§4 基因克隆的载体系统4.1 质粒（ plasmid ）载体 大肠杆菌主要的天然质粒类型：

① F 质粒：致育因子或性因子 ② R 质粒：抗药性因子 ③ Col 质粒：产生大肠杆菌素因子

基因工程中使用的质粒载体都是在天然质粒的基础上人工改造而成的。质粒载体是重组 DNA 研究中最常用的也是最重要的基因克隆载体。

4.1.1 质粒的生物学特性

4.1.1.1 质粒 DNA 及其构型 绝大多数质粒都是环状双链 DNA 分子

质粒 DNA 的构型：

SC 构型：由 cccDNA 呈现超螺旋而形成；

OC 构型：开环 DNA （ ocDNA ）的构型；

L 构型：双链断裂而形成的线性质粒 DNA 分子。

（ 2 ） F 质粒及起接合转移：详见遗传学相关内容

4.1.1.2 质粒 DNA 的转移（ 1 ）质粒的类型 接合型质粒：能够自主转移的质粒。 非接合型质粒：不能自主转移的质粒。

4.1.1.3 质粒 DNA 的迁移作用 由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程ColE1 质粒的迁移：2 个相关基因：

bom ： ColE1 DNA

上的特异位点，是 Mob 基因产物的作 用位点；

mob ：其产物是 ColE1 质粒特有 的弥散产物—核 酸酶，作用于 bom 位点。

4.1.1.4 质粒 DNA 的复制类型 质粒拷贝数：（ 1 ）生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒 DNA 分子的数目；（ 2 ）对应于每条细菌染色体平均具有的质粒 DNA 分子数目。

严禁型质粒和松弛型质粒 严禁型质粒：低拷贝数的质粒，每个寄主细胞仅含有 1~3 拷贝； 松弛型质粒：高拷贝数的质粒：每个寄主细胞中可高 达 10~60 份

质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型之间有一定的相关性：接合型质粒由于具有较高的分子量，一般属于严禁型的；而非接合型质粒往往具有较小的分子量，一般属于松弛型质粒。

4.1.1.5 质粒的不亲和性（不相容性） 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主细胞内稳定地共存的现象。 彼此间不亲和的质粒属于同一个不亲和群；而彼此间能够共存的质粒属于不同的不亲和群。

质粒不亲和现象的图解

4.1.2 质粒 DNA 的分离和纯化 为了在基因克隆中用作载体分子，要获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。加入溶菌酶或 SDS （十二烷基硫酸钠）来裂解大肠杆菌细胞，在从细菌细胞内分离得到质粒 DNA ，然后在进一步纯化质粒 DNA ，使其没有细菌染色体 DNA 片段、RNA 、蛋白质等杂质的污染。

4.1.2.1 碱变性法 原理：在 pH12.0~12.5 范围内，线性 DNA 分子会被变性，成为线性单链分子；而质粒 cccDNA 的互补的两条链仍会紧密地结合在一起。在酸中和时，质粒 DNA 分子的两条链的复性迅速而准确，而随机断裂的线性 DNA 分子复性不会那么快速而准确，它们聚集成网状结构，在下一步的离心分离时与变性的蛋白质与 RNA 一道沉淀下来，滞留在上清液中的质粒 cccDNA 用酒精或异丙醇等试剂沉淀收集。

简要操作过程（投影）4.1.2.2 微量碱变性法

如果质粒 DNA需求量不多的情况下（或高拷贝质粒）可采用此种方法。此方法具有快速简便、经济实惠等优点，还可以同时抽提几种质粒 DNA 。方法同大量提取法相近。

4.1.2.3 氯化铯（ CsCl ）密度剃度离心法 如果实验需要高纯度、高质量的质粒 DNA ，可采用这种方法离心纯化质粒 DNA 。由于在离心管中还要加入溴化乙锭溶液，所以也叫氯化铯 -溴化乙锭密度剃度离心法。

在超速（或高速）离心状态下，氯化铯在离心管中形成密度剃度，而细菌裂解液或质粒溶液中的不同成分按其密度在氯化铯的不同密度层面分离存在，从而达到分离纯化的目的。

4.1.2.4 影响质粒 DNA 产量的因素（ 1 ）寄主菌株的遗传背景（ 2 ）质粒的拷贝数及分子大小（ 3 ）实验操作误差

4.1.3 质粒载体的构建及类型4.1.3.1 天然质粒的局限性

天然质粒在抗生素标记、限制性内切酶酶切位点、分子量、拷贝数等等很多方面不能满足基因克隆的要求，所以绝大部分质粒载体是在天然质粒的基础上根据基因工程的需要而改造而来的。

4.1.3.2 质粒载体必备的条件 1 、具有复制起点 2 、具有抗菌素抗性基因（理想情况下 2 种抗性基因） 3 、具有若干个限制酶单一识别位点 4 、具有较小的分子量和较高的拷贝数

4.1.3.3 质粒载体的选择性标记（ 1 ）负选择标记

（ 2 ）正选择体系① 丧失四环素抗性标记的正选择体系

具有四环素抗性标记的细胞对亲脂的螯合剂—萎蔫酸极其敏感，因此能够在含有萎蔫酸的培养基中生长的只能是四环素敏感的细胞，而不是四环素抗性的转化子。

将外源 DNA 片段克隆到载体的四环素抗性基因（ tetr ）内某个限制位点上，使后者发生插入失活，并使用含萎蔫酸的培养基进行正选择。这样获得的抗药性群体全都可能含有插入的外源 DNA 片段。

② 环丝氨酸富集法 环丝氨酸是氨基酸类似物，如果在细胞生长分裂过程中参入到新合成的蛋白质多肽链，则会导致细胞的死亡。因此，在含有四环素的培养基中环丝氨酸只能杀死生长的 Tetr 细胞，而对于停止生长的 Tets 细胞则无致死效应。

环丝氨酸富集法 由 tetr基因内带有插入序列的重组质粒所转化的大肠杆菌细胞，在含有氨苄青霉素的培养基初步筛选以后，经过一次环丝氨酸处理，存活的细胞中 Tets细胞所占比例得到明显的提高，再经若干次重复处理， Tets细胞的富集则可上升数倍。

4.1.3.4 质粒载体的类型⑴ 高拷贝数的质粒载体 在没有蛋白质合成的条件下仍能复制，具有低分子量、高拷贝数的特点。在基因工程中用于分离大量的高纯度的克隆基因 DNA片段。通常选用 Col1 、 Pmb1 或它们的派生质粒。

通常采用的方法是：在处于对数生长晚期的含有 Col1 一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入氯霉素或壮观霉素等蛋白质合成抑制剂，此时细菌染色体 DNA 的复制被阻断，而质粒 DNA 的复制不受什么影响，再继续培养 10~12h 后，每个细胞内的质粒拷贝数则可扩增到 1000~3000 个之多，这样就可以用较少量的大肠杆菌培养物获得大量的质粒 DNA 。

⑵ 低拷贝数的质粒载体 分子量相对高，拷贝数低。某些克隆的编码基因的产物过量而影响寄主细胞的正常代谢，在克隆这样的基因时需要用低拷贝数的质粒作为载体，使其表达水平置于严格控制之下。

有些低拷贝数质粒可与高拷贝数质粒连接成双复制子质粒，从而提高其拷贝数。

⑶ 失控的质粒载体 有些质粒载体具有温度敏感复制控制特点，在不同的温度条件下其拷贝数有显著的变化。即低拷贝数的质粒在某些温度下其复制失去了控制而表现高拷贝数质粒的特点，虽然这会导致细胞的生长受到抑制，但此时质粒 DNA 的产量得到明显的提高。

⑷ 插入失活的质粒载体 大部分情况下要克隆的外源 DNA 片段都没有选择性标记，此时用我们以前讲过的标记基因内有限制位点的质粒载体来克隆这些外源 DNA 片段，使质粒的某一选择性标记失活而选择带有外源 DNA 片段的转化子。

也可用对载体酶切末端进行修饰等方法达到同样的目的。

⑸ 正选择质粒载体 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件下进行选择，这样我们在转化之后直接就能选择出重组质粒。

举例：正选择质粒载体 pKN80

Pkn80编码一种对 Mu噬菌体非溶源性菌株具有致死效应的 kil 基因，在 pKN80 质粒的 HpaI 或 HindIII 位点插入外源 DNA ，便会使这种致死效

应失活，产生出具 有 Ampr表型的 Mu

噬菌体非溶源性的 转化子菌株。这样， 我们就直接选择出 在 HpaI 或 HindIII 位 点插入外源 DNA 的 重组体质粒之转化 子。

典型的大肠杆菌表达载体⑹ 表达性的 质粒载体

将克隆外源真核基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下，这种特殊设计构建，能使克隆在其特定位点上的外源真核基因的编码序列在大肠杆菌细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的克隆载体称为表达载体。

4.1.4 重要的大肠杆菌质粒载体

4.1.4.1 pSC101

pSC101 是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体。 平均每个寄主细胞仅有1~2 份拷贝，分子量为 9.09Kb ，编码有一个四环素抗性基因（ tetr ）。 该质粒具有 EcoRI 等 7中限制性内切酶的单一切割位点，其中 HindIII 、 BamHI 和 SalI 等 3 个位点克隆外源 DNA 时，都会导致 tetr 基因的失活。

pSC101应用实例1 ：

金黄色葡萄球菌的Ampr 基因插入 pSC101

质粒

pSC101 应用实例 2 ： 应用 pSC101 质粒作载体在大肠杆菌细胞中 克隆非洲爪蟾的 rDNA 基因片段

4.1.4.2 pBR322

pBR322 质粒由 3 个不同来源的部分组成：第一部分来源于 pSF2124 质粒易位与 Tn3 的氨苄青霉素抗性基因（ ampr ）；第二部分来源于 pSC101 质粒的四环素抗性基因（ tetr ）；第三部分来源于 CoLEI 的派生质粒 pMB1 的 DNA 复制起点。

pBR322 质粒的优点：

⑴ 分子量较小： 4363bp ，易于自身 DNA 的纯化，可克隆达 6kb 的外源 DNA 。

⑵ 具有两种抗生素抗性基因（ ampr 和 tetr ）可供作转化子的选择性标记，

⑶ 具有多达 24 种限制性内切酶的单一切割位点，其中， BamHI 等 9 种限制性内切酶的切割位点在位于 tetr 基因

的内部或启动子区域，另外在 ampr 基因内部还有 PstI 等 3 个限制性内切酶的切割位点，这些位点上克隆外源 DNA 时都会导致抗性基因的插入失活，从而为转化子的选择提供了很大的方便。

pBR322 质粒载体 tetr 基因的插入失活

4.1.4.3 pUC 质粒载体 pUC 质粒载体是在 pBR322 的基础上，使用多克隆位点（ MCS ）技术，组入了一个在其 5′-端带有一段 MCS 位点的lacZ′ 基因，从而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

⑴ pUC 质粒载体的结构：有以下 4 个组成部分

① 来自 pBR322 的复制起点；

② 无限制位点的氨苄青霉素抗性基因（ ampr ）；

③ 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码 α-肽链的 DNA序列，此结构特称为 lacZ′ 基因；

④ 位于 lacZ′ 基因中的靠近 5′-端的一段 MCS 位点（并不 破坏 lacZ′ 基因的功能）

pUC18 及 pUC19 质粒载体的多克隆位点（ MCS ）

pUC 质粒载体的优点

① 分子量小拷贝数高，分子量只有 2.7kb左右，而拷贝数未经 氯霉素扩增即可高达 500~700 个 / 细胞；

② 适用于组织化学方法检测重组体。由于有 lacZ′ 基因，所编码的 α-肽链可参与 α 互补，因而可用 X-gal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。

③ 具有多克隆位点 MCS区段，而且与 M13mp8噬菌体的 MCS

相同。因此在 MCS 上克隆的外源 DNA 片段可以方便地转移 到 M13mp8 载体上进行测序。同时，由于有不同限制位点， 还可以把具有不同粘性末端的外源 DNA 片段直接克隆到 pUC 质粒载体上。

4.1.4.4 其它重要质粒载体（ 1 ）丧失迁移功能的质粒载体—— pBR327

pBR327 是从 pBR322 改建而来，比 pBR322缺失了一条 1.09kb 的 DNA 片段，导致在复制和结合能力方面发生了改变，但氨苄青霉素抗性和四环素抗性的基因保持完整。

pBR327 有如下 2 个 主要特点：

① 拥有较高的拷贝数， 平均每个大肠杆菌 寄主细胞可达 30~

45 份；② 由于失去了 bom 位点，

不能提高结合而转移， 具有更高的安全系数。

（ 2 ）能在体外转录克隆基因的质粒载体—— pGEM-3Z

pGEM-3Z 由 pUC 系列质粒载体派生而来，是与 pUC 系列十分类似的小分子质粒载体。有一个氨苄青霉素抗性基因和一个 lacZ′ 基因，后面插入了一段含有 EcoRI 等 13 个限制性内切酶识别位点的多克隆位点（ MCS ）。

pGEM-3Z 与 pUC 系列质粒载体的主要区别在于它具有2 个来自噬菌体的启动子—— T7启动子和 SP6启动子，分别位于 MCS 位点两侧，取向相反。它们为 T7 或 SP6 的 RNA 聚合酶提供了特意性的识别位点。

pGEM-3Z 和 pGEM-3Z 的差别在于 T7启动子和 SP6启动子的位置互换，取向相反。

这样的载体还有 pSP64 和 Psp65 质粒载体，也是由 pUC系列质粒载体派生而来。这些载体都可以在体外转录体系中进行转录和翻译克隆的外源基因。

pGEM-3Z ／ pGEM-3Z

质粒载体及 其克隆位点 序列图

pSP64 和 Psp65 质粒载体：含有噬菌体 SP6 的启动子，两者之间的差别在于 MCS 位点取向彼此相反

（ 3 ）穿梭质粒载体 所谓的穿梭质粒载体是指一类人工构建的，具有两种不同复制

起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

以大肠杆菌细胞为寄主进行基因操作具有技术成熟、方便实用等很多优点，而在其它的原核生物或真核生物细胞中进行直接的基因操作总是有很多麻烦的问题有待解决。所以，构建能够穿梭于大肠杆菌与其它生物细胞之间的载体就能解决这些难题了。

常见的穿梭质粒载体有大肠杆菌 -枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌 -酿酒酵母穿梭质粒载体等，应用这样的载体，可以很方便地在大肠杆菌细胞中进行重组 DNA操作和增殖，然后在返回到枯草芽孢杆菌或酿酒酵母中进行研究。

现在也有大肠杆菌和动物细胞之间的穿梭质粒载体，如利用大肠杆菌和牛乳头瘤病毒构建的 pBPV-BV1 。成功克隆到人 β-干扰素基因，并在多种动物细胞中得到表达。

举例说明—大肠杆菌 - 酿酒 酵母穿梭质粒载体

含有两种分别来自大肠杆菌 和酿酒酵母的复制起点和选 择标记，另有一个多克隆位 点。

（ a ）转化 Amps 大肠杆菌细胞； （ b ）转化 LEU －酿酒酵母细胞； （ c ）质粒在两种细胞之间穿梭； （ d ）涂布在含氨苄青霉素的平 板上选择 Ampr 大肠杆菌转 化子； （ e ）涂布在无亮氨酸的平板上 选择 leu －酿酒酵母转化子。

4.2 噬菌体载体和柯斯载体4.2.1 λ 噬菌体载体 λ 噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌噬菌体，它与大肠杆菌一样，是同现代分子生物学及分子遗传学的创立和发展过程密切相关的。

λ 噬菌体的分子量为 31×106dal ，基因组 DNA 分子的长度为 48.502kb ，已经定位的 λ 噬菌体的基因至少有 61 个，其中有一半左右参与噬菌体生命周期的活动——称之为 λ 噬菌体的必要基因；另一部分基因可以被外源基因或 DNA取代而并不影响噬菌体的生命功能——称之为非必要基因；在 λ 噬菌体线性双链 DNA 分子的末端，各有一条由 12 个核苷酸组成的彼此完全互补 的 5′ 单链突出序列——称之为粘性末端。感染大肠杆菌后， λ 噬菌体会迅速以粘性末端之间的互补作用而形成双链环状 DNA 分子，这个由粘性末端结合形成的双链区称为 cos 位点。

4.2.1.1 λ 噬菌体载体的 构建及其主要类型

（ 1 ）构建 λ 噬菌体载体 的基本原理

由于野生型 λ 噬菌 体 DNA序列中常用的限 制性内切酶位点过多， 所以，首先消去多余的 限制位点和切除非必要 区段。

λ 噬菌体 DNA 限 制位点示意图

（ 2 ） λ 噬菌体载体的主要类型A 插入型载体

具有外源 DNA插入克隆位点，并有插入失活效应，克隆的 DNA 片段长度在 10kb以内，广泛应用与 cDNA 或小片段 DNA 的克隆。根据其插入失活效应的特异性，可分为以下两种亚型：

免疫功能失活的插入型载体：这类载体的免疫区内带有一两种限制性内切酶单切位点，当外源 DNA 片段插入后其免疫性遭受破坏，不能进入溶源周期而形成清晰的噬菌斑；而没有外源 DNA插入的亲本噬菌体会形成浑浊的噬菌斑，为分离重组体分子提供了方便。

β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：许多 λ 噬菌体载体基因组中含有一段大肠杆菌的 lac5区段，其中有 lacZ 基因，插入位点在 lac5区段内，当外源 DNA 片段插入后，其 β-半乳糖苷酶基因失活。用这种载体感染大肠杆菌 lac －指示菌，涂布在含有 IPTG 和 Xgal 的培养基平板上，就会形成只能形成白色菌落。而由未插入外源 DNA 片段的载体感染大肠杆菌 lac －指示菌，涂布在含有 IPTG 和 Xgal 的培养基平板上，就会形成蓝色菌落。

B 替换型载体 这种载体的中央部分有一个可以被外源 DNA 片段所取代的 DNA 片段，可取代部分两侧的多克隆位点是反向重复序列。当外源 DNA 片段插入时，一对克隆位点之间的 DNA 片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源 DNA 片段的能力。替换型载体可承受 15kb外源 DNA 片段的有效克隆能力。

（ 3 ） Charen 噬菌体载体 Charen噬菌体（ charen bacteriophage ）载体是 λ 噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。许多 Charen噬菌体载体都带有 β-半乳糖苷酶基因以及它的操纵区和启动子的 lac5取代片段，从而在感染大肠杆菌 lac －指示菌后产生不同颜色的菌落而识别重组体或非重组体。

Charen噬菌体载体中既有插入型载体，也有替换型载体。

Charen噬菌体载体克隆外源 DNA 片段的一般程序

首先，分离线性载体 DNA ，限制酶切消化，分离片段取两臂；其次，将分离得到的两条载体臂段与经相同限制酶消化的外源 DNA 片段混合，加入连接酶连接；第三，将连接物与包装蛋白混合温育，使之包装成具有感染能力的噬菌体颗粒；最后把包装产物涂布在敏感细菌平面上进行组织化学检测。

4.2.1.2 λ 重组体 DNA 分子的体外包装（ 1 ） λ 重组体 DNA 分子的转染作用 转染（ transfection ） : 由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA 的过程。

在用 λ 噬菌体载体进行转染时，由于转染效率低下。重组体分子转染效率只要 103~104 （每微克 λDNA 转染产生的噬菌斑数目），不能满足基因转移的要求，所以一般采用体外包装的方法加以解决。

（ 2 ） λ DNA 的体外包装 所谓 λ DNA 的体外包装，就是指在体外试管中完成发生与寄主细胞内的包装过程。

（ 3 ） λ 噬菌体 DNA 的包装限制

λ 噬菌体头部外壳蛋白容纳 DNA 的能力是有一定限度的：上限不得超过正常野生型 λ DNA总量的 5% ；而低限有不得少于野生型 λ DNA总量的 75% 。也就是说， λ 噬菌体头部外壳蛋白的包装范围控制在野生型 λ DNA 长度的 75%~105% 之间。

λ 噬菌体 DNA 长度为 48.502kb ，其中，编码必要基因的区段占 28kb ，如果说包装上限为 51kb ， 那么， λ 噬菌体载体克隆外源 DNA 片段的理论极限值是 23kb 。而在实际应用中，克隆的有效长度只有 15kb 。

4.2.1.3 λ 重组体的选择方法

（ 1 ） cI 基因功能选择法 cI 基因失活会寄主细胞无法溶源化，形成清亮型噬菌斑。

而非重组体分子具有溶源化效应，形成浑浊的菌落。

（ 2 ） lacZ 基因功能选择法 以前讲过的组织化学检测法。

（ 3 ） sPi －选择法 λ 噬菌体的 red 和 gam 基因的编码产物抑制噬菌体在

P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中正常生长，而这 2 个基因的突变型或缺失体噬菌体可在 P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中正常生长

4.2.2 柯斯质粒载体4.2.2.1 柯斯质粒载体的构建 柯斯质粒载体， cosmid （ cos site-carrying plasmid ）的原意是带有粘性末端（ cos ）的质粒，是人工构建的含有 λ 噬菌体的 cos序列和质粒复制子的特殊质粒载体。

构建这种载体的主要目的是提高质粒载体的克隆大片段外源 DNA 的容量，使其更适合应用于真核基因的克隆。

柯斯质粒载体的构建以 pHC79 为例：

用 λ 噬菌体基因组的 cro-rII 的 Bgl II限制片段取代 pBR322 质粒 DNA 的位于 1459~1666bp 之间的 Sau3A 片断，产生出具有 Bgl II 单切位点的重组体分子。

通过产生的 Bgl II 单切位点将带有 cos序列，长度为 1.78kb 的 λ DNA 之 Bgl II 片段插入进去，得到了柯斯质粒 pHC79 。

pHC79 的 cos 位点两侧还具有与 λ 噬菌体包装有关的 DNA

短序列，而质粒 DNA

部分则是一个完整的复制子，编码着一个复制起点和两个抗菌素抗性基因 ampr 和tetr 。

pHC79兼备了 λ

噬菌体载体和pBR322 质粒载体两方面的优点，其克隆能力为 31~45kb 。

4.2.2.2 柯斯质粒载体的特点（ 1 ）具有 λ 噬菌体的特性：柯斯质粒载体克隆了合适长度的外源 DNA 片段，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以高效率地转导对 λ 噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进入寄主细胞后便通过 cos序列环化起来。但由于缺失了 λ 噬菌体部分必要基因，因此并不能通过溶菌周期形成子代噬菌体颗粒。

（ 2 ）具有质粒载体的特性：由于有了质粒复制子，柯斯质粒载体能够在寄主细胞内像质粒一样进行复制，而且还可以通过氯霉素来扩增。柯斯质粒载体还可以通过抗菌素抗性及其插入失活特点来进行重组体的选择。

（ 3 ）具有高容量的克隆能力：柯斯质粒载体只有复制子、选择标记和 cos序列等必要序列，其本身的分子量较小，长度一般只有 5~7kb ，克隆容量可达 45kb左右。由于存在包装限制，柯斯质粒载体适合克隆大片段 DNA 的克隆。

（ 4 ）具有与同源序列的质粒进行重组整合的能力：在与具有同源序列的质粒载体共存与同一个寄主细胞时，可通过同源部分形成共和体分子。

4.2.2.3 柯斯克隆

柯斯克隆（ cosmid cloning ） :应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组 DNA 技术。

先用限制性内切酶局部消化真核生物的 DNA ，产生出来大分子量外源 DNA 片段，与经同样的限制酶酶切的柯斯质粒线性 DNA 分子进行体外连接反应。这样产生的连接物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个取向一样的 cos 位点的长度约为 40kb 的外源 DNA 片段。

然后加入 λ 噬菌体包装连接物，其中的一种 cos 位点特异的切割体系——末端酶（ terminase ， Ter ），识别两个相距适宜的 cos 位点，将多连体分子切割成λ 单位长度的片段，将其包装到λ 噬菌体头部。

这样产生的“λ 噬菌体”可以感染大肠杆菌，包装在头部内的真核 DNA-cos 杂种分子便通过 cos 位点环化起来。并按着质粒分子的方式在大肠杆菌细胞内进行复制和表达其抗药性标记。

柯斯克隆示意图

4.2.3 单链噬菌体载体 M13 、 f1 和 fd 等是一类亲缘关系密切的丝状大肠杆菌噬菌体，都含有长度为 6.4kb 、彼此具有高度同源性的单链环状 DNA分子。 单链 DNA 噬菌体载体有别于其它载体的的优越性是：

① 复制以双链环状 DNA （ replication form DNA ， RF DNA ， 复制性 DNA ）为中间媒介，可以象质粒 DNA 一样在体外进 行纯化和操作。

② 无论是 RF DNA 还是 ssDNA ，都能感染感受态的大肠杆菌寄 主，而且根据实验方法的不同，可形成噬菌斑或菌落。

③ 单链 DNA 噬菌体颗粒的大小取决于 DNA 的多寡，并不存在包装 限制。有成功包装总长度为 M13 6 倍的 DNA 分子的报道。

④ 应用单链 DNA 噬菌体，很容易地测定出外源 DNA 片段的插入向。

⑤ 可产生大量纯化的含外源 DNA 片段插入的单链 DNA 分子。可进 行双脱氧测序，也可用于标记探针，还可用于寡核苷酸定点突变。

4.2.3.1 M13 噬菌体及 M13 克隆体系（ 1 ） M13 噬菌体概述

M13 噬菌体颗粒的 外形呈丝状 , 大小范围为 900nm×9nm ，颗粒中 包装的只是（ + ）链的 DNA ，也称为感染性的 单链。

M13 是雄性大肠杆菌特有的噬菌体，只能感染带有 F 性须的大肠杆菌菌株。不过 M13 噬菌体DNA亦可以通过转染作用导入雌性大肠杆菌细胞。

M13 噬菌体首先吸附在 F 性须的末端；在基因 III编码的向导蛋白作用下，其 ssDNA 基因组通过 F 性须进入大肠杆菌细胞内； M13 的 ssDNA便在基因 II

编码的蛋白质的作用下，形成RF DNA ；此种 DNA指导合成子代M13 单链基因组；这些单链的 M13 DNA 随之被包装成噬菌体颗粒，并挤压出寄主细胞。

M13 单链 DNA 噬菌体的生命周期

M13 噬菌体在感染的大肠杆菌 细胞中的复制

（ a ）感染性的单链环状（ + ） DNA 在寄主 酶的作用下转变成双链的 RF DNA ；（ b ） RF DNA 按 θ 形式进行若干复制循环；（ c ） RF DNA 的负链转录成 M13 的 mRNA ；（ d ） M13 基因 II 编码的蛋白质在 RF DNA

正链的特定位点切割形成切口； M13 基因组的扩增正式开始（ e ）利用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I ，复制叉 沿负链移动，不断合成正链；（ f ） M13 基因 II 编码的蛋白质切下完整的 子代正链，并进行环化；（ g ）继续合成子代正链。

M13噬菌体颗粒在感染的大肠杆菌细胞中的复制过程

M13 噬菌体的复制过程中， RF DNA 快速增殖到每个细胞含量达 200 个拷贝时，由于细胞内累计了足够数量的由噬菌体基因 V编码的单链特异的 DNA 结合蛋白质， RF DNA 的复制就变成了不对称的形式。这是因为这种蛋白质与正链 DNA 结合，阻断了其互补链——负链的合成，继续进行的只是正链的不断合成。

合成出来的正链与基因 V的编码产物形成特异的 DNA- 蛋白质复合物，然后转移到寄主的细胞膜，同时基因 V蛋白质脱落，正链DNA 从寄主细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白质包裹成噬菌体颗粒的。正因为这样， M13 噬菌体不存在严格的包装限制问题， M13 噬菌体载体也就有了较大的克隆能力。

M13 噬菌体虽然不会导致寄主细胞发生溶菌效应，但被感染的寄主细胞的生长和分裂会受到影响，其速度仅为正常细胞的 1/2~3/4 。每个寄主细胞每个时代可释放出 1000 个左右的子代噬菌体颗粒。

由于 RF DNA 在寄主细胞中以高拷贝数的形式存在，所以很容易纯化出来供作基因克隆载体使用。同时，由于培养物中存在大量的噬菌体，也很容易分离到 M13 噬菌体颗粒，有利于制备大量的单链模板 DNA 。

（ 2 ） M13 克隆体系 ① β- 半乳糖苷酶显色反应原理

用于基因克隆的 M13 载体或大肠杆菌寄主，都不能单独产生β-半乳糖苷酶，只有将两者结合在一起时才能形成有功能的 β-半乳糖苷酶。而且这种酶的活性还可以用 Xgel （ X-gel ）显色反应测定出来，是一种组织化学测试技术：

β- 半乳糖苷酶可以将无色的化合物 Xgel （ 5- 溴 -4- 氯 -3-吲哚 -β-D- 半乳糖苷）切割成半乳糖和兰色的底物 5-溴 -4-氯 -靛蓝。

顺反子内互补作用：编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生一种有功能的蛋白质多肽的生化过程。需要说明的是，这种互补作用并不是普遍存在的。

通过 DNA重组技术，构建了只含有 β-半乳糖苷酶基因一小部分序列的 M13派生载体。这段序列只编码 β-半乳糖苷酶的氨基末端，即 α-肽链，可通过顺反子内互补作用检测其活性。

举例： lac缺失突变 lacZ （△M15 ），简称M15 基因，合成的是一种缺失了 11~41氨基酸的缺陷性 β-半乳糖苷酶，失去了四聚化作用的功能，又称M15 多肽。它的功能可以由体外加入的 β-半乳糖苷酶的溴化氰片段（ 2~92氨基酸）来恢复。这里，溴化氰片段是 α-给体， M15 多肽是 α-受体，这种功能补偿现象叫做 α-互补作用。

用一种特定的 β-半乳糖苷酶基因的 HindII 片段编码的多肽替代溴化氰片段同样能发生 α- 互补作用。在 M13 克隆体系中， lacHindII 片段位于 M13 噬菌体载体分子上，而大肠杆菌寄主细胞的 F 质粒则带有 M15突变。

M13 载体所携带的 lacHindII 片段上具有 lac操纵子的操纵区和启动子，所以被感染的细胞中， β-半乳糖苷酶的合成将是组成型的。因为 200 个左右的 RF DNA 的存在使普通 lac+ 的阻遏状态（每个细胞只要 10 个左右的阻遏物分子）被消除。

为了克服这种组成性，可以将 lac阻遏基因的 Iq突变引入寄主细胞，产生出十余倍超量的阻遏物分子，去补偿大量的M13 RF DNA 分子。在 lac Iq 突变基因的寄主细胞中，给 lac操纵子加入诱导物 IPTG （异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷）就可以激活 lacHindII 片段的转录表达。

IPTG 是一种乳糖类似物，在不存在底物乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成 β-半乳糖苷酶。所以我们称其为 β-半乳糖苷酶的安慰诱导物。在细菌固体培养基平板上加入 IPTG即可起到诱导作用。

通常在 M13 克隆体系中使用的大肠杆菌菌株是 JM101 ，其 lacZ 基因被缺失掉了，但在其 F 质粒上有一个 M15 基因和 lac Iq 突变基因，可以产生超量的 lac阻遏物，这就使 lac操纵子的表达置于从培养基中渗入的 IPTG 的调节控制之下。

IPTG 分子结构式

② M13 载体系列的发展 与 λ噬菌体不同的是， M13

噬菌体并不存在明显的非必要区段，但在其基因 II 和 IV 之间有一个长度为 507 个核苷酸的唯一基因间区段（第 5498至 6005 核苷酸），该序列上存在着M13 DN

A 的复制起点，就噬菌体的发育功能而言，并不需要该区段的完整性，可以在此插入外源 DNA 。由此发展出了 M13 克隆载体系列。

M13 载体系列命名为 mpn ， 其中 n代表整数，如M13mp8 、 M13mp9 等。

M13 载体系列的系谱图

NMU ：亚硝基 -N-甲基尿烷

lacHindII 片段 =lacZOPI ：包括lacI′、 lac启动子（ P ）和lac 操纵子（ O ）以及 lacZ′.lacZ ′:头 145 个氨基酸密码子

lac HindII 片段的克隆步骤： 首先用限制酶 BsuI局部消化 M13 RF DNA （共有 10 个识别位点），并通过凝胶电泳分离出全长的单体分子，然后再同大肠杆菌的 lac HindII 片段作平末端连接。由此产生的重组 DNA 分子中， 只有 lac HindII 片段插入到基因间非必要区段（此区段有一个 BsuI识别位点）内的才有存活的能力。同时，也可以通过插入失活 lac HindII 片段等方法对外源 DNA片段的克隆进行选择。

在 lac HindII 片段上，只有 AvaII 、 Bgl II 、 PvuI三种限制酶单一识别位点，还有 PvuII限制酶三个识别位点，而基因克隆中常用 EcoRI 、 HindIII 等一些酶都不存在相应的识别位点。为了弥补这个不足， 1978年， B.Gronenborn 和 J.Messing将一个 EcoRI限制位点导入 M13mp1 载体的 lac HindII片段上，得到了 M13mp2 载体

通过对M13mp1 载体的甲基化而获得M13mp2 载体过程：

M13mp1 载体的第 5

个氨基酸密码子附近的序列为 GGATT

C ，对其第 2 个核苷酸 G 进行甲基化就成为限制酶 EcoRI 的限制位点。

从M13mp2 载体到M13mp7 载体的过程

原则：将必要区段内相应的限制酶识别位点消除，在非必要

区段内增加常用限制酶识别位点。

若干种M13 噬菌体载体的多克隆位点

③ M13 载体系列的优点

第一、这类载体的基因组中有 lac操纵子的 β-半乳糖苷酶基因片段（ HindII 片段）其中插入了一段密集的多克隆位点的序列。

第二、由于 M13 载体是应用基因工程技术成对构建的，可以有效地克隆外源双链 DNA 分子中的每一条链。其中，可根据外源 DNA 的插入取向或双酶切定向插入的方法克隆并分析每一条 DNA 链。

外源 DNA 片段在 M13 噬菌体载体 上的定向克隆

一对M13 噬菌体载体（ M13mp10/M13mp11 ） 分子结构图

都带有一段限制位点 相同而取向相反的多 克隆位点序列

（ 3 ）噬菌体展示载体（ phage display vectors ）

象 M13这样的单链 DNA噬菌体颗粒的表面存在着 3~5个拷贝的基因 III编码的蛋白质。这类蛋白质对于噬菌体颗粒的正确组装以及对大肠杆菌性须的吸附过程起到重要的作用。

基于这种事实， G.P.Smith 于 1985年建立了一种专门在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的所谓噬菌体展示技术——噬菌体展示技术（ phage display ）。后又构建了一类特殊用途的噬菌体展示载体。

当外源 DNA 片段被插入在噬菌体展示载体的基因 III编码序列中，在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生出由克隆基因与基因 III联合编码的融合蛋白质。

应用噬菌体展示随机多肽基本原理

应用噬菌体展示载体 分离 hGH 变体的示意图

（ a）随机突变的 hGH cDNA 文库与噬 菌体展示载体作体外连接；

（ b）转化大肠杆菌细胞；

（ c）制备的噬菌体过 hGH 受体层析柱；

（ d）洗脱结合的 hGH- 噬菌体；

（ e）克隆个别的噬菌体；

（ f）分离噬菌体；

4.2.4 噬菌粒载体

4.2.4.1 噬菌粒载体的概念

虽然 M13噬菌体载体可方便地用来制备克隆基因的单链DNA ，但也有以下方面的缺点和不足：

（ 1 ）插入外源 DNA 片段以后，其遗传稳定性会显著地下降； （ 2 ）外源 DNA 片段总是按一种主要的取向插入； （ 3 ）克隆外源 DNA 的实际能力一般情况下最大仅为 1.5kb 。

为了解决这个问题，科学工作者已经发展出了一类由质 粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为 噬菌粒载体（ phagemid 或 phasmid ）。

4.2.4.2 噬菌粒载体一般特性 （ 1 ）分子量比M13 载体小，约为 3kb ，易于体外操作，可得到长

达 10kb 的外源 DNA 的单链序列； （ 2 ）具有质粒和噬菌体双复制起点，在大肠杆菌细胞内按正常的

双 链质粒 DNA 分子形式复制，形成的双链 DNA既稳定又高产； 而同时存在辅助噬菌体的情况时，在噬菌体基因 II 蛋白质的影 响下，又可如同 M13 载体一样按滚环模型复制产生单链 DNA ， 并在包装成噬菌体颗粒之后被挤压出寄主细胞。 （ 3 ）可直接进行克隆 DNA 片段的序列测定。

4.2.4.3 pUC118 和 pUC119 噬菌粒载体 pUC118 和 pUC119 是一对由 pUC18 和 pUC19 质粒与野生型 M13噬菌体的基因间隔区（ IG ）重组而成的噬菌粒载体。

IG 的长度为 476bp ，含有 M13 噬菌体的复制起点，是插入到 pUC18

和 pUC19 质粒的 NdeI 位点上。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反以外，两者的分子结构完全相同。

pUC118 和 pUC119 的多克隆位点

pUC118 多克隆位点

pUC119 多克隆位点

pUC118和

pUC119噬菌粒载体的两种复制模型

辅助噬菌体 辅助噬菌体是一类自身 DNA 复制效率极低的突变体，但

它们可以为寄主细胞中的相关载体的复制与包装提供所需的蛋白酶和外壳蛋白质。

最常见的辅助噬菌体是M13 的一种派生噬菌体，叫做M13K07 。它是通过在野生型M13 的基因间隔区（ IG ）的唯一识别位点 AvaI 上插入了一个已经发生了突变的来自M13m

pI 的噬菌体复制起点、一个来自 p15A 的质粒复制起点和一个来自 Tn903 的卡那霉素抗性基因等三个组分发展而成的。

M13K07 （ 8.7kb ）

当寄主细胞内不存在pUC118 和 pUC119时，

低效率复制产生出足够数量的M13K07噬菌体保证自身的遗传稳定性

pUC118或 pUC119噬菌粒载体的优点：（ 1）具有小分子量的 cccDNA，可克隆长达 10kb的外源 DNA

片段， 并易于进行体外分离和操作；（ 2）具有 ampr基因作为选择标记，便于选择转化子；（ 3）高拷贝，每个寄主细胞可多达 500个，便于制备大量的载 体 DNA；（ 4）存在多克隆位点，便于直接克隆不同类型的外源 DNA片段， 同时，多克隆位点在 lacZ基因的 5′-编码区，故可按照 Xgal-IPTG组织化学显色反应实验来筛选重组体分子；（ 5）具有质粒和噬菌体双复制起点，可根据需要来选择其复制 方式；（ 6） pUC118或 pUC119的MCS序列取向相反，所以其中一个

可用 来转录克隆基因的正链 DNA，另一个则可转录负链 DNA。（ 7）可以直接进行克隆 DNA片段的序列测定。

pUC118/pUC119噬菌粒 载体的克隆程序

（ 1）对外源 DNA片段和 载体分子进行限制 酶酶切消化，并进 行体外连接；（ 2）转化具有 lacZ△15 的大肠杆菌 Amps表 型菌株；（ 3）涂布在含有 Xgal- IPTG和氨苄青霉素 的培养基表面，选 择兰色菌落。