INTRODUCCIÓNLas técnicas de diagnóstico microbiológico han

experimentado en los últimos años un considerabledesarrollo, esto se ha hecho especialmente patenteen el estudio de la patología pulmonar infecciosadada la complejidad diagnóstica que presenta:- dificultad para obtener muestras representati-

vas del foco infeccioso- los microorganismos implicados en el proceso

pueden ser muy diferentes- creciente desarrollo de cepas resistentes a la

terapia antibiótica- presencia de gérmenes comensales en las vías

respiratorias- pacientes inmunodeprimidos con el consi-

guiente auge de la tuberculosis e infeccionesoportunistasHa sido, por lo tanto, necesario el desarrollo de

nuevas técnicas diagnósticas, la mejora de las yaexistentes y la puesta en marcha de técnicas ins-trumentales que nos permitan un óptimo accesoal foco de estudio para mejorar la calidad de lamuestra obtenida1.

La obtención de las muestras (Tabla I) puedellevarse a cabo mediante técnicas no invasivas(esputo, líquido pleural, sangre y orina) e invasivas(punción transtraqueal, fibrobroncoscopia, puncióntranstorácica y biopsia pulmonar).

Éstas últimas conllevan una mayor rentabilidaddiagnóstica que las no invasivas pero también unmayor número de complicaciones por lo que debenreservarse para pacientes graves en los que no haya-mos podido conseguir una orientación diagnósticacon las técnicas habituales.

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICOMICROBIOLÓGICO EN NEUMOLOGÍA

1. Técnicas no invasivas

1.1 Análisis del esputoPara que sea de utilidad la muestra obtenida

debe proceder del tracto respiratorio inferior evi-tando la contaminación orofaríngea.

Tanto los resultados de la sensibilidad (60-100%),como de la especificidad (14-100%) deri-vados de este tipo de muestra son muy variables.

En ocasiones será necesario recurrir a técnicasde inducción de esputo con suero fisiológico paraobtener una buena muestra2.- Tinción de GRAM: permite el examen directo del

esputo; tiene valor orientativo en el diagnósticode infecciones bacterianas, es una técnica rápi-da y sencilla. Se considera que el material esrepresentativo si se visualizan > 10 leucocitosPMN y< 25 células de descamación por campo.

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- Tinción de Zhiehl-Neelsen: debe realizarse antesospecha de etiología tuberculosa, su rentabi-lidad aumenta con el número de muestras reco-gidas (por regla general tres)2,3.Se requieren al menos 10.000 BAAR / ml paraque puedan ser visualizados poresta técnica.No permite diferenciar M.tuberculosis de otrasmicobacterias.Es una técnica fácil y rápida de realizar.

- Tinción de auramina: permite la visión directadel mycobacterium mediante un microscopiode fluorescencia utilizando como colorante unfluorocromo como la auramina, tiene una efi-cacia similar a la tinción de Zhiehl – Neelsenaunque su principal ventaja es su mayor rapi-dez, por lo que su utilización está justificada enaquellos laboratorios que realicen más de 10exámenes microscópicos diarios.

- Blanco de calcofluor: para hongos- Tinta china: análisis en fresco para criptococos.- Cultivo de esputo: su rentabilidad depende de

la calidad de la muestra obtenida. Tiene unasensibilidad entre 45-60% cuando se realizaconjuntamente con la tinción de GRAM y un60% de especificidad en el diagnóstico del

agente etiológico responsable de la neumoníaadquirida en la comunidad. Su utilidad es limi-tada en el caso del neumococo3.

- Cultivo de M. tuberculosis: permite el diag-nóstico de confirmación de la enfermedad,esun procedimiento mucho más sensible que lamicroscopía, y consigue mayor rentabilidad encaso de muestras paucibacilares (son suficientes10 BAAR / ml de esputo). Pueden utilizarsetanto medios sólidos como líquidos. Los mediossólidos son los más conocidos como el deLowenstein-Jensen (medio con base de huevo),o el cultivo 7H10-7H11 de Midelbrook (semi-sintético con base de ágar). Algunas micobac-terias requieren suplementar los medios de cul-tivo con factores de crecimiento especiales (san-gre, citrato amónico, hemina…)El tiempo de crecimiento del bacilo una vezsembrado, oscila entre 3-6 semanas de ahí quese hallan desarrollado sistemas de detecciónmás rápidos como los radiométricos (BACTEC)que permiten determinar la actividad metabó-lica del mycobacterium entre 15- 20 días, pre-senta mayor sensibilidad que los cultivos tra-dicionales así como la posibilidad de identifi-car M. tuberculosis en 4-5 días y realizar anti-biograna en 3-6 días2,3.Su principal inconveniente es que el sistemaBACTEC requiere trabajar con 14 C por lo quenecesita permisos especiales para su manipu-lación.Se han investigado métodos de cultivo no radio-métricos como los bifásicos (MB-Septi- Check®)como alternativa pero presentan la desventajade ser más lentos que BACTEC®.

- Inmunofluorescencia directa (IFD): demuestrala presencia de antígenos mediante anticuer-pos específicos marcados con fluoresceína, conel empleo de anticuerpos monoclonales hamejorado la especificidad de la técnica que depor sí es elevada, la sensibilidad varía según eltipo de muestra utilizada, siendo más alta cuan-do se utiliza una técnica invasiva.Es útil para la detección de L. pneumophila,Chlamydia pneumoniae y virus respiratoriosentre otros3.

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1. No invasivas:- esputo- sangre- suero - orina- líquido pleural

2. Invasivas- Punción transtraqueal- Fibrobroncoscopia:

• Broncoaspirado• Catéter telescopado con cepillo protegido• Lavado broncoalveolar• Biopsia transbronquial• Punción transbronquial espirativa

- Punción aspiración transtorácica- Biopsia pulmonar

Tabla I. Tipos de muestras para diagnóstico micro-biológico en Neumología1.

1.2 HemocultivoDe uso obligado en pacientes diagnosticados

de neumonía que requieran ingreso hospitalario.Suele ser positivo tan sólo en un 15-25% de loscasos ya que por regla general los pacientes hanrecibido terapia antibiótica previamente y las bac-teriemias en las neumonías son transitorias.

Los hemocultivos deben realizarse lo más pre-cozmente posible y durante un pico febril, la can-tidad mínima de sangre requerida es de 10cc y lasiembra debe realizarse tanto en medio aerobiocomo anaerobio.

Se han desarrollado, así mismo, técnicas quepermiten la detección de micobacterias en sangre,las más eficaces son las de lisis –centrifugación ylas radiométricas. Son más útiles en caso de pacien-tes inmunodeprimidos.

1.3 Técnicas serologicasConsisten en la detección de Anticuerpos espe-

cíficos en el suero del paciente.Tienen gran valor epidemiológico, pero son

poco útiles como orientación terapeúticaya que sontécnicas de resultado tardío; se requieren dos mues-tras, una en la fase aguda y otra en la de convale-cencia (a los 14 -21 días), siendo necesario detec-tar seroconversión entre una y otra.

Se considera positiva cuando el título de la fasede convalecencia es cuatro veces superior al dela fase aguda.

Las técnicas más utilizadas son: fijación delcomplemento, inmunofluorescencia indirecta y Enzi-moinmunoensayo (ELISA).

La técnica de fijación del complemento ha sidola más utilizada en el serodiagnóstico de infeccio-nes respiratorias sin embargo es poco sensible yrequiere altas concentraciones de antígenos, es unatécnica larga con resultados inespecíficos con muchafrecuencia.

Ha sido el diagnóstico más establecido en labo-ratorios de referencia para el diagnóstico de neu-monías víricas, se utiliza para el diagnóstico, confines epidemiológicos de gérmenes como Myco-plasma, Legionella, Chlamydia y Coxiella.

La técnica de ELISA presenta mejor sensibili-dad y especificidad. La prueba es menos efectiva

para virus por mala reproductibilidad así como fal-sos positivos y negativos. Su mayor utilidad radicaen el diagnóstico de Micplasma pneumoniae yCoxiella burnetti, tanto para detectar IgG como IgM(2,3).

1.4 Orina: determinación de antigenuria- Antígeno neumocócico urinario: detecta antí-

genos capsulares por técnicas de coaglutina-ción, aglutinación con partículas de látex (LA),radioinmunoensayo (RIA), fluorescencia direc-ta, enzimoinmunoensayo (EIA)…La prueba tiene una alta especificidad pero bajasensibilidad (0-58%).Estos inconvenientes se obvian con una técni-ca más reciente, la inmunocromatografía demembrana que detecta el antígeno polisacá-rido C de membrana neumocócico, con resul-tados disponibles en unos 15 minutos.La técnica es cara y puede dar falsos positi-vos en EPOC, por lo que en la actualidad escomplementaria pero no de primera línea enel diagnóstico de la neumonía neumocócica4.

- Antígeno urinario de Legionella: Legionella esun patógeno obligado que no coloniza la víaaérea por lo que su aislamiento es sinónimode infección.El cultivo de esputo tiene una sensibilidad entreel 50-80% y una especificidad del 100% peropresenta como principal inconveniente que sumáximo rendimiento no se obtiene hasta los7-9 días, por lo que no se considera una buenatécnica para diagnóstico rápido.Al menos el 80% de los pacientes con legio-nellosis excretan antígenos por orina, de ellosel 70-80% es producida por L. pneumophilaserogrupo 1. La antigenuria aparece dentro delos 3 días desde el comienzo de los síntomasy puede mantenerse hasta 60 días después desu aparición.Los técnicas más empleadas son radioinmu-noensayo (RIA) y enzimoinmunoensayo (EIA),ambas con una buena sensibilidad y una espe-cificidad que se acerca al 100%, así como altovalor predictivo positivo, sin embargo EIA notiene riesgo de radiación, es más barato y más

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sencillo. Como principales inconvenientes estándiseñados sólo para la detección del serogru-po 1 de L. pneumophila y la antigenuria per-sistente puede dificultar el diagnóstico de lasrecurrencias.En los últimos años se ha introducido un testde inmunocromatografía de membrana parael serotipo 1, el test es rápido y sencillo peroparece tener una menor sensibilidad que elEIA4,5.

1.5 Técnicas de amplificación genéticaTodos los microorganismos poseen en sus áci-

dos nucleicos secuencias de nucleótidos propiasque les permiten distinguirlos de los demás, la detec-ción de estas secuencias de DNA o RNA específi-cas permite realizar el diagnóstico de una enfer-medad infecciosa.- Sondas genéticas: se comercializaron en la déca-

da de los 80, consisten en un fragmento de ácidonucleico marcado (con isótopos radiactivos o sus-tratos cromógenos) que poseee una secuenciade bases complementaria a la del genoma delmicroorganismo. Presentan muy buena especi-ficidad pero baja sensibilidad Se han utilizado para identificación de micobac-terias, L: pneumophila, virus…En la actualidad han sido superadas por otras téc-nicas.

- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)6: Per-mite sintetizar por vía enzimática millones de copiasde un fragmento específico de DNA. El métodoconsta de 3 etapas: extracción del DNA, amplifi-cación y análisis del producto final. En la primeraetapa mediante métodos preferentemente enzi-máticos selibera el ADN que contienen todas lascélulas presentes en la muestra, posteriormentese incorpora a la muestra una enzima, la polime-rasa, y unos fragmentos de DNA denominadosiniciadores o primers que son específicos y com-plementarios de un segmento de DNA del ger-men a estudio (DNA diana) y se instauran unosciclos térmicos predefinidos. En cada ciclo se pro-duce la separación de las cadenas de DNA, el aco-plamiento con los iniciadores, si existe DNA diana,y la duplicación de las cadenas. Unicamente las

cadenas de DNA presentes en la muestra y com-plementarias a los iniciadores sufrirán el procesode amplificación. El número final de cadenas deDNA se incrementará exponencialmente en cadaciclo en función al número de ciclos realizados.La técnica es altamente sensible y suministra resul-tados de forma muy precoz, en tan sólo unashoras, pero presenta falsos positivos en pacien-tes no infectados sino colonizados y como resul-tado de contaminación de la muestra durante sumanipulación.Las muestras para estudio pueden obtenerse delesputo, lo que conlleva un alto riesgo de conta-minación por flora saprofita, por lo que se consi-deran más útiles las muestras sanguíneas y lasrespiratorias obtenidas por técnicas invasivas.Se han realizando estudios para valorar su efi-cacia en el diagnóstico de la neumonía adqui-rida en la comunidad tanto neumocócica comono neumocócica, con una sensibilidad del 73%para las neumonías neumocócicas bacteriémi-cas, frente al 48% para las no bacteriémicas6.Las técnicas de amplificación genética más des-arrolladas en los últimos años han sido las desti-nadas a detección de Mycobacterium tubercu-losis7. Entre ellas destacan el sistema Amplicor TB R deRoche con una sensibilidad, especificidad y valorpredictivo positivo y negativo de 97,6%, 100%,100% y 90,9% respectivamente para muestrascon cultivo positivo.Posteriormente se han creado técnicas de segun-da generación como el Gen Probe Amplified MTDR que utiliza la amplificación delRNA ribosomal que ha mejorado su sensibilidadcon respecto al cultivo manteniendo una exce-lente especificidad para el diagnóstico de M.tuberculosis; no requiere instrumental muy sofis-ticado y puede llevarse a cabo de rutina en lamayoría de los laboratorios clínicos, permitien-do la realización de 50 muestras en 5 horas8,9.

2. Técnicas invasivasEstán indicadas en situaciones de gravedad o

en ausencia de respuesta a tratamiento empíricocorrecto.

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2.1 Punción transtraqueal: Es una técnica que se encuentra en declive en

la actualidad, tiene dependiendo de las series unasensibilidad entre 60-100% y una especificidad del14 -100%. Esta especificidad es menor en pacien-tes EPOC o en situaciones que predisponen a laaspiración.

Sus principales contraindicaciones son: diáte-sis hemorrágica, tos incontrolable y falta de cola-boración.

Entre sus principales complicaciones cabe des-tacar la hemoptisis grave y el enfisema subcutáneo.

2.2 Técnicas fibrobroncoscópicas- Broncoaspirado (BAS): una de sus principales

indicaciones es el diagnóstico de tuberculosispulmonar. En el diagnóstico de infecciones bac-terianas su inconveniente más importante esla contaminación con flora de la vía aérea supe-rior.

- Catéter telescopado de doble luz con cepilloprotegido: su principal indicación es el diag-nóstico de las neumonías en pacientes some-tidos a ventilación mecánica y de las neumo-nías comunitarias graves en pacientes con fac-tores de riesgo. La técnica tiene escasas com-plicaciones y contraindicaciones, pero su prin-cipal desventaja es que explora un territorio pul-monar muy pequeño.El punto de corte establecido en cultivos cuan-titativos es > 103 ufc/ml.

- Lavado broncoalveolar (LBA): muy útil para eldiagnóstico de infecciones oportunistas eninmunodeprimidos, a pesar de su baja espe-cificidad tiene la ventaja de que explora un terri-torio pulmonar amplio. El punto de corte encultivos cuantitativos para distinguir entre infec-ción y colonización es de 104ufc/ml. La administración previa de antibióticos invali-da tanto este resultado como el del catétertelescopado.La realización de LBA protegido mejora tanto lasensibilidad como la especificidad de la técnica.La sensibilidad de las pruebas endoscópicasoscila, según el procedimiento empleado Entre 55-95% y la especificidad del 90%.

2.3 Técnicas percutáneas: - Punción transtorácica espirativa (PTA): en la

actualidad se realiza con aguja ultrafina de cali-bre 25. Tiene una sensibilidad del 50-60%,queaumenta si el paciente no ha sido previamen-te tratado con antibióticos, y una especificidadentre el 90-100%.Es una técnica muy útil en pacientes neutro-pénicos, receptores de transplantes e infecta-dos por VIH.Sus complicaciones más frecuentes son lahemoptisis y el neumotórax. Son contraindicaciones el enfisema bulloso yla ventilación mecánica.

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