30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI CARDIOMIOCITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI IN GITA A FIRENZE!!!

30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI

CARATTERIZZAZIONE CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI ELETTROFISIOLOGICA DI

CARDIOMIOCITI CARDIOMIOCITI

DERIVATI DA CELLULE DERIVATI DA CELLULE STAMINALISTAMINALI

““IN GITA A FIRENZE!!!”IN GITA A FIRENZE!!!”


Università degli Studi di FirenzeUniversità degli Studi di Firenze

Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica

"Mario Aiazzi Mancini"

FACOLTA’ DI MEDICINA



IL CUBOIL CUBO



CENTRI OSPITATICENTRI OSPITATICentro Interdipartimentale di Servizi di Spettrometria di Massa (

C.I.S.M.)

Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata (

C.I.M.M.B.A.)

Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali di Laboratorio (

Ce.S.A.L.)



COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A?COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A?

LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA

CARDIACA


Rimodellamento Elettrofisiologico e Molecolare della cellula e tessuto

cardiaco durante lo sviluppo fisiologico e durante alcune patologie cardiache

Studio di farmaci antiaritmici e delle sostanze che modulano la frequenza

cardiaca.


QUALI MODELLI?QUALI MODELLI? Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di

cuore (umano o animale) patologico;cuore (umano o animale) patologico;

Cardiomiociti in vitro:Cardiomiociti in vitro: -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di

cellule staminali embrionali cellule staminali embrionali -cardiomiociti immortalizzati;-cardiomiociti immortalizzati;

Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e della regolazione dei canali HCN, che mediano della regolazione dei canali HCN, che mediano la corrente If.la corrente If.


PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO?PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO?

ASSISTITO AD ALCUNI ESPERIMENTI DI

PATCH-CLAMP ESEGUTI CON DIVERSI SET-UP SU CARDIOMICITI DERIVATI DA CELLULE

STAMINALI EMBRIONALI, VOTLI A RACCOGLIERE DATI SU:

1. CORRENTI IONICHE;

2. POTENZIALI DI MEMBRANA;

3. POTENZIALI D’AZIONE;

4. EFFETI DI FARMACI E ALTRE SOSTANZE SU TALI GRANDEZZE.


L’iter delle cellule:

PRODOTTE IN AUSTRALLIA

DIFFERENZIATE IN SVIZZERA (GINEVRA)

FATTE INVECCHIARE E CARATTERIZZATE A FIRENZE

10.000 EURO


INVECCHIAMENTO

EARLY 15-40:

Più facile da mantenere.

LATE 50-110:

Più difficili da conservare.


EARLY:1. ICal;2. IKr;3. If sparisce;

LATE:1. Ito2. IK1;


PATCH -CLAMPPATCH -CLAMP

PRIMO PASSO: INVECCHIAMENTO

SECONDO PASSO: DIVISIONE (ENZIMA, VINCERE ELASTICITA’)

TERZO PASSO:PIASTRINE (SOSPESO ENZIMA, VETRO)

QUARTO PASSO: SOLUZIONI


INTRA (ELETTRODO):

1. FISIOLOGICA;

2. IONI DI SELZIONE;

3. EGTA.

•PH=7.2;

•PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA;

•UNICA.


EXTRA (PIASTRINA): TYRODE

1. NaCl 140 mM;2. KCl 5,4 Mm;3. MgCl2 1,2 mM;4. Glucosio;5. HEPES (Acido);

pH=7.3

Inseguito CaCl2 2mM;

DIFFERENZIATE


Set-up: insieme di tutti gli elementi che permettono di fare la misura

1. microscopio;2. amplificatore Axon;3. multi canale;4. braccio e elettrodi;5. provette con dentro le

soluzioni extra-cellulari;6. perfusore per fare

entrare le soluzioni nei vetrini;

7. Aspiratore (occhio posizionamento);

8. Aspiratore per suzione9. Rilevatore temperatura.


SEALSEAL

1. Elettrodo lontano Seal=200 MΏ;2. Elettrodo appoggiato Seal=3 MΏ;3. Suzione Seal=50 MΏ;4. Rottura Seal=80 MΏ;5. Perfusione e ulteriore suzione=100 MΏ.

Il GΏ E’ UN SOGNO!!!!!!!

•PROBLEMI DI PERFUSIONE (TROPPO, POCO…)

•TENUTA DELL’HOLDER.


PROTOCOLLO

I=V/Rseal Rseal sale I scende

PULSE 2 mV

PERFUSIONE: AIUTA LA FORMAZIONE DEL SEAL

DIFFICOLTA’: CELLULE PICCOLE E PIATTEINCUBAZIONE;

ROTTURA OVERLOAD


POSSO ANCHE CALCOLAREPOSSO ANCHE CALCOLARE

Capacità di membrana (automatico);Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana;Reisitenza di membrana; Time costantTime costant Resistenza foro (apertura protocollo)Resistenza foro (apertura protocollo) capacità foro;capacità foro;

Se c’è del leakage si elimina inserendo una Se c’è del leakage si elimina inserendo una resistenza in serie al seal (set-up nuovo).resistenza in serie al seal (set-up nuovo).


STUDIO DELLE CORRENTI E DEI STUDIO DELLE CORRENTI E DEI POTENZIALIPOTENZIALI

1. Perfondere con la soluzione extra adatta;

2. Applicare un protocollo;

3. Registrare;

4. Fare esperimenti con protocolli e soluzioni extra diverse (perfusione, aspirazione);

5. Ricominciare;


IfIf



ESPERIMENTOESPERIMENTO

ISOPRENALINA: ANTAGONISTA DEI RECETTORI BETA-ADRENERGICI (AUMENTA If) PER VEDERE COME VIENE MODULATA If NEL CORSO DELLA MATURAZIONE DELLE

CELLULE (CAMBIAMENTO CANALE)

REVERSIBILITA’ LAVAGGIO

ACETILCOLINA/CARBACOLO (ANALOGO STABILE):

CORRENTE DI POTASSIO, POICHE’ VENGONO ATTIVATI I RECETTORI MUSCARINICI CHE

AUMENTANO LA Gk


INaCaINaCa



REGISTRAZIONIREGISTRAZIONI



THANKS TO THANKS TO ALL THE ALL THE CC33MIGersMIGers

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