16

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan Agustus

2011, bertempat di PT Z, Jakarta Utara, Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan

Hasil Perikanan dan Kelautan (BPMPHPK) DKI Jakarta, dan Laboratorium

Mikrobiologi Klinik, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging ikan tuna

segar (Thunnus sp) pada bagian ekor dan perut, yang ditangani sesuai dengan

penanganan bahan baku perusahaan terkait (Lampiran 1). Bahan untuk membawa

ikan tuna dari PT Z ke laboratorium adalah sterofoam, selotip putih, dan plastik

polypropylene steril. Bahan untuk pengujian kadar histamin meliputi metanol,

glass wool, HCl 1 N, NaOH 1 N, HCl 0,1 N, orto-ptalatdikarbosildehid (OPT)

0,1%, H3PO4 3,57 N, resin penukar ion, dan histamin dihidroklorida. Pengujian

total volatile base (TVB) membutuhkan bahan berupa asam perklorat 6%, NaOH

20%, H3BO4 3%, HCl 0,02 N. Pengujian angka lempeng total (ALT)

membutuhkan plate count agar dan larutan butterfield’s phosphate buffered.

Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin membutuhkan larutan butterfield’s

phosphate buffered dan larutan agar Niven yang terdiri dari: 0,1% trypton, 0,2%

yeast exstract, 1,8% L-histidin, 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 2,5% agar, dan 0,003%

phenol red. Isolasi bakteri membutuhkan bahan berupa media Niven, Trypticase

Soy Agar (TSA) dan Trypticase Soy Broth Histidine (TSBH). Karakterisasi

bakteri, yakni pewarnaan Gram membutuhkan kristal violet, iodin, safranin,

minyak imersi, alkohol 95%; Uji motilitas membutuhkan agar semi solid; Uji

oksidase membutuhkan kertas oxidase test strip; Uji katalase membutuhkan 3%

H2O2. Identifikasi bakteri membutuhkan API kit 20 E dan API kit 20 NE beserta

reagen.

Alat penyimpanan sampel pada suhu 4-5 ºC berupa lemari pendingin

dengan temperature display bermerk Vwr Refrigerator Chrom 45.5CF VCR445D

dengan rentang suhu 1 ºC - 8 ºC, dengan setting suhu 4 ºC - 5 ºC, sedangkan alat

17

penyimpanan sampel pada suhu -2-1 ºC berupa lemari pendingin dengan

temperature display bermerk Vwr/ Shel lab 5216 dengan rentang suhu -60 ºC - 8

ºC, dengan setting suhu -2 ºC - 1 ºC. Alat yang dibutuhkan untuk pengujian kadar

histamin adalah kolom resin dan instrumen spektroflorometer Cary Eclipse

FLO811M007 detektor floresens dan waterbath. Alat yang dibutuhkan untuk

pengujian TVB adalah alat destilasi uap dan timbangan analitik dengan ketelitian

10-4

gram. Alat pengujian ALT dan analisis jumlah bakteri pembentuk histamin

yang dibutuhkan adalah timbangan analitik, homogenizer, cawan petri, inkubator,

alat penghitung koloni (acolyte) serta pH meter. Isolasi bakteri membutuhkan

pipet 0,1 ml, cawan petri, dan inkubator. Alat yang dibutuhkan untuk karakterisasi

bakteri adalah kaca objek dan mikroskop cahaya merek Olympus untuk

pengamatan morfologi koloni dan bentuk sel; pewarnaan Gram membutuhkan

mikroskop cahaya; uji motilitas membutuhkan inkubator; uji oksidase

membutuhkan ose dan stopwatch; uji katalase membutuhkan ose dan pipet tetes.

Identifikasi bakteri membutuhkan alat berupa inkubator, nephelometer, dan

apiwebTM

identification software (Ref. 40 011).

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap, yaitu: (1) preparasi sampel;

(2) penyimpanan sampel; (3) analisis kimia dan mikrobiologi, yakni analisis kadar

histamin, analisis kadar Total Volatile Base (TVB), analisis Angka Lempeng

Total (ALT), dan bakteri pembentuk histamin (BPH); serta (4) isolasi,

karakterisasi, dan identifikasi bakteri.

3.3.1 Preparasi sampel

Sampel merupakan daging ikan tuna (Thunnus sp) segar yang diperoleh

dari PT Z. Daging tuna yang digunakan meliputi daging bagian ekor dan perut

(Frank et al. 1981). Pengkodean sampel dilakukan dengan memberikan tanda

sesuai dengan ketentuan yang ditunjukkan pada Gambar 3.

Teknik preparasi yang dilakukan meliputi penerimaan, pencucian,

penyimpanan sementara, pemotongan kepala dan sirip, serta pembentukan loin

(Lampiran 1). Teknik tersebut mengacu pada SNI 01-4104.3-2006 tentang tuna

loin beku (BSN 2006b). Daging tuna yang digunakan meliputi daging bagian ekor

18

dan perut dari produk tuna loin, dengan daging pada bagian perut yang tidak

dilakukan proses pemotongan (Frank et al. 1981). Hal tersebut dilakukan karena

PT Z melakukan proses pemisahan pada penjualan loin dan daging perut. Proses

preparasi sampel dilakukan dengan memperhatikan sanitasi peralatan dan

higienitas manusia (BSN 2006a), yang dilakukan oleh pihak PT Z.

Perut Ekor

Gambar 3 Lokasi bagian daging yang digunakan dalam penelitian.

Seluruh sampel selanjutnya dibawa dengan segera dari PT Z ke

laboratorium menggunakan sterofoam dengan lama perjalanan 10 menit. Selama

transportasi, sampel dalam sterofoam diberikan es curai mengacu kepada

Widiastuti (2008).

3.3.2 Penyimpanan sampel

Sampel yang diperoleh dari perusahaan, ditimbang dan dicacah hingga

halus. Namun, sampel analisis mikrobiologi tidak dicacah. Proses tersebut

dilakukan dengan memperhatikan higienitas dan sanitasi, yakni selalu

menggunakan api bunsen, alkohol, masker, dan sarung tangan. Sampel kemudian

dibungkus dengan plastik polypropylene steril. Sampel selanjutnya disimpan

dalam ruang pendingin (BSN 2006a). Suhu ruang penyimpanan yang digunakan

adalah -2-1 ºC untuk penyimpanan suhu -2-1 ºC , mengacu ketentuan EC (2004)

dan Dalgaard (2008) serta 4-5 ºC untuk penyimpanan suhu 4-5 ºC , mengacu

ketentuan FDA (2001). Lama penyimpanan sampel dilakukan selama 0, 2, dan 7

hari berdasarkan FDA (2009) dan ketentuan PT Z.

3.3.3 Analisis kimia dan mikrobiologi

Tingkat kemunduran mutu sampel diketahui dengan melakukan analisis

kimia dan mikrobiologi, yang meliputi analisis kadar histamin (SNI

2354.10:2009), analisis kadar Total Volatile Base (TVB) (SNI 2354.8:2009),

19

analisis Angka Lempeng Total (ALT) (SNI 01-2332.3-2006) dan analisis jumlah

bakteri pembentuk histamin (BPH) (modifikasi Niven et al. 1981). Analisis

tersebut dilakukan dengan pengulangan sebanyak tiga kali dan duplo. Model tabel

analisis penelitian dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4 Model tabel data analisis

Lama

penyimpanan

Lokasi daging

Perut Ekor

Suhu penyimpanan (°C)

4-5 -2-1 4-5 -2-1

0 hari

2 hari

7 hari

3.3.4 Isolasi, karakterisasi, dan identifikasi bakteri

Jenis bakteri yang berperan dalam memproduksi histamin diketahui

dengan isolasi bakteri (Hwang et al. 2010), karakterisasi bakteri yang terdiri dari

uji morfologi koloni, morfologi sel, yakni bentuk sel, pewarnaan Gram, uji

motilitas, uji oksidase, uji katalase (Tiwari et al. 2009), dan identifikasi bakteri

(bioMérieux 2006a; bioMérieux 2006

b).

3.4 Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok

(RAK) faktorial. Penggunaan RAK faktorial disebabkan karena sampel yang

digunakan pada setiap ulangan berasal dari ikan tuna dari hasil tangkapan yang

berbeda. RAK faktorial sangat baik digunakan jika keheterogenan unit percobaan

berasal dari satu sumber keragaman (Mattjik & Sumertajaya 2002), dalam hal ini

adalah tuna pada masing-masing ulangan. Faktor yang digunakan meliputi lokasi

daging, suhu penyimpanan dan lama penyimpanan. Lokasi daging terdiri dari ekor

dan perut. Suhu penyimpanan adalah -2-1 ºC dan 4-5 ºC, serta lama penyimpanan

adalah 0, 2, dan 7 hari. Pengujian dilakukan dengan ulangan sebanyak tiga kali.

Model untuk RAK faktorial adalah (Steel & Torrie 1983)

20

Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + þk + εijk

Keterangan:

Y jk : hasil pengamatan untuk faktor A taraf ke- i, faktor B taraf ke- j pada

kelompok ke- k

μ : nilai tengah populasi

αi : pengaruh faktor A pada taraf ke- i

βj : pengaruh faktor B pada taraf ke- j

(αβ)ij : pengaruh interaksi AB pada taraf ke-i (dari faktor A), dan taraf ke-j (dari

faktor B )

þk : pengaruh taraf ke k dari faktor kelompok

εijk : pengaruh acak (galat percobaan) pada taraf ke-i (faktor A), taraf ke-j

(faktor B), interaksi AB yang ke- i dan ke- j

Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis ragam dengan bantuan program

SAS 9.1. Bila hasil perlakuan menunjukkan pengaruh yang nyata, maka dilakukan

uji lanjut Duncan untuk mengetahui perlakuan yang memberikan perbedaan yang

nyata terhadap respon yang dianalisis. Model uji Duncan adalah sebagai berikut.

Se = √(KTG/n)

Keterangan:

Se : uji Duncan

KTG : KT galat

n : jumlah sampel

3.5 Prosedur Pengujian Sampel

Prosedur kerja analisis dalam pengujian sampel pada penelitian ini, terdiri

dari analisis kadar histamin, kadar Total Volatile Base (TVB), Angka Lempeng

Total (ALT), analisis jumlah bakteri pembentuk histamin, isolasi, karakterisasi,

dan identifikasi bakteri.

3.5.1 Analisis kadar histamin (SNI 2354.10:2009)

Analisis kadar histamin dilakukan dengan menggunakan

spektroflorometri, yang didasarkan pada pengukuran fluorosensi. Prinsip metode

tersebut adalah histamin diekstrak dari jaringan daging sampel (BSN 2009a).

Prosedur analisis kadar histamin, yakni sampel diblender hingga homogen,

kemudian ditimbang sebanyak 10±0,1 gram dalam beaker glass 250 ml dan

ditambahkan 50 ml metanol. Sampel dalam keadaan tertutup dipanaskan di dalam

waterbath selama 15 menit pada suhu 60 ºC dan didinginkan dalam suhu kamar.

Sampel tersebut dituang ke dalam labu takar 100 ml dan tepatkan hingga tanda

tera dengan metanol. Setelah itu dilakukan penyaringan menggunakan kertas

21

saring dan filtrat ditampung dalam botol contoh. Filtrat dapat disimpan dalam

refrigerator.

Glass wool yang telah diberi aquades dimasukkan ke dalam kolom resin

setinggi 1,5 cm. Resin netral dalam medium air dimasukkan ke kolom resin

setinggi 8 cm dengan volume air di atas resin setinggi 1 cm. Labu takar 50 ml

yang berisi 5 ml HCl 1 N diletakkan di bawah kolom resin untuk menampung

elusi contoh yang dilewatkan pada kolom resin.

Filtrat contoh sebanyak 1 ml dipipet ke dalam kolom resin, kran kolom

resin dalam posisi terbuka dan hasil elusi dibiarkan menetes lalu ditampung dalam

labu takar 50 ml. Aquades ditambahkan pada saat tinggi cairan 1 cm di atas resin

dan cairan dibiarkan terelusi. Prosedur tersebut diulangi hingga hasil elusi dalam

labu takar tepat 50 ml. Hasil elusi dapat disimpan dalam refrigerator.

Tiga tabung reaksi 50 ml disiapkan untuk sampel, standar, dan blanko.

Filtrat sampel, larutan standar kerja, dan blanko (HCl 0,1 N) dipipet masing-

masing sebanyak 5 ml. Ke dalam tabung reaksi tersebut berturut-turut

ditambahkan 10 ml HCl 0,1 N dan diaduk; 3 ml NaOH 1 N dan diaduk, kemudian

didiamkan selama 5 menit; 1 ml OPT 0,1% lalu diaduk dan didiamkan selama 4

menit; 3 ml H3PO4 3,57 N dan diaduk. Pengukuran flourescene dilakukan

terhadap sampel, standar, dan blanko sesegera mungkin dengan alat

spektroflorometri pada panjang gelombang eksitasi 350 nm dan emisi 444 nm

dalam waktu 90 menit.

y = a + bx

Keterangan:

y : fluoresensi contoh

a : intersep

b : kemiringan

x : konsentrasi contoh

Konsentrasi histamin (µg/g) = x . (volume akhir (ml). faktor pengenceran)

gram sampel

3.5.2 Analisis kadar Total Volatile Base (TVB) (SNI 2354.8:2009)

Total volatile base (TVB) merupakan jumlah basa nitrogen yang mudah

menguap. Analisis ini bertujuan untuk menentukan jumlah kandungan senyawa

basa volatil yang terbentuk akibat degradasi protein. Prinsip analisis TVB adalah

22

sampel diekstraksi menggunakan larutan asam perklorat (HClO4) 6%. Ekstrak

dibasakan dengan penambahan larutan NaOH 20% kemudian didestilasi uap,

destilat ditampung dalam larutan H3BO3 3%. Konsentrasi TVB-N dalam destilat

ditentukan dengan cara titrasi menggunakan larutan HCl 0,02 N (BSN 2009b).

Analisis kadar TVB dilakukan dengan tahapan ekstraksi, destilasi, titrasi,

dan perhitungan kadar TVB. Sampel ditimbang sebanyak 10 gram ± 0,1 gram

dengan menggunakan beaker glass. Ke dalam sampel ditambahkan 90 ml asam

perklorat (PCA) 6%, kemudian dihomogenkan dengan homogenizer selama 2

menit dan disaring dengan kertas saring kasar. Ekstrak dapat disimpan paling

lama satu minggu pada suhu 2 ºC – 6 ºC.

Ekstrak sebanyak 50 ml dimasukkan ke dalam tabung destilasi dan

ditambahkan dengan 3 tetes indikator fenolftalein. Tabung destilasi dipasang pada

peralatan destilasi uap dan ditambahkan 10 ml NaOH 20% (pada tahap ini

campuran berwarna merah). Penampung erlenmeyer berisi 100 ml H3BO4 3% dan

3-5 tetes indikator tashiro disiapkan (larutan berwarna ungu). Destilasi uap

dilakukan selama 10 menit hingga mempeoleh destilat 100 ml, sehingga terdapat

volume akhir sebanyak 200 ml larutan berwarna hijau. Destilasi larutan blanko

sama dengan sampel, tetapi mengganti ekstrak contoh dengan 50 ml PCA 6%.

Titrasi destilat contoh dan blanko dilakukan dengan menggunakan larutan

HCl 0,02 N. Titik akhir titrasi ditandai dengan terbentuknya kembali warna ungu

pada cairan yang sama dengan warna blanko yang telah didestilasi.

Kadar TVB-N (mg/100g) =

Keterangan:

Ar N : 14.007

Faktor pengenceran : 2

3.5.3 Analisis Angka Lempeng Total (ALT) (SNI 01-2332.3-2006)

Angka lempeng total merupakan jumlah mikroorganisme hidup yang

membutuhkan oksigen yang terdapat dalam suatu produk yang diuji. Pengujian ini

bertujuan untuk mengetahui jumlah total bakteri aerob pada sampel. Prinsip kerja

analisis ALT adalah pertumbuhan mikroorganisme setelah contoh diinkubasi

23

dalam media agar pada suhu 35 ºC selama 48 jam, maka mikroorganisme tersebut

akan tumbuh berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung

dihitung (BSN 2006c).

Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 25 gram dan ditambahkan

225 ml larutan butterfield’s phospate buffered, kemudian dihomogenkan selama 2

menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1

. Dengan menggunakan

pipet steril, diambil 1 ml homogenat dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml

larutan butterfield’s phospate buffered sehingga diperoleh contoh dengan

pengenceran 10-2

. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25

kali, kemudian dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-3

, 10-4

, 10-5

, dan

seterusnya sesuai kondisi sampel. Selanjutnya untuk metode cawan tuang (pour

plate method), dipipet sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dan dimasukkan ke

dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Ke dalam masing-

masing cawan yang sudah berisi sampel, ditambahkan 12-15 ml media Plate

Count Agar (PCA) yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45 ºC. Setelah

agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut

dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu

35 ºC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni

bakteri yang ada di dalam cawan petri menggunakan alat penghitung koloni.

Jumlah koloni yang dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri

antara 25-250 koloni.

3.5.4 Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin (modifikasi Niven et al.

1981)

Analisis bakteri pembentuk histamin dilakukan untuk mengetahui jenis

bakteri yang berperan dalam pembentukan histamin. Prinsip dari analisis bakteri

pembentuk histamin adalah Enterobactericeae akan mengubah histidin menjadi

histamin melalui proses dekarboksilasi yang akan menaikkan pH dan mengubah

warna pada media (Niven et al. 1981).

Media modifikasi Niven agar dipersiapkan dengan cara mencampurkan

0,1% trypton, 0,2% yeast extract, 1,8% L-histidin, 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl,

2,5% agar, dan 0,003% phenol red, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer

dan diencerkan menggunakan aquades hingga 1000 ml. Selanjutnya dipanaskan

24

hingga mendidih dan diatur pH 6 kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf

pada suhu 121 ºC selama 15 menit.

Sampel sebanyak 25 gram dimasukkan ke dalam botol yang berisi 225 ml

larutan butterfield’s phospate buffered steril, kemudian diblender hingga larutan

homogen. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1

. Dari campuran

tersebut kemudian diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml

larutan butterfield’s phospate buffered sehingga diperoleh contoh dengan

pengenceran 10-2

, kemudian dikocok hingga homogen. Pengenceran dilakukan

hingga 10-4

. Satu ml larutan sampel di setiap pengenceran dimasukkan ke dalam

cawan petri, lalu 12-15 ml media Niven bersuhu 45 ºC dituangkan ke dalam

cawan berisi sampel. Setelah media Niven memadat, cawan petri dimasukkan

dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 ºC.

Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah koloni dengan pink halo

hingga purpe halo yang merupakan koloni bakteri pembentuk histamin.

3.5.5 Isolasi bakteri (modifikasi Niven et al. 1981; Kung et al. 2009; Hwang et

al. 2010)

Isolasi dan pemurnian bakteri bertujuan memperoleh isolat bakteri murni

dari sampel, sehingga dapat dilakukan karakterisasi dan identifikasi bakteri yang

diperoleh. Isolasi bakteri yang dilakukan menggunakan metode gores kuadran,

yaitu menggoreskan larutan sampel beberapa kali menggunakan lup inokulasi di

permukaan media kultur.

Larutan sampel dari setiap pengenceran untuk analisis jumlah bakteri

pembentuk histamin atau ALT dipipet sebanyak 0,1 ml dan dituang ke media

Niven lalu diinkubasi selama 4 hari pada suhu 35 ºC. Koloni berwarna biru atau

ungu digoreskan pada media trypticase soy agar (TSA) untuk memperoleh kultur

murni. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.

Isolat bakteri dikatakan murni jika diperoleh bentuk sel dan morfologi koloni

yang seragam.

3.5.6 Karakterisasi bakteri (Tiwari et al. 2009)

Karakterisasi bakteri meliputi pengujian terhadap morfologi koloni dan sel

bakteri serta sifat fisiologis isolat murni yang diperoleh. Sebelum karakterisasi

bakteri dilakukan, penting dilakukan pengujian kemampuan bakteri menghasilkan

25

histamin. Pengujian tersebut bertujuan untuk meyakinkan bahwa isolat bakteri

yang dimiliki merupakan BPH.

Kultur murni ditumbuhkan dalam 10 ml trypticase soy broth (TSB) yang

ditambahkan 1% L-histidin atau disebut sebagai media trypticase soy broth

histidine (TSBH), kemudian diinkubasi pada suhu 35 ºC selama 24 jam. Biakan

tersebut digunakan untuk pengujian kadar histamin yang dihasilkan bakteri sesuai

BSN (2009a).

3.5.6.1 Morfologi koloni

Pengamatan morfologi koloni bertujuan mengetahui bentuk koloni dari

atas, bentuk tepi, bentuk elevasi, dan warna koloni secara visual (Lampiran 2).

3.5.6.2 Morfologi sel (Tiwari et al. 2009)

Pengamatan morfologi sel meliputi pewarnaan gram dan uji motilitas.

Pewarnaan gram merupakan metode yang sangat bermanfaat untuk

mengidentifikasi bakteri berdasarkan perbedaan warna karena perbedaan

komposisi kimia dan fisika dinding sel bakteri.

Pewarnaan gram diawali dengan mengolesi inokulum yang berumur 24

jam pada kaca objek dan difiksasi di atas api hingga kering. Kaca objek ditetesi

larutan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Larutan kristal violet dibuang

dengan memiringkan kaca objek dan dibilas dengan aquades lalu dikeringkan

dengan tisu. Selanjutnya kaca objek digenangi dengan larutan iodin selama 1

menit dan dibilas dengan alkohol 95% selama 15 detik, kemudian ditetesi dengan

safranin selama 45 detik dan dibilas dengan aquades serta dikeringkan dengan

tisu. Saat pengamatan dengan mikroskop, kaca objek ditetesi minyak imersi.

Mikroskop di-setting memiliki perbesaran lensa objek 100 kali dan perbesaran

lensa okuler 10 kali. Bila terbentuk warna merah muda, menandakan bakteri

Gram negatif, sedangkan bila terbentuk warna ungu, menandakan bakteri Gram

positif.

Bentuk sel dari preparat bakteri juga dapat diamati melalui pewarnaan

gram. Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus. Sel

bakteri yang berbentuk silindris atau batang dinamakan basilus. Bakteri berbentuk

spiral atau spirilum terurtama dijumpai sebagai individu sel yang tidak saling

melekat (Pelczar dan Chan 1986) (Lampiran 3).

26

Uji motilitas dilakukan dengan cara menusukkan isolat bakteri ke dalam

media semisolid agar dengan jarum ose tusuk steril, kemudian diinkubasi selama

semalam pada suhu 37 ºC. Bila pertumbuhan bakteri menyebar, maka bakteri

tersebut motil dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar atau hanya berupa

segaris mengikuti arah tusukan, maka bakteri non motil.

3.5.6.3 Uji sifat fisiologis (Tiwari et al. 2009)

Uji sifat fisiologis meliputi uji oksidase dan uji katalase. Sebanyak satu

ose koloni bakteri digoreskan pada kertas Oxidase Test Strip untuk pengujian

oksidase. Perubahan warna yang terjadi pada tes strip diamati setelah 10-15 detik.

Bila terjadi perubahan warna menjadi biru violet menandakan oksidase positif dan

bakteri termasuk bakteri non enterik, sedangkan bila tidak terjadi perubahan

warna menandakan oksidase negatif dan bakteri termasuk bakteri enterik.

Uji katalase dilakukan dengan cara satu ose koloni bakteri dioleskan pada

kaca objek kering dan diteteskan 2-3 tetes 3% H2O2. Bila terbentuk gelembung

udara, maka bakteri dinyatakan katalase positif. Bakteri aerob memberikan reaksi

positif, sebaliknya pada bakteri anaerob.

3.5.7 Identifikasi bakteri (bioMérieux 2006)

Identifikasi bakteri dilakukan dengan menggunakan analytical profile

index (API). API terdiri dari beberapa jenis dan bersifat spesifik terhadap

karakteristik bakteri yang akan diidentifikasi. Skema pemilihan API untuk bakteri

Gram negatif, berbentuk batang dan tidak rewel (non fastidious) dapat dilihat pada

Gambar 4.

Identifikasi bakteri yang bersifat Gram negatif, tidak rewel, dan oksidase

positif dilakukan menggunakan API kit 20 NE dengan tahapan sebagai berikut

(bioMérieux 2006a).

1. Bakteri dengan koloni murni yang akan diuji disegarkan terlebih dahulu

selama 18-24 jam.

2. Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis (0,85%) sebanyak

6 ml dan dihomogenisasi, kemudian kekeruhan larutan diukur

menggunakan nephelometer. Kekeruhan larutan sebesar 0,5 Mc Farland.

27

3. Sebanyak 0,2 ml larutan bakteri murni dihomogenkan dengan media API

AUX.

4. Larutan media tersebut dipipet ke dalam cupules (sumur) API 20 NE

menggunakan jarum suntik.

5. Cupules yangbertanda dipipet hingga penuh, yakni cupules GLU, ARA,

MNE, MAN, NAG, MAL,GNT, CAP, ADI, MLT, CIT, dan PAC.

6. Cupules NO3, TRP, GLU, ADH, URE, ESC, GEL, dan PNPG dipipet

hanya sampai setengah bagian cupules.

7. Cupules GLU, ADH, dan URE ditambahkan dengan minyak mineral.

8. Hasil dibaca setelah inkubasi selama 24±2 jam pada suhu 29±2 ºC.

9. Setelah inkubasi 24 jam, reagen James ditambahkan sebanyak 1 tetes pada

cupules TRP dan hasil dapat dibaca langsung. Reagen Nit 1 dan Nit 2

ditambahkan pada cupules NO3.

10. Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil, kemudian kode angka

yang diperoleh berdasarkan pembacaan hasil dimasukkan ke dalam

software API web. Spesies isolat akan ditampilkan sebagai hasil.

Identifikasi bakteri yang bersifat Gram negatif, tidak rewel, dan oksidase

negatif dilakukan menggunakan API kit 20 E dengan tahapan sebagai berikut

(bioMérieux 2006b).

1. Bakteri dengan koloni murni yang akan diuji disegarkan terlebih dahulu

selama 18-24 jam.

2. Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis (0,85%) sebanyak

6 ml dan dihomogenisasi, kemudian kekeruhan larutan diukur

menggunakan nephelometer. Kekeruhan larutan sebesar 0,5 Mc Farland.

3. Suspensi bakteri tersebut kemudian dipipet ke dalam cupules API 20 E

menggunakan pipet sekali pakai.

4. Cupules yang bertanda dipipet hingga penuh, yakni cupules Cit, VP,

dan Gel.

5. Cupules lainnya dipipet hanya sampai setengah bagian cupules.

6. Cupules ADH, LDC, ODC, H2S, dan URE ditambahkan dengan minyak

mineral.

7. Hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 36±2 ºC.

28

8. Setelah inkubasi 24 jam, reagen James ditambahkan sebanyak 1 tetes pada

cupules IND dan hasil dapat dibaca langsung. Reagen VP 1 dan VP 2

ditambahkan pada cupules VP, tunggu selama 10 menit untuk melihat

perubahan warna. Reagen TDA ditambahkan pada cupules TDA.

9. Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil, kemudian kode angka

yang diperoleh berdasarkan pembacaan hasil dimasukkan ke dalam

software API web. Spesies isolat akan ditampilkan sebagai hasil.

Gambar 4 Skema pemilihan API (bioMérieux 2006ab

).

Oksidase positif

Fermenter positif

Bakteri Gram negatif bentuk batang

Oksidase positif Oksidase negatif

Oksidase positif

Fermenter negatif Oksidase positif

Fermenter negatif

Oksidase negatif

Fermenter positif

Non fermenter:

API 20 NE

Fermenter:

API 10 S

API 20 E

Rapid 20 E