Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

MICROBIOLOGÍA GENERAL II

Equipo 8:

MARTÍNEZ PÉREZ LIDIA

JUÁREZ PASTÉN GERARDO

GUZMÁN CÓRDOBA GERARDO

CARACTERÍSTICAS

TINTORIALES DE

LOS HONGOS

OBJETIVO

- El alumno al termino de la practica será capaz deobservar y diferenciar hongos de diferentes fuentes,mediante diferentes técnicas tintoriales.

- El alumno conocerá las principales técnicas detinción de hongos.

- El alumno procurara identificar y clasificar los hongosaislados en la practica 2.

PARED CELULAR

Esta formada por capas de polisacáridos

- Glucanos (polímeros β-1,6, ramificados de glucosa)

- Mananos(polímeros α –1,6, ramificados de manosa)

- Polímeros de glucosamina

- Proteínas

- Lípidos (ergosterol)

- Quitina (polímero β-1,4 de N-acetilglucosamina)

MECANISMOS DE COLORACION

¿COMO ENTRAN?

La coloración celular y tejidos son una combinación defenómenos físicos y químicos de absorción: los fenómenosfísicos de absorción, capilaridad y ósmosis participan en ciertogrado.La afinidad de colorantes básicos por los tejidos ácidos yviceversa indican que hay reacción química.

¿CÓMO SE TIÑEN?La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos quetienen alguna afinidad específica por los materiales celulares.

Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculascargadas positivamente (cationes) y se combinan conintensidad con los constituyentes celulares cargadosnegativamente, tales como los ácidos nucleicos y lospolisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son elazul de metileno, el cristal violeta y la safranina.

Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente(aniones) y se combinan con los constituyentes celularescargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esoscolorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; loscolorantes de este grupo se combinan con los materialeslipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar lalocalización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplode colorante liposoluble es el negro Sudán.

TINCIONES SIMPLES DIFERENCIALES ESPECIALES

FUNDAMENTO Se utiliza un solo colorante, es simple y fácil de realizar.

Se utilizan dos o mas colorantes.

Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distintacomposición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes.

EJEMPLOS • Azul de

metileno

• Safranina

.

• Eritrocina.

• Anaranja

do de

acridina

• Azul de

algodónDe lactofenol

• Gram.

• Ziehl-

Neelsen

• Acido

peryodico

de Schiff

• Giemsa y

Wright.

•Tinta china.

•Grocott – Gomori.

•Blanco de

carcoflour

TINCIONES SIMPLES

AZUL DE METILENO

UTILIDAD: Para exámenes en fresco o coloraciones compuestas.

FUNDAMENTO: Los hongos adquieren un color azul semejante al azul de algodón, aunque el hongo se observa mas intenso que el fondo del campo.

COMPONENTES

Azul de metileno 0.3g. Colorante

Agua destilada 100ml

Mucor sp

Safranina

UTILIDAD: Para el estudio de cultivos y productos

biológicos líquidos.

FUNDAMENTO: Los elementos fúngicos se tiñen de

color rojo intenso, y el resto del campo toma un

tono incoloro o rosa pálido.

Rihizopus sp

Penicillium sp.

Aspergillus sp.

Tinción con Eritrocina.

Útil para la observación de gránulos

causados por:

• Nocardia

• Madurella grisea

• Madurella mycetomatis

Granos de micetoma por Nocardia sp.

Anaranjado de Acridina

• Colorante vital, que da una fluorescencia

verde si el microorganismo está vivo y roja si

está muerto.

Tinción de ascosporas de

Sowerbyella rhenana en naranja

de acridina

Mucor mucedo.

Candida albicans

COMPONENTES FUNCIÓN

Fenol Destruye la flora acompañante.

Ácido láctico Conserva las estructuras fúngicas al

provocar un cambio de gradiente

osmótico con relación al interior del

fúngico generando una película por así llamarlo protectora.

Azul de lactofenol

El colorante es fuertemente ácido y se usa

para la tinción directa de micelio

micólico, el cual toma un delicado color azul claro.

Glicerol Agente humectante.

Azul de algodón

Microsporium canis Rihizopus sp.

Aspergillus sp.Absidia corymbifera

TINCIONES DIFERENCIALES

Tinción de Gram

UTILIDAD: Se emplea para teñir:

- Productos biológicos líquidos

- Exudados de lesiones

- Macerados de biopsias

- Todos los hongos son positivos a la

coloración de Gram, excepto

Cryptococcus neoformans.

FUNDAMENTO

- El decolorante alcohol acetona disuelve

a los lípidos de la pared impidiendo la

retención del cristal violeta en los

organismos Gram negativos

- Se forma un complejo: lugol-cristal-

violeta-ribonucleato de magnesio

- Esta técnica se basa en las diferencias

en el punto isoeléctrico.

Blastomyces dermatitis Candida albicans

Granos de Nocardia sp.

Tinción Ziehl-Neelsen (Ácido-Alcohol-

Resistentes)UTILIDAD

Útil en algunos microorganismos ácido

resistentes como N. asteroides, N. brasiliensis

y otros actinomicetes.

FUNDAMENTO

El contenido lipídico de estos organismos

esta compuesto principalmente por ceras y

fosfolípidos que alcanzan hasta un 40 % desu peso seco total .

Grano de Nocardia sp.Grano de Actinomadura madurae .

Actinomyces Israelii

Técnica de SchiffFUNDAMENTO

- En la tinción PAS se trata el material con

ácido peryódico, que oxida los 1,2-glicoles

formándose grupos aldehído en los

glucanos y mananos de las paredes

celulares de los hongos

- Con el reactivo de Schiff, los aldehídos

reaccionan dando un color rojo luminoso.

Mucor sp.

Coccidioides immitis

Hystoplasma Capsulatum

Tinción de Giemsa y Wright

- Utilizada para levaduras intracelulares,

que generalmente se encuentran dentro

de los macrófagos o monocitos

- Forma un halo alrededor de la pared

celular

- Citoplasma se tiñe de azul celeste

- Un polo se tiñe de azul oscuro (media

luna)

Blastomyces dermatitidis. Aspirado de tejido de perro, tinción Wrigth

Hystoplasma capsulatum

TINCIONES ESPECIALES

Tinción negativa con tinta china

FundamentoEste método es ideal para observar

inclusiones refráctiles que no se tiñen

fácilmente, tales como gránulos de azufre,

ácido poli-B-hidroxibutirico, esporas o capsulas,

debido a que las partículas de carbón

empleadas están cargadas negativamente y

son repelidas por la carga negativa de la

pared y delimitan una silueta mayor que el

tamaño real de la bacteria.

UTILIDAD

- Esta tinción especial

para visualizar a

Cryptococcus

neoformans.

- La tinta china se emplea

en una dilución de 1:2

con agua destilada

(suspensión de coloidal

de carbón o nigrosina)

- La técnica consiste en

colocar una gota del

producto biológico por

examinar y una gota

de tinta china

separados por 3 mm

COMPONENTES:

Tinta china de buena

calidad (nigrosina, tinta

Pelikan India Ink o Parker

Black Ink, entre otras).

La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una

levadura redonda, delimitado por las partículas de carbón en

suspensión coloidal de la tinta china, exhibiendo un nítido

contraste.

Tinción con tinta china para observar la

cápsula de C. neoformans.

Tinción de Gomori-Grocott(Metenamina de plata)

FundamentoEsta basada en que presencia de acido

crómico, los grupos hidroxilo de lo

polisacáridos de la pared celular de los

hongos son oxidados a aldehídos; estos a su

vez, reducen el complejo nitrato- plata

metenamina produciendo la coloración

café a negra, debido de la plata reducida

en los lugares de localización de los

aldehídos

Imagen histológica, tinción con Gomori-Grocott (tinción con

plata) mostrando esférulas en diferentes estados de

maduración.

TINCIÓN DE GROCOTT-GOMORI

Con esta técnica los hongos se tiñen de color negro al igual que unas

bacterias(Nocardia y Actinomices) la mucosa adquiere un color gris

oscuro; las partes internas del micelio rosa oro; el fondo aparece de

color verde claro.

C. neoformans

Blanco de carcoflourFundamento

El calcofloúr es un flourocromo que se une apolisacáridos con los enlaces beta 1-3 y beta 1-4

presentes en polímeros tales como celulosa y la

quitina. El colorante fluorece cuando se expone a

una fuente de luz ultravioleta de onda corta o

capaz de producir la luz azul (longitud de onda

410-450 nm). Es un método de alta sensibilidad

para definir claramente los elementos micoticos

con microscopio de fluorescencia

Reactivos

- Calcoflour blanco M2R (polysciences)

- Azul de Evans

HIDRÓXIDO DE POTASIO.

Puede utilizarse para examinar muestras

clínicas con abundantes células y restos

celulares.

El Hidróxido de potasio al 10% (solución de

KOH) permite ver elementos de hongos ya

que el KOH digiere parcialmente los

componentes proteicos, por ejemplo de la

célula huésped, pero no actúa sobre los

polisacáridos de las paredes celulares de

los hongos.

Solución de KOH al 10%

Cabello

infectado de

tiña de la

cabeza (Tinea

capitis)

Procedimiento

• Tomar un espécimen con abundante crecimiento.

• Aplicar la técnica de tinción

• Observar a 10X y 40X

• Aplicar otra técnica y el KOH al 10 %.

• Observar a 10 y 40X y esquematizar

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS- Guzman Arenas Roberto, “Micología médica”., Editorial

McGraw-Hill, 2ª. Edición; México, 2004. Capitulo 34 pag 299-

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- RubenLopezMartinez, Micología Médica Procedimiento para

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- F.J. Baker, Manual de Técnicas de Micología Médica Editorial

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- Dr. Norman F. Connan; Micología; Editorial Interamericana

S.A de C.V 3ra Edición México 1972 pag. 557-569

- Lynch, M; Raphael, S. Métodos de Laboratorio. Editorial

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- MURRAY, G. Microbiología Médica. Edit. El Manual Moderno.

3º edición México D.F. 1997 pag 175-182