Proteini

Proteini

• Protos-grcki prvi• Organske materije koje cine 18-20 % naseg organizma• Aminokiseline• Dipeptid• Oligopeptid• Polipeptidi (obicno izmedju 50 i 2000 a.k.)• Proteini

• Molekularna tezina proteina se izrazava u daltonima (1 Da). • Srednja molekularna tezina aminokiselina je 128 Da. S obzirom da

se prilikom nastanka peptidne veze odcjepljuje molekula voda, aminokiselinski ostatak u proteinu iznosi oko 110 Da.

Proteini

• Najvise zastupljene makromolekule• Hiljade razlicitih proteina u tipicnoj celiji, svaki sa

posebno odredjenom funkcijom• Vrlo velike molekule, vecina polipeptida se sastoji od

manje od 2000 aminokiselina• Neki proteini se sastoje od jednog polipeptida, dok neki

imaju 2 ili vise polipeptida u svojoj strukturi (istih ili razlicitih)

• Homologni proteni su proteini koji posjeduju homologne sekvence, odredjene pozicije u polipeptidnim lancima sadrze iste aminokiseline, nezavisno od vrste

Razne bioloske funkcije

• Katalizatori-enzimi• Transport- hemoglobin, lipoproteini• Hranjivi-albumin, kasein• Zaduzeni za kontrakciju i kretanje- miosin, aktin• Strukturni- kolagen, elastin, keratin• Regulatorijski- hormoni• Zastitu- trombin, imunoglobulini

Kolagen• Strukturni protein koji se nalazi u dermisu, koji je unutrasnji sloj koze i cini kozu cvrstom i daje joj teksturu. Vremenom se degradira i treba stimulisati njegovu proizvodnju u celijama• Struktura molekule je kruti heliks

izgradjen od 3 lanca u kojima je svaka treca aminokiselina glicin. Tako nastali kolagenski monomeri se zatim postavljaju jedan do drugoga i grade kolagenska vlakna

Keratin• Protein kose• Cys i Met su dvije aminokiseline koje su zastupljene u velikom broju u ovom proteinu.• 3 polipeptidna lanca prave

protofibril, a 11 protofibrila se povezuje u makrofibril

• Proteini u samponima- nije dokazano da mijenjaju hemijski sastav kose, ali ostecena kosa absorbira vise proteina nego zdrava

Botoks

• Botulinum toxin je neurotoksicni protein koji se koristi u malim dozama za lijecenje bolova u misicima i u kozmeticki zahvatima.

• Djeluje tako sto blokira nerve i onemogucava misice da budu stimulisani i na taj nacin smanjuje kontrakcije misica lica koje uzrokuju bore.

• Misici mogu ostati paralizovani kao posljedica dodavanja ovog neurotoxina.

Pojavadelokalizacije (prijenosa ) elektrona upeptidnoj vezi prikazana jesljedećim strukturama:

1Å (Angstrom)= 1 nm

3D struktura proteina

• Struktura proteina moze se posmatrati na 4 nivoa:1. Primarna struktura je sam redosljed (sekvenca)

aminokiselina u proteinskom lancu2. Sekundarna struktura obuhvata prostorni raspored

samog peptidnog lanca (ne obazirujuci se na R-grupe)3. Tercijarna struktura predstavlja prostorni polozaj svih

atoma4. Kvaterna struktura je 3D struktura proteina

Primarna struktura i njeno odredjivanje

• Hidrolizom peptida nastaju aminokiseline• Za odredjivanje sekvence polipeptida se koriste 3 procedure: 1. hidroliza polipeptida da se utvrdi sastav aminokiselina 2. identifikacija N-terminalne aminokiseline (dansyl chloride) 3. Edmanova degradacija, proces koji odstranjuje samo N-aminokiselinu a ostavlja ostatak polipeptida netaknut. Ponavljanjem ove procedure moze se odrediti cijela sekvenca polipeptida. Uredjaj koji se koristi u ovom procesu se naziva sekvenator

Veliki proteini se moraju razgraditi u manje polipeptide za odredjivanje sekvence

• Ako polipeptidi sadrze vise od 50 aminokiselina moraju se prvo razgraditi u manje polipeptide

• Disulfidne veze se moraju prvo pokidati (β-merkaptoetanol), a onda se polipeptidi cijepaju na manje dijelove djelovanjem enzima (proteaza). Redosljed tako nastalih peptida se odredjuje preklapanjem

Lys-Tyr-Tyr-Pro-Lys-Gly-Ser-Leu

Preklapanje

Sekundarna struktura

• Peptidni lanci unutar molekule proteina mogu imati razlicit prostorni oblik i u zavisnosti od toga imamo 3 vrste sekundarne strukture:

1. α- heliks

2. β- nabrana ploca

3. β- okret

α- heliks

Kicma ili osnova lanca

α- heliks

• je stabilizovan vodikovim vezama izmedju karbonilne (C=O) grupe jedne aminokiseline i amino (N-H2) grupe 4. aminokiseline u polipeptidu

• Ove vodikove veze su moguce ako peptidni lanac obavijemo oko valjka tako da ove grupe dodju jedna nasuprot drugoj

• Aminokiselinski ostaci (R-grupe) su orijentisane prema vani

• Svaki puni zavoj sadrzi 3.6 aminokiselina• Aminokiselina prolin se ne moze uklopiti u ovu strukturu,

tako da tamo gdje je u polipeptidu prolin dolazi do odstupanja u pravilnosti strukture

β- nabrana ploca• Nastaje povezivanjem NH- i C=O grupa razlicitih dijelova

polipeptidnog lanca ili razlicitih polipeptidnih lanaca vodikovim vezama

• Ravan u kojoj se nalaze polipeptidni lanci je nabrana, tako da R-grupe stoje gotovo okomito nagore ili prema dole u odnosu na tu ravan. Na taj nacin bocne R-grupe imaju dovoljno prostora

Paralelna i antiparalelna ploca

• Dva polipeptidna lanca

vezana vodikovim

vezama mogu ici u

istom smjeru (paralelna)

ili u suprotnim smjerovima

(antiparalelna) β- ploca

β-okret

Sadrzaj sekundarne strukture

• Varira od proteina do proteina, od vrlo malog udjela do visokog postotka, tako da neki proteini sadrze samo α-heliks a neki samo β- strukturu

Disulfidna vezaDisulfidna veza je kovalentna veza kojom je stabiliziranastruktura mnogih proteinaDisulfidna veza nastaje oksidacijom SH-skupine u bočnim ograncima dvaju cisteina unutar istog ili različitih lanaca

Tercijarna struktura

• Prostorni raspored svih atoma*• Stabilizirana je velikim brojem razlicitih

nekovalentnih veza ili interakcija izmedju R-grupa u aminokiselinama

Tercijarna struktura proteina odredjena redosljedom aminokiselina

• Dokazano klasicnim eksperimentom Christian Anfinsen-a 1950-tih godina

Kvaterna struktura

• Odredjuje prostorni raspored polipeptida, ili podjedinica, unutar proteina

• Podjedinice ne moraju da budu identicne. Npr. hemoglobin se sastoji od po dvije identicne jedinice koje se spajaju u tetramer

Koje vrste hemijskih veza su bitne u razlicitim nivoima 3D-strukture

Struktura Vrsta vezePrimarna Kovalentna

peptidna veza

Sekundarna Vodikove veze

Tercijarna Hidrofobne veze + druge

Kvaterna Hidrofobne veze + druge

Homologni proteini su evolucijski srodniproteini slične primarne strukture i funkcije

Usporedba primarnestrukture homolognihproteina

promjenjiviaminokiselinski ostaci:bez značaja za funkcijuproteina

visokoočuvaniaminokiselinski ostaci:od specifičnog značaja zafunkciju proteina

Usporedba primarne strukture serinskih proteaza

Podjela proteina

• Mozemo ih podijeliti u 3 grupe prema njihovim hemijskim osobinama:

1. Vlaknasti proteini- nerastvorivi proteini koji sluze uglavnom kao strukturne komponente (primjeri: kolagen, keratin, miosin, elastin)

2. Globularni proteini- su proteini rastvorljivi u vodi, a okruglog su oblika po cemu su i dobili ime (primjeri su proteini krvne plazme, vecina enzima,...)

3. Proteinski kompleksi- su proteini koji su izgradjeni od proteinskog dijela i neke neproteinske ili prostetske grupe (metaloproteini, glikoproteini, lipoproteini, fosfoproteini)

kolagen

lizozim

hemoglobin

Izdvajanje proteina

• se vrsi uglavnom prema velicini proteina i prema elektricnom naboju• Elektroforeza:odvajanje proteina prema elektricnom naboju. Na

razlicitim pH, razliciti proteini ce imati razlicit naboj. Ako ove proteine stavimo u elektricno polje, brzina kojom se oni krecu u tom elektricnom polju ce zavisiti od velicini naboja, ali i o velicini i obliku molekule

• Separacija se vrsi u razlicitim gelovima (polucvrsti rastvori izgledom slicni zelatinu u kolacima)

• Najcesce se koriste poliakrilamidni gelovi (PAGE)• Gel se polimerizira izmedju staklenih ploca i velicina pora u gelu

zavisi od koncentracije akrilamida, tako da se brzina kretanja proteina odredjuje velicinom pora i jacinom el polja

• Manji proteini se krecu brze kroz gel koji se nalazi smjesten u elektricnom polju

SDS-gel elektroforeza

• SDS-gel elektroforeza: odvajanje proteina prema njihovoj velicini. SDS (natrij-dodecilsulfat) je deterdzent koji izaziva denaturaciju proteina i veze se za proteine tako da oni postaju negativno naelektisani. Broj molekula SDS koji se veze za protein je proporcionalan duzini polipeptida

• U elektricnom polju, ovi kompleksi proteina vezanih za SDS se onda krecu prema pozitivnoj elektrodi i koristenjem ove metode se eliminira uticaj oblika proteina na brzinu kretanja

• Nakon elektroforeze, proteini se mogu izolirati iz gela da bi se podvrgli daljim analizama

Kromatografija

• Kromatografija je zajednicki naziv za grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje smjesa. Pod kromatografijom se podrazumijevaju metode razdvajanja koje se zasnivaju na različitoj raspodjeliraspodjeli komponenata uzorka između dvije faze, od kojih je jedna nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna) u odnosu na prvu.

• Može biti analitička i preparativna. • Kromatografija je jedna od vodećih analitičkih metoda i

omogućava razdvajanje i kvantitativno određivanje supstanci veoma slične strukture i hemijskih osobina.

Stacionarna faza• Se sastoji od matrice koja je nerastvorivi polimer u obliku kuglica.

Ove kuglice moraju biti porozne tako da proteini mogu prodrijeti u njih

• Matrice koje su bazirane na agarozi ili drugim karbohidratima imaju dovoljno velike pore na kuglicama da propuste proteine velicine oko 106 Da

• Sinteticke i anorganske matrice, npr silika, su takodje razvijene u posljednje vrijeme

• Kod kromatografije na jonskim kolonama, ligandi su pricvrsceni za ovu matricu jednostavnim hemijskim reakcijama. Najcesce se koristi DEAE- (dietilaminoetil-) ili CM- (karboksimetil-) substituenti, u zavisnosti od toga da li se radi o anion ili kation jonskim kolonama

Kromatografija-gel filtracija• Proteini se razdvajaju prema velicini.• Rastvor proteina (mobilna faza) se ”filtrira” kroz polisaharidni

gel (stacionarna faza) koji djeluje kao molekulsko sito• Veci proteini se krecu brze kroz gel zato sto su preveliki da

udju u pore u “perlama” gela i prolaze direktno kroz kolonu

Kromatografija na jonskim kolonama

Afinitetska kromatografija

Stacionarna faza ponovo polisaharidza koji se u ovom slucaju veze substratonog enzima koji zelimo da izoliramoEluacija se vrsi dodavanjem nekog drugog substrata ili bufera sa drugompH vrijednosti