Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
19
3. METODE PENELITIAN
3.1 Materi Penelitian
3.1.1 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun mangrove Nypa
fruticans yang diperoleh dari Konservasi Hutan Mangrove “Clungup Mangrove
Conservation” Kabupaten Malang, Jawa Timur. Daun diambil dari pohon
mangrove Nypa fruticans yang berumur kisaran 5 tahun. Tanaman ini tumbuh
rapat bersama dan biasanya membentuk komunitas yang luas disepanjang
sungai dekat muara sungai dengan air payau. Bentuk buahnya bulat seperti buah
pandan dengan panjang bonggol hingga 45 cm. Daunnya memanjang seperti
daun pada pohon kelapa yang memiliki ruas daun (Kitamura et al., 1997).
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu proses ekstraksi sampel,
uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan dan uji toksisitas. Bahan-bahan yang
digunakan pada proses ekstraksi senyawa bioaktif pada sampel meliputi
metanol, kertas saring, plastik wrap, aluminium foil dan kertas label. Setelah
memperoleh ekstrak kasar, maka dilakukan pengujian fitokimia menggunakan
bahan-bahan antara lain aquades, asam sulfat 2 N, asam sulfat pekat, HCl pekat,
HCl 2 N, kloroform, etanol, pereaksi meyer, FeCl3 10%, serbuk magnesium,
amonia pekat dan asam asetat anhidrat. Pada pengujian toksisitas
menggunakan bahan antara lain air laut dan starter indukan telur Artemia salina
Lench. Pada pengujian aktivitas antioksidan menggunakan bahan antara lain
methanol, DPPH, alumunium foil, kertas label dan asam askorbat.
3.2.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat-alat untuk
ekstraksi sampel daun mangrove nipah adalah timbangan digital, oven, rotary
20
evaporator, gelas ukur, erlenmeyer, beaker glass, botol kaca, spatula dan
corong. Alat yang digunakan untuk pengujian fitokimia yaitu tabung reaksi, rak
tabung reaksi, beaker glass 100 ml, pipet tetes, pipet volume, gelas ukur,
spatula, labu ukur, bola hisap dan timbangan digital. Pada pengujian toksisitas
menggunakan alat timbangan digital, mikro pipet, spatula, corong, botol vial,
beaker glass, gelas ukur, aerator, selang, cover glass, bola hisap, pipet serologis
dan pipet volume. Pada pengujian total fenol menggunakan alat gelas ukur,
waterbath, labu ukur, beaker glass, pipet volume, timbangan analitik, spatula,
tabung reaksi, rak tabung reaksi, bola hisap dan spektofotometri UV-Vis. Pada
pengujian aktivitas antioksidan menggunakan alat gelas ukur, beaker glass, botol
vial, pipet serologis, bola hisap, pipet tetes spatula, spectofotometri UV-Vis.
3.2 Metode Penelitian
Metode merupakan suatu kerangka kerja untuk melakukan suatu tindakan
atau juga dapat di sebut sebagai kerangka berfikir dalam penyusunan suatu
gagasan dengan maksud dan tujuan tertentu. Penelitian merupakan suatu
kegiatan mengkaji secara teliti dan teratur dalam suatu bidang ilmu tertentu yang
menurut pada suatu kaidah yang disebut metode (Notohadiprawiro, 2006)
Metode yang di gunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen.
Metode eksperimen bersifat laboratoris. Penelitian dilakukan secara sengaja
dengan cara memberikan perlakuan tertentu terhadap subjek penelitian guna
membangkitkan suatu kejadian atau keadaan yang akan diteliti untuk diketahui
bagaimana akibatnya (Jaedun, 2011).
3.2.1 Variabel Penelitian
Variabel penelitian gejala yang dapat diukur menurut objektivitasnya,
reabilitas dan validalitas ilmiah. Dilihat dari peran dan posisinya, variabel dibagi
atas variabel bebas dan variabel terikat. Veriabel bebas merupakan variabel
21
penjelas, penentu dan penduga, sedangkan variabel terikat adalah variabel
konsekuensi atas akibat (Suryana, 2010).
Variabel bebas dari penelitian ini adalah suhu dan lama waktu
pengeringan yang berbeda. Kedua variabel ini akan menentukan berapa suhu
dan waktu opimal yang selanjutnya akan digunakan untuk menentukan nilai IC50.
Variabel terikat pada penelitian ini adalah nilai aktivitas antioksidan yang
diukur dengan LC50 menggunakan analisa probit yang diperoleh dari pengujian
toksisitas dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Lench dengan metode
BSLT, nilai IC50 yang diperoleh dari hasil akumulasi persentase nilai IC50 dari
masing-masing larutan konsentrasi larutan ekstrak pada tiap jenis pelarutnya.
3.2.2 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
(RAL) faktorial dengan 3 ulangan. Faktor pertama adalah suhu pengeringan
bahan (40, 50, 60ºC) dan faktor ke dua adalah lama waktu pengeringan (24, 36,
48 jam). Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan ANOVA (Analysis
of Variance) untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap respon parameter
yang dilakukan, dengan uji F pada taraf 5% dan 1% dan jika didapatkan hasil
yang berbeda nyata maka dilakukan uji Tukey pada taraf 5% (Sastrosupadi,
2000).
Peneitian pendahuluan dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui
pelarut apakah yang paling baik digunakan untuk mendapatkan nilai rendemen
tertinggi pada sampel daun mangrove yang sebelumnya diberikan perlakuan
pengeringan menggunakan suhu 40ºC dan lama waktu 24 jam. Menurut Hermani
dan Rahmawati (2009) kadar flavonoid tertinggi dihasilkan dari pengeringan suhu
oven 40ºC selama 24 jam. Untuk daun yang dikeringkan dengan oven, produk
22
akan berwarna lebih hijau dari pada di keringkan dengan sinar matahari karena
suhu yang di gunakan lebih stabil.
3.2.3 Parameter Uji
Parameter uji pada penelitian ini adalah uji kuantitatif, yaitu berdasarkan
data yang diperoleh dari hasil perhitungan probit nilai LC50 dan perhitungan rata-
rata nilai IC50 dari masing-masing pelarut. Nilai LC50 menunjukkan besarnya
konsentrasi suatu bahan uji yang dapat menyebabkan 50% kematian hewan uji
setelah perlakuan 24 jam. Data tersebut dianalisis menggunakan probit analisis
untuk mengetahui nilai LC50. Jika nilai LC50 masing-masing ekstrak senyawa uji
kurang dari 1000 µg/mL maka dianggap menunjukkan adanya aktivitas biologik
(Nisfi, 2010). Sedangkan nilai IC50 merupakan konsentrasi larutan sampel yang
mampu mereduksi aktivitas DPPH sebesar 50% (Ika, 2013). Selain itu parameter
uji dalam penelitian ini juga terdiri atas perhitungan rendemen, kadar air serta uji
fitokimia.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penelitian Tahap 1
Penelitian tahap 1 bertujuan untuk mengetahui ekstrak terbaik yaitu pada
suhu dan lama waktu paling optimal dari daun nipah serta untuk mengetahui
fitokimia, rendemen, serta nilai LC50 dari sampel daun mangrove nipah dengan
tiga pelarut yang berbeda, yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol sehingga
dapat diperoleh pelarut terbaik yang akan digunakan untuk penelitian utama.
Pada penelitian ini, digunakan sampel daun yang dioven pada suhu 40ºC selama
24 jam. Menurut Hermani dan Rahmawati (2009) kadar flavonoid yang tertinggi
dihasilkan dari pengeringan suhu oven 40oC selama 24 jam. Untuk daun yang
dikeringkan dengan oven, produk akan berwarna lebih hijau dari pada
dikeringkan dengan sinar matahari karena suhu yang digunakan lebih stabil.
23
a. Ekstraksi Sampel (Fathonah, 2016)
Ekstraksi sampel menggunakan metode maserasi bertingkat. Pelarut yang
digunakan adalah n- heksan, etil asetat, dan metanol. Sampel dalam bentuk
kering diambil sebanyak 150 g dan dilarutkan dalam pelarut non polar yaitu n-
heksan dengan perbandingan 1:4 (b/v) sebanyak 600 ml. Kemudian
dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 24 jam pada suhu 28-30ºC. Hasil
maserasi sampel dalam pelarut n-heksan disaring dengan kertas saring halus
dan menghasilkan filtrat dan residu. Filtrat dari n-heksan (A) kemudian di
pisahkan dari pelarut menggunakan vacuum rotary evaporator suhu 40-50 ºC.
Kemudian sisa pelarut pada ekstrak diuapkan dengan menggunakan nitrogen
sehingga diperoleh ekstrak pekat. Residu dari ekstrak A dimaserasi kembali
dengan pelarut etil asetat sebanyak 600 ml dan dihomogenkan dengan magnetic
stirer selama 24 jam pada suhu 28-30 ºC. Kemudian disaring sehingga diperoleh
ekstrak etil asetat (B) dan residu. Ekstrak etil asetat (B) kemudian dilakukan
pemisahan dengan pelarut menggunakan vacuum rotary evaporator suhu 40-50
ºC. Lalu sisa pelarut pada ekstrak diuapkan dengan nitrogen sehingga diperoleh
ekstrak pekat. Residu dari ekstrak B dimaserasi kembali dengan pelarut metanol
sebanyak 600 ml dan di homogenkan dengan magnetic stirer selama 24 jam
pada suhu 28-30 ºC. Kemudian disaring sehingga diperoleh ekstrak metanol (C)
dan residu. Ekstrak metanol (C) kemudian dilakukan pemisahan dengan pelarut
menggunakan vacuum rotary evaporator suhu 40-50 ºC. Lalu sisa pelarut pada
ekstrak diuapkan dengan menggunakan nitrogen sehingga diperoleh ekstrak
pekat. Proses ekstraksi sampel dapat dilihat pada Gambar 2.
24
Gambar 2. Metode Ekstraksi Sampel daun mangrove Nypa fruticans
Ditimbang bahan baku yang dikeringkan suhu 40ºC selama 24jam sebanyak 150 g
Dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 24
jam suhu 28-30℃
Di tambahkan metanol 1:4
Dihomogenkan dengan magntic stiter selama 24 jam suhu
28-30ºC
Disaring dengan kertas saring
residu
Ditambahkan n-heksan 1:4 (b/v)
Dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 24 jam suhu 28-30℃
Disaring dengan kertas saring halus
Filtrat
Dievaporasi suhu 40-50℃
Diuapkan sisa pelarut
dengan nitrogen
Ekstrak n-heksan pekat
(A)
Residu (g)
Ditambahkan etil asetat 600 ml (1:4)
Disaring dengan kertas saring halus
Filtrat Residu(g)
Dievaporasi suhu 40-50ºC
Diuapkan sisa pelarut dengan gas nitrogen
Ekstrak etil asetat pekat (B)
filtrat
Dievaporasi suhu 40-50ºC
Diuapkan sisa pelarut dengan gas nitrogen
Ekstrak metanol pekat (C)
analisis
analisis
analisis
25
b. Perhitungan Rendemen (Yulia, 2007)
Nilai perhitungan rendemen menunjukkan jumlah ekstrak jumlah
ekstrak sampel yang diperoleh dari setiap gram sampel yang diekstrak
(%w/w). Perhitungan rendemen adalah sebagai berikut:
% rendemen =
x 100%
c. Uji Fitokimia
Uji fitokimia merupakan tahap selanjutnya dari proses ekstraksi bahan
baku yang bertujuan untuk mengetahui kandungan bioaktif yang terkandung
dalam ekstrak tersebut. Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, uji
tannin, uji steroid, uji terpenoid, uji saponin dan uji flavonoid.
Uji Alkaloid (Nafisah et al., 2014)
Sampel diuji kandungan senyawa alkaloid menggunakan prinsip
mereaksikan ekstrak sampel dengan asam dan pereaksi Meyer. Ekstrak dari
sampel sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan
5 tetes amonia pekat. Setelah itu larutan disaring dan selanjutnya
ditambahkan 2 N dan dikocok sampai terbentuk lapisan atas dan bawah.
Larutan tersebut kemudian ditambahkan 1 tetes pereaksi Meyer, apabila
positif alkaloid maka akan terbentuk endapan. Pengujian alkaloid dari
ekstrak daun Nypa fruticans dapat dilihat pada Gambar 3.
26
Gambar 3. Uji Alkaloid
Uji Tannin (Marliana, et al., 2005)
Ekstrak dari sampel sebanyak 3 ml ditambahkan aquades sebanyak 3 ml.
Larutan tersebut ditambahkan 5 tetes NaCl 10% lalu disaring. Filtrat dibagi
menjadi 3 bagian yaitu A, B, C. Filtrat A sebagai larutan blanko, filtrat B
ditambhakan pereaksi FeCl3 1% sebanyak 3 tetes, lalu filtrat C ditambahkan
larutan garam gelatin. Kemudian diamati perubahan yang terjadi. Uji tannin
dalam ekstrak sampel dapat dilihat pada Gambar 4.
Ekstrak daun Nypa fruticans
Dimasukkan kedalam tabung reaksi
Ditambahkan ammonia pekat
Disaring dengan kertas saring halus
Ditambahkan asam sulfat 2N dan dikocok hingga terbentuk lapisan
Ditetesi pereaksi Meyer
Diamati perubahan yang terjadi. Positif alkaloid jika terbentuk endapan putih, coklat, dan jingga
27
Gambar 4. Uji Tannin
Uji Flavonoid (Darminto, et al., 2009)
Ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan 2 ml etanol 95%, 0,5 g serbuk
Mg, dan 2 ml HCN 2 N. Larurtan didiamkan selama 1 menit, kemudian
ditambahkan 2 ml HCN pekat. Larutan positif apabila terbentuk warna kuning
sampai jingga. Uji flavonid dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Uji Flavonoid
Ekstrak daun Nypa fruticans
Dimasukkan kedalam tabung reaksi
Ditambahkan aquades, NaCl 10%
Ditambahkan FeCl3 1% sebanyak 2-3 tetes
Ditambahkan asam sulfat 2N dan dikocok hingga terbentuk lapisan
Diamati perubahan yang terjadi. Positif tannin jika terbentuk warna coklat kehijauan atau biru kehitaman
Ekstrak kulit batang Nypa fruticans
Ditambahkan etanol 95%, serbuk Mg, dan HCl 2 N
didiamkan
Ditambahkan HCl pekat
Diamati perubahan yang terjadi. Positif alkaloid jika terbentuk warna kuning sampai jingga
28
Uji Steroid (Sangi et al., 2008)
Sebanyak 50 mg sampel uji ditambahkan asam asetat anhidrat
sampai sampel terendam semuanya, dibiarkan selama kira-kira 15 menit.
Kemudian 6 tetes larutan dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan di
tambahkan 3 tetes asam sulfat pekat. Adanya triterpenoid ditunjukkan
dengan terjadinya warna merah, jingga, atau ungu, sedangkan adanya
steroid ditunjukkan dengan adanya warna biru dan jika warna berubah
menjadi hijau kebiruan maka positif sterol. Pengujian steroid dan terpenoid
pada ekstrak daun mangrove Nypa fruticans dapat dilihat pada Gambar 6.
. Gambar 6. Uji Steroid dan Terpenoid
Uji Saponin (Rasyid, 2012)
Pengujian saponin dilakukan menggunakan metode Forth yaitu
melihat ada atau tidaknya busa yang terbentuk dengan mereaksikan sampel
dan air. Ekstrak kasar sampel diambil sebanyak 1 g dan ditambahkan 10 ml
aquades. Larutan dipanaskan selama 5 menit. Kemudian larutan
dimasukkan tabung reaksi dalam keadaan panas lalu dikocok secara vertikal
selama 10 detik. Hasil positif apabila terbentuk busa yang stabil dan tidak
hilang saat ditambahkan satu tetes HCN 2 N. Uji saponin dapat dilihat pada
Gambar 7.
Ekstrak daun Nypa fruticans
Ditambahkan asetat anhidrat
Ditambahkan asam sulfat pekat
Diamati perubahan yang terjadi. Positif steroid jika terbentuk warna biru atau hijau kebiruan dan positif triterpenoid jika terbentuk warna merah
jingga atau ungu
29
Gambar 7. Uji Saponin
d. Uji Toksisitas Menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test Penyiapan Larva Artemia salina Lench. (Muaja et al., 2013)
Penyiapan larva Artemia salina Lench. Dilakukan dengan cara mengambil
telur Artemia salina Lench. sebanyak 1 g dan ditetaskan dengan cara merendam
telur tersebut dalam air laut buatan sebanyak 2 L dan diberi penerangan dengan
lampu pijar 40-60 watt serta diaerasi selama 48 jam. Telur Artemia salina Lench.
akan menetas menjadi nauplii instar III/IV yang siap digunakan sebagai hewan
uji. Air laut buatan dibuat dengan cara melarutkan 40g garam dalam 2 L air
kemudian disaring. Penetasan telur Artemia salina lench. dapat dilihat pada
Gambar 8.
Ekstrak daun Nypa fruticans
Ditambahkan aquades
Dipanaskan
Diamati tidak ada busa. Positif jika terbentuk busa yang stabil dan tidak hilang saat ditambahkan satu tetes HCl 2 N
Dimasukkan dalam tabung reaksi dan dikocok vertikal
30
Gambar 8. Penetasan telur Artemia salina Leach.
Penentuan Konsentrasi Larutan Ekstrak dan Uji Toksisitas Artemia salina Leach. (Muaja et al., 2013)
Penentuan konsentrasi larutan uji yang digunakan dimulai dari
pembuatan larutan induk dengan konsentrasi 2000 ppm yang di buat dari
melarutkan 40 mg ekstrak sampel dalam 20 ml air laut. Larutan induk
tersebut kemudian diencerkan kembali hingga menghasilkan larutan dengan
konsentrasi 1000, 500, 100, 50, 25, dan 12,5 ppm serta 0 ppm tanpa
tambahan ekstrak sampel digunakan sebagai kontrol. Perhitungan untuk
konsentrasi larutan uji dapat dilihat pada Lampiran 1.
Uji toksisitas dilakukan dengan mengisikan 5 ml larutan ekstrak dari
masing-masing sampel (A, B, C) untuk tiap konsentrasinya ke dalam botol
vial, sehingga ada 19 botol vial untuk 1 kali ulangan. Lalu 10 ekor Artemia
salina Leach. dimasukkan kedalam masing-masing botol vial tersebut.
Pengamatan jumlah larva Artemia salina Leach. yang mati dilakukan selama
24 jam ditiap 6 jam sekali. Skema uji toksisitas dapat dilihat pada Gambar
10.
Telur Artemia salina Leach.
Direndam dalam air laut dalam wadah toples
Diaerasi sampai telur menetas
Artemia salina Leach. umur 48 jam siap digunakan
31
Gambar 9. Skema Uji Toksisitas
3.3.2 Penelitian Tahap 2
Penelitian tahap 2 (utama) bertujuan untuk mengetahui pengaruh
perbedaan interaksi suhu dan lama waktu pengeringan ekstrak daun Nypa
fruticans terhadap nilai LC50 dan IC50 dari ekstrak tersebut. Penelitian ini
menggunakan bentuk sampel yang telah diberi perlakuan pengeringan dengan 3
suhu yang berbeda dan 3 lama waktu yang berbeda yaitu suhu 40ºC, 50ºC dan
60ºC dan lama waktu 24 jam, 36 jam dan 48 jam. Proses preparasi bahan sama
seperti pada penelitian tahap 1 yang kemudian dilanjutkan dengan proses
ekstraksi secara bertingkat. Pada penelitian tahap 2 (utama) ini juga
ditambahkan parameter uji yang meliputi uji kadar air, total fenol dan analisa
ekstrak menggunakan LC-MS.
Ekstrak daun mangrove Nypa Fruticans diberi perlakuan pengeringan
berbeda terlebih dahulu yang terdiri dari 3 suhu yaitu 40, 50, 60ºC dan 3 lama
waktu pengeringan yaitu 24, 36, 48 jam. Kemudian dimaserasi dengan pelarut
Disiapkan larutan stock 2000 ppm
Diencerkan larutan stock dengan konsentrasi 1000, 500, 100, 50, 25, dan 12,5 ppm
Dibuat kontrol (0 ppm)
Larutan dipipet dan dimasukkan dalam botol vial
Dimasukkan larva Artemia salina Leach. pada tiap perlakuan
Diamati jumlah larva yang mati dan dihitung
32
metanol yang bersifat polar universal. Proses maserasi ini akan menghasilkan 9
ekstrak dengan perlakuan pengeringan berbeda dan dilakukan pengulangan
sebanyak 3 kali. Adapun rancangan penelitian utama dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Rancangan Penelitian
Perlakuan Interaksi suhu dan lama waktu
Waktu 24(x) 36(y) 48(z)
Suhu I II III I II III I II III
40 (A) Ax1 Ax2 Ax3 Ay1 Ay2 Ay3 Az1 Az2 Az3
50(B) Bx1 Bx2 Bx3 By1 By2 By3 Bz1 Bz2 Bz3
60(C) Cx1 Cx2 Cx3 Cy1 Cy2 Cy3 Cz1 Cz2 Cz3
a. Uji Kadar Air (Legowo et al., 2004)
Metode analisis kadar air yang dilakukan menggunakan metode oven
kering (metode termogravimetri) yang didasarkan pada prinsip perhitungan
selisih bobot bahan (sampel) sebelum dan sesudah pengeringan. Selisih bobot
tersebut merupakan air yang teruapkan dan dihitung sebagai kadar air bahan.
Langkah-langkah analisis kadar air dengan metode termogravimetri adalah
sampel sebanyak 2 sampai 5 g ditimbang pada cawan yang sudah diketahui
bobotnya lalu dikeringkan pada oven suhu 105º C selama 4 sampai 6 jam.
Setelah itu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot
tetap. Bobot dianggap konstan bila selisih penimbangan tidak lebih dari 0,2 mg.
Perhitungan kadar air diperoleh dengan membandingkan bobot sampel sebelum
dikeringkan dan bobot yang hilang setelah dikeringkan dikali 100%. Rumus
perhitungannya sebagai berikut:
Kadar air (% bb) =
x 100%
(% bk) =
x 100%
Keterangan : a = berat bahan awal ; b = berat bahan akhir; bb = berat basah;
bk = berat kering
a. Total Fenol
33
Pembuatan Kurva Standart Asam Galat (Ratnayanti et al., 2012)
Larutan stok asam galat dengan konsentrasi 100 ppm (mg/L) dibuat
dengan melarutkan 0,01 g asam galat dalam labu ukur 100 mL dan
ditambahkan akuades sampai tanpa batas. Diambil sebanyak 0; 0,2; 0,4;
0,8; 1,6 dan 3,2 mL dari larutan stok asam galat 100 ppm dan kemudian
masing-masing ditambahkan dengan reagen folin 50% sebanyak 0,8 mL,
dimasukkan pada labu ukur 10 mL. Selanjutnya ditambahkan Na2CO3 5%
hingga tanda batas, sehingga menghasilkan larutan standart dengan
konsentrasi 0; 2; 4; 8; 16; dan 32 ppm. Masing-masing larutan didiamkan
selama 60 menit, dan serapannya diukur pada panjang gelombang 760 nm.
Dengan mengalurkan absorbansi terhadap konsentrasi, dapat diperoleh
kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y = bx + a. Hasil yang diperoleh
dibuat dalam bentuk kurva, sebagai sumbu y adalah absorbansi dan panjang
gelombang cahaya sebagai sumbu x. Dari kurva tersebut dapat ditentukan
panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum. Skema kerja
pembuatan kurva standart asam galat dapat dilihat pada Gambar 10.
34
Gambar 10. Skema Kerja Pembuatan Kurva Standart Asam Galat
Penentuan Total Senyawa Fenolat dengan Metode Folinciocalteu (Ratnayanti et al., 2012) Sampel sebanyak 0,001 g ditimbang teliti dan dilarutkan dengan metanol
85% dalam labu ukur 10 mL sampai tanda batas. Campuran tersebut disaring,
dan filtratnya dipipet 1,0 mL kemudian ditambahkan dengan reagen folin 50%
sebanyak 0,8 mL, dimasukkan pada labu ukur 10 mL. Setelah itu dikocok dan
ditambahkan Na2CO3 5%sampai tanda batas, sehingga volume total larutan
menjadi 10 mL. Larutan didiamkan selama 60 menit, dan serapannya diukur
pada panjang gelombang maksimum. Pengukuran dilakukan pengulangan
sebanyak 6 kali. Konsentrasi senyawa fenolat dalam sampel dapat ditentukan
dengan mengalurkan absorbansi sampel pada kurva kalibrasi. Skema kerja
Serbuk asam galat 0,01 gram
Ditambahkan aquades sampai batas labu ukur 100 ml
Didapatkan larutan induk 100 ppm
Diambil sebanyak 0; 0,2; 0,4; 0,8; 0,16; dan 3,2 ml
Dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml
Ditambahkan reagen follin 50% sebanyak 0,8 ml
Ditambahkan Na2CO3 5% sampai batas labu ukur 10
Dihasilkan konsentrasi 0; 2; 4; 8; 16; dan 32 ppm
Didiamkan selama 60 menit
Serapannya diukur pada panjang gelombang 769 nm
35
penentuan total senyawa fenolat metode folinciocalteu dapat dilihat pada
Gambar 11.
Gambar 11. Skema Kerja Penentuan Total Senyawa Fenolat Metode
Folinciocalteu
b. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Modifikasi Rohimat et al., 2014 dan Wikanta et al., 2010)
Sampel ekstrak daun mangrove Nypa fruticans sebanyak 0,001 g
Dilarutkan dengan metanol 85% dalam labu ukur 10 ml sampai tanda batas
Disaring dengan keras saring halus
Filtrat dipipet 0,1 ml
Ditambahkan dengan reagen folin 50% sebanyak 0,8 ml, dimasukkan pada labu ukur 10 ml
Dikocok
Ditambahkan Na2CO3 5% sampai tanda batas labu ukur 10 ml
Larutan didiamkan selama 60 menit di ruang gelap
Serapannya diukur pada panjang gelombang 760 nm dengan spektrofotometer UV-Vis
36
Sebanyak 5 mg sampel ekstrak dilarutkan dalam 5 mL metanol sehingga
diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm (larutan induk). Larutan induk
dipipet sebanyak 62,5 µL, 125 µL, 250 µL, 500 µL, 1000 µL dimasukkan kedalam
tabung reaksi untuk mendapatkan konsentrasi sampel 12,5 ppm, 25 ppm, 50
ppm, 100 ppm, 100 ppm dan 200 ppm. Kedalam masing-masing tabung
ditambahkan 1 mL larutan DPPH 0,1 mM kemudian ditambahkan metanol hingga
menjadi 5 mL. Setelah homogen , diinkubasi pada suhu ruang (27ºC) selama 30
menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Setiap sampel
dilakukan 6 kali ulangan dan dihitung presentase peredamannya menggunakan
persamaan berikut:
% Peredaman =
x 100%
A0 adalah absorbansi kontrol (metanol + DPPH) tanpa ekstra dan A1 adalah
absorbansi sampel uji (Ekstrak + DPPH). Skema kerja uji aktivitas antioksidan
metode DPPH dapat dilihat pada Gambar 12.
37
Ekstrak daun mangrove Nypa fruticans 5 mg
Dilarutkan dalam 5 ml metanol (1000 ppm) menjadi larutan induk
Diambil 6,25 µL
Diambil 125 µL
Diambil 250 µL
Diambil 500 µL
Diambil 1000 µL
Konsentrasi 12,5 ppm
Konsentrasi 25 ppm
Konsentrasi 50 ppm
Konsentrasi 100 ppm
Konsentrasi 200 ppm
Dimasukkan kedalam botol vial
Ditambahkan larutan DPPH 0,1 nM sebanyak 1 mL
Ditambahkan metanol sampai volumenya menjadi 5 mL
dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap
Diukur absorbansi pada panjang gelombang 517 nm dengan spektrofotometer UV-Vis
Diukur % inhibisi dan nilai IC50 (melalui suatu persamaan garis linier)
Gambar 12. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH
38
c. Identifikasi Senyawa Bioaktif Menggunakan LC-MS (Modifikasi Lisdiawati et al., 2007)
Metode LC-MS merupakan metode pemisahan dan identifikasi untuk
senyawa obat atau organik. Metode ini sangat sensitif dan selektif
dibandingkan metode deteksi dengan sinar UV biasa (Purwanto, 2011).
Skema kerja identifikasi senyawa bioaktif menggunakan LC-MS dapat dilihat
pada Gambar 13.
Gambar 13. Skema Kerja Identifikasi Senyawa Bioaktif Menggunakan LC-MS
0,8 mg ekstrak Nypa fruticans
Dilarutkan dalam 0,8 ml metanol 95% dengan asam asetat 0,3%
0,2 µL larutan disuntikkan pada instrumen LC-MS dengan laju alir 0,1 mL/menit
Dipompa selama 10-15 menit
Masuk kedalam katup kolom selector
Dilakukan pemisahan menuju UV detector
Berat molekul dideteksi dengan spektrofotometer massa