Nuôi cấy sâm ngọc linh Nuôi cấy sâm ngọc linh thu nhận gisenosidesthu nhận gisenosides

Thành viên:Thành viên:Đặng Xuân PhongĐặng Xuân PhongTrần Văn PhongTrần Văn Phong

Nguyễn Hoàng ÂnNguyễn Hoàng ÂnNguyễn Duy ĐạiNguyễn Duy Đại

• I. Tổng quan về sâm ngọc linhI. Tổng quan về sâm ngọc linh• II. Thành phần hóa học sâm ngọc linhII. Thành phần hóa học sâm ngọc linh• III. Quy trình nuôi cấy sâm ngọc linhIII. Quy trình nuôi cấy sâm ngọc linh• IV. Thu nhận ginsenosidesIV. Thu nhận ginsenosides

• I. Tổng quan về sâm ngọc linhI. Tổng quan về sâm ngọc linh1.Danh pháp1.Danh phápTTên khoa học ên khoa học :: Panax vietnamesis Ha et GrushyPanax vietnamesis Ha et Grushy

Giới (Giới (regnumregnum):): Plantae Ngành (Ngành (divisiodivisio):): MagnoliophytaLớp (Lớp (classclass):):Magnoliopsida Bộ (Bộ (ordoordo): Apiales ): Apiales Họ (Họ (familiafamilia): Araliaceae ): Araliaceae Phân họ (Phân họ (subfamiliasubfamilia): ): AralioideaeAralioideae Chi (Chi (genusgenus): Panax ): Panax Phân chi (Phân chi (subgenussubgenus): ): PanaxPanax Nhánh (Nhánh (sectionsection): ): PanaxPanax Loài (Loài (speciesspecies): ): P. vietnamensisP. vietnamensis

2. Đặc điểm sâm ngọc linh2. Đặc điểm sâm ngọc linh- Sâm Ngọc Linh mọc tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon Sâm Ngọc Linh mọc tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon

Tum và Quảng Nam trên độ cao 1.500 - 2.200 m. Tum và Quảng Nam trên độ cao 1.500 - 2.200 m.

- Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578m với lớp đất vàng đỏ trên đá 2.578m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit granit dày trên 50cm, có độ dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộngmùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng,nhiệt độ thích ,nhiệt độ thích hợp vào ban ngày là hợp vào ban ngày là 20°C-25°C20°C-25°C, ban đêm là :, ban đêm là :15°C -18°C15°C -18°C

- Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm đến Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm đến 100cm100cm

- Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân độ 4-8mm, thường tàn hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân độ 4-8mm, thường tàn lụi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong lụi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm. Thân rễ có đường kính 1-2cm, mọc bò ngang như củ vài năm. Thân rễ có đường kính 1-2cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinhhoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất độ 1-3cm, mang nhiều rễ trên hoặc dưới mặt đất độ 1-3cm, mang nhiều rễ nhánh và củ. nhánh và củ.

II. Thành phần hóa học của sâm.II. Thành phần hóa học của sâm.1. Thành phần hóa học của sâm1. Thành phần hóa học của sâm- Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin

hay gọi là ginsenosides (saponin hay gọi là ginsenosides (saponin có cấu có cấu trúc Damaran(với hai đại diện là nhóm trúc Damaran(với hai đại diện là nhóm protopanaxadiol và nhóm protopanaxadiol) protopanaxadiol và nhóm protopanaxadiol) và saponin có cấu trúc olean)và saponin có cấu trúc olean)

- Ngoài ra còn 14 axit béo,16 axit amin Ngoài ra còn 14 axit béo,16 axit amin (trong đó có 8 acid amin không thay thế), (trong đó có 8 acid amin không thay thế), 18 nguyên tố đa lượng và vi lượng.18 nguyên tố đa lượng và vi lượng.

- Sâm Việt Nam mới có hợp chất saponin Sâm Việt Nam mới có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol với Majonosid R2 dammaran kiểu ocotillol với Majonosid R2 chiếm hơn 50% hàm lượng saponinchiếm hơn 50% hàm lượng saponin

Công thức của Công thức của Majonosid R2 Majonosid R2

2. Tác động của sâm đến sức khỏe con người.2. Tác động của sâm đến sức khỏe con người.- Tác dụng bổ chung, tăng lực và sinh thích Tác dụng bổ chung, tăng lực và sinh thích

nghi (antistress), phục hồi sự suy giảm chức nghi (antistress), phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường mà khái niệm của y học cổ bình thường mà khái niệm của y học cổ truyền gọi là "hồi dương" truyền gọi là "hồi dương"

- Tác dụng chống lão hóa, kháng các độc tố Tác dụng chống lão hóa, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào, tăng tạo các tế bào mới bào, tăng tạo các tế bào mới

- Tác dụng kích thích điều hòa cơ chế miễn Tác dụng kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch, tăng sức đề kháng của cơ thể, phòng dịch, tăng sức đề kháng của cơ thể, phòng và chống lại một số bệnh ung thư (và chống lại một số bệnh ung thư (Rh2 và Rh2 và Rg3Rg3 ). ).

III. Quy trình nuôi cấy sâm ngọc linhIII. Quy trình nuôi cấy sâm ngọc linh

Nuôi trong môi trường MS

Callus( Mô sẹo đầu tiên)

Nuôi trong Erlen 100ml

Hệ thống nuôi cấy sinh học(Bioreactor)

Thu hồi sản phẩm

Khử trùng

Cắt mẫu

-Ta chọn những rễ sâm đã trưởng th-Ta chọn những rễ sâm đã trưởng thàành nh (khoảng trên 5 năm) cắt rễ l(khoảng trên 5 năm) cắt rễ lààm mẩu. Khử m mẩu. Khử trtrùùng mẩu với ethanol 70% sau đng mẩu với ethanol 70% sau đóó ngâm ngâm totoààn bộ mẫu trong dung dịch sodium n bộ mẫu trong dung dịch sodium hypochlorite khoảng 15 phhypochlorite khoảng 15 phúút, cuối ct, cuối cùùng rửa ng rửa dưới vòi nước cất khoảng 5 phdưới vòi nước cất khoảng 5 phúút. t.

- cho mẫu v- cho mẫu vàào trong đĩa petri chứa môi o trong đĩa petri chứa môi trường MS ctrường MS cóó bổ sung thêm 0.5mg/l 6- bổ sung thêm 0.5mg/l 6-benzyl-aminopurine (BAP), 3mg/l 1-benzyl-aminopurine (BAP), 3mg/l 1-naphaleneacetic acid (NAA) vnaphaleneacetic acid (NAA) vàà 30g đường 30g đường sucrose, nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25sucrose, nuôi trong điều kiện nhiệt độ 2500C C trong tối. Đặc biệt pH của môi trường phải trong tối. Đặc biệt pH của môi trường phải điều chỉnh ở mức 5.8 trước khi đem khử điều chỉnh ở mức 5.8 trước khi đem khử trtrùùng, khử trng, khử trùùng ở 121ng ở 12100C trong 15 phC trong 15 phúút.t.

- khi mô sẹo được h- khi mô sẹo được hìình thnh thàành. Cắt mo sẹo nh. Cắt mo sẹo chuyển sang môi trường SH. Kchuyển sang môi trường SH. Kíích thước mô ch thước mô sẹo cắt khoảng 1cm, cho vsẹo cắt khoảng 1cm, cho vàào erlen chứa o erlen chứa khoảng 40ml môi trường SH. Đồng thời khoảng 40ml môi trường SH. Đồng thời môi trường SH bổ sung thêm 0.5mg/l BAP, môi trường SH bổ sung thêm 0.5mg/l BAP, 3mg/l NAA, 30g/l đường sucrose. Đưa erlen 3mg/l NAA, 30g/l đường sucrose. Đưa erlen vvàào nuôi trong tối nhiệt độ lo nuôi trong tối nhiệt độ làà 25 2500C với tốc C với tốc độ lắc lđộ lắc làà 60 vòng/ph 60 vòng/phúút. t.

- pH của môi trường ta c- pH của môi trường ta cóó thể điều chỉnh ở thể điều chỉnh ở 5.0, 5.5, 6.5, 7.0, trước khi đưa môi trường 5.0, 5.5, 6.5, 7.0, trước khi đưa môi trường vvàào khử tro khử trùùng. Nồng độ đường, nitrogen, ng. Nồng độ đường, nitrogen, photphate điều chỉnh ở khoảngphotphate điều chỉnh ở khoảng 1-9%, 127.6- 1-9%, 127.6-1148 mg/l và 26.9-242.1mg/l. 1148 mg/l và 26.9-242.1mg/l.

  

Mô sẹo hình thành:Mô sẹo hình thành:

- - - Ngoài ra ta có thể Ngoài ra ta có thể nuôi mô sẹo trong nuôi mô sẹo trong bioreacor. Cắt ở mô bioreacor. Cắt ở mô sẹo một dài khoảng sẹo một dài khoảng 2mm đường kính 2mm đường kính 0.5cm cho vào 0.5cm cho vào bioreactor đã chứa bioreactor đã chứa môi trường SH.Tiến môi trường SH.Tiến hành nuôi trong điều hành nuôi trong điều kiện nhiệt độ là kiện nhiệt độ là 252500C, độ ẩm 70- C, độ ẩm 70- 80%, cường độ chiếu 80%, cường độ chiếu sáng là 45 mol.msáng là 45 mol.m-2-2.s.s--11.với chu kỳ chiếu .với chu kỳ chiếu sáng là 10h/ ngày.sáng là 10h/ ngày.

• Thành phần môi trường MS(Thành phần môi trường MS(1962)1962)• Thành phần khoáng đa lượng:Thành phần khoáng đa lượng:• NH4NO3……………………………………………1650mg./lNH4NO3……………………………………………1650mg./l• KNO3………………………………………………1900mg/lKNO3………………………………………………1900mg/l• CaCl2.2H20………………………………………440mg./lCaCl2.2H20………………………………………440mg./l• MgSO4.7H2O…………………………………..370mg./lMgSO4.7H2O…………………………………..370mg./l• KH2SO4…………………………………….170mg/lKH2SO4…………………………………….170mg/l•   Thành phần khoáng vi lượng:Thành phần khoáng vi lượng:• MnSO4.H2O………………………………….23,3mg/lMnSO4.H2O………………………………….23,3mg/l• ZnSO4.7H2O…………………………………8,6mg/lZnSO4.7H2O…………………………………8,6mg/l• H3BO3……………………………………….6,2mg/lH3BO3……………………………………….6,2mg/l• KI…………………………………………….0,83mg/lKI…………………………………………….0,83mg/l• Na2MoO4.2H2O……………………….0,25mg/lNa2MoO4.2H2O……………………….0,25mg/l• CuSO4.5H2O……………………………0,025mg/./CuSO4.5H2O……………………………0,025mg/./• CoCl2.6H2O…………………………….0,025mg/lCoCl2.6H2O…………………………….0,025mg/l• Na2EDTA……………………………….37,30mg/lNa2EDTA……………………………….37,30mg/l

• FeSO4.7H2O……………………………27,8mg/lFeSO4.7H2O……………………………27,8mg/l• Vitamin và amino acidVitamin và amino acid• Thiamine HCL …………………………..0,1mg/lThiamine HCL …………………………..0,1mg/l• Acid nicotinic…………………………….0,5mg/lAcid nicotinic…………………………….0,5mg/l• Pyridoxine HCL………………………….0,5mg/lPyridoxine HCL………………………….0,5mg/l• Glycine…………………………………..2,00mg/lGlycine…………………………………..2,00mg/l

Thành phần môi trường SHThành phần môi trường SH2-Môi trường SH(1972):2-Môi trường SH(1972):Thành phân khoáng đa lượng:Thành phân khoáng đa lượng: KNO3………………………………………………2500mg/lKNO3………………………………………………2500mg/l CaCl2.2H20………………………………………200mg./lCaCl2.2H20………………………………………200mg./l MgSO4.7H2O…………………………………..400mg./lMgSO4.7H2O…………………………………..400mg./l NH4H2PO4……………………………….300mg/lNH4H2PO4……………………………….300mg/l Thành phần khoáng vi lượng:Thành phần khoáng vi lượng:MnSO4.H2O………………………………….10mg/lMnSO4.H2O………………………………….10mg/lZnSO4.7H2O…………………………………1,00mg/lZnSO4.7H2O…………………………………1,00mg/lH3BO3……………………………………….5,00mg/lH3BO3……………………………………….5,00mg/lKI…………………………………………….1,00mg/lKI…………………………………………….1,00mg/lNa2MoO4.2H2O……………………….0,1mg/lNa2MoO4.2H2O……………………….0,1mg/lCuSO4.5H2O……………………………0,20mg/./CuSO4.5H2O……………………………0,20mg/./CoCl2.6H2O…………………………….0,1mg/lCoCl2.6H2O…………………………….0,1mg/lNa2EDTA……………………………….20,00mg/lNa2EDTA……………………………….20,00mg/lFeSO4.7H2O……………………………15,00mg/lFeSO4.7H2O……………………………15,00mg/l

Vitamin và amino acid:Vitamin và amino acid:Thiamine HCL …………………………..5,00mg/lThiamine HCL …………………………..5,00mg/lAcid nicotinic…………………………….0,5mg/lAcid nicotinic…………………………….0,5mg/lPyridoxine HCL………………………….0,5mg/lPyridoxine HCL………………………….0,5mg/l

Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lựơng Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lựơng saponin saponin

a.a. pHpH

b. Nồng độ đườngb. Nồng độ đường

c. Nồng độ nitrogenc. Nồng độ nitrogen

d. Nồng độ photphated. Nồng độ photphate

IV. Thu nhận ginsenosidesIV. Thu nhận ginsenosides2kg mẫu dung dịch methanol 80% 2kg mẫu dung dịch methanol 80% làm bay hơi huyền phù bằng nước làm bay hơi huyền phù bằng nước cho ete vào(ethyl ete) làm bay hơi lớp cho ete vào(ethyl ete) làm bay hơi lớp nước chuyển vào cột sắc kýnước chuyển vào cột sắc kýCác giếng:Các giếng:1.1.NướcNước2.2.30% KOH (7g)30% KOH (7g)3.3.50% KOH (13g)50% KOH (13g)4.4.80% KOH(174g)80% KOH(174g)5.5.KOH + acetonKOH + aceton

-Quá trình tách chiết ở KOH 80% thì thu Quá trình tách chiết ở KOH 80% thì thu được hàm lượng cao nhất saponin.được hàm lượng cao nhất saponin.+ 20(s) protopanaxdiol+ 20(s) protopanaxdiol+ 20(s) protopanaxtriol+ 20(s) protopanaxtriol+ ocotillol+ ocotillol