G35-36 Nadège CALMELS Jean-David RICARDON et Thomas MEREBCours du 26/10/12 de 14h à 16hM1 Physiopathologie

Recherche de remaniements chromosomiques par puces à ADN

I. LES TECHNIQUES D’ANALYSE GLOBALE DU GENOME

Cytogénétique classique: le caryotype• Caryotype humain à 46 chromosomes (Tijo et Levan, 1956)• Découverte de la première anomalie chromosomique: la trisomie 21 (Lejeune, 1959)• Techniques de bandes chromosomiques: bandes R et G (1970’s)Il y a une augmentation de la résolution, ce qui nous permet de voir des anomalies de plus en plus petites

Caryotype standard (500 bandes) : on voit des anomalies qui vont jusqu'à 10 mégabases (10^6 bases)Caryotype haute résolution : 5 Mb

Le caryotype se fait sur des cellules en culture et non de l’ADN (on fait une prise de sang, on met les lymphocytes en culture, puis on récupère sur une lame de verre les cellules en mitose pour pouvoir classer les chromosomes).

Cytogénétique moléculaire: la FISH Hybridation in situ fluorescente (1980’s) On utilise un petit morceau d'ADN marqué avec une sonde fluorescente qui peut être une sonde centromèrique, chromosomique (et réaliser ainsi une peinture chromosomique), ou une sonde locus spécifique.+ Robuste, rapide, résolution d'environ 200 kb : permet l'étude de syndromes microdélétionnels- On est dans une étude ciblée : on cherche si le patient à une délétion,...

Défit technologiqueEffectuer une analyse pangénomique et avoir une résolution fine.

Hybridation génomique comparative (CGH) (1982)On prend l'ADN du patient et un ADN de référence et on les marie avec des couleurs différentes.A coté, sur une lame de verre on prépare des étalons chromosomiques d'un individu contrôle qui va bien.On mélange l'ADN du patient avec l'ADN de référence, on le dénature pour que les brins se séparent. On dénature les chromosomes qui sont sur la lame et on met tout ça en contact.Les régions qui sont complémentaires de l'ADN du patient et de l'ADN de référence vont aller s'hybrider sur les chromosomes qui sont sur la lame. Il y aura donc compétition entre l'ADN du patient et l'ADN de référence.Statistiquement, autant d'ADN du patient que d'ADN de référence va aller se fixer sur l'e chromosome qui correspond.On révèle ça avec un scanner qui détecte le mélange de fluorescence.Si il y a plus d'ADN du patient le spot sera plutôt vert. Si le patient a une délétion c'est plutôt l'ADN de référence qui va s'hybrider et ce sera plutôt rouge.

+ Résolution d'environ 3 Mb, étude pangénomique (on étudie tous les chromosomes)- Manque de reproductibilité, technique longue

… d'où l’avènement des puces à ADN !

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II. LES PUCES A ADN

Aussi appelé :- CGH array (CGHa) - Caryotype moléculaire- Analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA)- …

La CGH sur puce ou CGH array (1997)

Au lieu d'hybrider l'ADN du patient sur l'ADN de référence sur une lame de verre on va hybrider ça sur une lame ou a été déposé des petits morceaux d'ADN. On prend donc l'ADN d'un individu sain,

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on le coupe en petits morceaux on va faire des milliers de copies sur un point / spot d'une lame de verre. On fait ça pour tous les chromosomes.On mélange les 2 ADN qui ont été marqués différemment, on hybride sur la lame avec les spots et on aura la même différences : si il n'y a ni gain ni pertes dans l'ADN du patients les deux vont entrer en compétitions et aller s'hybrider de la même façon.

Rq : Le principe de la CGH array était tombé à l'exam il y a 2 ans. La prof a donc beaucoup insisté sur ça...

étapes- on extrait l'ADN double brin- on les coupe en différents fragments avec une enzyme de restriction- on marque chaque ADN avec des molécules fluorescentes de couleurs différentes- on met des spots (grand nombre du même fragment d'ADN simple brin) sur la lame- on mélange en quantité égale et on dénature les 2 ADN - on les met sur la puce et les parties d'ADN complémentaires vont aller s'hybrider sur les spots- le scanner permet de révéler les différences de couleurs

Les différents types de puces à ADNLes puces permettent toutes l'exploration pangénomique avec fort niveau de résolutionDifférentes techniques- CGHarray : BAC/PAC ou oligonucléotides- Puces SNP (ou polymorphismes)

A. CGH array (voir précédemment)

Résumé: Deux ADN marqués (patient, contrôle) sont hybridés de façon compétitive sur des séquences nucléotidiques déposées sur une puce afin de détecter une différence de nombre de copies entre les 2 échantillons au niveau de chacune des séquences : ADN patient (ADN contrôle)BAC

1) CGH array de type BAC/PAC

BAC: bacterial artificial chromosomePAC: phage artificial chromosomeCréation d’une banque génomique :- ADN génomique humain fragmenté- morceaux insérés dans des BAC (petit morceau d'ADN circulaire)- insertion du BAC dans la bactérie- amplification par bactéries

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Extraction de l’ADNDépôt de chaque fragment sur une lame (puce) à un endroit précis (spotter)Technique plus tellement utilisée car spots de grandes tailles, on ne peut donc pas en mettre beaucoup sur une lame.

2) CGH array de type oligonucléotides

Fragments d’ADN sont remplacés par des oligonucléotides (25 –60 mers)Exemple: puces Agilent: fabrication in situ type imprimante jet d’encre.Il y a les 4 bases et selon le patron qu'on lui fourni l’imprimante va déposer d'abord une base puis une autre au dessus jusqu'à faire un oligonucléotide d'une soixantaine de paires de bases.

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B. Puces SNP (Affymetrix, Illumina,…)

SNP: Single Nucleotide Polymorphism (en moyenne, 1 SNP/1 000pb)1 individu : 3 milliards de paires de bases → 3 millions de SNP

Sondes localisées au niveau de SNP et il y aura plusieurs sondes par SNP car il y a des sondes spécifiques de l'allèle A et des sondes spécifiques de l'allèle B2 informations:- nombre de copie (comme CGHa) : on détecte gains et pertes d'ADN- génotype homozygote A/A ou B/B ou hétérozygote A/B

- Association sur les puces de sondes SNP (sondes polymorphiques) et de sondes non polymorphiques- Haute résolution (jusqu’à 2,7 millions de sondes / puce (résolution: 1,5 kb = 1500 pb))- pas de compétition avec un ADN normal : comparaison avec une référence informatique- détection des isodisomies uniparentales

Quand on est en isodisomie on ne trouve que des SNP à l'état homozygote. Il y a donc une région de perte d'hétérozygotie.Par contre quand on est en hétérodisomie il n'y aura pas de perte d'hétérozygotie.

Situations potentiellement pathogènes quand concernent des gènes soumis à empreinte parentale

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Régions soumises à empreinte parentale et pathologies associéesLa plupart des gènes soumis à empreinte sont localisés sur le chromosome 6, 7, 11, 14, 15.Donc en cas de perte d'hétérozygotie dut à une isodisomie certains de ces gènes peuvent ne pas être du tout exprimé.Exemple de pathologies liées à un défaut d’expression de gènes soumis à empreinte parentale(différents mécanismes possibles, il y a aussi la délétion):

- Syndrome de Prader-Willi- Syndrome d'Angelman- Syndrome de Silver-Russel- Syndrome de Beckwith-Wiedemann- Ostéodystrophie héréditaire d'Albright, …

Quelque soit le type de puce, importance de la résolution (directement liée au nombre de sonde)

Quelque soit le type de puce on ne va pas mettre tout le génome (3 milliards de pb)  : on va prendre un panel de sondes représentatives (1000 sondes sur chromosome 1, 1000 sur le 2 par exemple). Il est utile de savoir combien il y avait de sonde sur la lame car de ça va découler la résolution car plus on a de sonde et plus on voit des petites anomalies.

III. LES VARIATIONS DU NOMBRE DE COPIE (CNV)

Résultats de la puce = liste de variations du nombre de copie chez le patient.Selon la résolution et la qualité de la puce utilisée: de 2 à plusieurs dizaines de CNV/patientL’un d’entre eux est-il responsable de la pathologie?

Tous les CNV ne sont pas pathogènes !!Avril 2003: fin du Human Genome Project, basé sur la notion que 99,9% du génome des individus sains sont identiques (à quelque SNP près)2004: présence de 100aine de variations du nombre de copie (CNV: copy number variant) chez les individus sains2006 : CNV couvrent 12% du génome humain. Il y a donc des gens qui vont parfaitement bien et qui ont des lésions ou des gains de certaines régions. Ces régions peuvent contenir des gènes (non sensibles à l’haploinsuffisance)

Problèmes d’interprétation = déterminer la pathogénicité d’une anomalieDéfinition CNV: fragment d’ADN de plus de 1kb, présent en un nombre variable de copie par rapport à un génome de référence. Ne présume pas de l’impact clinique (pathogénicité)G35-36 6/12

⇒ Conséquences pour l’interprétation des résultats de puces à ADN.Les CNV peuvent donc être polymorphe, pathogène, ou dont la pathogénicité n'est pas connue.Critères de classification- notion d’hérédité: caractère de novo ou hérité - anomalie décrite chez des individus contrôles- anomalie décrite chez des patients atteints- richesse en gènes/ nature des gènes impliqués- critères mineurs: délétion/duplication (les délétions sont plus pathogènes), taille de l’anomalie

La recherche du CNV chez les parentsPermet également la vérification du CNV chez le patient lui-même (indispensable quand puce utilisée est de faible résolution ou si l’anomalie contient peu de sondes adjacentes)La recherche du CNV chez les parents du patient est rarement faite par puce à ADN (trop cher)Deux techniques utilisables:- hybridation fluorescente in situ (FISH)- la PCR quantitative (PCRq)

Hybridation in situ fluorescente (FISH) sur étalements chromosomiques (comme un caryotype)- nécessite d’avoir des étalements chromosomique pour le patient (pas uniquement ADN)- peu de sondes commerciales : nécessité de préparer des sondes maisons par un système de BAC (on met la région dans un chromosomique artificiel de bactérie, on fait pousser la bactérie pour qu'elle reproduise le morceau d'ADN que l'on marque, qu'on purifie...)- adaptée aux vérifications des délétions (non visualisation du signal de la sonde)- limites : CNV de petite taille (<40kb) car la sonde est très grande, duplication plus difficile à voir.

Techniques de PCR quantitatives

- dénaturation les 2 brins d'ADN- hybridation des primers (amorces spécifique de la région qu'on veut étudier)- en présence de la polymérase on il y a recopiage à partir de l'amorce en fonction du brin complémentaire- multiplication par 2 à chaque cycle = phase exponentielle- puis une phase plateau car à partir d'un moment la polymérase s'épuise

PCR quantitative en temps réel

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- PCR en présence d’un intercalant de l’ADN double brin (molécule fluorescente) - Quantification en phase exponentielleEtapes- Au début on a un mélange avec l'ADN dénaturé, les amorces et les molécules fluorescentes- On refroidit pour que les amorces s'hybrident- la polymérase va recopier le brin complémentaire- la molécule fluorescente se fixe à l'ADN- on mesure à ce moment là du cycle la fluorescence du tube avec un laser- on reprend un cycle après- on dénature les doubles brins en simple brin et les molécules fluorescentes redeviennent libres et ne fluorescent plus (la molécule fluorescente ne fluoresce que si elle est incorporée à l'ADN double brin)On voit donc facilement augmenter la quantité d'ADN.

Application à la vérification/analyse familiale des résultats de puce :- Quantification relative (quantification du nombre de cible par rapport à une région de référence et en même temps on va faire une amplification de la région cible/gène de référence (présent en 2 copies) → permet de voir si il y a une déletion ou une duplication sur le gène qu'on étudie.- Inconvénient : choix des amorces de PCR à renouveler pour chaque patient- Adaptée aux remaniements de petite taille (<40kb) et aux amplifications qu'on ne voit pas bien en FISH→ Si le CNV est hérité d'un parent sain il n'est pas pathogène

Quels gènes impliqués dans le CNV?On utilise une base de données internationalesexemple : http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayIl y a aussi des bases de données bibliographiques comme PUBMEDhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/Attention! Nouveaux syndromes pas toujours publiés!

Le CNV a-t-il déjà été décrit chez des individus sains?→ Base de données des CNV polymorphes : http://projects.tcag.ca/variation/

Être prudent : CNV décrits chez plusieurs individus, si possible par des équipes différentesOrientation du CNV (Gain/perte)

Le CNV a-t-il déjà été décrit chez des individus atteints?→ Base de données des variations pathogènes du nombre de copie (decipher)

Pour résumer : Critères de Lee (2007)

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Analyse bioinformatique- Grand volume de données à analyser pour chaque patient (plusieurs centaines de mega octets) → prévoir place de stockage pour la sauvegarde des données- Complexité des résultats : dans le passé, nécessité de compétences bioinformatiques pour interpréter les puces- Aujourd’hui, logiciels d’analyse développés par chaque fournisseur de plateforme de puce : liste des CNV, comparaison des résultats obtenus avec les banques de données internationales (liens), possibilité de comparer plusieurs patients,…

- Stockage des données dans un cloud- Enregistrement du phénotype clinique selon mots clés- Filtres en série : on peut éliminer tous les CNV polymorphes par exemple. Chainage enregistré- Priorisation : gènes présents dans les CNV qui pourraient être à l’origine des symptômes du patient- Partage de données avec d’autres centres.

IV. APPLICATION DES PUCES A ADN EN DIAGNOSTIC

A. Application 1

L’application principale est le diagnostic étiologique des retards mentaux syndromiques et des malformations congénitales. Quand on utilisait le caryotype avec des techniques ciblées comme FISH, le diagnostic était fait pour 5 à 10% des patients.Avec les techniques de puces à ADN, on obtient un gain de 20% d’anomalies supplémentaires diagnostiquées.Les bénéfices de l’identification de la cause de la maladie pour le patient et sa famille sont :-Fin de l’errance médicale et déculpabilisation (les parents se sentent fautifs)-Permettre une prise en charge adaptée si on connait le syndrome-Mettre en place de conseils génétiques dans la famille, et éventuellement un Diagnostic PréNatal (DPN) pour un enfant à venir.

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Ces techniques ont permis de caractériser au niveau clinique et moléculaire des syndromes associés à une microdéletion ou à une microdéletion (on trouve de nouveaux syndromes ou on élargit le spectre clinique de syndromes déjà connus), ainsi que l’identification de gènes candidats de certaines pathologies.Cas cliniques   : -Premier cas clinique: Gauthier, né en 2005, a consulté en génétique médicale à 4 mois pour une hypotonie axiale modérée. Taille satisfaisante, surpoids léger, traits particuliers, acquisition motrice décalée, retard de langage. Après bilan et caryotype, les syndromes de Di George, Prader-Willi, de Steinert on été recherchés en vain. A 3 ans a été faite une CGH array, la mère étant enceinte et s’inquiétant pour son enfant à naître. On a trouvé une délétion sur le chromosome 6 de 9 MB, qui contient notamment le gène SIM1, décrit comme deleté chez les patients avec un syndrome Prader-Willi like (mêmes symptômes). Ceci a été confirmé par hybridation in situ. Ce CNV est donc responsable de la maladie. Il s’agit d’une anomalie de novo, les parents étant négatifs aux tests, le risque de récidive pour la grossesse en cours est donc très faible. -Deuxième cas clinique : Thomas, né en 2002, dysmorphie faciale avec nez épaté, dents espacées, lèvre en chapeau de gendarme, syndrome polymalformatif, retard psychomoteur, ataxie. Bilan normal, réalisation d’une puce : délétion de petite taille, 269 kB, incluse dans un gène, impliqué dans le syndrome Pitt- Hopkins où le gène TCF4 est deleté.-Troisième cas clinique : Melissa, née en 2001, hypotonique à la naissance, troubles de la succion/ déglutition, retard de croissance jusqu’à 4 ans et demi, puis accélération pondérale et obésité. Légère dysmorphie faciale, yeux en amandes, pointe du nez bulbeuse, petite bouche, puberté précoce, des extrémités de petite taille, pas de retard intellectuel. On a fait une puce SNP, qui permet de voir à la fois le nombre de copies et le génotype. On a une délétion dans le syndrome 14, au niveau de gènes sous empreinte parentale (disomie).-Quatrième cas clinique : Maxime, né en 2010. Des anomalies ont déjà été vues à l’échographie. Né hypotonique, retard de langage, de développement, macrocéphalie, a arrêté de grandir à 5 mois, syndrome polymalformatif. Le couple a eu au précédent 3 fausses couches. Pas d’anomalies de caryotype de l’enfant et du parent, on fait une puce. On a trouvé l’extrémité du bras court du chromosome 7 en gain (duplication), et l’extrémité du bras long du chromosome 18 en perte (délétion) : suspicion de translocation, confirmée par hybridation in situ. L’enfant porte une translocation déséquilibrée, la mère porte une translocation équilibrée (déséquilibration au niveau des gamètes)-Cinquième cas clinique : Morgane, née en 1984, syndrome polymalformatif, bilan négatif, puce réalisée à 24 ans : délétion interstitielle sur le bras long du chromosome 3, amplifiée par PCR : on a un ADN de référence, l’ADN de Morgane et celui de ses deux parents. On fait des ratios entre le gène cible et le gène de référence. Chez l’individu normal, on a deux copies du gène cible, donc 2/2=1, on a un ratio de 1. Chez Morgane, on a un ratio de 0.5, car elle n’a qu’une copie du gène cible sur deux copies du gène de référence, 1/2. On lui a trouvé deux autres CNV avec une délétion terminale sur le bras court du chromosome 7, et un gain sur le bras court du 19 : translocation confirmée par hybridation in situ, absente chez les parents, donc translocation de novo. Ici, elle était invisible au caryotype.

B. Application 2

Rechercher des pertes ou des gains chez les patients présentant déjà un remaniement chromosomique apparemment équilibré mais présentant un phénotype anormal.Les remaniements équilibrés sont généralement asymptomatiques, comme dans la translocation réciproque (ni perte, ni gain d’ADN), ou dans l’inversion.

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6% des gens porteurs d’un remaniement équilibré présentent des signes cliniques : le point de cassure s’est fait dans un gène, qui ne s’exprimera pas, ou dans des régions impliquées dans la régulation d’un gène, ou le remaniement n’est pas aussi équilibré qu’il y parait  : petites délétions, petits gains chez ces patients. Réalisation de CGH array chez ces patients : dans 40% des cas, on a un gain ou une perte, soit au niveau des points de cassure, soit de manière indépendante (autre chromosome)Attention : la puce ne permet pas de savoir s’il y a effet de position ou perturbation de l’empreinte parentale.

C. Application 3

Borner finement des anomalies chromosomiques mises en évidence sur le caryotype, par exemple : délétion au chromosome 7 vue en cytogénétique, bien délimitée avec une puce.Ceci présente un intérêt scientifique et pour le patient.

V. LIMITES DE CETTE TECHNIQUE

A. C’est une technique purement quantitativeElle détecte s’il y a un gain ou une perte, mais ne reconnait pas les remaniements de structure équilibrés.

B. Les mosaïques

Si un individu porte à la fois des cellules normales et des cellules anormales. Quand on extrait l’ADN, on l’extrait à partir d’un mélange de cellules normales et anormales. L’anomalie sera « diluée » et peut passer inaperçue, s’il y a moins de 15% de cellules anormales.

L’aptitude de la puce à détecter les mosaïques est fonction : Du type de puce Du niveau de mosaïcisime

Exemple : Nathan, dysmorphie faciale, malformations musculaires. Il possède 62% de cellules normales, et sur 38% une duplication du chromosome 13. On fait une puce : le résultat ne montre pas de duplication.

C. Mise en évidence d’anomalies sans rapport avec l’indication

On trouve des anomalies sans rapport avec ce qu’on recherche, par exemple des prédispositions aux cancers : délétion dans le gène BRC1 pour une fille de 2 ans avec un retard mental, donc risque de cancer du sein, ce qui est difficile à annoncer. On peut aussi trouver des cas d’hétérozygotes pour des pathologies récessives (ex : transmission de la mucoviscidose possible). En conséquence, le consentement éclairé est indispensable. Le fait qu’on peut trouver des choses qu’on ne rechercher pas à été rajouté dans le consentement pour la CGH Array. Le patient peut choisir de ne pas être informé des résultats qui n’ont rien à voir avec ce qui est recherché. Ils peuvent avoir un délai de réflexion.C’est le cas de Charlotte, 20 ans, dyspraxie bucco-linguo-faciale, difficultés d’élocution, retard de la parole et mental. 2 caryotypes ont été réalisés, ainsi que des recherches ciblées qui n’ont rien donné. Un caryotype a été refait : on a trouvé une délétion interstitielle du bras long du chromosome 7 (de novo, les parents n’en ayant pas). On a fait une puce pour borner la délétion, qui emporte les gènes FOXP2 (responsable de la dyspraxie) et CFTR, gène de la mucoviscidose.

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VI. LES PUCES EN DIAGNOSTIC PRENATAL

Quand on trouve des anomalies chez un fœtus, il y a environ 10% (jusqu’à 50% pour certaines) de risques qu’une anomalie chromosomique en soit à l’origine, d’où l’intérêt de réaliser des puces sur de l’ADN fœtal. C’est couramment utilisé à l’étranger, et de plus en plus en France bien que le développement y soit plus lent du fait des questions soulevées : on est dans une situation d’urgence dans le sens ou le résultat ne doit pas être rendu après l’accouchement (le test peut prendre plusieurs semaines), et il y a un risque de se retrouver avec des CNP non classées sans savoir s’il est bénin ou pathogène. Autre problème, on peut trouver des anomalies sans rapport avec l’indication (comme vu auparavant). Une alternative consiste en l’utilisation de puces ciblées : on utilise des spots dans des régions d’intérêt, dans les régions d’anomalies connues au lieu du génome complet, ou on utilise une puce de résolution moins grande. On peut aussi utiliser les puces en deuxième intention après avoir mis en évidence une anomalie sur le caryotype, par exemple un marquage surnuméraire.Exemple : Femme de 38 ans, risque de trisomie 21, caryotype sur les cellules du liquide amniotique. Dans 26% des mitoses, il y a un marqueur chromosomique surnuméraire (morceau non identifié), et un deuxième marqueur identifié comme du chromosome 14 ou 22 par hybridation in situ. Le marqueur a, au deuxième caryotype, été reconnu présent dans 64% des cellules. A 34 SA, 3eme prélèvement après un retard de croissance intra utérin et dilatation pyélocalicielle du fœtus, on trouve : des cellules normales, des cellules avec le marqueur 14/22, des cellules avec les deux marqueurs, et une majorité de cellules avec le marqueur non identifié. On a de plus des anomalies à l’échographie. Pour identifier ce marqueur, on a fait une puce, qui a permis de découvrir qu’il s’agissait de chromosome 16, confirmé avec une FISH et peinture chromosomique. Cet enfant est né avec plusieurs malformations.

CONCLUSION

Cette technique a vraiment été une révolution pour la cytogénétique et toutes les pathologies génétiques en général, qui est passé dans la routine, la pratique courante, pour la mise en évidence de remaniements chromosomiques chez les patients atteints de retard mental, de troubles autistiques et de malformations congénitales. L’étape critique n’est pas tant la technique en elle-même mais plutôt l’analyse et interprétation des données. On tend de plus en plus à changer la stratégie, on tend de plus en plus à faire une puce en première intention au lieu d’un caryotype, dans certains indications (inutile dans le cas de recherche de remaniements équilibrés chez une femme ayant fait plusieurs fausses couches).

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