1.510 1.707 1.529 ± 0.170

SDS

4.55 9.09 11.97 8.536 ± 3.74 1.284 1.195 1.092 1.190 ± 0.096

Simulasi cangkang

kapsul dari gelatin

sapi

Kit Roche®

8.70 13.82 19.01 13.84 ± 5.15 1.851 1.169 1.583 1.534 ± 0.343

SDS

13.57 15.39 13.30 14.09 ± 1.14 1.408 1.345 1.424 1.392 ± 0.041

Simulasi cangkang

kapsul dari gelatin

babi

Kit Roche®

2.30 4.33 9.54 5.388 ± 3.73 1.772 1.310 2.013 1.698 ± 0.357

SDS

20.53 23.87 36.99 27.13 ± 8.70 1.283 1.299 1.276 1.286 ± 0.012

Keterangan : a mean ± SD

35


Hasil pengukuran kemurnian yang didapatkan belum dikatakan

murni. Menurut Muladno, (2010) bahwa DNA yang dikategorikan

murni berkisar 1.8 – 2. Dalam penelitian, nilai kemurnian gelatin sapi,

gelatin babi, simulasi sapi, dan simulasi babi pada metode kit

komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) berturut-

turut berkisar 1.561 – 1.698, 1.369 – 1.707, 1.169 – 1.851, dan 1.310

– 2.013 sedangkan metode cell lysis buffer SDS 1% berturut-turut

1.351 – 1.401, 1.092 – 1.284, 1.345 – 1.424, dan 1.276 – 1.299.

Berdasarkan nilai-nilai tersebut dapat disimpulkan bahwa isolasi

dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation

(Roche®) memberikan hasil kemurnian yang lebih bagus dikarenakan

adanya pengikatan DNA pada fiber glass (silikon dioksida) sehingga

pencampuran dengan bahan lain dapat diminimalisir.

4.2.4. Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika

Analisis pengukuran isolat DNA dilakukan dengan bantuan

program statistik, yaitu software IBM SPSS Statistics 20 bertujuan

agar lebih mudah dan cepat. Adapun hasilnya disajikan dalam tabel

4.2.

Tabel 3. Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan simulasi

menurut konsentrasi DNA

Metode Isolasi Mean SD c SE d P value N

Metode 1 a

Metode 2 b

16.520

17.174

13.500

7.881

6.750

3.941 0.936

4

4

Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)

b. Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

c. Standar Deviasi

d. Standar Error

Tujuan analisis dengan statistik adalah untuk mengetahui

apakah ada perbedaan mean antara dua kelompok (metode kit

komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan cell

lysis buffer SDS 1%). Uji yang dipakai adalah uji t tidak berpasangan

karena terdiri dari 2 kelompok dan tidak saling ketergantungan

(Hastomo, 2007). Syarat uji t adalah wajib berdistribusi normal dan

36


data konsentrasi ini memenuhinya. Dari tabel 3. rata-rata konsentrasi

DNA metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation

(Roche®) adalah 16.520 ng% dengan standar deviasi 13.500 ng%,

sedangkan untuk metode cell lysis buffer SDS 1% rata-rata

konsentrasi DNA-nya adalah 17.174 ng% dengan standar deviasi

7.881 ng%. Hasil uji statistik didapatkan nilai p=0.936, berarti pada

alpha 5% terlihat tidak ada perbedaan yang signifikan rata-rata

konsentrasi DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial

High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan metode isolasi

DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%.

Tabel 4. Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan simulasi

menurut kemurnian DNA

Metode Isolasi Mean SD c SE d P value N

Metode 1 a

Metode 2 b

1.60325

1.31025

0.084976

0.092500

0.042488

0.092500 0.003 4

4

Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)

b. Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

c. Standar Deviasi

d. Standar Error

Dari tabel 4.3 rata-rata kemurnian DNA metode kit komersial

High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) adalah 1.60325

dengan standar deviasi 0.084976 , sedangkan untuk metode cell lysis

buffer SDS 1% rata-rata kemurnian DNA-nya adalah 1.31025

dengan standar deviasi 0.092500 . Hasil uji t didapatkan nilai

p=0.003, berarti pada alpha 5% terlihat ada perbedaan yang

signifikan rata-rata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA

dengan kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®)

dan metode isolasi DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%.

4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul

Keras Gelatin dengan Real Time PCR

Amplifikasi DNA dengan Real Time PCR menggunakan metode

Hydrolisis Probe dengan mengikuti metode Izzah (2014) dengan sedikit

modifikasi pada jumlah siklus, yaitu 50 siklus menjadi 65 siklus untuk primer

37


sapi dan 60 siklus menjadi 65 siklus untuk primer babi. Persiapan metode

Hydrolisis Probe adalah menentukan sepasang primer target spesifik dengan

cara mendesain primer. Dalam penelitian, primer yang digunakan mengacu

pada Tanabe, et al., (2007) dalam Izzah (2014) dengan modifikasi.

4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang

Kapsul Keras Gelatin dengan Primer Sapi

Proses amplifikasi dilakukan dalam 3 tahap, yaitu tahap

denaturasi, anealing, dan ekstensi. Denaturasi adalah tahap dimana

DNA tamplate membelah menjadi untai DNA tunggal pada suhu 950 C.

Suhu tersebut merupakan waktu optimal DNA terdenaturasi (Muladno,

2010). Tahap penempelan (anealing) antara primer dan DNA tamplate

pada suhu 610 C sesuai optimasi yang dilakukan oleh Izzah (2014).

Salah satu keberhasilan dalam amplifikasi PCR adalah tergantung pada

suhu annealing primer. Jika suhu annealing terlalu tinggi,

oligonukleotida primer tidak akan menempel dengan baik, sehingga hasil

produk akan sangat sedikit. Namun, apabila suhu annealing terlalu

rendah, primer dapat menempel pada bukan situs target (non-spesific),

sehingga dihasilkan produk PCR yang tidak diinginkan bahkan bisa jadi

tidak ada produk yang dihasilkan (Dale & Malcom, 2002; Bartlet &

Stirling, 2003).

Format deteksi dari Hydrolisis Probe adalah FAM (6-carboxyl-

flourescein) sebagai reporter dan BHQ1 (Block Hole Quencher) sebagai

quencher (Johansson, 2006). FAM merupakan hidrolisis probe yang

memiliki serapan gelombang pada 483nm dan gelombang emisi 533nm

(Roche®), sedangkan BHQ1 memiliki serapan gelombang 543nm

(Johansson, 2006).

38


Gambar 4.2 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin pada

primer sapi

Keterangan : DS (Daging sapi), DB(daging babi), GS (Gelatin Sapi metode kit), GS2 (Gelatin

sapi metode SDS), GB (Gelatin babi metode kit), GB2 (gelatin babi metode SDS), SS

(simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi metode kit), SS2(simulasi cangkang kapsul

gelatin sapi metode SDS), SB (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode kit),

SB2 (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode SDS), dan NTC (No Tamplate

Control)

Data kualitatif yang diperoleh dari hasil analisis berupa Crossing

point (Cp). Cp adalah nilai dimana flouresens pada sampel meningkat

di atas fase lag (background) dan ini menjadi tanda pada siklus

keberapa sampel mulai teramplifikasi seperti diperlihatkan pada gambar

4.2.

Dari hasil kurva amplifikasi terlihat kenaikan kurva

(membentuk fase log) pertama kali dari daging sapi sesuai gambar 4.2

dengan Cp 13,92; selanjutnya diikuti berturut-turut gelatin sapi metode

SDS (26.47), simulasi sapi metode SDS (27.77), simulasi sapi metode

kit (27.85), gelatin sapi (29.78), dan daging babi (33.49). Kenaikan

tersebut menandakan primer yang dipakai spesifik dikarenakan semua

sampel yang sebagai kontrol positif dapat teramplifikasi dan NTC tidak

mengalami kenaikan. Naiknya daging babi kemungkinan pada saat

pengerjaan reaksi RT-PCR terkontaminasi. Real time PCR ini dapat

DS

GS2

SS2 GS DB

SB

SS

SB2

GB

GB2

SB NTC

SB

39


mendeteksi cemaran sampai 0.01% dan bahkan sampai piktogram

(Roche c).

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang

Kapsul Keras Gelatin dengan Primer Babi

Amplifikasi DNA gelatin dan simulasi cangkang kapsul keras

mengikuti metode Puspitaningrum (2014) dengan suhu annealing 610

C. DNA genom yang diamplifikasi adalah DNA genom yang memiliki

konsentrasi yang tinggi diantara tiga kali pengulangan dari masing-

masing sampel [gelatin babi (metode kit & SDS 1%), gelatin sapi

(metode kit & SDS 1%), simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi

(metode kit & SDS 1%), dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin

sapi (metode kit & SDS 1%) ]. Dari gambar 4.3 sampel yang

mengalami kenaikan adalah daging babi dengan Cp 10,86; simulasi

babi metode SDS (18.59), gelatin babi metode kit (27.29), dan daging

sapi (31.78).

Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin pada

primer babi

Keterangan : DS (Daging sapi), DB(daging babi), GS (Gelatin Sapi metode kit), GS2 (Gelatin

sapi metode SDS), GB (Gelatin babi metode kit), GB2 (gelatin babi metode SDS), SS

(simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi metode kit), SS2(simulasi cangkang kapsul

gelatin sapi metode SDS), SB (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode kit),

DB

SB2

NTC GB

GS2

SS2

GS

SS

GB2

SB

DS

40


SB2 (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode SDS), dan NTC (No Tamplate

Control)

Nilai Cp yang dihasilkan sesuai urutan tertinggi dengan jumlah

konsentrasi yang dimiliki dari masing-masing sampel. Sampel simulasi

cangkang kapsul keras dari gelatin babi dengan metode kit komersial

High Pure PCR Template Preparation dan gelatin babi metode cell lysis

buffer SDS 1% tidak mengalami kenaikan dikarenakan ada

kemungkinan DNA yang dikandung mengalami fragmentasi pada saat

pengolahan sehingga tidak ada sekuens yang cocok dengan primer babi

(Demirhan., et al., 2011) Naiknya daging sapi kemungkinan tercemar

pada saat pencampuran reaksi RT-PCR.


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:

1. Metode isolasi DNA kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation

lebih unggul (ekonomis, tingkat kemurnian tinggi, lebih aman, dan lebih

sederhana) dibanding metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl

Sulphate).

2. DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras dengan metode kit

komersial High Pure PCR Tamplate Preparation belum dapat

teramplifikasi, sedangkan dengan metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium

Dodecyl Sulphate) sudah dapat teramplifikasi.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan optimasi pada tahap presipitasi protein pada metode cell

lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) dengan asetonitril, asam

tungstat, dan asam trikoloroasetat agar didapatkan DNA genom dengan

tingkat kemurnian yang lebih bagus dari kloroform.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan metode isolasi DNA yang

lain seperti dengan deterjen CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl

Ammonium Bromide) dan kit SureFood® Animal ID Sens agar didapatkan

DNA genom yang lebih murni.

3. Perlu dilakukan pengujian lanjut dengan sampel cangkang kapsul yang

beredar di pasaran.

42


DAFTAR PUSTAKA

Ansel, Howard. (2005). Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi ed. Keempat. Jakarta:

UI Press

Bailey A.J., Paul R.G., (1998). Collagen – A not so simple protein. J. Soc. Leather

Techn. Chem. 82 (3), 104-110

Balti, et al. (2010). Extraction and Functional Properties of Gelatin From The Skin

of Cuttlefish (Sepia officinalis) using Smooth Hound Crude Acid

Protease-Aided Process. Artikel pada Press Food Hydrocolloids

Belitz, H. D., and W. Grosch. (1999). Food Chemistry. 2nd Edit. Springer, Germany.

Cai, H., X. Gu, M.S. Scanlan, D.H. Ramatlapeng dan C.R. Lively. (2012). Realtime

PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in

gelatin mixtures and gelatin capsules. J. Food Compos. Anal., 25, 83-87

Carr, J.M., K. Sufferling, dan J. Poppe. (1995). Hydrocolloids and Their Use in The

Confectionery Industry. Journal of Food Technology. Vol.32 (7). Hal:

41-42

Chawla, H. S. (2003). Plant Biotechnology : A Practical Approach. Science

Publishers, Inc. Plymouth

Dale, Jeremy W. & Malcom von Schantz. (2002). From Genes to Genomes:

Concepts and Applications of DNA Technology. United Kingdom : John

Wiley & Sons, Ltd

Fatimah, Widia. (2012). Analisa Profil Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Sebelum dan

Setelah Perlakuan Hidrolisis Enzim Pepsin. Skripsi. Program Studi

Kimia. Fakultas Sains dan Teknologi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gaffar, Shabrani. (2007). Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPA-

Universitas Padjajaran

Gallagher, S.R. (1989). Quantitation of DNA and RNA with Absorption and

Fluorescene Spectroscopy, dalam : F.A. Ausubel et al, Current Protocols

in Molecular Biology. New York : John Wiley & Sons

Giacomazzi, et al., (2005). Medium-Range Structural Properies of Vitreus

Germania Obtained Through First Principles Analyss of Vibrational

Spectra. Phys. Rev. Lett 95, 075505

Glicksman M. (1969). Gum Technology in Food Industry. New York: Academic

Press

43


Grobben, A.H., et al., (2004). Inactivation of the ovine-spongiform-encephalopathy

(BSE) agent by the acid and alkali processes used the manufacture of

bone gelatin. Biotechnology and Applied biochemistry 39: 329-338

GMIA, (2012), Gelatin Handbook , USA : Gelatin Manufactures Instituteof

America

Guillen, Gomez M.C., Perez-Mateos, M., Gomez-Estaca, J., Lopez-Caballero, E.,

Gimenez., B., & Montero, P. (2009). Fish Gelatin: A RenewableMaterial

for The Development of Active Biodegradable Films. Trends in Food

Science and Technology. Vol.20. hal 3-16

Hartati, Yeni W., Maksum, Iman P. (2010). Amplifikasi 0,4 kb Daerah D-Loop

DNA Mitokondria dari Sel Epitel Rongga Mulut untuk Keperluan

Forensik, FMIPA-Universitas Padjadjaran

Hidaka, S. dan S.Y. Liu. (2003). Effects of gelatins on calcium phosphate

precipitation: A possible application for distinguishing bovine bone

gelatin from porcine skin gelatin, J. Food Compos. Anal., 16, 477-483

Holme D.J. P. Hazel. (1998). Analytical Biochemistry 3rd ed, London: Addison

Wesley Longman

Izzah, A.N. (2014). Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolisis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapid an DNA Babi

dengan menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi.

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta

Johansson, M.K. 2006. Choosing Reporter-Quencher Pairs for Efficient Quenching

Through Formation of Intramolecular Dimers, dalam Methods in

Molecular Biology 335 : 17 – 29

Kesmen, Z., A.Gulluce., F. Sahin., H. Yetim. (2009). Identification of Meat Species

by Taqman-Based Real-Time PCR assay. Meat Science 82: 444 – 449

Khosravinia, et al, (2007). Optimazing Factors Influencing DNA extraction from

Fresh Whole avian blood. African journal of Biotechnology. Vol. 6(4).

Pp-481-486.

Koolman, Jan. (1994). Atlas Berwarna dan teks Biokimia / Jan Koolman, Klaus-

Heinrich Rohm ; alih bahasa, Septelia Inawati Wanandi ; editor edisi

bahasa Indonesia, Moh. Sadikin. Jakarta : Hipokrates, 2000

Kurniati, Elly. (2009). Pembuatan Konsentrat Protein dari Biji Kecipir dengan

Penambahan HCL. Jurnal Penelitian Ilmu Teknik 9(2) : 115 – 122

44


M. Wink, (2006), An Introduction to Molecular Biotechnology: Molecular

Fundamentals, Methods and Application in Modern Biotechnology,

Wiley-VCH, Weinheim, Germany

Maftuchah., & Zainudin, Agus. (2006). Pengembangan Metode Isolasi DNA

Genom pada Tanaman Jarak Pagar (Jatropha Curcas L.). HUMANITY

2(1): 63 – 69

Malisa, A. L., P. Gwakisa., S. Balthazary., S. K. Wasser., B.M. Mutayoba. (2006).

The Potential of Mitochondrial DNA Markers and Polymerase Chain

Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism for Domestic and

Wild Species Identification. African Journal of Biotechnology 5 (18):

1588

Mariod, A.A. & Adam, H.F., (2013), Review: Gelatin, Source, Extraction, and

Industrial Applications, J. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment 12 (2), 135-

147

Marmur, J., & L. Lane. (1958). Strand Separation and Specific Recombination in

Deoxyribonucleic Acids Biological Studies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

(44): 671 – 682– 1593

Montero, P; and M.C. Gomez-Guillen. (2000). Extracting Condition for Mergin

(Lepidorhombus boscii) Skin Collagen Affect Functioonal Properties of

Resulting Collagen. Jurnal of Food science, 55(2) 1 –5

Muladno. (2010). Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. Bogor: IPB Press

Mulyana, Yopi. (2010). Analisis Cemaran Daging Babi pada Kornet Sapi di

Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain

Reaction (PCR). Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Murray, et al., (2012). Biokimia Harper. Jakarta : EGC

Nhari, R.M.H.R., A. Ismail dan Y.B. Che Man. (2012). Analytical methods for

gelatin differentiation from bovine and porcine origins and food

products.J. Food Sci., 71, R42-R46

Plummer, D.T. (1971). An Introduction to Practical Biochemistry 1st Edition. New

Delhi : Tata McGraw-Hill Publishing Company Ltd

Pratami, D.F. (2011). Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Burger Sapi

yang Beredar di Wilayah Ciputat Melalui Amplifikasi DNA

Menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

45


Purves, et al. (2004). Life: The Science of Biology. Edisi Ketujuh. United States of

America : Sinauer Associates and W.H. Freeman

Puspitaningrum, Yanti. (2015). Deteksi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi pada

Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real-Time PCR untuk

Analisis Kehalalan. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas


Rabadiya, Bhavisha dan Paresh Rabadiya. (2013). Capsule Shell Material from

Gelatine to Non Animal Origin Material. International Journal of

Pharmaceutical Research and Bio Science (IJPRBS). Vol. 2(3). Hal: 42-

71

Rahmawati, Putri. (2012). Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Dendeng

Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA

Menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas


Replubika. (2014). Gelatin kulit babi vs kulit sapi, Republika online vers, Breaking

News, 25 November 2014. http//www.republika.co.id

Rowe, Raymond C., Paul J. Sheskey, dan Marian E Quinn. (2009). Handbook of

Pharmaceutical Excipients. Edisi Keenam. London:Pharmaceutical

Press

Saputra, F.R. (2014). Aplikasi Metode SDS-PHAGE (Sodium Dodecyl Sulphate

Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) untuk Mengidentifikasi Sumber

Gelatin pada Kapsul Keras. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Setiawati, Ima Hani. (2009). Karakterisasi Mutu Fisika Kimia Gelatin Kulit Ikan

Kakap Merah (Lutjanus sp.) Hasil Proses Perlakuan Asam.Skripsi.

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor

Solihin, Dedy Duryadi. (1994). Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA)

dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan.

Bogor : FMIPA IPB. ISSN 0854-8587

Subandiyah, S. (2006). Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi

Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA.Pelatihan dan

Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. Hal. 22-25

Sulistyaningsih, Erma. (2007). Polymerase Chain Reaction: Era Baru Diagnosis

dan Manajemen Penyakit Infeksi. Biomedis, 1 (1) : 17 – 25

Surzycki, S.J. (2000). Basic Techniquesin Molecular Biology. Springer-Verlag

publisher ISBN 3-540-66678-8

46


Stansfield, et al. (2003). Shaum’s Easy Outlines : Molecular and Cell Biology.

USA: Mc.Graw-Hill Companies, Inc

Susmiarsih, T. (2010). Peran Genetika DNA Mitokondroa (mtDNA) Pada Motilitas

Spermatozoa. Universitas Yarsi, Fakultas Kedokteran :Majalah

Kesehatan Pharma Medika

Syafiqoh, Fathmah. (2014). Analisis Gelatin Sapid an Gelatin Babi pada Produk

Cangkang Kapsul Keras Obat dan Vitamin Menggunakan FTIR dan

KCKT. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Tahmid, Muhammad. (2005). Studi Kelayakan Pendirian Industri Gelatin TipeB

Berbasis Tulang Sapi di Indonesia. Skripsi. Fakultas Teknologi

Pertanian. Institut Pertanian Bogor

Teare, J.M., R. Islam., R. Flanagan., S. Gallagher., M.G Davies., C. Grabau. (1997).

Measurement of Nucleic Acid Concentrations Using the DyNA QuantTM

and the GeneQuantTM. BioTechniques 22 : 1170 – 1174

Utami, et al., (2012), Varisai Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma

xanthorrhiza, Roxb), Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa,

Surabaya.

Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. (2004). Evaluation of Real-Time PCR

Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles

Windiastika, G. Teknologi Marka Molekular Tanaman. Balai Besar Pembenihan

dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya

Wink, M. (2006). An Introduction to Molecular Biotechnology: Molecular

Fundamentals, Methods and Application in Modern Biotechnology,

Germany: Wiley-VCH, Weinheim

Yuwono, Triwibowo. (2009). Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga

47


Lampiran 1. Kerangka Penelitian

Keterangan :

Produk

Proses

Preparasi

Metode SDS

Ekstraksi

Isolasi dan

Purifikasi DNA

Metode Kit

Pengukuran Kemurnian

dan

Konsentrasi DNA

Analisis hasil

Amplifikasi dengan Real

Time PCR

Gelatin Sapi Gelatin Babi

DNA terisolasi DNA tidak terisolasi

Cangkang Kapsul

Simulasi Babi

Cangkang Kapsul

Simulasi Sapi

Analisis Statistik

(Uji t)

Kesimpulan

48


Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS

a. Jumlah serbuk Na2EDTA yang diperlukan

Massa = M x Mr x V

1000

= 0.5 x 372.24 x 10

1000

= 1.8612 gram

b. Jumlah serbuk TRIS yang diperlukan

Massa = M x Mr x V

1000

= 1 x 121.14 x 10

1000

= 1.2114 gram

c. Jumlah serbuk NaCl yang diperlukan

Massa = M x Mr x V

1000

= 5 x 58.44 x 30

1000

= 8.76 gram

d. Larutan Na2EDTA yang diperlukan

M1 x V1 = M2 x V2

25 x 100 = 500 x V2

V2 = 5 ml

e. Larutan Tris-HCl yang diperlukan

M1 x V1 = M2 x V2

50 x 100 = 1000 x V2

V2 = 5 ml

f. Larutan NaCl yang diperlukan

M1 x V1 = M2 x V2

300 x 100 = 5000 x V2

V2 = 6 ml

49


Lampiran 3. Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS

a. Larutan SDS 5 %

- SDS : 2.5 gram

- NaCl : 1 gram

- Aquadest ad 50 ml

- Larutan dibuat dengan cara mencampurkan bahan kimia dalam beaker

glass sembari diaduk secara perlahan-lahan agar busa yang dihasilkan

tidak terlalu banyak.

b. Larutan Tris-HCL 1M pH 7.45 (10 ml)

- Tris : 1.2114 gram

- HCL p.a : 0.42 gram

- Aquadest ad 10 ml


glass dengan bantuan pengadukan magnetic stirrer dalam hot plate

- Larutan homogen disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 1210 C

selama 15 menit

c. Larutan Na2EDTA 0.5M pH 7.44 (10ml)

- Na2EDTA : 1.8612 gram

- NaOH : 0.2 gram

- Aquadest ad 10 ml


glass dengan bantuan pengadukan magnetic stirrer

- Untuk pengaturan pH dilakukan dengan menambahkan HCL hingga

pH7.44


selama 15 menit

d. Larutan NaCL 5M pH 7.5 (30 ml)

- NaCl : 8.76 gram

- Aquadest ad 30 ml

50


- Larutan dibuat dengan cara melarutkan NaCl dalam aquadest dengan

bantuan pengadukan menggunakan batang pengaduk


selama 15 menit

e. Buffer SDS (100 ml)

- Larutan SDS 1% : 20 ml larutan SDS 5%

- Larutan NaCl 300 mM : 6 ml larutan NaCl 5M pH 7.5

- Larutan Na2EDTA 25mM : 5 ml larutan EDTA 0.5M pH 7.44

- Larutan Tris-HCl 50mM : 5 ml larutan Tris-HCl 1M pH 7.45

- Aquadest steril ad 100 ml

- Larutan komponen buffer SDS dicampur homogenkan dengan bantuan

batang pengaduk

f. Buffer TE (50ml)

- Larutan Tris-HCl 1M pH 7.45 : 0.5ml

- Larutan EDTA 0.5M pH 7.44 : 0.1 ml

- Aquadest ad 50ml

- Larutan dicampurkan dan dihomogenkan dengan bantuan batang

pengaduk

51


Lampiran 4. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe serta Tm (Melting

Temperature) Primer

a. Perhitungan pembuatan larutan primer

1. Membuat larutan primer dan probe 10 µM dari larutan induk 100 µM

M1 x V1 = M2 x V2

10 µM x 100 µL = 100 µM x V2

V2 = 10 µL

Maka, 10 µL diambil dari masing-masing primer 100 µL dan di cukupkan

sampai volume 100 µL dengan PCR eater grade

2. Membuat larutan primer dengan konsentrasi 10 µM

M1 x V1 = M2 x V2

0.8 µM x 20 µL = 10 µM x V2

V2 = 1.6 µL

Maka, diambil 1.6 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM

3. Membuat larutan probe dengan konsentrasi 0.2 µM

M1 x V1 = M2 x V2

0.2 µM x 20 µL = 10 µM x V2

V2 = 0.4 µL

Maka, diambil 0.4 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM

b. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

Primer sapi

Tm Forward = 20 C (2+8) + 40 C (2+8)

= 600 C

Tm Reverse = 20 C (5+8) + 40 C (6+5)

= 700 C

Tm Rata-rata Primer sapi

Tm = (60+70)/2

= 650 C

Ta* = 600 C

Primer Babi

Tm Forward = 20 C (7+6) + 40 C (4+7)

= 700 C

Tm Reverse = 20 C (8+7) + 40 C (6+4)

= 700 C

Tm Rata-rata Primer babi

Tm = (70+70)/2

= 700 C

Ta* = 650 C

52


Lampiran 5. Tabel Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®) dan Campuran Reaksi Hydrolisis Probe

Mastemix

Tabel 1. Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure PCR Template

Preparation (Roche®)

No. Nama Komponen Kit Komposisi

1. Tissue Lysis Buffer 4M Urea, 200mM Tris,

20mM NaCl, 200mM

EDTA pH 7.4

2. Binding Buffer 6M Guanidine HCl,

10mM Urea,10 mM

Tris-HCl, 20% Triton X-

100 (v/v) pH 4.4

3. Inhibitor Removal Buffer 5M Guanidine HCl,

20mM Tris-HCl pH 6.6

4. Proteinase K Enzim Proteinase PCR

grade

5. Wash Buffer 20mM NaCl, 2mM Tris-

HCl pH 7.5

6. Elution Buffer 10mM Tris-HCl pH 8.5

7. High Pure Filter Tube Berasal dari bahan

polipropilen yang terdiri

dari dua lapisan serat

kaca

8. Collection Tube Berasal dari bahan

polipropilen

Tabel 2. Campuran Reaksi Hydrolisis Probe Mastemix

Konsentrasi Larutan Induk

Jumlah yang

digunakan

Primer Forward 0.8 µM 10 µM 1.6 µM

Primer Riverse 0.8 µM 10 µM 1.6 µM

Probe 0.2 µM 10 µM 0.4 µM

LightCycler® 480

Probe Master - - 10 µM

ddH2O - - 1.4 µM

DNA Tamplate - - 5 µM

Total 20 µM

53


Lampiran 6. Gambar Presipitasi Protein

Gambar 2. Fase air (a),

protein (b), dan kloroform

(c) pada ekstraksi simulasi

cangkang kapsul sapi


protein (b) dan kloroform

(c) pada ekstraksi gelatin

sapi


protein (b) dan kloroform (c)

pada ekstraksi simulasi

cangkang kapsul gelatin babi

Gambar 3. Fase air (a) ,

protein (b) dan kloroform

(c) pada ekstraksi gelatin

babi

a

b

c

a

b

c

54


Lampiran 7. Hasil Analisis Nilai Konsentrasi dengan SPSS

1. Uji Normalitas

Metode Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Konsentrasi Kit Roche® .329 4 . .854 4 .238

SDS 1% .161 4 . .990 4 .959

a. Lilliefors Significance Correction

Uji Normalitas menggunkaan parameter Shapiro-Wilk karena sampel ≤ 50

Nilai sig./p merupakan nilai yang menunjukkan besarnya peluang salah menolak Ho dari penelitian (Hastono, 2007)

Nilai α yang digunakan adalah 5% (tingkat kemaknaan)

Hipotesis : Ho = Data terdistribusi normal

Ha = Data tidak terdistribusi normal

Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 maka hipotesis nol diterima (data

terdistribusi normal)

Group Statistics5%

Metode N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

Konsentrasi Kit Roche® 4 16.51950 13.500123 6.750061

SDS 1% 4 17.17400 7.881768 3.940884

55


2. Uji Varians dan Uji t Tidak Berpasangan

Independent Samples Test

Levene's

Test for

Equality of

Variances

t-test for Equality of Means

F Sig. T df Sig. (2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error

Difference

95% Confidence Interval of the

Difference

Lower Upper

Konsentrasi

Equal variances

assumed .865 .388 -.084 6 .936 -.654500 7.816258 -19.780195 18.471195

Equal variances

not assumed

-.084 4.832 .937 -.654500 7.816258 -20.958431 19.649431

a. Uji Varians menggunkaan parameter Levene



Hipotesis : Ho = Data varians sama

Ha = Data varians beda

Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 (0.388) maka hipotesis nol diterima

(data varians sama)

56



( Rata-rata tidak berbeda secara signifikan )

b. Uji t tidak berpasangan



Hipotesis : Ho = Rata-rata tidak berbeda secara signifikan

Ha = Rata-rata berbeda secara signifikan

57


Lampiran 8. Hasil Analisis Nilai Kemurnian dengan SPSS

1. Uji Normalitas

Tests of Normality

Metode Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Kemurnian Kit Roche® .292 4 . .851 4 .229

SDS 1% .251 4 . .916 4 .512

a. Lilliefors Significance Correction

Uji Normalitas menggunkaan parameter Shapiro-Wilk karena sampel ≤ 50



Hipotesis : Ho = Data terdistribusi normal

Ha = Data tidak terdistribusi normal

Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 maka hipotesis nol diterima (data

terdistribusi normal)

Group Statistics

Metode N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

Kemurnian Kit Roche® 4 1.60325 .084976 .042488

SDS 1% 4 1.31025 .092500 .046250

58


2. Uji Varians dan Uji t Tidak Berpasangan

Independent Samples Test

Levene's Test for

Equality of

Variances

t-test for Equality of Means

F Sig. t df Sig. (2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error

Difference

95% Confidence Interval of the

Difference

Lower Upper

Purity

Equal variances

assumed .001 .983 4.665 6 .003 .293000 .062804 .139325 .446675

Equal variances not

assumed

4.665 5.957 .004 .293000 .062804 .139058 .446942

a. Uji Varians menggunkaan parameter Levene



Hipotesis : Ho = Data varians sama

Ha = Data varians beda


(data varians sama)

59



( Rata-rata berbeda secara signifikan )

a. Uji t tidak berpasangan



Hipotesis : Ho = Rata-rata tidak berbeda secara signifikan

Ha = Rata-rata berbeda secara signifikan

60


Vortex 1’ , ink. 700

C, 10 menit

Filter tube, sentrifugasi 8000 rpm, 1 menit,

ganti collection tube

sentrifugasi 8000 rpm, 1menit,






Vortex 1 menit

Lampiran 9. Bagan Metode Isolasi DNA

a. Metode Isolasi DNA Kit Komersial High Pure PCR Tamplate Preparation

(Izzah, 2014)

50 mg gelatin + 100 µL aquadest 750

C+ 200 µL Tissue lysis

buffer + 40 µL Proteinase K

+ 200 µL Binding buffer

+ 500 µL Inhibitor Removal Buffer

+ 500 µL Washing Buffer


+ 150 µL Elution Buffer

Simpan pada suhu 40 C

+ 150 µL Isopropanol

ink. 570

C, 21 jam

’

Vortex 1’ , ink. 570 C, 21 jam

Buang filter tube

61


Vortex 1 menit , ink. 700

C, 10 menit

Filter tube, sentrifugasi 8000 rpm, 1 menit,








Vortex 1 menit

b. Metode Isolasi DNA Kit Komersial High Pure PCR Tamplate Preparation

(Izzah, 2014 dengan modifikasi)

100 mg simulasi cangkang kapsul + 200 µL aquadest 750

C

+ 230 µL Binding buffer

+ 500 µL Inhibitor Removal Buffer



+ 150 µL Elution Buffer

Simpan pada suhu 40 C

+ 250 µL Tissue lysis buffer + 50 µL Proteinase K

+ 150 µL Isopropanol

Vortex 1 menit, ink. 570

C, 21 jam

’


Buang filter tube

ink. 750

C, 30 menit

’


Filter tube, sentrifugasi 8000 rpm, 1menit,


62


c. Metode Isolasi DNA Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

(Utami, et al., 2012)

200 mg daun temulawak, + 400 µL buffer SDS 1%

+ 100 µL buffer SDS 1%, + 20 µL Proteinase K

+ 800 µL etanol absolut

Simpan di - 200

C

+ 400 µL kloroform

Ambil lapisan atas

+ 500 µL etanol 70%

+ 50 molecular water

+ 400 µL kloroform

Digerus halus

Ambil lapisan atas

Ambil pellet

Inversi, Sentrifugasi 13000 rpm, 1’

ink. -200

C, 1 jam, Sentrifugasi 13000 rpm, 3’

Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ Ambil pellet, keringanginkan

63


d. Metode Isolasi DNA Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

(Utami, et al., 2012 dengan modifikasi)

+ 400 µL buffer SDS 1%, + 20 µL Proteinase K

+ 800 µL etanol absolut

Simpan di - 350

C

+ 400 µL kloroform

Ambil supernatan

Ambil lapisan atas

+ 500 µL etanol 70%

+ 150 µL TE

+ 400 µL kloroform

Ink. 750

C, 30’

Ambil lapisan atas

Ambil pellet

Ink. 570


Vortex 20’’, Sentrifugasi 13000 rpm, 1’

Vortex 20’’, Sentrifugasi 13000 rpm, 1’

ink. -350


Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ Ambil pellet, keringanginkan

100 mg simulasi cangkang kapsul + 200 µL aquadest 750

C

64


Lampiran 10. Gambar Bahan-Bahan yang digunakan dalam penelitian

Gambar 1. Larutan Stok

SDS Ekstraksi

Gambar 4. Simulasi Cangkang

Kapsul Gelatin Babi dan Serbuk

Gelatin Sapi

Gambar 3. Serbuk Gelatin

Babi dan Simulasi Cangkang

Kapsul Gelatin Babi

Gambar 2. Larutan Stok

Kit Ekstraksi (Roche®

)

65


Lampiran 11. Gambar Alat-alat yang Digunakan dalam Penelitian

Gambar 1.

Spektrofotometer DNA

(Biodrop®)

Gambar 2. Collection

Tube dan Filter Tube

(Roche®

)

Gambar 4. Multiwell,

Sealing Foil, dan

Perekat

Gambar 3. Real Time

PCR (Polymerase Cain

Reaction)

Documents

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA - repository.uinjkt.ac.idrepository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/37917/1/RIAN... · 3.3.3 Preparasi Sampel ... Tabel 4 Distribusi Rata-rata