401.биохимический и ультраструктурный анализ аппарата подвижности бактерий и архей

<£~3{Ш

На правах рукописи

МЕТЛИНА

АНТОНИНА ЛЕОНИДОВНА

БИОХИМИЧЕСКИЙ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ

АППАРАТА ПОДВИЖНОСТИ БАКТЕРИЙ И АРХЕЙ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2003

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологин им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Наталья Борисовна Ливанова

доктор биологических наук, профессор Юрий Сергеевич Ченцов

доктор биологических наук Софья Юрьевна Хайтлина

Ведущая организация - Институт микробиологии РАН

Зашита состоится в 10°°час на заседании диссертационного

совета (Д 002.247.01) в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (119071

Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 2, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической

литературы РАН (119071 Москва Ленинский проспект, 33, корпус 1)

Автореферат разослан £ 2003 года %ЧиалЛ.

Ученый секретарь диссертационного совета, г~~л//^^* доктор биологических наук, профессор ^ - ^ / " Т А . Валуева

-%


I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Формы проявления биологической подвижности чрезвычайно разнообразны, однако, в основе их лежит всего несколько молекулярных механизмов. Так, молекулярный механизм подвижности всех эукариотических клеток основан на взаимодействии двух белков, сопровождаемом гидролизом нуклеозидтрифосфата, химическая энергия которого при этом трансформируется в механическую энергию движения. Это актомиозиновая система подвижности, динеин-тубулиновая система в жгутиках простейших, а также различного рода системы внутриклеточного транспорта, основанного на взаимодействии белков-моторов, обладающих АТФазной активностью (кинезин, динеин, миозиноподобные белки), и структурных белков (тубулин, актиноподобные белки). Существует большое количество дополнительных белков, участвующих в этих процессах, но принцип молекулярного механизма функционирования данных двигательных систем одинаков.

Совершенно иной молекулярный механизм лежит в основе движения бактериальной клетки. Способность бактерий к быстрому и направленному перемещению в среде обусловлена наличием у этих организмов специального органа движения — бактериального жгутика, структуру и функционирование которого кодирует около 50 генов. Бактериальный жгутик имеет дискретную структуру, состоящую из базального тела, расположенного в толще клеточной стенки, длинной наружной белковой нити и гибкого сочленения, так называемого «крюка», соединяющего эти две части. Расположенное в толще клеточной стенки базальное тело, вращаясь, приводит в движение наружную полужесткую спиральную белковую нить, обеспечивающую генерацию гидродинамической силы, которая направленно толкает клетку. Длительное время в составе бактериального жгутика искали АТФазу, но не обнаружили ее. Только в конце 70-х годов уже прошлого столетия выяснилось, что базальное тело бактериального жгутика представляет собой миниатюрный электромотор, благодаря которому клетка способна развивать скорость до 60-80 мкм/сек. Энергетика этого процесса оказалась уникальной для систем биологической подвижности - трансмембранный потенциал ионов водорода (или натрия) на мембране (Larsen et a]., 1974; Белякова и др., 1976; Manson et al., 1977; Glagolev & Skulachev, 1978).

Очевидно, что система бактериальной подвижности кардинально отличается от других двигательных систем, однако структура, белковый состав и механизм функционирования этого аппарата движения [долгое время были практически неизвестны. ' w ••• "••-'*'*"

т"былй"


Особого внимания заслуживает белок наружной спиральной нити бактериального жгутика - флагеллин. Свойства флагеллина в составе нити таковы, что позволяют белковой надспирали жгутика принимать разные формы (нить жгутика имеет форму полужесткой спирали типа винта), тем самым обеспечивая возможность клетке менять направление движения. Кроме того, нить бактериального жгутика обладает способностью к самосборке. Поскольку флагеллиновая нить бактериального жгутика является наиболее просто организованной структурой, она служит удобной моделью для изучения явления сборки биологических систем в целом.

Жгутик как система подвижности прокариот длительное время изучался только на представителях эубактерий. Вся имеющаяся информация о его структуре и свойствах получена, в основном, на Salmonella typhimurium и Esherichia coli. Однако, грамположительные бактерии, монотрихи и лофотрихи имеют свои особенности структуры их систем подвижности. И уж совсем немного известно о жгутиках архебактерии, которые, внешне не отличаясь от бактериальных жгутиков, представляют собой особую форму подвижности прокариот.

Известно, что в группу микроорганизмов - архебактерии, подвижность которых осуществляется жгутиками, входят метаногены, экстремальные галофилы, различные серозависимые, термофильные и гипертермофильные организмы. Анализ нуклеотидных последовательностей и состава 16s pPHK этих организмов явился основанием для выделения архебактерии в отдельное царство Archaea наряду с еще двумя царствами (или надцарствами, или доменами) — Bacteria и Eucarya (Woese & Fox, 1977; Woese et al., 1990). Это событие инициировало интерес научного мира и к системе подвижности этих прокариот, внешне не отличающейся от бактериального жгутика, но принадлежащей организмам отдельного царства.

Особенностью прокариотического жгутика является то, что его наружная нить, составляющая основную массу жгутика, сама по себе двигательной активностью не обладает и приводится во вращение закрепленным в клетке мотором - базальным телом. Эта часть жгутика не только приводит во вращение длинную белковую нить, но и является одним из звеньев цепи передачи информации из внешней среды в клетку (различного рода таксисы). Поэтому структура базального тела жгутикового аппарата как части биосенсорной системы данных микроорганизмов представляет особый интерес, но именно эта часть наименее изучена как у бактерий, так и у архей.

2


Структурно и функционально жгутик бактерий как органелла подвижности организмов, находящихся на низшем уровне развития, отличается от других систем подвижности, однако, возникает вопрос, а имеются ли какие-либо общие свойства у белков двигательных систем прокариот и более высокоразвитых организмов. Нить бактериального жгутика отдаленно напоминает Ф-актин, один из основных компонентов актомиозиновой системы, присутствующей, по-видимому, во всех типах клеток, в том числе и в бактериальной. Имеется ли нечто общее в природе белков эволюционно удаленных друг от друга двигательных систем ?

Следует добавить, что информация о структуре и свойствах бактериального жгутика имеет и практическое значение. Известно, что бактериальный жгутик является фактором вирулентности патогенных бактерий. Последнее время проводятся активные исследования в этом направлении, в частности, для растений. Например, показано, что растения, не имея той иммунной системы, которая имеется у позвоночных, тем не менее, имеют чувствительную рецепторную систему, взаимодействующую с участком высококонсервативного домена на N-концах молекулы флагеллина. Этот небольшой участок из 15-22 аминокислот действует как «извлекатель защитного ответа» растительных клеток (Felix et al., 1999; Gomez-Gomez et al., 1999). Известны также многочисленные работы последнего времени о роли жгутиковой подвижности бактерий в образовании микробных биопленок, понимание образования которых имеет индустриальное и экологическое приложения (Costerton et al., 1995; Pratt & Kolter, 1998; O'Toole & Kolter R., 1998). Имеются также сведения о разработках по использованию жгутикового мотора бактерий в медицинских нанотехнологиях.

Цель и задачи работы. Настоящая работа посвящена изучению структуры и свойств жгутиков бактерий и архей как аппарата подвижности прокариот. Цель работы состояла в изучении свойств и механизма сборки флагеллиновой нити бактериального жгутика, изучении структуры его базальной части и сравнении ее с внутриклеточной базальной областью жгутиков архей.

В задачи исследования входило: 1. Изучить физико-химические свойства флагеллина и роль его отдельных

аминокислот в поддержании структуры нити бактериального жгутика на примере жгутиков Bacillus brevis G.-B.p+.

2. Изучить изменения конформации флагеллина при самосборке, что позволило бы обсуждать механизм сборки нити бактериального жгутика in vivo. Для подтверждения имевшегося в литературе предположения о двустадийности механизма сборки флагеллина в нить требовалось

3


подобрать условия, при которых флагеллин, максимально сохраняя свойства интактного белка, обнаружил бы изменение конформации до включения его в полимер в условиях in vitro.

3. Изолировать "интактные жгутики" (полная структура бактериального жгутика, выделяемая из клетки биохимическими методами и состоящая из базального тела, крюка и флагеллиновой нити) нескольких грамотрицательных и грамположительных бактерий и сравнить структуру их базальных тел. Изучить внутриклеточное крепление бактериального жгутика при помощи метода электронной микроскопии.

4. Изучить свойства флагеллина в составе "интактных жгутиков" бактерий, в том числе возможность взаимодействия с белками других систем биологической подвижности.

5. Изолировать жгутики некоторых представителей архей и сравнить их структуру со структурой бактериальных жгутиков.

6. Изучить внутриклеточное крепление жгутиков архей методом электронной микроскопии.

7. Дать сравнительную характеристику структуры базальной области бактериальных жгутиков и жгутиков архей.

Научная новизна работы. Для изучения конформационных изменений флагеллина при его полимеризации создана модельная система, позволяющая сместить равновесие мономер а=* полимер в сторону образования полимера (нити бактериальных жгутиков) при блокировании конечной стадии его образования. Продемонстрировано, что скорость полимеризации флагеллина in vitro в определенных условиях может достигать скорости роста жгутика на живой клетке. Изучена локализация и роль тирозина в поддержании структуры флагеллина и нитей жгутиков В. brevis var. G.-B. p . Продемонстрирована возможность конформационной перестройки молекулы флагеллина до ее включения в состав нити бактериального жгутика.

Впервые изолированы ранее не изученные "интактные жгутики" ряда г(+) и г(-) бактерий, исследованы их физико-химические свойства и структура базальных тел. Получены экспериментальные доказательства существования в цитоплазме вблизи мембраны эубактерий дополнительных компонентов мотора, теряющихся при изолировании "интактных жгутиков" биохимическими методами. При проведении работы с целью определения места бактериального флагеллина среди других белков биологической подвижности впервые обнаружено сходство флагеллина бактериальных жгутиков с мышечным Ф-актином по целому ряду свойств (декорирование нитей бактериального жгутика субфрагментом 1 миозина; соосаждение нитей с миозином; влияние нитей на АТФазную активность миозина; влияние нитей на

4


взаимодействие миозина с актином). Обсуждаются возможные причины обнаруженного явления.

Впервые в клетках галофильных архей обнаружена и описана особая внутриклеточная цитоплазматическая структура, на которой крепится пучок жгутиков. У эубактерий жгутики, как известно, закреплены при помощи специализированных структур (дисков), связанных с клеточной оболочкой, и практически не продолжаются в цитоплазму. Результаты представленной работы предлагают принципиально иной способ крепления жгутиков в клетках подвижных прокариот - архей: пучок жгутиков погружен в цитоплазму, где он закреплен при помощи обширной дискообразной структуры. Таким образом, получено еще одно свидетельство в пользу того, что архей обладают особой системой подвижности, принципиально отличающейся от системы подвижности жгутиков эубактерий.

На основе полученного экспериментального материала предложены модели строения фрагментов клеток эубактерий и архей с выходящими из них жгутиками. Представлен системный сравнительный анализ свойств и строения органелл подвижности эубактерий и архей как отдельных представителей прокариотических организмов. Практическая значимость работы. Создание модельной системы, позволяющей фиксировать конформационные переходы молекулы флагеллина при полимеризации, дало возможность представить экспериментальные доказательства двухстадийному механизму сборки нитей бактериальных жгутиков. Обнаружение новой цитоплазматической структуры, на которой крепятся жгутики галофильных архей, и сравнительный анализ строения базальнои области бактериального жгутика и жгутика архей позволяет существенно расширить представления о молекулярных механизмах сборки и функционирования органелл подвижности эубактерий и архей как прокариотических организмов. Полученные в работе результаты важны для сравнения структурной организации двух внешне очень похожих, но имеющих принципиальные различия систем подвижности прокариот, а анализ полученных в данной работе и уже имеющихся экспериментальных результатов помогает в какой-то мере дать оценку эволюционному развитию эубактерий и архей.

Разработан новый метод полимеризации флагеллина в присутствии полиэтиленгликоля, обеспечивающий практически мгновенную сборку нитей бактериальных жгутиков и позволяющий предотвратить разрушение флагеллина протеолитическими ферментами при сборке нитей бактериальных жгутиков. На метод получено авторское свидетельство.

5


Получен модифицированный флагеллин, сохраняющий конформацию интактного белка, но полностью потерявший способность к полимеризации. Такой флагеллин может быть использован при его кристаллизации. Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова в рамках темы «Выяснение молекулярных основ явлений биологической подвижности в сравнительно-эволюционном аспекте» (научные руководители: член-корр. РАН, проф. Поглазов Б.Ф. (1930-2001); д.б.н. Левицкий Д.И.; д.б.н. Надеждина Е.С.; к.б.н. Метлина А.Л.; № гос. регистрации 0187.0090309).

Работа поддержана грантами ISF (1994 г.); Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 95-04-12713); Программой поддержки ведущих научных школ РФ «Изучение молекулярных механизмов явлений биологической подвижности» (два проекта: № 96-15-98019; № 00-15-97787; совместно с Институтом биохимии им. А.Н. Баха РАН). Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме по клеточной подвижности (Варшава, 1978); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); 12-ой Международной конференции по мышце и подвижности (Сегед, Венгрия, 1983); V Всесоюзном совещании по немышечным формам подвижности (Чернигов, 1988); Международном симпозиуме «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 1994); Московском семинаре по клеточной биологии (Биологический ф-т МГУ, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 работ в отечественных и зарубежных изданиях. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 251 странице, иллюстрирована 70 рисунками и 7 таблицами. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, содержащей описание объектов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, основных выводов, списка использованных литературных источников и раздела «Благодарности». Список литературных источников содержит 328 работ.

Список использованных сокращений. БЖ - бактериальные жгутики НБЖ - нити бактериальных жгутиков ИЖБ - "интактные жгутики" бактерий ЖА - жгутики архей

б


ИЖБ - "интактные жгутики" бактерий ЖА - жгутики архей ПЭГ - полиэтиленгликоль ПЭГ3оо<ь ПЭГбооо и т.д. - ПЭГ с молекулярными массами 2000, 6000 и т.д. ДК-флагеллин - флагеллин, полученный диссоциацией нитей бактериальных жгутиков кислотой ДН-флагеллин - флагеллин, полученный диссоциацией нитей бактериальных жгутиков нагреванием ТНМ - тетранитрометан ТНМ-флагеллин (ТНМ-ДК-флагеллин; ТНМ-ДН-флагеллнн)

модифицированный тетранитрометаном флагеллин ТНМ-НБЖ - модифицированные тетранитрометаном нити бактериальных жгутиков О - субфрагмент 1 миозина СЧМ - стержневая часть молекулы миозина ДПС - дискообразная пластинчатая структура ЦМ - цитоплазматическая мембрана ПО - "полярная органелла" КС - "кэповидные структуры", изолированные вместе со жгутиками из клеток архей КД - круговой дихроизм [в]222 - молярная эллиптичность белка при 222 нм г(-) - грамотрицательные бактерии г(+) - грамположительные бактерии

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзор литературы

В обзоре литературы, представленном 5-ю разделами и 15 подразделами, излагаются современные взгляды на белковый состав, ультраструктуру, сборку, полиморфизм бактериальных жгутиков. В том числе отдельный раздел посвящен жгутикам архей. Изложен материал о структурных белках мотора бактериальных жгутиков и приведены последние предполагаемые модели функционирования бактериального жгутика. Представлен сравнительный анализ строения и свойств жгутиков бактерий и архей как органелл подвижности прокариот.

Материалы и методы исследования В работе использовали следующие культуры бактерий и архей: Bacillus

brevis var. G.-B.p+; Bacillus brevis var. G.-B.p"; Bacillus subtilus 168; Escherichia coli MS 1350; Ervinia chryzanthemi ENA-49; Vibrio alginolyticus; Halobacterium halobium Flx3; Halobacterium salinarium B-1231; Halobacterium salinarium 4W12; Natronobacterium magadii {Natrialba magadii) B-1751.

7


Результаты работы получены с помощью следующих методов. 1. Микробиологические методы: отбор наиболее подвижных форм бактерий и

архей на полужидком агаре (0,3%); получение биомассы культур, в том числе и в больших объемах (5-10 л).

2. Биохимические и физико-химические методы: выделение и очистка белков и белковых структур (нити жгутиков бактерий и архей; "интактные жгутики" бактерий; комплексы "базальное тело - крюк" жгутиков бактерий; флагеллин), для чего были разработаны отдельные методики; электрофорез в ПААГ; электронная микроскопия; препаративное и аналитическое ультрацентрифугирование; аминокислотный анализ белков; круговой дихроизм; химическая модификация белка; определение АТФазной активности миозина.

Результаты и обсуждение

1 . И з у ч е н и е м е х а н и з м а п о л и м е р и з а ц и и ф л а г е л л и н а .

Самосборка флагеллина in vitro в какой-то мере отражает механизм сборки нитей бактериальных жгутиков (НБЖ) in vivo. Японскими авторами был предложен двустадийный механизм сборки флагеллина in vivo, первая стадия которого состоит в изменении конформации отдельных субъединиц флагеллина до такого состояния, при котором белок становится способным встроиться в полимер (Asakura, 1970; Gerber et al., 1973). Поскольку прямого экспериментального подтверждения предложенной схемы представлено не было, мы попытались подобрать условия, при которых можно было бы определить возможное изменение конформации мономерного флагеллина в условиях его полимеризации, но до его включения в полимер. При этом полностью должна была быть исключена возможность полимеризации флагеллина. Для решения этой задачи были использованы нити и флагеллин жгутиков В. brevis var.G.-B.p*, впервые изолированные нами, и исследованы их физико-химические свойства.

1.1. Физико-химическая характеристика флагеллина.

Флагеллин получали двумя способами - диссоциацией НБЖ В. brevis var. G.-B.p+ нагреванием (ДН-флагеллнн) и диссоциацией их кислотой (ДК-флагеллин). Электрофорез очищенных жгутиков В. brevis var. G.-B.p+ показал присутствие единственной белковой полосы, мигрирующей с той же скоростью, что и флагеллин жгутиков Bacillus subtilis 168 (De Lange, 1973) и флагеллин жгутиков В. brevis 503 (Метлина, 1970). Аминокислотный состав

8


флагеллина жгутиков В. brevis var. G.-B.p+ оказался похожим на аминокислотный состав флагеллинов других видов бактерий. В большом количестве присутствуют апанин, глутаминовая и аспарагиновая аминокислоты. Содержание ароматических аминокислот и пролина незначительно. Отсутствие триптофана и цистеина является характерной чертой бактериальных флагеллинов (Метлина, 1970; De Lange et al., 1973). Молекулярная масса флагеллина жгутиков В. brevis var.G.-B.p*, расчитанная из на основании аминокислотного анализа, составляет 39600±800 Да, что хорошо согласуется с результатами электрофореза и укладывается в рамки молекулярных масс изученных ранее флагеллинов. Анализ N-концевого участка флагеллина жгутиков В. brevis var.G.-B.p показал, что N-концевой аминокислотой этого белка является метионин. Сравнение последовательности из шести N-концевых аминокислот флагеллинов жгутиков В. subtilis 168 (De Lange et al., 1973) и В. brevis var.G.-B.p+ обнаружило единственную аминокислотную замену (аргинин в положении 2 флагеллина жгутиков В. subtilis 168 заменен на изолейцин во флагеллине жгутиков В. brevis var.G.-B.p*). Спектры кругового дихроизма (КД) ДН-флагеллина и ДК-флагеллина жгутиков В. brevis var.G.-B.p оказались идентичными, с характерными максимумами при 222 и 208 нм (рис. 2). Определение аминокислотного состава, электрофоретической подвижности и коэффициента седиментации флагеллина жгутиков B.brevis var.G.-B.p продемонстрировали сходство данного флагеллина по своим свойствам с ранее исследованными флагеллинами (McDonough, 1965; Smith & Koffler, 1971; Метлина, 1971).

1.2. Модификация флагеллина тетранитрометаном.

Одной из задач работы было изучение механизма полимеризации флагеллина, а так как за полимеризационные свойства белка отвечают конкретные аминокислоты с определенными функциональными группами, с помощью химической модификации была изучена роль некоторых из них (аргинин, тирозин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты) в поддержании структуры НБЖ. Поскольку только нитрование флагеллина по тирозину тетранитрометаном (ТНМ) позволило получить флагеллин с необходимыми нам свойствами, далее будут представлены свойства модифицированного таким способом флагеллина.

При нитровании флагеллина ТНМ происходит внедрение нитро-группы в ароматическое кольцо в орто-положении по отношению к гидроксильной группе фенола (Sokolovsky M-, et al., 1966), и в результате реакции образуется нитроформиат ион и нитропроизводное тирозина. По данным аминокислотного анализа флагеллин жгутиков В- £rev/s var.G.-B.p+ содержит всего два остатка

9


г # #

J Г.2 ̂ Рис.1. Электрофореграмма флагеллина жгутиков Bacillus brevis var.

G.-B.p*. 1 - ДК-флагеллин, 2 - ТНМ-ДК-флагеллик.

250 нм

Рис. 2. Спектры КД-флагеллина жгутиков Bacillus brevis var. G.-B. p*. 1 - ДК и ДН-флагеллины; 2 - ТНМ-ДК(ДН)-флагеллины.

тирозина. Количество модифицированных остатков тирозина расчитывали, используя коэффициент экстинции нитротирозина при 428 нм, равный 4100 (Sokolovsky et al., 1966), а также с помощью аминокислотного анализа, поскольку модификация приводит к уменьшению площади пика, соответствующего тирозину. ТНМ может модифицировать и цистеин; однако,

10


флагеллин не содержит этой аминокислоты, что позволило обеспечить специфичность нитрования данного белка. Спектрофотометрический анализ модифицированного ТНМ флагеллина (ТНМ-флагеллнн) обнаружил наличие 2 остатков нитротирозина в составе молекулы данного флагеллина, что согласуется с результатами аминокислотного анализа. Электрофореграммы в ПААГ флагеллина жгутиков В. brevis var. G.-B. р+ и его ТНМ-производного в присутствии додецилсульфата натрия представлены на рис. 1. Спектр КД ТНМ-флагеллина не обнаружил статистически достоверных отличий от спектра КД ДК-флагеллина (рис. 2). Однако при такой внешней идентичности физико-химических свойств интактного и ТНМ-флагеллинов последний продемонстрировал полную потерю способности к полимеризации.

Одновременно было проведено нитрование полимерной формы флагеллина (НБЖ) тетранитрометаном. По данным аминокислотного анализа модификация НБЖ В. brevis var. G.-B. p+ приводит к нитрованию только одного остатка тирозина на каждую молекулу флагеллина. Спектр КД коротких фрагментов модифицированных НБЖ не отличался от спектра КД нативных НБЖ. При диссоциации ТНМ-НБЖ и дальнейшей их реконструкции образуются полимерные структуры, сходные с реконструированными обычным способом НБЖ. Следовательно, модификация одного из остатков тирозина, не задействованного в полимеризации флагеллина, не влияет на свойства НБЖ.

1.3. Способы быстрой полимеризации флагеллина.

1.3.1. Полимеризация флагеллина в присутствии сульфата аммония.

В обычных условиях ДН-флагеллин полимеризуется только в присутствии коротких фрагментов жгутиков, исполняющих роль затравки для полимеризации флагеллина. С другой стороны, известно, что низкомолекулярные высаливающие агенты, такие как цитрат натрия и сульфат аммония, способствуют сборке биологических объектов, в том числе НБЖ (Wakabayashi К., et al„ 1969).

Один из подходов к изучению механизма самосборки НБЖ в представленной работе заключался в разработке способа быстрой полимеризации флагеллина, поскольку в обычных условиях флагеллин полимеризуется в течение суток. Полимеризация ДК-флагеллина В. brevis 503, в отличие от ДН-флагеллина, полимеризующегося только в присутствии затравки, инициируется спонтанно после нейтрализации закисленного раствора белка (Метлина и Поглазов, 1969; 1970). Можно было ожидать, что сульфат аммония как высаливающий агент будет более эффективно способствовать полимеризации ДК-флагеллина В. brevis var. G.-B. p* по сравнению с ДН-

11


флагеллином, ускоряя самопроизвольное образование затравочных элементов. На рис. 3 представлены кривые полимеризации ДК-флагеллина в присутствии сульфата аммония. При концентрации флагеллина 2,5 мг/мл сборка НБЖ в присутствии 1 М (NH4)2S04 заканчивается в течение трех часов, тогда как без сульфата требуется около 18 часов. Дальнейшее увеличение концентрации высаливающего агента приводит к денатурации белка.

Рис. 3. Кинетические кривые полимеризации ДК-флагеллина жгутиков S. brew's var. G.-B. р* в отсутствие и в присутствии сульфата аммония. (1) - без (NH4)2S04; (2) - в присутствии 0,3 M (NH4)2S04; (3) - 0,6 M (NH4)2S04; (4) -1 М (NH4)2S04; 20°C, рН 7,0.

1.3.2. Полимеризация флагеллина в присутствии полиэтиленгликоля.

В качестве другого и, как оказалось, более эффективного ускоряющего полимеризацию флагеллина агента мы впервые использовали полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ представляет собой линейный синтетический водорастворимый нейтральный полимер, обладающий ярко выраженными эксклюзивными и дегидратационными свойствами. Наличие этих свойств обеспечивает, с одной стороны, достаточно мягкое высаливающее действие полимера, а с другой - обуславливает эффект микроскопического концентрирования белка за счет взаимного исключения макромолекул, находящихся в растворе (эффект эксклюзии). ПЭГ известен как агент, способный воздействовать на равновесное состояние целого ряда биохимических процессов in vitro. Электронномикроскопическое изучение реконструированных в присутствии ПЭГ НБЖ показало их практически полную внешнюю идентичность с нативными и реконструированными в обычных условиях НБЖ (рис. 4).

12


Рис. 4. Нити жгутиков Bacillus brevis var. G.-B. p*. Интактные (а); реконструированные в обычных условиях (б);

реконструированные в присутствии ПЭГ (в); масштабная линейка - 250 нм.

13


час

Рис. 5. Кинетика полимеризации ДК-флагеллина в присутствии 10% ПЭГ с различной молекулярной массой. 1 - ПЭПзшхмоооо; 2 - ПЭГ20оо-«ооо; з -ПЭГ600; 4 - ПЭГ*»; S - без ПЭГ.

Рис. 6. Кинетика полимеризации ДК-флагеллина в присутствии ПЭГ2ооо-1 - 10%, 20%; 2 - 8%; 3 - 6%; 4 - без ПЭГ; 20°С, рН 7,0.

Флагеллин оказался достаточно устойчив к высаливающему действию ПЭГ и выдерживает его концентрацию до 20% (вес/объем). На рис. 5 и 6 представлены кривые полимеризации ДК-флагеллина жгутиков В. brevis var. G.-B. р в присутствии ПЭГ4оо-40ооо- Степень полимеризации флагеллина выражали как процентное соотношение полимеризованного флагеллина к общему (исходному) количеству белка. Количество полимеризованного флагеллина определяли по результатам осаждения его полимерной формы при ультрацентрифугировании. На рисунках видно, что увеличение содержания ПЭГ в растворе приводит к резкому ускорению процесса полимеризации.

14


При сравнении представленных на рисунках кривых полимеризации становится очевидным наиболее эффективное действие ПЭГгооо-Эффективность ПЭГ40000 уменьшается, по-видимому, из-за так называемого «ситового эффекта», суть которого состоит в уменьшении скорости диффузии белковых молекул в вязких средах. Олигомерные формы ПЭГ обладают слабыми дегидратационными свойствами, поэтому не оказывают выраженного действия на полимеризацию флагеллина. Тем не менее, присутствие олигомеров ПЭГ с молекулярной массой от 400 до 600 дальтон все-таки способствует незначительному ускорению сборки жгутиков (рис. 5).

Сборка НБЖ в присутствии 20% ПЭГ завершалась за 3-5 мин. в диапазоне концентраций флагеллина от 0,1 до 10 мг/мл, в то время как при полимеризации флагеллина без ПЭГ степень полимеризации можно было оценить только через 18-20 час. Использование в этом случае концентрации флагеллина ниже 1 мг/мл приводило к резкому падению степени полимеризации, и при концентрации белка ниже 0,5 мг/мл полимеризация отсутствовала полностью. В то же самое время в присутствии ПЭГ флагеллин не терял способности к полимеризации даже при концентрации 0,1 мг/мл, причем в присутствии 20%) ПЭГгооо степень полимеризации в три раза превышала соответствующую величину, регистрируемую в присутствии 20% ПЭГ40000. •

Поскольку оптимальное значение температуры сборки НБЖ составляет 26-28°С, была изучена кинетика этого процесса для флагеллина В. brevis var. G.-B. р* в присутствии ПЭГ при разных температурах и показано, что в интервале температур от 4°С до 35°С скорость и степень полимеризации флагеллина постоянны. Выше и ниже этих температур белок начинал денатурировать.

Известно, что нагревание НБЖ при 65 С в течение нескольких минут приводит к образованию мономерного флагеллина, находящегося в так называемом метастабильном состоянии (ДН-флагеллин). Такой флагеллин при низкой ионной силе раствора полимеризуется только в присутствии затравки -коротких фрагментов НБЖ. Изучив действие ПЭГ на кинетику полимеризации ДН-флагеллина жгутиков В. brevis var. G.-B. p , мы обнаружили, что ПЭГ инициирует процесс его полимеризации в отсутствие затравки.

1.3.3.Физико-химическая характеристика жгутиков, реконструированных в присутствии ПЭГ.

Среди известных способов реконструкции НБЖ существуют такие, которые меняют их морфологию, термостабильность и другие параметры (Hotani et al., 1969; Метлина, 1970) при сохранении химической целостности флагеллина как их структурной единицы. Поэтому мы изучили свойства

15


реконструированных в присутствии ПЭГ НБЖ и сравнили их со свойствами интактных и реконструированных в обычных условиях НБЖ.

Как уже сообщалось выше, в электронном микроскопе ПЭГ-реконструированные НБЖ В. brevis var. G.-B.p+ выглядят идентичными интактным и реконструированным обычным способом НБЖ (рнс. 4). Спектры КД интактных, ПЭГ-реконструированных и реконструированных обычным способом НБЖ также выглядят идентичными (рис. 7). Различия в величине молярной эллиптичности при 220 и 210 нм, где спектры имеют максимумы, незначительны и статистически недостоверны. Изменения длины оптического пути и концентрации белка не влияли на характер спектров.

0

§ 6 £

г* S о ч а е-12

i 18

Рис. 7. Спектры КД нитей жгутиков жгутиков Bacillus brevis var. G.-B. р*. НативныеНБЖ(|); реконструированные в присутствии ПЭГ (2) и без ПЭГ (3) НБЖ.

Анализ полученных результатов позволяет констатировать сходство свойств реконструированных в присутствии ПЭГ НБЖ со свойствами интактных и реконструированных в обычных условиях НБЖ.

1. 4. Изучение механизма полимеризации флагеллина.

Самосборка НБЖ сопровождается увеличением содержания а-спирали в составе молекулы флагеллина от ~30% до ~50% (Метлина и Поглазов, 1969; Klein et al., 1969; Uratani et al., 1972). Японскими авторами был предложен

250 нм

16


двустадийный механизм сборки НБЖ, первая стадия которого состоит в частичном изменении конформации флагеллина до его включения в состав нити жгутика (Asakura, 1970; Gerber et al., 1973). Однако прямого экспериментального подтверждения предложенной схемы представлено не было. Мы попытались решить этот вопрос, то есть обнаружить изменения конформации флагеллина при его полимеризации, применив ингибирование процесса полимеризации в сочетании с условиями, сдвигающими равновесие системы флагеллин-НБЖ в сторону образования полимера. О конформационном состоянии флагеллина жгутиков В. brevis var.G.-B.p+ судили по спектрам КД в интервале от 260 до 190 нм, а также по изменению величины молярной эллиптичности [0]222 (Chen et al., 1972). Для ингибирования процесса полимеризации использовали флагеллин в концентрации значительно ниже критической (10-20 мкг/мл), а также не способный к полимеризации модифицированный ТНМ-флагеллин, поскольку низкие концентрации флагеллина не исключают полностью возможности его полимеризации. В качестве агентов, сдвигающих равновесие системы в сторону образования полимера, использовали ПЭГ и сульфат аммония, который, так же как и ПЭГ, ускоряет сборку НБЖ, но обладает менее выраженным действием.

Добавление агентов, сдвигающих равновесие флагеллин-НБЖ в сторону образования полимера, приводит к увеличению [0]222, причем характер изменения этой величины оказался рН-зависимым. В интервале рН 2,9-3,9 добавление ПЭГ до 10% увеличивает [0] 22 ДК-флагеллина до значения -9,82 10"э град см2дмоль"'; при дальнейшем повышении концентрации ПЭГ величина [0]222 не изменяется (рис. 10). Добавление сульфата аммония до 0,8 М в этих же интервалах значений рН также приводит к возрастанию величины [0]222. Так, при рН 3,0 она соответствует -10,80 10" град см дмоль*1, а при увеличении концентрации сульфата аммония выше 0,8 М [0]222 остается неизменной (рис. 11). В интервале значений рН 4,3-10,0, то есть в том интервале, где происходит полимеризация флагеллина (сборка НБЖ) (Smith, Koffler, 1971), добавление к раствору ДК-флагеллина ПЭГ или сульфата аммония приводит к более значительным изменениям [0] 22. В частности, при рН 6,0 увеличение концентрации ПЭГ до 20% приводит к постепенному возрастанию ее величины до -12,02 10'3 град см2 дмоль"1 (рис. 10). Увеличение концентрации сульфата аммония до 1 М воздействует на величину молярной эллиптичности [0] ДК-флагеллина аналогично действию увеличения концентрации ПЭГа на эту величину (рис. 11). Максимальное увеличение [0]222

при добавлении указанных количеств ПЭГ и сульфата аммония происходит при значении рН раствора, равном 6,0.

17


Ранее было зарегистрировано возрастание молярной эллиптичности [0]222

мономерного флагеллина в условиях его полимеризации в присутствии сульфата аммония (Uratani et al., 1972), однако техника постановки эксперимента в работе не исключала возможности полимеризации белка в данных условиях, а значит и фиксирования изменения конформации флагеллина, связанного с его полимеризацией. Поэтому мы использовали ТНМ-ДК-флагеллин для исключения такой возможности.

'* 13 с; о 2 Ч

"s и ч го о. к. Ь ^ 9

.

Ж^^^^^

у ^ ^ _ ^ - * — ' ^ ^ • » • * ' ' '• "

. . I 1

-.2 ===̂ Ч

.1 — * з 1

2.5 5 10 15 20 ПЭГ,%

Рис. 10. Изменение величины [0]222 флагеллина в присутствии ПЭГ. Флагеллин: I - рН 3,0; 2 - рН 6,0. ТНМ-ДК- флагеллин: 3-рНЗ,0; 4-рНб,0.

1,0 (NH4)2S04 М

Рис. 11. Изменение величины [0]222 флагеллина в присутствии (NhUfeSQ». Флагеллин: I - рН 3,0; 2 - рН 6,0. ТНМ-ДК-флагеллин: 3-рНЗД 4-рН6,0.

Добавление к раствору ТНМ-ДК-флагеллина ПЭГ или сульфата аммония приводит к изменениям величины [Э]222, сходным с изменениями [0]222

обычного ДК-флагеллина в идентичных условиях (рис. 10, 11), и характер таких изменений зависит от рН. Присутствие в растворе ТНМ-ДК-флагеллина


ПЭГ или сульфата аммония в концентрации 20% и 1 М соответственно (рН 6,0), приводит к увеличению [б]222 до значения -11,87 1013 град см2 дм о ль"', и зависимость этой величины от концентрации высаливающих агентов полностью соответствует подобной зависимости для ДК-флагеллина.

Поскольку изменение спектра КД может быть следствием неспецифической агрегации белка в присутствии высаливающих агентов (Cassim & Yang, 1967), в качестве контроля в работе был проведен седиментационный анализ препаратов флагеллина в присутствии ПЭГ.

0.

S3 б о 2 р.

»s о Ч £.12 и ь

I

18

Рис. 12. Спектры ДК-флагеллина и нитей жгутиков Bacillus brevis war. G.-B.p* (рН 6,0). I - ДК-флагеллнн; 2 - ТНМ-ДК-флагеллин; 3 - ТНМ-ДК-флагеллин в присутствии 20% ПЭГ или 0,8 М сульфата аммония; 4 - короткие фрагменты нитей интактных жгутиков.

Представленные данные свидетельствуют о том, что наблюдаемые изменения спектра КД в условиях полимеризации флагеллина обусловлены конформационной перестройкой как нативной, так и модифицированной его форм, причем модификация не препятствует изменению конформации белка. Однако следует обратить внимание на то, что присутствие высаливающих

19

210 230 250 нм


агентов, сдвигающих равновесие в сторону образования полимера, не приводит к увеличению [&]гп до значений, соответствующих величине молярной эллиптичности флагеллина в составе полимера (интактных или реконструированных НБЖ) (рис. 12). В то же время постепенное увеличение содержания ПЭГ или сульфата аммония при рН 4,0-10,0 приводит к такому же постепенному увеличению [0]222(рис. 10,11).

Подобный характер изменения спектра КД можно объяснить, предположив существование в растворе флагеллина двух его конформационных состояний, находящихся в динамическом равновесии друг с другом. Одно из них соответствует конформации мономерного флагеллина до начала полимеризации, другое — конформации, которую молекула принимает при включении ее в состав НБЖ или близкой к ней конформации. Тогда увеличение [ в ] 2 2 является следствием смещения равновесия двух конформации в сторону преобладания последней, то есть той конформации, которая позволяет мономеру включиться в полимер.

Оба использованные в работе флагеллина (ДК- и ДН-флагеллин) имеют одинаковую скорость полимеризации, и в присутствии 10% ПЭГ2ооо сборка НБЖ заканчивается в течение 3-5 минут. Зная длину НБЖ, можно расчитать скорость их роста в присутствии ПЭГ. Простые расчеты показывают, что скорость роста НБЖ (данные приведены для НБЖ A subtilis 168) в присутствии 10% ПЭГгооо при концентрации белка 2,5 мг/мл равняется 600+40 нм/мин. Согласно данным оптической дифракции жгутик длиной 10 мкм построен из 22000 молекул флагеллина, то есть в состав жгутика A subtilis в 10% растворе ПЭГ включается 22 молекулы флагеллина в секунду. Такая скорость роста в 6 раз превышает максимальную скорость роста жгутиков, расчитанную теоретически для стремящейся к бесконечности концентрации флагеллина (Asakura, 1970), и в 8 раз превышает скорость роста жгутика в тонком слое раствора, регистрируемую с помощью метода темнопольной микроскопии (Ishikihara & Hotani, 1980). При столь высокой скорости роста нить жгутика длиной 10 мкм реконструируется в течение 15 минут, что соответствует скорости роста жгутика на клетке A subtilis 168 (Grand & Simon, 1968). Из всего этого следует, что ПЭГ позволяет добиться in vitro скорости полимеризации флагеллина, близкой к скорости роста НБЖ на живой клетке.

Изменение конформации флагеллина в присутствии ускоряющих полимеризацию агентов является, по нашему мнению, результатом изменения гидратной оболочки белка. ПЭГ как полимер обладает свойствами, которые позволяют ему оказывать более эффективное по сравнению с сульфатом

20


аммония действие на сборку НБЖ. С одной стороны это эксклюзивные свойства, обеспечивающие микроскопическое концентрирование белка в растворе, с другой стороны это способность молекул ПЭГ к внутримолекулярным флуктуациям, приводящим к нарушению структуры воды, что должно в значительной степени дестабилизировать гидратную оболочку белка. Поскольку через изменение структуры воды реализуется воздействие одного белка на конформационное состояние другого, ПЭГ можно рассматривать как агент, влияющий на внутриклеточное окружение молекул

k флагеллина. г"-» Ранее было показано, что столкновение флагеллина с растущим концом

жгутика приводит к нарушению водной оболочки его молекулы, вследствие чего происходит ее конформационная перестройка (Bode, 1974). Результаты данной работы подтверждают этот факт, демонстрируя, что высаливающие агенты обеспечивают конформационную перестройку субъединиц флагеллина до соударения их с растущим концом жгутика, что ускоряет включение белковой молекулы в состав жгутика. Так как флагеллин полимеризуется на удаленном от клетки дистальном конце жгутика, высокая скорость роста жгутиков in vivo обусловлена, по-видимому, тем, что флагеллин, проходя по внутреннему каналу НБЖ и находясь в тесном окружении белковых молекул, имеет необходимую для полимеризации конформацию. ПЭГ способствует образованию подобных условий для флагеллина in vitro.

Полученные в представленной работе результаты хорошо согласуются с самой последней информацией о сборке НБЖ in vivo (Yonekura et al., 2000). Известно, что дистальный конец нити жгутика, на котором происходит сборка флагеллина in vivo, замыкает структура НАР2 или "cap" (FliD) (Homma et al., 1986). Оказалось, что "cap" не только предотвращает «утекание» флагеллиновых молекул с дистального конца НБЖ, как считали ранее (Ikeda et al., 1993), но и индуцирует необходимые конформационные изменения в субъединицах флагеллина перед встраиванием их в нить. В момент продвижения по внутреннему каналу мономер флагеллина развернут и имеет особое конформационное состояние до достижения им дистального конца и до его поступления в распоряжение «cap». «Cap» вступает в контакт с поступающими мономерами флагеллина и помогает им приобрести необходимую для встраивания в полимер конформацию (Yonekura et al., 2000). В нашем случае ПЭГ, по-видимому, помогает молекулам флагеллина за короткий промежуток времени приобрести конформацию, близкую к той, которую они имеют в момент прохождения по внутреннему каналу нити до взаимодействия с «cap» на дистальном конце жгутика. То, что происходит далее в живой клетке, смоделировать in vitro невозможно. А именно,

21


происходит многоступенчатая процедура сборки нити из молекул флагеллина при помощи «cap». Возможно, что этот процесс и есть тот самый второй этап полимеризации, существование которого предполагали японские авторы (Asakura, 1970; Gerber et al., 1973).

Выборочно изучив роль отдельных аминокислот в полимеризации флагеллина, мы остановились на тирозине, модификация которого позволила изучить конформационные изменения флагеллина при полимеризации НБЖ in vitro. Эта часть представленной работы была проведена около 20 лет назад, поэтому очень важной для нас оказалась совсем недавняя работа, в которой впервые методом рентгеновской дифракции на кристаллах практически полной молекулы флагеллина были подтверждены и развиты многие результаты, полученные другими авторами и другими методами для структурных переходов в НБЖ (Samatey et al., 2001). В том числе было показано, что именно тирозин из-за существенно большей объемности своей молекулы по сравнению с аспарагиновой кислотой, которая составляет значительную часть молекулы флагеллина, стабилизирует упаковку трех имеющихся во флагеллине доменов в конформации R-типа НБЖ. Возможно, модификация по тирозину, проведенная нами для флагеллина нитей жгутиков В. brevis G.-B. р+, затронула как раз участок, стабилизирующий данный биополимер.

В заключение этого раздела работы нужно добавить, что тема сборки биологических объектов, в том числе и бактериальных жгутиков, перешла на качественно иной уровень после открытия молекулярных шаперонов - особых белков, способствующих сборке белок-содержащих структур. Полученные нами результаты следует рассматривать в рамках более ранних работ в этой области (Caspar & Klug, 1962; Anfinsen, 1973), в которых сборка надмолекулярных структур рассматривается как самосборка, то есть спонтанный процесс без участия других макромолекул или экзогенных источников энергии. Участие шаперонов в сборке бактериального жгутика только недавно стало обсуждаться в связи с выяснением роли его отдельных внутриклеточных белковых компонентов (Zhu et al., 2002).

2. Изучение структурной организации и свойств жгутиков эубактернй. 2..1. Изучение структурной организации базальных тел жгутиков эубактернй. Одной из задач работы было изолирование «интактных жгутиков»

бактерий (ИЖБ), то есть БЖ с его внутриклеточной частью - базальным телом, и сравнение их структуры. Были разработаны специальные методики для изолирования ИЖБ Erwinia chrysanthemi, двух штаммов В. brevis, Vibrio alginolyticus. За основу выделения ИЖБ всех использованных в работе бактерий был взят метод Де Памфилиса и Адлера (De Pamphilis & Adler, 1971).

22


Однако для ряда бактерий эту методику пришлось существенно модифицировать. В диссертации приведены электронные микрофотографии ИЖБ всех выше перечисленных бактерий.

Известно, что базальные тела жгутиков г(-) бактерий содержат две пары дисков, а жгутиков г(+) бактерий — одну пару дисков. Мы обнаружили в базальных телах ИЖБ В. brevis var. G.-B.p+ дополнительную структуру, расположенную в области контакта дисков с крюком. Эта структура, впервые обнаруженная у жгутиков г(+) бактерий и названная нами "воротничком", имеет диаметр чуть меньший, чем у дисков базального тела данных ИЖБ, и отсутствует у ИЖБ другого штамма данной культуры - В. brevis var. G.-B.p".

Все изолированные в работе ИЖБ состоят из спиральной нити, крюка и базального тела; величина соотношения размеров дисков базальных тел L и М постоянна для жгутиков бактерий внутри одного вида. Наши исследования структурной организации ИЖБ нескольких представителей г(-) и г(+) бактерий с перитрихиальным характером жгутикования подтвердили основные закономерности строения базальных тел их жгутиков. Некоторые структурные особенности базальных тел изолированных в работе жгутиков следует отнести, скорее всего, к индивидуальным особенностям строения клеточной стенки конкретной бактерии (например, наличие «воротничка» в базальных телах жгутиков В. brevis var. G.-B.p+). Однако имеется ряд моментов, позволяющих констатировать, что выяснение функции отдельных кольцевых структур базального тела БЖ еще впереди. Так, например, до сих пор не выяснена окончательно роль MS-кольцевого комплекса в работе жгутикового мотора (составная часть ротора? статора?). Более того, недавно высказано предположение, что внешнее L-кольцо базальных тел жгутиков г(-) бактерий является компонентом аппарата экспорта жгутиковых белков (Minamino & Macnab, 1999), поэтому отсутствие пары L-P колец в базальных телах жгутиков г(+) бактерий ставит дополнительные вопросы о функции внешних колец базального тела БЖ.

Иногда у выделенных «интактных жгутиков» наблюдались базальные тела с дополнительным компонентом под MS-кольцевым комплексом, но стабильно зафиксировать эту структуру в выделяемом комплексе «крюк-базальное тело» не удавалось. Поэтому мы использовали метод получения тонких срезов в электронной микроскопии и обнаружили на срезе клетки V. alginolyticus в цитоплазме под MS-кольцевым комплексом дополнительный компонент базального тела БЖ (Метлина и Бакеева, 1989). Нам удалось продемонстрировать этот внутриклеточный структурный элемент жгутика на срезах бактериальной клетки до того, как это удалось сделать биохимическими

23


методами (Driks & DeRosier, 1990; Khan et al., 1992), и задолго до того, как методами молекулярной биологии были установлены цитоплазматические встроенные в MS-комплекс компоненты бактериального жгутика, соответствующие, возможно, аппарату экспорта его структурных белков (Fan et al., 1997; Minamino & Macnab, 1999).

2.2. Взаимодействие НБЖ с миозином. 2.2.1.Электронномикроскопическое изучение взаимодействия бактериальных жгутиков с субфрагментом J миозина.

Внимательное рассмотрение различных систем биологической подвижности организмов позволяет обнаружить в них отдаленное сходство. В каждой из них имеются надмолекулярные структуры, спиральные биополимеры (Ф-актин, микротрубочки, НБЖ), состоящие из большого количества одинаковых мономеров. В литературе имеются данные о возможности взаимодействия белков, принадлежащих к разным системам биологической подвижности. Например, обнаружено взаимодействие миозина с тубулином (Shimo-Oka et al., 1980). НБЖ отдаленно напоминает Ф-актин, присутствующй, по-видимому, во всех типах клеток. Возникает вопрос о месте флагеллина среди этих белков.

Одним из методов идентификации актина в клетках является метод декорирования нитей Ф-актина водорастворимыми фрагментами миозина -тяжелым меромиозином или субфрагментом 1 миозина ( О ) - с последующим электронномикроскопическим изучением образующихся структур. Метод основан на специфическом взаимодействии актина с миозином. С1 представляет собой изолированные головки миозина без его стержневой части, сохраняющие активные центры миозина. Этот метод использован в работе для обнаружения возможного взаимодействия между структурными компонентами БЖи С1.

Исследования проводили с использованием ИЖБ E.coli MS 1350 и B.brevis var. G.-B. p+, содержащие все структурные элементы БЖ - нить, крюк и базальное тело. Такие жгутики (0,1мг/мл) инкубировали с С1 (0,05мг/мл) в среде, содержащей 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 50 мМ КС1 и 5 мМ MgCb, в течение 3-5 минут при комн. температуре, а затем проводили электронномикроскопическое исследование полученных препаратов (электронные микрофотографии приведены в диссертации). На фотографиях отчетливо видно, что флагеллиновые нити жгутиков E.coli MS 1350 и B.brevis var. G.-B.p+ связывают CI, который равномерно распределяется вдоль нити жгутика, увеличивая его диаметр. Однако такой способностью обладают только флагеллиновые НБЖ, а крюк и базальное тело жгутиков не

24


декорируются. При этом степень декорирования НБЖ Е. coli MS 1350 явно больше, чем НБЖ В. brevis G.-B.p+. О специфичности обнаруженного эффекта свидетельствует быстрая диссоциация комплекса при добавлении 1 мМ АТФ (в присутствии 5 мМ MgCb). Такой эффект характерен для взаимодействия актина с С1. Действие АТФ на комплекс НБЖ-С1 практически исключает возможность неспецифического налипания С1 на НБЖ.

Способность связывать С1 является, по-видимому, общим свойством НБЖ как г(-), так и г(+) бактерий, поскольку декорированию подвергались НБЖ E.coli, B.brevis и B.subtilis, правда, в разной степени. С1 декорирует не только оторванные механическим способом от клетки НБЖ и НБЖ в составе «интактных жгутиков», но и НБЖ на целой бактериальной клетке. Кроме того, в одном препарате встречаются как отдельные декорированные и недекорированные НБЖ, так и декорированные и недекорированные участки на одной НБЖ. Это может быть связано с нарушением структурной целостности НБЖ за счет каких-либо воздействий (физико-химических факторов, протеолиза и т.д.). Однако, наиболее привлекательным нам кажется предположение, что различное декорирование нитей жгутиков С1 фиксирует ряд полиморфных состояний НБЖ, сопровождающихся изменением конформации флагеллина, возможность появления которых является условием обеспечения переориентации бактериальной клетки в среде. В пользу этого говорит и тот факт, что в процессе хранения препаратов изолированных НБЖ (7-10 дней при 0°С) происходит изменение характера и степени декорирования НБЖ, и в конце концов они теряют способность связывать С1. В литературе имеются сведения о том, что длительное хранение жгутиков в условиях низких температур приводит к полиморфным трансформациям жгутиков (Asakura, 1970; Calladine, 1978). Совокупность этих данных дает основание полагать, что конформационное состояние флагеллина в составе НБЖ влияет на их взаимодействие с головками миозина.

2.2.2. Соосаждение НБЖ и флагеллина с миозином и стержневой частью миозина.

Способность НБЖ взаимодействовать с миозином подтверждается методом агрегации и осаждения молекул миозина при низкой ионной силе раствора. Ранее таким способом было обнаружено взаимодействие миозина с тубулином (Shimo-Oka, 1980). При низкоскоростном центрифугировании, когда миозин осаждается в условиях низкой ионной силы раствора, а НБЖ в этих условиях не осаждается, обнаружение НБЖ в осадках миозина является свидетельством их взаимодействия с миозином. На рис. 13а видно, что после соосаждения миозина с НБЖ E.coli MS 1350 при весовом соотношении 1:1 (1 мг НБЖ и 1 мг миозина) на электрофореграмме миозина присутствует полоса

25


флагеллина. Чем больше НБЖ было исходно добавлено к фиксированному количеству миозина (1 мг), тем больше их обнаруживалось в осадке (рис. 13в). Аналогичные эксперименты проводили и с флагеллином в мономерной форме, однако, в этом случае обнаружить флагеллин в осадках миозина не удалось.

НБЖ представляют собой довольно крупные фибриллярные структуры, поэтому они могут вовлекаться неспецифически в осадки агрегированного миозина. Для того, чтобы исключить такую возможность, было проведено соосаждение НБЖ со стержневой частью миозина (СЧМ), лишенной глобулярных головок, а следовательно, и активных центров миозина. В этом случае соосаждение НБЖ с СЧМ должно иметь неспецифический характер, например, за счет механического вовлечения НБЖ в осадки агрегированных молекул СЧМ. Действительно, НБЖ присутствовали в осадках СЧМ, но их количество было незначительно по сравнению с их содержанием в осадках целых миозиновых молекул (рис. 136).

2.2.3. Влияние НБЖ на АТФазную активность миозина. Каждая из двух головок миозина содержит активный центр миозиновой

АТФазы. Следовательно, если миозин действительно взаимодействует с НБЖ своими головками, то это должно каким-то образом отразиться на его ферментативных свойствах. Ф-актин, например, взаимодействуя с миозином, значительно активирует его Mg^-АТФазу, ингибирует lC-EDTA-АТФазу и оказывает слабое активирующее влияние на Са2+-АТФазу. Было проведено исследование влияния НБЖ на АТФазную активность миозина. Присутствие НБЖ приводит к ингибированию Са2+- и К+-ЭДТА-АТФазных активностей миозина. При этом степень ингибирования увеличивается с возрастанием количества добавленных к миозину НБЖ (рис. 14А). При весовом соотношении НБЖ к миозину 10:1 степень ингибирования Са2+-АТФазной активности миозина составляет 50%, а К+-ЭДТА-АТФазной активности - 80%. Из сравнения этих данных с данными по соосаждению НБЖ с миозином следует, что степень ингибирования миозиновой АТФазы возрастает пропорционально количеству НБЖ, вступивших во взаимодействие с миозином. При этом степень ингибирования Са2+- и К+ -ЭДТА-АТФазных активностей НБЖ Е. coli MS 1350 оказалась выше (~ на 10%), чем в случае НБЖ Б. brevis var. G.-В.р+. Эксперименты проводились параллельно в идентичных условиях.

Перед измерением АТФазных активностей миозина проводилась инкубация НБЖ с миозином в течение 10 минут. Это обусловлено тем, что наблюдаемое ингибирование Са2+ - и К+-ЭДТА-АТФазных активностей миозина НБЖ происходит не мгновенно. На рис. 14Б видно, что степень ингибирования повышается с увеличением времени преинкубации нитей с миозином и достигает максимального значения через 10 минут после начала

26


Б

12 3 4 5

• Т Ц М - -

мс — W

ф

лцмр;

* #

» •

120

0.5 1.0 НБЖ, мг

Рис. 13. Соосаждение НБЖ с миозином. (А). НБЖ изолированы из К coli MS I350. Осадки миозина анализировали методом электрофореза в 10% SDS-ПААГ после ннзкоскоростного центрифугирования миозина в присутствии НБЖ при низкой ионной силе раствора (линия 1) и в отсутствие НБЖ (линия 3); (линия 2 - 1 0 мкг НБЖ). (Б) НБЖ изолированы из В. brevis G.-B. p \ Осадки получены после осаждения миозина в отсутствие (линия 1) и в присутствии (линия 2) НБЖ; (линия 3 - 1 0 мкг НБЖ). Линии 4 и 5 - осадки получены после осаждения изолированных миозиновых стержней в присутствии (4) и в отсутствие (5) НБЖ. Во всех случаях на гель наносили 60 мкг миозина или миозиновых стержней. (В) Количество НБЖ В. brevis G.-B. p+ в осадках миозина в зависимости от исходно добавленного количества НБЖ. ТЦМ - тяжелые цепи миозина; ЛЦМ - легкие цепи миозина; МС - миозиновые стержни; Ф - флагеллин.

27


0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 НБЖ (мг/мл)

Б

О 5 10 15 20 Время преинкубации (мин)

Рис. 14. Действие НБЖ В. brew's G.-B. р* на К*-ЭДТА-АТФазную активность (•) или Са2*-АТФазную активность (ш) миозина. (А) НБЖ добавлены к миозину за 1 минуту до измерения АТФазной активности. (Б) различное время преинкубации НБЖ (0,2 мг/мл) с миозином (0,1 мг/мл) до измерения АТФазной активности. 100% соответствует 0,8 мкмол РДган на 1 мг миозина.

инкубации, что свидетельствует о достаточно низкой скорости взаимодействия НБЖ с миозином.

Флагеллин жгутиков Е. coli MS 1350 и В. brevis var. G.-B.p+ в мономерной форме не влияет на АТФазные активности миозина и, как уже отмечалось, такой белок и не соосаждается с миозином в условиях низкой ионной силы раствора. Следовательно, только полимерная форма флагеллина (НБЖ) обладает способностью взаимодействовать с миозином.

2.2.4. Влияние НБЖ на взаимодействие миозина с актином. Поскольку в головках миозиновой молекулы находятся центры

связывания актина с миозином, интересно было выяснить, оказывают ли НБЖ влияние на взаимодействие миозина с актином, а также влияет ли их присутствие на активацию актином Mg2+-ATPa3bi миозина.

28

60

20

£ X

О I

ост

X Л X

акт

я <

100

80

60

40


С этой целью были проведены следующие эксперименты. В одном случае миозин (0,1 мг/мл) смешивали с НБЖ (0,4 мг/мл) и инкубировали 10 мин при 25°С, а затем добавляли Ф-актин из скелетных мышц кролика (0,4 мг/мл). В другом случае к миозину сначала добавляли Ф-актин, а затем уже НБЖ. Полимеризацию актина вызывали добавлением КС! до 60 мМ и MgC^ до 2 мМ. Таким образом, в обоих случаях конечный белковый состав был одинаков, различие состояло лишь в порядке добавления компонентов. В одной серии

Рис. 15. Электрофоретический анализ осадков, полученных после низкоскоростного центрифугирования миозина в присутствии Ф-актина и НБЖ: (2) -миозин (0,1 мг/мл) инкубирован с Ф-актином (0,4 мг/мл) в течение 10 минут, затем добавлены НБЖ (0,4 мг/мл); (3) - миозин сначала инкубирован с НБЖ в течение 10 минут, затем добавлен Ф-актин; (1) - смесь НБЖ и Ф-актина; (4) - миозин. А - актин; Ф -флагеллин; ТЦМ - тяжелые цепи миозина; ЛЦМ - легкие цепи миозина.

Таблица 1. Влияние нитей жгутиков В. brevisvat. G.-B.p* на степень активации Мд2*- АТФазы миозина актином

Порядок добавления компонентов

Миозин Миозин + Ф-актин Миозин + НБЖ + Ф-актин Миозин + Ф-актин + НБЖ

Mg'^-АТФазная активность миозина, Мкмол Ф„ мг" мин'1

0,010 ± 0,002 0,130 ± 0,020 0,095 ±0,018

0,133 ± 0,012

Mg^-АТФазная активность миозина,

%

100 1300 950

1330

Число измерений = 4

29


экспериментов в полученных препаратах определяли М§2+-АТФазную активность миозина (Табл. 1). В другой серии экспериментов проводили осаждение при низкой ионной силе и определяли наличие актина и флагеллина в осадках миозина методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (рис. 15). В том случае, если первыми к миозину были добавлены НБЖ, они обнаруживались в осадках миозина наряду с актином и в сравнимых с ним количествах (рис.15, полоса 3). При этом степень активации М§2+-АТФазы миозина актином снижалась в среднем на 27% (Табл. 1). Если же первым к миозину был добавлен актин, то только он и обнаруживался в осадках миозина, тогда как флагеллин там практически отсутствовал (рис. 15, полоса 2). Степень активации А/^2+-АТФазы миозина актином в этом случае не зависела от присутствия НБЖ (табл. 1).

Результаты работы свидетельствуют о возможности флагеллина в составе НБЖ связываться с миозином, влиять на его АТФазную активность и в некоторой степени даже конкурировать с Ф-актином за такое связывание. Необходимо подчеркнуть, что это свойство не является особенностью НБЖ какого-то одного вида бактерий. Все результаты получены на жгутиках представителей г(-) и г(+) бактерий {E.coli MS 1350, B.brevis var.G.-B.p+, B.subtilis 168).

В отличие от Ф-актина, НБЖ связываются с миозином довольно медленно. Кроме того, Ф-актин, связавшись с миозином, вообще лишает НБЖ такой возможности. Все это говорит о достаточно низком сродстве НБЖ к миозину по сравнению с Ф-актином. С другой стороны, данные по конкуренции НБЖ и Ф-актина за центры связывания на миозине (рис. 15, табл. 1) свидетельствуют в пользу того, что ответственный за связывание НБЖ участок в головках миозина если и не совпадает полностью с актинсвязывающим участком, то, по крайней мере, близок к нему.

Интересен факт полного отсутствия связывания мономерного флагеллина жгутиков всех изученных бактерий с миозином и влияния его на АТФазную активность миозина. Нечто подобное наблюдается и у актина. Так, мономерный Г-актин, хотя и обладает способностью связываться с миозином, но не способен активировать М§2+-АТФазу миозина (Estes & Gershman, 1978; Lheureux & Chaussepied, 1995). По-видимому, специфическое взаимодействие с миозином осуществляется в этом случае лишь целой структурой (Ф-актином). Также предполагается, что участок связывания миозина для такого взаимодействия должен быть сформирован двумя соседними мономерами актина (Estes & Gershman, 1978). По аналогии можно предположить такую же модель взаимодействия флагеллина в составе НБЖ с миозином. Нужно заметить, что

30


миозин связывается только с флагеллиновой НБЖ, но никак не с другой полимерной белковой структурой БЖ - крюком. Это означает, что важна именно природа белка, а не его полимерное состояние.

Миозин находится внутри клетки, а НБЖ вне ее, поэтому трудно допустить какой-либо физиологический смысл взаимодействия миозина с НБЖ. По-видимому, речь может идти только о возможности некоторого структурного сходства актина и флагеллина и о некоторых общих свойствах их полимерных форм. Однако почему именно такой далекий от актомиозиновой системы белок флагеллин обнаружил сходство с актином?

До недавнего времени считали, что в бактериях отсутствуют актиновый и тубулиновый цитоскелеты, характерные для эукариотических клеток. Исследования последних лет показали, что в бактериях имеются белки, гомологичные актину (МгеВ и РагМ) (Van den Ent et al., 2001; Egelman, 2003) и тубулину (FtsZ белок) (Nogales et al., 1998; Erickson, 1995; De Pereda et al., 1996). Факт появления сведений о белках бактериального цитоскелета инициирует изучение механизма подвижности, основанного на этих белках, уже в бактериальной клетке. Появление работ современного методологического уровня о существовании актин- и тубулин-подобных белков в бактериальной клетке оказалось важным и для нас. Ранее были сообщения об актиноподобном белке в бактериальных клетках, способном связываться с мышечным миозином (Nakamura & Watanabe, 1978; Somaya & Tanaka, 1979), а также взаимодействовать с миозинподобным белком из бактерий (Nakamura et al., 1978), однако, развития эти работы не получили. Еще в 1982 г. мы высказали предположение, что одной из возможных причин обнаруженного сходства в свойствах флагеллина и мышечного актина может быть общее происхождение данных белков. Известно, что актин, присутствующий во всех типах клеток, включая, как теперь становится очевидным, бактериальную клетку, является консервативным полифункциональным белком (Poglazov, 1983). Можно предположить, что какой-то эволюционный предок этого белка, способный образовать хорошо упорядоченную структуру, вполне мог бы дать начало не только самому актину, но и тубулину, и флагеллину. Затем на протяжении длительной эволюции эти белки сохранили способность взаимодействовать с миозином. Ранее это было продемонстрировано для тубулина (Shimo-Oka et al., 1980). В процессе эволюции актин принял участие в формировании актомиозиновых систем биологической подвижности в эукариотических клетках и изменился весьма незначительно, так как всегда находился внутри клетки. А флагеллин, «вышедший» за пределы клетки, принял участие в формировании двигательного аппарата бактерий. В процессе эволюции бактериальным клеткам приходилось приспосабливаться к самым разным

31


условиям и средам обитания, что не могло не отразиться на флагеллине НБЖ, локализованных снаружи клеток. В результате флагеллин претерпел в процессе эволюции значительные изменения, о чем свидетельствует, к примеру, как большой разброс в значениях молекулярных масс флагеллинов у разных бактерий, так и их разная антигенная специфичность.

В дополнение к вышесказанному можно привести пример еще одного сходства белков разных биологических систем. Это обнаруженная не так давно гомология между FHI базального тела БЖ и Р субъединицей бактериальной F0

F| АТФазы, а также вакуолярной и архебактериальной АТФазами (Volger et al., 1991). Авторы предположили, что эти белки (АТФазы) разошлись от общего предка в одно и то же время.

3. Изучение структуры органелл подвижности архей. 3.1. Изучение нитей жгутиков галофильных архей.

Длительное время занимаясь изучением структуры и свойств БЖ как органелл подвижности прокариот, мы не могли не обратить внимание на жгутики архебактерий. Первые эксперименты, проведенные нами, показали, что жгутики архей (ЖА) значительно отличаются от БЖ. Были изолированы нити жгутиков Halobacterium halobium Flx3 и Halobacterium salinarium BKMB-1231 и изучен их белковый состав методом ЭФ в ПААГ. Нити жгутиков Н. halobium были представлены тремя полосами (флагеллины Flal, Flail, Flalll), разбитыми на отдельные тонкие подполосы в виде "лестницы", что является результатом гликозилирования флагеллинов архей (Alam & Osterhelt, 1984). Значения молекулярных масс для флагеллинов жгутиков Halobacterium halobium Flx3 составляли: Flal - 25 кДа, Flail - 28 кДа, Flalll - 37 кДа. Нити жгутиков Halobacterium salinarium BKMB-1231 были представлены четырьмя полосами с молекулярными массами 23 кДа, 25 кДа, 28 кДа, 31 кДа. Следует отметить, что белковый состав нитей жгутиков архей (НЖА) Н salinarium оказался отличным от того же самого у Н. halobium. Кроме того, наблюдалось явное различие в характере полос, поскольку у флагеллинов Н. salinarium отсутствует «лестница», характерная для сульфогликопротеинов и ярко выраженная у флагеллинов Н. halobium. Более того, было показано, что антитела, полученные к флагеллинам Н. salinarium, не реагируют с флагеллинами Н. halobium (Сперанский, 1996). Поскольку не так давно два вида архей - Н. halobium и Н. salinarium — объединили в один вид - Н. salinarium, мы считаем, что данные результаты представляют интерес для микробиологов.

На электронномикроскопических фотографиях нити жгутиков Н halobium и Н. salinarium отличаются от НБЖ. У НБЖ иногда даже просматривается укладка субъединиц флагеллина в составе нити, чего никогда не наблюдалось у

32


жгутиков Н. halobium и Н. salinarium. Диаметр нитей жгутиков B.brevis var.G.-В.р+ составляет 12 нм, у Е. coli MS 1350 - 14 нм. Диаметры нитей жгутиков Н. halobium Flx3 и Н. salinarium ВКМВ-1231 в два раза меньше и составляют ~6 нм.

Белковый состав и структура НЖА в настоящее время составляют отдельную область изучения жгутиков архей (Jarrell et al., 1993, 1996; Fedorov et al., 1994). Внутриклеточная часть жгутиков архей практически не была исследована, поэтому мы обратились именно к этой проблеме и, используя в качестве представителя архей экстремальный галофил Н. salinarium, изучили внутриклеточное крепление его жгутиков методом электронной микроскопии.

3.2. Изучение структуры внутриклеточной части жгутиков галофилъных архей.

Присутствие в среде выращивания высокой концентрации NaCl не позволяет получить методом негативного контрастирования достаточно качественные препараты, на которых можно было бы изучать строение жгутикового аппарата в интактных и лизированных клетках Н. salinarium. Предварительная фиксация глутаровым альдегидом позволяет лишь незначительно снизить концентрацию NaCI.

Рис.16. Полюс клетки Н. salinarium ВКМВ-1231 со жгутиками. Негативное контрастирование фосфорновольфрамовой

кислотой; масштабная линейка— 100 нм.

Применение жестких воздействий, в том числе обработка детергентами и ДНКазой, дает результаты, которые трудно интерпретировать. Тем не менее, просмотр большого числа негативно контрастированных препаратов позволил сделать одно существенное наблюдение: жгутики выходят из клеточной стенки

33


все вместе, пучком (рис. 16). Иногда на таких препаратах просматривалась некая обширная внутриклеточная структура. Однако понять, расположена ли наблюдаемая структура в толще клеточной стенки или глубже в цитоплазме, было затруднительно. В подобных случаях обычно используют ультратонкие срезы объекта.

Рис. 17. Дискообразная пластинчатая структура (ДПС) на полюсе клетки Н. salinarium при большом увеличении.

ДПС обозначена стрелкой. Масштабная линейка - 50 нм

Мы не обнаружили никаких специализированных структур в области прохождения жгутиков галобактерий через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану (ЦМ), где, как известно, у жгутиков бактерий расположены диски базального тела. Однако, на срезах клетки Н. salinarium отчетливо видно, что жгутики пересекают ЦМ и проходят внутрь клетки. При этом их основания связаны вместе сложной структурой. На продольном срезе через клетку эта структура выглядит как электронноплотная линия длиной до 250-300 нм, расположенная в основании пучка жгутиков параллельно ЦМ (рис. 17). Анализ серийных срезов (рис. 18) показал, что такие линии представляют собой поперечные сечения пластинки дисковидной формы, и эта пластинка всегда расположена на полюсе клетки на расстоянии приблизительно 20 нм от ЦМ точно в месте вхождения в клетку пучка жгутиков. Эта электронноплотная линия видна в среднем на пяти

34


Рис. 18. Серии последовательных срезов через полюс клетки H.salinarium. Фиксация глутаровым альдегидом-четырехокисью осмия, толщина срезов 60-80 нм. Стрелка указывает на ДПС в основании пучка жгутиков.

Масштабная линейка - 100 нм.

последовательных срезах толщиной 60-70 нм (при этом, очевидно, она занимает не всю толщину первого и последнего срезов); своей максимальной протяженности она достигает на срединных срезах. Биполярные клетки с двумя пучками жгутиков имели, соответственно, по две таких электронноплотных линии. Мы назвали эту структуру, состоящую из ряда слоев, дискообразной пластинчатой структурой (ДПС) (рис.17,18). Морфология слоев этой структуры и их взаимное расположение

35


соответствуют существующим представлениям о том, как должны выглядеть на электронномикроскопических препаратах мембраны, фиксированные четырехокисью осмия (Sjostrand, 1960). Для проверки предположения о наличии в составе ДПС мембранной структуры были проведены эксперименты по фиксации галобактерий перманганатом калия, а также по экстракции липидов метанол-хлороформом. Поведение мембранных структур в этих условиях подробно описано (Riemersma, 1966; Afzelius, 1962; Stoeckenius, 1962; Napolitano et al., 1967), так что такие воздействия позволяют делать выводы относительно химической природы выявляемых структур. Результаты нашей работы в какой-то мере предполагают сходство ДПС с мембранной структурой.

Здесь же нужно добавить, что применение метода получения «теней» путем обработки клеток перед фиксацией растворами с пониженной концентрацией NaCl позволило увидеть детали строения ДПС. В частности, хорошо различимы слабоокрашенные нитевидные структуры, связывающие ДПС с цитоплазматической мембраной. Толщина этих структур ~ 3-5 нм. (Сперанский, 1996).

Анализ серийных срезов клеток Н. salinarium обнаружил присутствие вблизи их полюсов еще одной сложноорганизованной структуры, напоминающей на первый взгляд ДПС, но имеющей совершенно другое строение и локализацию (электронные микрофотографии представлены в диссертации). Эта структура никогда не простирается в зону вхождения в клетку жгутиков и находится по обе стороны ДПС. Кроме того, эта структура не слоистая как ДПС, а состоит из отдельных глобул, соединенных электронноплотными мостиками с внутренней стороной ЦМ. Одинаковый вид этой структуры на продольных и поперечных срезах через клетку позволяет предположить, что она состоит из повторяющихся субъединиц, упакованных в двумерный пласт, прилегающий к ЦМ. Эта структура отстоит от мембраны приблизительно на то же расстояние, что и ДПС. Серийные срезы выявляют сложную форму данного образования, простирающегося на десятые доли микрометра в продольном и поперечном направлениях вдоль ЦМ, к которой оно тесно прилегает. По своей локализации и ультраструктуре эта обнаруженная нами в клетках галофильного археона Н. salinarium структура напоминает известную уже более 30 лет так называемую «полярную мембрану» или «полярную органеллу» (ПО), встречающуюся у эубактерий с полярным жгутикованием (Murray & Birch-Andersen, 1963).

3.3.Цитохимическое выявление АТФазной

активности субплазмалемных структур в клетках галобактерий. Для проверки предположения об идентичности обнаруженной нами в

клетках Н. salinarium субплазмалемной структуры, располагающейся по обе 36


стороны от ДПС, «полярной органелле» эубактерий, которая обладает АТФазной активностью (Tauschel, 1985), а также с целью дальнейшей характеристики самой ДПС была проведена цитохимическая локализация АТФазной активности на срезах клеток Н. salinarium В-1231 с использованием модифицированного метода Вахштейна-Майзель (Wachstein & Meisel, 1957; Tauschel, 1988). Метод заключается в «захвате» ионами свинца неорганического фосфата с образованием нерастворимого осадка гидроксиапатита свинца РЬ5(Р04)ОН на месте гидролиза АТФ. Высокая электронная плотность образующегося осадка, наряду с минимальной диффузией, позволяет использовать данную процедуру для электронномикроскопического наблюдения активности фермента. После проведения цитохимической реакции клетки подвергаются традиционной обработке для электронной микроскопии.

Известно, что альдегиды как химические фиксаторы, образуя поперечные сшивки в структуре белков, снижают активность ферментов (Wachtel et al., 1959; Sabatini et al., 1963). Были использованы три варианта: 1) с префиксацией формальдегидом; 2) с префиксацией глутаровым альдегидом; 3) без префиксации, когда живые клетки помещали непосредственно в инкубационную среду (электронные микрофотографии приведены в диссертации). Сильная АТФазная реакция наблюдалась на срезах клеток Н. salinarium В-1231 только в местах локализации «полярной органеллы», но не ДПС, после инкубации клеток в среде с субстратом без предварительной префиксации. В контрольных опытах - без добавления субстрата -электронноплотного осадка не наблюдалось. При инкубации предфиксированных формальдегидом клеток в среде с АТФ в области «полярной органеллы» наблюдалось уменьшение образования электронноплотного осадка. В опытах по инкубации клеток в среде с АТФ после префиксации глутаровым альдегидом наблюдалось полное отсутствие электронноплотного осадка в области "полярной органеллы". Отсутствие признаков АТФазной реакции после префиксации клеток глутаровым альдегидом и ее значительное ослабление в результате их префиксации формальдегидом указывает на то, что наблюдаемый электронноплотный осадок действительно является результатом ферментативного гидролиза АТФ в области локализации "полярной органеллы".

3.4. Изолирование кэповидных структур из клеток Halobacterium salinarium и Natronobacterium magadii.

Многолетние усилия ряда лабораторий по выделению из клеток галобактерий жгутиковых базальных структур до сих пор, по существу,

37


безуспешны. Не так давно (Kupper et al., 1994) биохимическими методами из клеток Н. salinarium были выделены жгутики, основания которых связаны некими недетализированными дисковидными структурами (так называемыми кэповидными структурами), очень напоминающими обнаруженную нами на тонких срезах клеток Н. salinarium ДПС. Несколько модифицировав предложенную методику выделения подобных структур, мы изолировали аналогичные комплексы жгутиков с кэповидными структурами (КС) из клеток Н. salinarium В-1231 и из клеток другого представителя архей -Natronobacterium magadii B-l 751.

Рис. 19. Электронномикроскопические микрофотографии изолированных из клеток Н. salinarium (а) и Natronobacterium magadii (б) кэповидных

структур со жгутиками при разном увеличении. Масштабная линеГжа - 500 нм (а); 400 нм (б)

38


На рис. 19 представлены электронномикроскопические фотографии КС из Н. salinarium и N. magadii. Диаметр этих дисковидных структур находится в интервале -250-400 нм. Они гораздо более чувствительны к снижению концентрации NaCl и действию детергентов, чем сами жгутики. Из-за высокой их лабильности изучение этих дискообразных структур представляет непростую задачу.

3.5. Зй-реконструкция полюса клетки Halobacterium salinarium на основе серийных ультратонких срезов.

На основе электронномикроскопических фотографий серийных ультратонких срезов был реконструирован полюс клетки Н. salinarium 4W12 с помощью программы Multivox. Работа проведена совместно с сотрудником отдела электронной микроскопии НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова канд. биол. наук Киреевым И.И. (реконструкция полюса клетки H.salinarium 4W12 приведена в диссертации).

Все вышеприведенные результаты по изучению тонких срезов клеток экстремального галофила Н. salinarium позволили нам констатировать присутствие на полюсах клеток в местах вхождения жгутиков в клетку новой, ранее не описанной и отсутствующей у эубактерий структуры - ДПС. Вторая обнаруженная нами структура располагается по обе стороны от ДПС, отличается от нее и напоминает «полярную органеллу» эубактерий. Дополнительным сходством с «полярной органеллой» является положительное окрашивание этой структуры при проведении цитохимической реакции на АТФазную активность. Одновременно показано, что ДПС АТФазной активностью не обладает.

Таким образом, из двух идентифицированных на полюсе архебактериальной клетки структур, одна (ДПС) имеет явное отношение к аппарату подвижности этого организма, а вторая (ПО) связана с какими-то жизненно важными функциями прокариотической клетки, общими для бактерий и архей, но, очевидно, не связанными с работой жгутиков.

Принципиально иная организация клеточной стенки у архей (Firtel et al., 1993) позволяет предположить, что и жгутики их закреплены иначе, чем у эубактерий. Так, археон Tliermoplasma acidophilum как будто вообще лишен клеточной стенки, но тем не менее имеет жгутики и подвижен (Black et al., 1979). Некие мембраноподобные образования в основании жгутиков обнаружены и у метаногенов (Jarrell & Koval, 1989). Все это свидетельствует в пользу того, что жгутики в клетках архей закреплены при помощи специализированных структур, подобных описанной нами ДПС.

39


Из имеющихся предварительных данных по выделению жгутиков архей со связывающими их основания дискообразными структурами (Kupper et al., 1994; наши данные) следует, что основания жгутиков архей, по-видимому, действительно базируются на некоем плато, погруженным в цитоплазму. Причина такого крепления жгутиков архей, возможно, связана с экстремальными условиями обитания архей. Но это только одно из возможных предположений.

Заключение В представленной работе проведено изучение структуры и свойств

органелл подвижности (жгутиков) бактерий и архей и их сравнение как функциональных составляющих организмов, принадлежащих к разным биологическим царствам. Изучение подвижности и сокращения у высших организмов имеет гораздо более глубокую историю, а жгутики бактерий и архей долгое время оставались на периферии мировой науки. И только к концу 70х - началу 80х годов уже прошлого столетия началось активное изучение этого интереснейшего аппарата живых систем, поражающего исследователей своей рациональностью и эстетикой устройства.

Основными задачами данного исследования было изучение «интактной» структуры бактериальных жгутиков и конформационных изменений флагеллина при самосборке их нитей in vitro как аналогии процесса сборки нитей бактериальных жгутиков in vivo, а также сравнение структуры бактериальных жгутиков со структурой архебактериальных жгутиков.

Модификация остатков тирозина (в составе молекулы флагеллина Bacillus brevis var. G.-B. p их оказалось всего два) показала, что один из них локализован на поверхности нити, а другой, по-видимому, находится в зоне гидрофобного взаимодействия между молекулами флагеллина. Модифицированный флагеллин, потеряв способность к полимеризации и сохранив при этом свою конформационную целостность, позволил регистрировать изменение конформации флагеллина до его включения в полимер. Если конформационная перестройка флагеллина происходит до его непосредственного включения в полимер, то в условиях, где равновесие системы флагеллин fF* НБЖ резко сдвинуто в сторону образования полимера, можно регистрировать конформационные изменения этого белка перед его полимеризацией. Для экспериментальной проверки такой возможности, а одновременно для изучения механизма сборки флагеллина, нами был разработан способ практически мгновенной полимеризации флагеллина в нити, неотличимые от интактных, в присутствии полиэтиленгликоля. Было обнаружено, что полиэтиленгликоль, воздействуя на этап нуклеации, ускоряет сборку жгутиков, предохраняя при этом флагеллин от разрушения

40


протеолитическими ферментами. Скорость сборки нитей жгутиков в присутствии полиэтиленгликоля оказалась равной скорости их роста на живой клетке. Все полученные результаты по сборке нитей жгутиков В. brevis var. G,-В. р+ в присутствии полиэтиленгликоля позволяют рассматривать этот реагент как создающий некую модель роста нитей бактериальных жгутиков на живой клетке и предположить, что высокая скорость роста нитей бактериальных жгутиков в присутствии полиэтиленгликоля обусловлена его воздействием на конформационное состояние флагеллина до встраивания его в полимер.

Результаты данной работы по обнаружению некоторых общих свойств нитей бактериальных жгутиков и Ф-актина на первый взгляд кажутся парадоксальными. Наши соображения о причинах подобного сходства изложены выше. Считаем, что сравнительное изучение флагеллина и актиноподобного белка из бактерий могло бы способствовать выяснению причин обнаруженного явления.

Рис. 20. Схематическое изображение полюса клетки Halobacterium salinarium: Ж - жгутики, КС - клеточная стенка, ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, ДПС - дискообразная пластинчатая структура, ПО - полярная органелла. Масштаб не соблюден.

к с no III!'

БАКТЕРИИ АРХЕИ

Рис. 21. Сравнение структуры жгутикового аппарата Halobacterium salinarium и бактерии лофотриха (продольный разрез): Ж - жгутики, КС -клеточная стенка, НМ - наружная мембрана, ПГС - пептидогликановый слой, ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, К - крюк, БТ - базальное тело, ЦК -цитоплазматический компонент бактериального жгутика, ПО - полярная органелла, ДПС - дискообразная пластинчатая структура.

41


Базальное тело бактериального жгутика пока остается загадкой с точки зрения того, как энергия протонного градиента на цитоплазматической мембране осуществляет его вращение. И совсем пока непонятно, как этот процесс происходит у архей, поскольку нет ясности даже в способе крепления архебактериального жгутика в клетке. Представленная работа в этой ее части органично встраивается в исследования мировой науки по проблеме подвижности прокариот, поскольку нам впервые удалось экспериментально подтвердить предположение о существовании у архебактериальной клетки внутриклеточного плато, на котором крепятся ее жгутики, продемонстрировать эту структуру и осуществить реконструкцию полюса клетки галофила на основании ее серийных срезов.

На основе представленных результатов и уже имеющихся в литературе данных можно аргументированно констатировать явное различие структурной организации БЖ и ЖА, несмотря на внешнее их сходство. На рис. 20 и 21 представлены предлагаемые нами схемы строения клеточных фрагментов клеток бактерий и архей со жгутиками.

Несмотря на множество фактов, свидетельствующих о фундаментальном различии бактерий и архей как отдельных биологических доменов (царств) и, в частности, их систем подвижности, имеются и факты, ставящие дополнительные вопросы в отношении происхождения и эволюции этих организмов. К ним относится сходство сенсорных систем бактерий и архей (Fguy & Jarell, 1999), а также демонстрация возможности горизонтального переноса в эволюции генов флагеллинов жгутиков бактерий и архей (Serganova et al., 2002).

ВЫВОДЫ 1. Изолированы нити и флагеллин бактериальных жгутиков Bacillus brevis var.

G.-B.p+ и изучены их физико-химические свойства. Показано, что данный флагеллин является типичным представителем этого класса белков.

2. С целью выяснения механизма сборки нитей бактериальных жгутиков изучено изменение конформации флагеллина при переходе его от мономерного состояния к полимерному. Для этого а) проведена химическая модификация флагеллина жгутиков Bacillus

brevis var. G.-B. p+ по тирозину, в результате чего получен флагеллин со свойствами интактного белка, но не способный к полимеризации; изучена роль тирозина в поддержании структуры нитей данных бактериальных жгутиков;

б) разработан способ быстрой полимеризации флагеллина бактериальных жгутиков Bacillus brevis var. G.-B. p+ в присутствии полиэтиленгликоля;

42


изучены физико-химические свойства впервые реконструированных в присутствии полиэтиленгликоля нитей бактериальных жгутиков и показано, что они идентичны нативным и реконструированным в обычных условиях нитям бактериальных жгутиков; изучены условия полимеризации флагеллина бактериальных жгутиков в присутствии полиэтиленгликоля;

в) изучено влияние высаливающих агентов (сульфата аммония и полиэтиленгликоля) на конформацию мономерного флагеллина в условиях полимеризации данного белка; продемонстрирована способность флагеллина бактериальных жгутиков к конформационной перестройке до включения его в состав полимера; обсуждается механизм полимеризации флагеллина бактериальных жгутиков.

3. Впервые изолированы «интактные» жгутики из нескольких грамотрицательных и грамположительных бактерий и исследована структура их базальных тел; методом электронной микроскопии продемонстрировано присутствие дополнительного компонента мотора бактериальных жгутиков в цитоплазме вблизи цитоплазматической мембраны эубактерий, теряющегося при выделении «интактных» жгутиков биохимическими методами.

4. Впервые методом электронной микроскопии обнаружена способность нитей жгутиков Escherichia coli MS1350, Bacillus brevis var. G.-B. p*, Bacillus subtilis 168 специфическим образом связывать субфрагмент 1 миозина скелетных мышц. Показано, что нити бактериальных жгутиков соосаждаются с миозином, ингибируют его АТФазную активность и конкурируют с Ф-актином скелетных мышц за центры связывания на миозине. Установлено, что мономерный флагеллин не соосаждается с миозином и не влияет на его АТФазную активность. Способностью взаимодействовать с миозином обладает только полимерная форма флагеллина (нити бактериальных жгутиков). Обсуждаются возможные причины сходства белков, входящих в столь эволюционно отдаленные системы биологической подвижности.

5. Впервые методом электронной микроскопии обнаружен и описан новый структурный элемент в составе жгутикового аппарата галофильных архей. Показано, что жгутики галобактерий значительно глубже погружены в цитоплазму, чем это наблюдается у эубактерий, и их основания закреплены особой дискообразной пластинчатой структурой (ДПС). ДПС имеет сложное строение и включает, возможно, мембраноподобное образование. Обнаруженная в клетках галобактерий ДПС достаточно прочно связана с цитоплазматической мембраной.

43


6. В клетках галобактерий обнаружен еще один внутриклеточный структурный компонент непосредственно вблизи цитоплазматической мембраны с двух сторон от ДПС, аналогичный так называемой "полярной органелле" бактерий с полярным жгугикованием. Данная структура существенно отличается от ДПС по строению и расположению в клетке. При проведении цитохимической реакции по методу Вахштейна-Майзель обнаружена АТФазная активность "полярной органеллы". В отличие от нее ДПС не обнаруживает АТФазной активности.

7. Впервые на основе серийных ультратонких срезов клетки Halohacterium salinarium осуществлена реконструкция внутриклеточной части аппарата подвижности представителя домена (царства) Archaea.

8 Изолированы комплексы жгутиков с кэповидными структурами из клеток другого представителя Archaea - галоалкалофила Natronobacterium magadii (Natrialba magadii). На основе полученных в работе экспериментальных данных и анализа уже имеющихся в литературных источниках предложены схемы строения фрагментов клеток эубактерий и архей с аппаратами их подвижности.

9 Представлен аналитический сравнительный анализ структуры и свойств органелл подвижности (жгутиков) бактерий и архей как функциональных элементов двух разных представителей прокариотических организмов.

Список опубликованных по теме диссертации работ.

1. Метлина А.Л. (1981) Бактериальные жгутики. - В сб.: "Немышечные двигательные системы" по материалам доклада на П-ом Совещании "Немышечные формы подвижности", Пущино, 1976. с. 30-45.

2. Метлина А.Л. (1995) Белки бактериальной системы подвижности. - В кн. «Белки и пептиды», ч. 1, «Двигательные белки». Изд-во «Наука», с. 311-314.

3. Метлина А.Л. (2001) Жгутики прокариот как система биологической подвижности. - Успехи биол. химии, т. 41, с. 229-282.

4. Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. (1970) Изучение конформационных изменений флагеллина при самосборке методом дисперсии оптического вращения. -Биохимия, т. 35, с. 994-1001.

5. Poglazova M.N., Birjuzova V.I., Medina A.L., Mishina T.I., Poglazov B.F. (1978) The structure and physico-chemical properties of bacterial flagella. - Acta Protozoologica Int. Sympos. Cell Motility, Warzawa, Poland, v. 18, p. 191.

44


6. Бирюзова В.И., Поглазова М.Н., Метлина А.Л., Мишина Т.Н., Поглазов Б.Ф. (1979) Структура и физико-химические свойства бактериальных жгутиков. -

. Микробиология, т. XIVIII, вып. 5, с. 868-872.

7. Новиков В.В., Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. (1980) Способ полимеризации флагеллина. - Авторское свидетельство № 3008188/13 от 17.10.1980.

8. Поглазов Б.Ф., Метлина А.Л., Новиков В.В. (1981) Современные представления о механизме движения бактерий. — Известия АН СССР, сер. биол.,№5, с. 672-690.

9. Новиков В.В., Метлина А.Л., Митина Н.А., Топчиева И.Н., Поглазов Б.Ф. (1981) Полимеризация флагеллина бактериальных жгутиков в присутствии полиэтиленгликоля. - Биохимия, т. 46, с. 1333-1336.

10. Новикова Н.А., Метлина А.Л., Левицкий Д.И., Поглазов Б.Ф. (1983) Декорирование нитей бактериальных жгутиков субфрагменом I миозина. -Доклады АН СССР, т. 269, № 5, с. 1252-1255.

11. Новикова Н.А., Метлина А.Л., Зарубина А.П., Поглазов Б.Ф. (1984) Изучение структуры базальных тел жгутиков B.brevis var. G.-B.p . - Микробиология, т. 53, вып. 1,с. 103-107.

12. Новикова Н.А., Левицкий Д.И., Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. (1983) Взаимодействие нитей бактериальных жгутиков с миозином. -Молекулярная биология, т. 6, с. 1227-1235.

13. Bakeeva L.E., Chumakov K.M., Drachev A.L., Medina A.L., Skulachev V.P. (1986) The sodium cycle. III. Vibrio alginolyticus resembles Vibrio cholerae and some other vibriones by flagellar motor and ribosomal 5S-RNA structures. -Biochim. Biophys. Acta, v. 850, p. 466-472.

14. Бакеева Л.Е., Чумаков К.М., Драчев А.Л., Метлина А.Л., Скулачев В.П. (1987) Сходство Vibrio alginolyticus и некоторых других вибрионов по строению флагеллярного мотора и структуре рибосомальной 5S РНК. -Биохимия, т. 52, вып. 1, с. 8-14.

15. Мельник СИ., Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. (1988) Изучение структуры базальных тел жгутиков Erwinia chrysanthemii. — Микробиология, т. 57, вып. 3, с. 431-434.

16. Метлина А.Л., Бакеева Л.Е. (1989) Существование дополнительных структурных компонентов в базальных телах жгутиков Е. coli и Vibrio alginolyticus. - Микробиология, т. 58, вып. 4, с. 624-626.

45


17. Бакеева Л.Е., Метлина А.Л., Новикова Т.М., Сперанский В.В. (1992) Ультраструктура двигательного аппарата Halobacterium salinarium. -Доклады РАН, т. 326, с. 914-915.

18. Серганова И.С., Полосина Я.Ю., Костюкова А.С., Метлина А.Л., Пятибратов М.Г., Фудоров О.В. (1995) Жгутики галофильных архей: биохимический и генетический анализ. - Биохимия, т. 60, вып. 8, с. 1261-1267.

19. Novikov V.V., Metlina A.L., Poglazov B.F. (1994) A study on the mechanism of polymerization of Bacillus brevis flagellin. -Biochem. Mol. Biol. Intern., v. 33, p. 723-728.

20. Сперанский В.В., Метлина А.Л., Новикова Т.М., Бакеева Л.Е. (1996) Дискообразная пластинчатая структура как часть жгутикового аппарата архей. - Биофизика, т. 41, с. 159-163.

21. Novikova N.A., Levitsky D.I., Metlina A.L., Poglazov B.F. (2000) Interaction of bacterial flagellum filaments with skeletal muscle myosin. - IUBMB Life, v. 50, p. 385-390.

22. Новиков В.В., Новикова Н.А., Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. (1982) Изучение строения и механизма самосборки бактериальных жгутиков. - Сборник трудов I Всессоюзного биофизического съезда, Москва, с. 66.

23. Новикова Н.А., Левицкий Д.И., Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. (1982) Взаимодействие субфрагмента I миозина с бактериальными жгутиками.' — Сборник трудов I Всесоюзного биофизического съезда, Москва, с. 67.

24. Poglazov B.F., Novikova N.A., Levitsky D.I., Metlina A.L. (1984) Interaction of bacterial flagella with myosin. - J. Muscle Res. Cell Motility, v. 5, p. 243.

25. Metlina A.L., Bakeeva L.E. (1989) An additional structural component in the flagellum basal bodies of E. coli and V. alginolyticus. - Absrtacts Intern. Symposium "Molecular organization of biological structures", part II, Moscow, p. 166.

26. Bakeeva L.E., Metlina A.L., Novikova T.M., Speransky V.V. ( 1994) A disk-like lamellar structure as part of the flagellar apparatus of Halobacterium salinarium. -Abstracts Internat. Symposium "Biological Motility", Pushchino, p. 275-276.

27. Serganova I.S., Polosina Y.U., Kostyukova A.S., Metlina A.L., Pyatibratov M.G., Fedorov O.V. (1994) Comparison of morphology and subunits composition of Halophilic archaebacterial flagella. - Abstracts Internat. Symposium "Biological Motility", Pushchino, p. 285-286.

46


28. Серганова И.С., Серганов А.А., Метлина А.Л., Федоров О.В. (1997) Клонирование и секвенирование генов, кодирующих белки жгутиков

. галоалкалофильного археона Natronobacterium magadii. - Тезисы I съезда биохимического общества РАН, Москва, с. 358.

Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме по клеточной подвижности (Варшава, 1978); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); V Всесоюзном совещании по немышечным формам подвижности (Чернигов, 1988); Международном симпозиуме «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 1994); Московском семинаре по клеточной биологии (Биологический ф-т МГУ, 2000).

47


Типография ИМАШ РАН, г. Москва, М. Харитоньевский пер., 4 Лиц. ЦЦ К» 00492 от 12.04.2000 Зак. Hi 35?>от;СР • Н 20ОЗ- тир. ^ О экз.


Documents

401.биохимический и ультраструктурный анализ аппарата подвижности бактерий и архей