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Revista de Ciencias Biolgicas y de la Saludwww.biotecnia.uson.mx

Universidad de Sonora

El saber de mis hijos harmi grandeza

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Volumen XVI, Nmero 3

PRODUCCIN DE BIOMASA A PARTIR DEAspergillus oryzaeEN CULTIVO SUMERGIDO

BIOMASS PRODUCTION FROMAspergillus oryzae IN SUBMERGED CULTURE

Alejandro De Jess Corts-Snchez*1, Luis Manuel Guadarrama2, Mayra Daz-Ramrez3

1 Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS). Microbiologa. Mxico D.F.2 Escuela de Ingeniera en Alimentos, Biotecnologa y Agronoma. Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de

Monterrey (ITESM)-Campus Quertaro.3 Departamento de Alimentos. Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud. Universidad Autnoma Metropolitana (UAM),

Unidad Lerma. Edo. Mxico.

*Autor para envo de correspondencia: Alejandro De Jess Corts-SnchezCorreo electrnico: [email protected]: 20 de enero de 2014Aceptado: 12 de abril de 2014

RESUMENLa produccin de biomasa a partir de microorganis-

mos probiticos, como Aspergillus oryzae, puede ser una al-ternativa para satisfacer la demanda creciente de alimentos.Adems de ser considerado como probitico, este microor-ganismo es muy utilizado en la elaboracin de alimentos

tradicionales fermentados en pases del continente Asitico.En el presente estudio se evalu la produccin biomasa,consumo de sustrato, contenido de protena, rendimiento ycambios de pH generados por A. oryzaeen cultivo sumergi-do, a partir de dos diferentes sustratos no convencionales(leche de vaca en polvo sin grasa Svelty Nestle y medioLitmus Milk Sigma-Aldrich) y dos condiciones de proceso(35C/160 rpm/96 h y 30C/180 rpm/96 h). Los resultadosmuestran como Aspergillus oryzae cumpli su carcter deaerobio mostrando mejores niveles de crecimiento y genera-cin de biomasa en condiciones de mayor agitacin y menortemperatura, siendo la mejor condicin de proceso a 180rpm/30C con un mayor rendimiento de 12.25g biomasa/g

sustrato, utilizando como sustrato leche de vaca en polvo singrasa Svelty Nestle. Los cambios en pH no tuvieron un efec-to significativo sobre la produccin de biomasa, consumo desustrato y protena.Palabras clave.- Leche, biomasa, hongos,Aspergillus ory-

zae, probiticos

ABSTRACTThe biomass produced by probiotic microorganisms,

as Aspergillus oryzae, could be an alternative to meetthe growing demand for human or animal food.This microorganism, is well known as a probiotic, and is

extensively used in traditional fermented food in Asiancountries. This study evaluated the biomass production,substrate consumption, pH changes, protein content andyield from A. oryzaegrown in submerged culture with twonon-conventional substrates (skim milk powder SveltyNestle and culture medium Litmus Milk Sigma-Aldrich),and two process conditions (35C/160 rpm/96 h y 30C/180rpm/96 h). The results show the aerobic behavior reportedfor A. oryzae, with higher levels of growth and biomassgeneration with higher agitation and lower temperatureconditions, being the best process condition at 180 rpm/30C

using defatted milk as substrate (skim milk powder SveltyNestle), the highest yield obtained at these conditions was12.25g biomass/g substrate. The pH changes did not affectsignificantly the biomass production, substrate consumptionnor protein content.Key words: Milk, biomass, fungi, Aspergillus oryzae,probiotics.

INTRODUCCINLa produccin de biomasa o protena unicelular a

partir de diversos microorganismos como algas, bacterias,levaduras y hongos filamentosos, cultivados en condicionesfermentativas adecuadas y con sustratos baratos, compues-tos o enriquecidos con carbono, nitrgeno y fsforo (Chacn,2004; Carrillo-Inungaray et al., 2010) parecen ser una alterna-tiva inmediata de fuentes alimentarias para la nutricin ani-mal (Chacn, 2004). En un futuro pueden considerarse paraconsumo humano, ya que algunos de estos microrganismosson considerados probiticos (Chaucheyras-Durand y Fonty,2002; Chacn, 2004) que podran destinarse para este fin.Diferentes bacterias del gnero Lactobacillus, Bifidobacteria,Streptococcus, Clostridium, Enterococcus,as como levadurasy hongos, entre los cuales figuran Saccharomyces boulardii,Saccharomyces carlbergiensis, Saccharomyces cerevisiae, As-pergillus oryzae y Aspergillus nigerson considerados ya comoprobiticos (Ashayerizadeh et al., 2009; Musa et al.,2009;Sayan et al, 2013; Hernndez y Borrel, 1993), siendo estostres ltimos microorganismosfuente de protena unicelular yprobiticos en la alimentacin, produccin y sanidad animalde rumiantes y aves (Martin y Nisbet, 1990; KyungWoo et al.,2006; Ashayerizadeh et al., 2009; Buitrago et al., 2008).

Los probiticos son microorganismos vivos que alser consumidos en cantidades apropiadas proporcionanbeneficios a la salud del husped (Guarner et al., 2011;Ashayerizadeh et al., 2009; Musa et al., 2009; Sayan et al.,2013; Hernandez y Borrel, 1993; KyungWoo et al., 2006). Estomediante distintos mecanismos, como son la acidificacinde la luz intestinal, liberacin de sustancias que inhiben elcrecimiento de microrganismos patgenos, efectos inmu-nomoduladores, hipocolesterolmicos y anticancergenos(Lorente y Serra, 2001).Para la alimentacin animal se basanen las propiedades benficas que se les atribuyen al mejorar

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la eficiencia de conversin alimenticia, promocin del cre-cimiento, reduccin del nmero de coliformes y patgenosintestinales. Adems, pueden ser sustitutos de terapias conantibiticos por mtodos menos agresivos que con lleven auna mejor salud animal, produccin y fuente de alimentosdestinados al consumo humano (Rosmini et al., 2004).

Por otro lado, el cultivo sumergido ha sido conside-rado un buen mtodo para la generacin y obtencin dediversos metabolitos de inters en diversas industrias comola farmacutica, de salud y la alimentaria, inclusive para laobtencin de biomasa como producto final. Este mtodo decultivo prevalece por encima de otros sistemas convencio-nales, ya que presenta varias ventajas, entre las cuales estnel control y seguimiento de condiciones de cultivo comotemperatura, pH, agitacin, concentracin de nutrientes,esterilidad, disminucin del tiempo para la obtencin de bio-masa y molculas bioactivas, as como la reduccin de costosde obtencin, separacin y purificacin de los metabolitosde inters (Zapata et al., 2007). Para el caso de estudios de

hongos en cultivo sumergido, este tiene ventajas importan-tes, ya que se ha reportado que tiene una produccin demicelio mayor en un espacio compacto, en menor tiempo ycon menor riesgo de contaminacin (Kim et al.,2002; Friel yMcLoughlin, 2000; Yang y Liau, 1998), adems los gradientesde temperatura, de concentracin de oxgeno y nutrientesson pequeos a ausentes por lo que puede utilizarse para laproduccin de biomasa deA. oryzae(Biesebeke et al.,2002).

El objetivo del presente estudio fue determinar elefecto de dos diferentes condiciones de temperatura y agita-cin y de dos tipos de sustrato en el crecimiento y generacinde biomasa, consumo de sustrato, rendimiento y protena en

cultivo sumergido por parte de una cepa probitica comoA.Oryzae.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOEXPERIMENTALSustratos como medios de cultivo.

Se utilizaron dos sustratos como medio de cultivo: a)Leche de vaca en polvo sin grasa Svelty Nestle y b) MedioLitmus Milk Sigma-Aldrich (medio de cultivo microbiolgicode composicin qumica definida).

Material biolgico.

La cepa deAspergillus Oryzaefue proporcionada de lacoleccin microbiolgica de la Escuela de Ingeniera en Ali-mentos, Biotecnologa y Agronoma del Instituto Tecnolgicoy de Estudios Superiores de Monterrey-campus Quertaro,Quertaro, Mxico.

Conservacin y propagacin de cepa fngica.El hongo se cultiv en medio YPD (1% extracto de

levadura, 2% peptona casena, 2% dextrosa (Ausubel et al.,1994), a 30C/ 200 rpm/ 48 h en una incubadora de agita-

cin orbital y temperatura controlada (KS3000i Marca IKA).Posteriormente, se transfiri 0.5 mL del cultivo en viales de1.5 mL estriles y se les adicion 0.5 mL de glicerol al 50%previamente esterilizado y posteriormente se procedi a sualmacenamiento a -70C.

Cultivo iniciador.El cultivo iniciador se prepar al adicionar a tempera-

tura ambiente el contenido de un criovial conA. oryzaealma-cenado a -70C, a un matraz con medio de cultivo YPD (1%extracto de levadura, 2% peptona casena, 2% dextrosa) y secoloc en una incubadora de agitacin orbital y temperaturacontrolada (KS3000i Marca IKA) a 30C/ 180 rpm/96 h.

Preparacin de medios de cultivo lcteos.Se prepararon dos diferentes medios de cultivo de

origen lcteo, en una proporcin de 4,67 g /35 mL (Lechesin grasa Svelty Nestle) y 3,53 g/ 35 mL (Medio Litmus Milk);ambos fueron reconstituidos con agua destilada y posterior-mente esterilizados a 121C/15 min/15 lb para su posterior

fermentacin.

Fermentacin de los medios de cultivo lcteos.Se emplearon matraces Erlenmeyer de 100mL con un

volumen de operacin de 35 mL y se inocularon con 1 mL delcultivo iniciador en YPD de 72h con una biomasa de 7,34 g/L,posteriormente se incubaron a dos diferentes condiciones:35C/160 rpm/96 h y 30C/180 rpm/96 h. A cada cultivo seles determin la biomasa generada (X

t), cambios de pH en el

medio de cultivo, azcares reductores (St) y protena soluble

cada 24h.Determinacin de azcares reductores (S

t). Se

tom 1 mL del cultivo y se centrifug 10000 rpm/30 min, y

al sobrenadante obtenido se le adicion 3 mL de reactivo3,5-dinitro saliclico (DNS) (Sigma-Aldrich), la mezcla se ca-lent a 90C entre 5-15 minutos y se le agreg 1 mL de unasolucin de tartrato de sodio potasio al 40%. Se procedi aenfriar la mezcla en un bao de agua y se registr la lecturaen un espectrofotmetro (UVD-3500 marca Labomed) a575nm (Miller, 1959).

Anlisis de protena. Se tom 1 mL de medio decultivo y se le agreg 0.5 mL butanol/etanol (1:1), se mezclvigorosamente y se coloc en una centrifuga (Z 383 K marcaHermle) operndose a 11310 rpm/30 min, al precipitado sele adicion 1 mL de NaOH 1M y se calent en bao maraa 95C/20 min, se dej enfriar, se mezcl vigorosamente yposteriormente se centrifug nuevamente a 11310 rpm/30min y a la solucin sobrenadante (Spoeckner et al., 1999) se lerealiz la determinacin de protenas (Bradford,1976).

Cuantificacin de pH y biomasa (Xt). Se determin el

pH del medio de cultivo a 25C utilizando un potencimetroThermo Scientific (Orion 3-Star Plus) previamente calibra-do. Posteriormente se obtuvo la biomasa (X

t) vertiendo el

contenido total del matraz de fermentacin a travs de unpapel filtro Whatman No.1 previamente secado y pesado,posteriormente el papel filtro fue secado en un horno (Binder

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No. 10-21821) a 90-100C hasta su peso constante (Oshomay Ikenebomeh, 2005).

Determinacin de los parmetros de crecimiento.A partir de los datos obtenidos de biomasa (X

t) y su valor

inicial (X0) a los diferentes tiempos, se grafic X (g

x/L) vs t (h)

obteniendo de la fase logartmica el valor de la velocidad decrecimiento () y considerando que sta permanece cons-tante se utiliz la ecuacin 1.

Para el clculo de la velocidad de consumo de sustrato(q

s) considerando S

0como el valor inicial de consumo y S

t, el

consumo al tiempo (t), de la grfica Stvs t se obtiene el valor

de la pendiente (qs) considerando la ecuacin 2.

El rendimiento final (Yx) se calcul con la ecuacin 3.

Anlisis de resultados. Todos los experimentos sehicieron por triplicado. Para el anlisis de resultados se utilizel software MS-Excel 2007 y Sigma-plot versin 10.0.

RESULTADOS Y DISCUSINBiomasa generada

La Figura 1 muestra el efecto de las condiciones de

operacin en cultivo sumergido (agitacin y temperatura)y del sustrato utilizado (Leche sin grasa y medio Litmus) enel crecimiento o generacin de biomasa (X

t) de A. Oryzae. El

crecimiento de este microorganismo alcanz un mximo alas 72 h de cultivo en todas las condiciones utilizadas, conexcepcin del cultivo en medio Litmus a 160 rpm/35C (48h),alcanzando los valores mximos de X

ta mayores velocidades

de agitacin (180 rpm), independientemente del sustratoutilizado, siendo de 43.641.5 g/L para Leche sin grasa(Svelty) y de 43.052.0 g/L para medio Litmus. En cuanto alefecto de la temperatura, se encontr que X

taumenta a me-

nor temperatura ya que en condiciones de 35C los valoresde obtencin de X

t fueron significativamente menores con

respecto al crecimiento a 30C con ambos sustratos (LecheSvelty, 6.211.2 g/L y Medio Litmus, 32.561.4 g/L). Al uti-lizar el medio Litmus a 35C/160 rpm se observ que X

tes

mayor con respecto al valor obtenido usando Leche Svelty,sin embargo en condiciones de 30C/180rpm X

tno fue sig-

nificativamente diferente, por lo que se sugiere, a partir deestos resultados, que las condiciones de cultivo (aireaciny temperatura) son los factores que determinan o limitan laproduccin de biomasa (X

t) en mayor grado que el tipo de

sustrato. Sin embargo, al analizar los valores de velocidadesde crecimiento (Cuadro 1) se observa que no slo las condi-ciones del cultivo afectan el crecimiento, sino tambin el tipode sustrato, ya que stas fueron significativamente diferentesal pasar de un medio a otro, observando el valor mayor utili-zando como sustrato leche desgrasada Svelty (0.049 h-1). Seha reportado, en estudios realizados por diversos investiga-dores, sobre el crecimiento fngico y produccin de metabo-litos de inters alimenticio, que cepas del gnero Aspergillus

sp. comoAspergillus nigerpresentan un mximo crecimientoen cultivo sumergido, aproximadamente superior a 20 g/L alos 4 das/30C/180 rpm en sustratos de origen lcteo comoel suero de leche (Toro et al.,2004). Asimismo, la proporcinde biomasa generada por cepas de Aspergillus niger en elsuero de leche sometido a un proceso de hidrolizado fue de15,21 g/L y en suero entero de 8,75 g/L al da 8 de cultivo a30C (Leal et al.,2011).

El contenido de carbohidratos presentes en el cultivo(Figura 2) tambin se cuantific, midiendo el consumo conrespecto al tiempo (S

t), mostrando que en medio Litmus esta

variable se comporta de manera similar en ambas condi-ciones de cultivo, mientras que en el caso de Leche Svelty

hay una mayor disminucin del sustrato (St) en condicionesde mayor agitacin (180 rpm) y menor temperatura (30C).Esto se confirma con los valores de velocidad de consumode sustrato q

sobtenidos (Figura 1), ya que en medio Litmus

los valores de qsno son significativamente diferentes, inde-

pendientemente de las condiciones utilizadas; mientras queen el caso de Leche Svelty, q

ses significativamente mayor en

condiciones de 180 rpm/30C. De estos resultados se obtuvoel rendimiento final (Y

x) de biomasa generada por consumo

de sustrato durante el proceso y se observ que a pesar deque hay una velocidad de consumo mayor de sustrato en elmedio Litmus con respecto al medio de Leche desgrasadaSvelty, la velocidad de crecimiento en este ltimo medio fuemucho mayor en condiciones de mayor agitacin y menortemperatura (180rpm/30C), siendo su rendimiento consi-derablemente mayor (12.25g

x/g

s) con respecto a los otros

tratamientos, posicionndolo como la mejor opcin de lasestudiadas para la produccin de biomasa.

Otro aspecto importante a evaluar fue el contenidode protena (Figura 3) durante el crecimiento de A. oryzae,donde se observa que los valores mayores se presentaronnuevamente en condiciones con una agitacin de 180rpm y30C en los medios Litmus (14.950.5 mg/mL) y leche Svelty

Tiempo de cultivo (h)

0 20 40 60 80 100 120

Biomasa

g/L

0

10

20

30

40

50

35C/160rpm/ Leche Svelty

30C/180rpm/Leche Svelty

35C/160rpm/Medio Litmus


Figura 1.- Biomasa generada en dos diferentes medios ycondiciones de cultivo porAspergillus oryzae.Figure 1.- Biomass generated from two different media andculture conditions forAspergillus oryzae.

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sin grasa (17.60.5 mg/mL), los que presentaron las mayoresproporciones de protena a las 72h y 48h de cultivo respec-tivamente, comparados con los resultados obtenidos a unatemperatura de incubacin mayor de 35C, pero a una menoragitacin con 160 rpm. En estas condiciones (180 rpm y30C) y de acuerdo con los resultados obtenidos, la leche singrasa Svelty result ser mejor sustrato para la obtencin deprotena comparada con el medio Litmus, ya que se obtuvouna mayor cantidad de protena en un menor tiempo, lo quesugiere que la asimilacin de este sustrato por A. oryzae parala produccin de protena fue favorecida tanto por el tipo desustrato como por las condiciones de agitacin y tempera-tura.

Por ltimo, se observaron los cambios de pH (Figura4), debido a la actividad metablica de asimilacin del sustra-tos, principalmente azcares y generacin de metabolitos decarcter cido por parte del hongo durante su crecimientode los medios de cultivo a travs del tiempo y su relacin conla generacin de biomasa (X

t), consumo de azcares (S

t) y ob-

tencin de protena (Tabla 2). La Figura 4 muestra que el valorde pH disminuy durante las 72 h de cultivo en condicionesde menor temperatura y mayor agitacin (180 rpm/30C),siendo ms drstico el cambio en el medio de cultivo Litmuscon respecto a la Leche Svelty, esto podra relacionarse conla fase de crecimiento del hongo, mientras que en las condi-ciones de menor aireacin y mayor temperatura el pH dismi-nuy durante las primeras 48h de cultivo y posteriormentese increment, siendo notable nuevamente el cambio en elmedio de cultivo Litmus. El incremento de pH en el medio sedebe posiblemente a la hidrlisis y posterior asimilacin de lafuente protenica, como son casenas presentes en el medioy cuya liberacin de sus respectivos grupos amino que lasconforman alcalinizan el medio de cultivo, originando unincremento de pH. El medio constituido por leche sin grasa a35C y 160 rpm tuvo slo ligeros cambios durante el transcur-so de las siguientes horas del cultivo. El Cuadro 2 muestra elanlisis estadstico de la relacin que existe entre el cambiode pH y las dems variables evaluadas en este estudio, sin


0 20 40 60 80 100 120

Azcar

es

reductores

g/100ml

1

2

3

4

5

6

7






0 20 40 60 80 100 120

Protena

mg/mL

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20





Figura 3.- Protena presente en dos diferentes medios ycondiciones de cultivo durante el crecimiento deAspergillusoryzae.

Figure 3.- Protein content in two different media and cultureconditions during growth ofAspergillus oryzae.

Figura 2.- Azcares reductores residuales en el medio decultivo de Aspergillus oryzae durante su crecimiento en 2diferentes medios y condiciones de cultivo.Figure 2.- Residual reducing sugars in the culture medium ofAspergillus oryzaeduring growth in two different media andculture conditions.

Condiciones Sustrato

Leche Svelty Medio Litmus

(h-1) R2 qs

R2 Yx

(gx

/gs

) (h-1) R2 qs

R2 Yx

(gx

/gs

)

160rpm/35C 0.006 0.851 0.00091 0.787 6.34 0.015 0.657 0.007 0.853 2.14

180rpm/30C 0.049 0.987 0.004 0.913 12.25 0.021 0.976 0.008 0.871 2.16

Tabla 1.Velocidades de crecimiento (h-1) de la fase logartmica de crecimiento de Aspergillus oryzae utilizando Xt=X

0et,

consumo de sustrato (qs) utilizando S

t=S

0e-qsty rendimiento final (Y

f) a diferentes condiciones y sustratos en cultivo sumergido.

Table 1.-

Growth rates (h-1) in the logarithmic growth phase ofAspergillus oryzaeusing Xt=X

0et , substrate consumption(q

s)

using St=S

0e-qst and final yield(Y

f) at different growth conditions and substrates in submerged culture.

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embargo, como se observa, no hubo una relacin clara entrelos cambios de pH observados y las dems variables evalua-das (biomasa, consumo de sustrato, produccin de protena).

CONCLUSINA. oryzaees un hongo capaz de crecer y desarrollarse

en medios de cultivo con componentes de origen lcteo, siendo las condiciones que promueven la aireacin como30C/180 rpm las que dieron lugar a una mayor generacinde biomasa en un tiempo de cultivo de 72 h, mostrandoadems en este caso particular que las condiciones aerobias,las cuales estn sujetas a la velocidad de agitacin, son nece-

sarias y de relevancia para una mayor generacin de biomasaen un mismo medio de cultivo. El mayor rendimiento seobtuvo en condiciones altas de agitacin y menor tempera-tura, utilizando como sustrato Leche sin grasa Svelty. El pHno tuvo efecto significativo sobre la generacin de biomasa,consumo de sustrato y produccin de protena bajo las con-diciones utilizadas en este estudio.

AGRADECIMIENTOSAl Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de

Monterrey- campus Quertaro, por las facilidades brindadaspara la realizacin del presente trabajo, as como del apoyomediante una beca otorgada por el Consejo Nacional deCiencia y Tecnologa (CONACyT) en el periodo 2012-2013 y2013-2014.

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unicelular de Kluyveromyces marxianus var. marxianus


0 20 40 60 80 100 120

pH

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5





Figura 4.- Cambios de pH en dos diferentes medios ycondiciones de cultivo durante el crecimiento de Aspergillusoryzae.

Figure 4.- pH Changes in two different media and cultureconditions during growth ofAspergillus oryzae.

Tabla 2.Relacin entre el pH, produccin de biomasa (Xt), consumo de sustrato (S

t) y produccin de protena.

Table 2. Relationship between pH, biomass production (Xt), substrate consumption (S

t) and protein production.

Variables pH

Leche Svelty Medio Litmus

160rpm/35C 180rpm/35C 160rpm/35C 180rpm/35C

Xt r -0.680 -0.328 0.173 -0.723P 0.207 0.590 0.781 0.168

St

r 0.842 0.167 -0.513 0.311

P 0.0736 0.788 0.376 0.610

Protena r -0.214 -0.520 0.424 -0.607

P 0.729 0.239 0.477 0.278

r: Coeficientes de correlacin. Valores de P mayores a 0.050 no presentan una relacin significativa entre ambasvariables

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