Nckh Hoan Chinh-ngoc Yen Linh

LỜI CẢM ƠN

Thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học là một trong những cơ hội giúp chúng tôi

học hỏi thêm nhiều kỹ năng, nâng cao tinh thần kỹ luật, luôn học hỏi, tìm tòi để thực

hiện công việc, đồng thời cũng giúp chúng tôi có thêm kỹ năng giải quyết vấn đề. Để

đạt được kết quả này, ngoài sự cố gắng của bản thân phải kể đến sự giúp đỡ của thầy

cô, gia đình và bạn bè.

Trước tiên, chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã luôn

luôn ủng hộ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi học tập, nghiên cứu.

Tiếp đến chúng tôi xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học,

trường đại học Mở TP. HCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, những kinh

nghiệm quý giá làm nền tảng cho chúng tôi có thể ứng dụng vào thực hiện đề tài

nghiên cứu.

Và đặc biệt chúng tôi xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh và Cô Dương Nhật

Linh, người đã tận tình chỉ dẫn, động viên, tạo cho em niềm say mê nghiên cứu.

Bên cạnh đó chúng tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẻ động

viên, giúp chúng tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian qua.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 05 năm 2011

Nhóm sinh viên thực hiện

Đỗ Bảo Ngọc

Trần Thị Khánh Linh

Hà Thị Bảo Yến

i

i

MUC LUC

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................12

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................15

1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH PHÒNG

TRỊ BỆNH TRÊN TÔM........................................................................................16

1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6]....................................16

1.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5].....................................16

1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41].......................................................17

1.2.1 Phân loài..................................................................................................17

1.2.2 Các giai đoạn phát triển...........................................................................18

1.2.3 Tuổi thành thục........................................................................................19

1.2.4 Tập tính ăn...............................................................................................20

1.2.5 Lột xác.....................................................................................................20

1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23]..................21

1.4 TÌNH HÌNH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ BỆNH

CHO TÔM [34, 36]................................................................................................23

1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY

SẢN .................................................................................................................24

1.5.1 Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8]...........................................................24

1.5.2 Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40]................25

1.5.3 Ưu điểm của probiotic trong phòng trị bệnh cho tôm..............................29

1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản

[35, 39, 22, 9, 30].....................................................................................30

1.6 TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DUNG TRONG

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN..................................................................................36

ii

ii

1.6.1 Trùn quế và phân trùn quế [38, 5]............................................................36

1.6.2 Chế phẩm sinh học từ trùn quế trong nuôi trồng thủy sản.......................39

1.7 VI KHUẨN BACILLUS...........................................................................41

1.7.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus..........................................................41

1.7.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn [12]............................................................41

1.7.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus [17].....................................................42

1.7.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản [40, 19, 20, 24, 28]....43

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................45

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.........................................46

2.2 VẬT LIỆU...............................................................................................46

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu..............................................................................46

2.2.2 Môi trường - hóa chất..............................................................................46

2.2.3 Thiết bị - dụng cụ.....................................................................................47

2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM............................................................................48

2.4 TÁI PHÂN LẬP BACILLUS...................................................................49

2.5 THỬ ĐỐI KHÁNG.................................................................................50

2.5.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc [26]...................50

2.5.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp [26].........................51

2.6 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY [27]...............................................52

2.7 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG

BACILLUS..............................................................................................................54

2.7.1 Thử khả năng gây dung huyết [1]............................................................54

2.7.2 Thử nghiệm tính an toàn cho các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú [11] 54

2.8 XỬ LÝ KẾT QUẢ...................................................................................58

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................59

3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP BACILLUS.................................................60

iii

iii

3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG...............................................................63

3.2.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc..........................63

3.2.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp................................66

3.3 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY.......................................................72

3.3.1 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. parahaemolyticus72

3.3.2 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. alginolyticus.......82

3.3.3 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. harveyi................91


BACILLUS:...........................................................................................................101

3.4.1 Thử khả năng gây dung huyết................................................................101

3.4.2 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú. .102

Chương 4...................................................................................................................105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................105

4.1 KẾT LUẬN............................................................................................106

4.2 KIẾN NGHỊ...........................................................................................106

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................108

PHU LUC.................................................................................................................112

iv

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA One-way analysis of variance

CFU Đơn vị khuẩn lạc

Cs Cộng sự

DC Đối chứng

LB Luria Bertani

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

PL Postlarvae (hậu ấu trùng)

TCBS Thiosulphate citrate bile salts sucrose

v

v

DANH MỤC CÁC ĐƠN VỊ ĐO

% Phần trăm

µl Microlít

‰ Phần nghìn

cm Centimét

g Gam

g/L Gam/lít

L Lít

m Mét

mg Miligam

mL Millilít

nm nanometoC Nhiệt độ bách phân

pH Độ pH

vi

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập..................................................................................61

Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp vạch vuông góc.....................64

Bảng 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.....................67

Bảng 3.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL)............................................................................72


trên LOG10 CFU/mL)............................................................................74


trên LOG10 CFU/mL)............................................................................75


trên LOG10 CFU/mL)............................................................................77


trên LOG10 CFU/mL)............................................................................78


trên LOG10 CFU/mL)............................................................................80

Bảng 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL)...................................................................................82


LOG10 CFU/mL)...................................................................................83

Bảng 3.12 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. alginolyticus ( tính trên

LOG10 CFU/mL)...................................................................................85


LOG10 CFU/mL)...................................................................................86

vii

vii


LOG10 CFU/mL)...................................................................................88

Bảng 3.15. Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL)...................................................................................89

Bảng 3.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL)..................................................................................91


LOG10 CFU/ mL)..................................................................................93


LOG10 CFU/ mL)..................................................................................94


LOG10 CFU/ mL)..................................................................................96


LOG10 CFU/ mL)..................................................................................98


LOG10 CFU/ mL)..................................................................................99

Bảng 3.22 Kết quả khả năng gây dung huyết.........................................................102

Bảng 3.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus................103

viii

viii

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Biểu đồ 3.1 Thử khả năng đối kháng của chủng Bacillus đối với V.

parahaemolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ.......................69

Biểu đồ 3.2 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V.

alginolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ...............................69

Biểu đồ 3.3 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V. harveyi theo

thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ............................................................70

Biểu đồ 3.4 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với

chủng F2 ở những mật độ khác nhau.....................................................73


chủng F10 ở những mật độ khác nhau...................................................74









Biểu đồ 3.10 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng

F2 ở những mật độ khác nhau...............................................................82


F10 ở những mật độ khác nhau..............................................................84



ix

ix







Biểu đồ 3.16 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở

những mật độ khác nhau.......................................................................92

Biểu đồ 3.17 Sự biến đổi mật độ của V .harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở




Biểu đồ 3.19 Sự biến đổi mật độ của V.harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở





những mật độ khác nhau.....................................................................100

Biểu đồ 3.22 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus............104

x

x

DANH MỤC CÁC HINH

Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú............................................19

Hình 1.2 Vi khuẩn Vibrio.........................................................................................21

Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm..........................................23

Hình 1.4 Trùn quế 37

Hình 1.5 Vi khuẩn Bacillus......................................................................................41

Hình 1.6 Cấu trúc của bào tử...................................................................................42

Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm.................................................................................48

Hình 2.2 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc...................................................51

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng nuôi cấy.....................................................53

Hình 2.5 Thuần hóa tôm...........................................................................................56

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an toàn cho các chủng vi khuẩn thử

nghiệm lên ấu trùng tôm sú..................................................................56

Hình 2.6 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm......................................................................57

Hình 2.7 Hộp bố trí thí nghiệm................................................................................57

Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24h nuôi cấy...........................60

Hình 3.2 Nhuộm gram Bacillus...............................................................................60

Hình 3.3 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc............................65

Hình 3.4 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch 2 lớp........71

Hình 3.5 Trải đĩa kiểm tra mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với F27 mật độ

107 ở ngày 5........................................................................................102

Hình 3.6 Kết quả thử khả năng gây dung huyết.....................................................103

xi

xi

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐẶT VẤN ĐỀ

12


Thủy sản là một trong những ngành mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế quốc

dân và thu hút nhiều lao động. Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói

chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ.

Bên cạnh những thành tựu và sự phát triển của ngành thì vấn đề nuôi tôm ở Việt

Nam còn nhiều vấn đề tồn đọng mà vấn đề quan trọng nhất là dịch bệnh gây chết hàng

loạt đã gây nhiều tổn thất cho người nuôi tôm nói riêng và ngành thủy sản nói chung.

Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản do

phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới

đáy ao nuôi.

Có rất nhiều nghuyên nhân dẫn đến bệnh tôm, đáng quan tâm là nhóm vi khuẩn

Vibrio spp., thường xuyên hiện diện và gây hại nghiêm trọng trên tôm sú, trong nhóm

này có V. harveyi và V. parahaemolyticus là các lòai vi khuẩn có độc lực cao, gây bệnh

phát sáng trên ấu trùng tôm sú. Các lòai Vibrio khác như: V. vulnificus, V.

alginolyticus, V. splendidus,.. được xem là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm sú

thương phẩm. Khi Vibrio xuất hiện trong nước với mật độ cao, có thể gây chết hàng

loạt ấu trùng và tôm sú, đôi khi tỷ lệ chết lên đến 100 % . [2, 7]

Mặc dù phải đương đầu với những bất lợi nhưng tôm nói riêng và sản phẩm

thủy sản nói chung vẫn là mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn đem lại nhiều lợi ích kinh tế.

Vấn đề đặt ra hiện nay là tìm ra những giải pháp hạn chế tối đa các tác nhân gây bệnh

cũng như nỗ lực thực hiện các kỹ thuật nuôi hợp lý và hiệu quả mà vẫn đảm bảo được

sự phát triển bền vững.

Ngày nay, sử dụng chế phẩm sinh học được xem như là giải pháp thay thế

kháng sinh, được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường

trong ao nuôi, khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng và đã tạo nền tảng vững chắc

cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Khác với biện pháp hóa học

và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn, bền vững đối với

người nuôi và tiêu dùng.

13


Có rất nhiều hệ vi sinh vật đã được dùng trong sản xuất chế phẩm sử dụng trong

nuôi trồng thủy sản. Nhưng Bacillus vẫn được xem là đối tượng quan trọng vì đã có

nhiều tài liệu cho rằng chế phẩm có sử dụng Bacillus giúp thủy sản sinh trưởng nhanh,

tăng sức đề kháng, chống lại một số loài gây bệnh - được báo cáo nhiều nhất là khả

năng đối kháng với Vibrio và khả năng tạo bào tử của nó.

Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cs (2010) thì một số

chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế và phân trùn quế có khả năng chịu muối mật,

pH acid dạ dày và khả năng đối kháng tốt đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho động

vật thủy sản. [5]

Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI

KHÁNG VỚI VIBRIO VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN ĐỐI VỚI ẤU TRÙNG

TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ TRÙN QUẾ”

Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus đã được phân lập từ trùn quế tiếp tục

được nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn Vibrio gây bệnh và đánh giá

tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thành công của

đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học cho việc phát triển thành chế phẩm vi sinh

trong việc phòng và trị bệnh do vi khuẩn, đặc biệt do nhóm Vibrio spp. gây ra trên

động vật thủy sản.

Mục tiêu

Tái phân lập Bacillus từ trùn quế và phân trùn quế.

Thử khả năng đối kháng của Bacillus với V. harveyi, V. parahaemolyticus, V.

alginolyticus.

Đồng nuôi cấy Bacillus với 3 loài vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra sự thay đổi mật

độ của vi khuẩn Vibrio theo thời gian nuôi cấy.

Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus.

14


Chương 1. T

ỔNG QUAN TÀI LIỆU

15


1.1 SƠ LƯỢC VỀ TINH HINH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH

PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN TÔM

1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6]

Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thủy sản có giá trị thương phẩm cao và

cũng là đối tượng nuôi quan trọng của một số nước đang phát triển ở Châu Á như

Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Việt Nam và Ecuador. Nghề nuôi tôm không

chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn

có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho

người nuôi thủy sản. [6] Hiện nay, nghề nuôi tôm nước lợ ở nhiều nước trên thế giới đã

và đang chịu ảnh hưởng nghiêm trọng do môi trường nuôi ô nhiễm và dịch bệnh phát

sinh, đặc biệt là mô hình nuôi tôm sú thâm canh. Hậu quả là có nhiều vùng nuôi tôm bị

thất bại liên tục đã bị bỏ hoang, gây nên những tác động nghiêm trọng về kinh tế xã

hội. Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ

733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến

năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn. [3]

1.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5]

Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản

nói riêng của nước ta đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo thống kê của Bộ Nông

nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2008, diện tích nuôi trồng thủy sản đã được

mở rộng lên trên 1 triệu ha và sản lượng đạt gần 2,45 triệu tấn, tăng gấp 12 lần so với

năm 1980. Bên cạnh đó, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam ngày càng tăng mạnh,

năm 2008 đạt trên 4,5 tỷ USD, đứng thứ tư trong những ngành hàng có kim ngạch xuất

khẩu cao nhất của cả nước.[5]

Tuy nhiên, thực tế cho thấy giá cả hấp dẫn và ổn định của con tôm trên thị

trường thế giới cùng với giá đất tương đối thấp của vùng Duyên Hải đã đưa đến sự

bùng nổ việc phát triển nghề nuôi tôm. Điều đáng lưu ý là kỹ thuật nuôi tôm tuy không

quá phức tạp, nhưng bản thân hệ sinh thái khá biến động đối với việc nuôi thâm canh,

16


hệ thống sản xuất thiếu tính bền vững đã dẫn đến nhiều thiệt hại cho nghề nuôi tôm.

Tại Việt Nam, trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan

rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng.

Theo sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Bạc Liêu năm 2008 - 2009, nhiều hộ dân

tại 3 đơn vị của tỉnh đã chuyển gần 1.000 ha đất nuôi tôm công nghiệp kém hiệu quả

sang làm muối. Trước tình hình trên, nhiều chương trình nghiên cứu liên quan đến việc

xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi, cụ thể ở Đồng bằng Sông Cửu

Long cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất hiện

của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV

(White Spot Syndrom Virus) .[3]

1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41]

Tôm Sú, có tên khoa học là Penaeus monodon, tiếng Anh là Giant Tiger

Shrimp.

Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản,

Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi. Nhìn chung, tôm

sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nước vùng

xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippin và Việt Nam.

Tôm bột, tôm giống và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và

rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống

vùng nước sâu hơn.

1.2.1 Phân loài

Ngành: Arthropoda

Lớp: Crustacea

Bộ: Decapoda

Họ chung: Penaeidea

Họ: Penaeus Fabricius

Giống: Penaeus

17


Loài: Monodon

Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

1.2.2 Các giai đoạn phát triển

Nauplli: 6 giai đoạn: 36-51 giờ, các Nauplli bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ

4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàng, không cần cho ăn.

N1:dài khoảng 0,40 mm, dày 0,20 mm.

N2: dài khoảng 0,45mm, dày 0,20 mm.

N3: dài khoảng 0,49 mm, dày 0,20 mm.



Zoea: 3 giai đoạn: 105-120 giờ, các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ 2 lần,

mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vất phiêu sinh.

Z1: dài khoảng 1 mm, dày 0,45 mm, xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt.

Z2: dài khoảng 1,9 mm, xuất hiện mặt và chủy.

Z3: dài khoảng 2,7 mm, xuất hiện gai trên bụng.

Mysis: 3 giai đoạn : 72 giờ, các Mysis bơi hướng xuống sâu, đuôi đi trước, đầu

đi sau.

M1: dài khoảng 3,4 mm, có hình dạng của tôm trưởng thành, xuất hiện các cặp

chân bụng, đuôi và quạt đuôi, các gai bụng thu nhỏ lại.

M2: dài khoảng 4,0 mm.

M3: dài khoảng 4,4 mm, chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng

trên chủy.

Postlarvae: giai đoạn gần trưởng thành.

Juvenile: giai đoạn trưởng thành.

18


1. Trứng tôm Giai đoạn 1: Naupli Giai đoạn 2: Zoeal

Giai loạn 3: Mysis Giai đoạn 4: Postlarva

Giai đoạn 5: Juvenile

Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú

1.2.3 Tuổi thành thục

Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác định

sự thành thục của tôm cái dễ hơn, chỉ cần quan sát có túi tinh ở cơ quan sinh dục phụ.

Phương pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn, chỉ khi nào tìm thấy được tinh

trùng ở cuối ống dẫn tinh.

Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (GIH, gonal inhibiting hormone)

được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vận chuyển tới

tuyến giáp sinap đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra. Sự thành thục sinh dục của

tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt sẽ thúc đẩy chu kỳ lột xác,

đem lại sự thành thục mau chóng hơn.

Số lượng trứng đẻ của tôm cái: nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng buồng

trứng và trọng lượng cá thể: trọng lượng lớn cho trứng nhiều hơn. Khi con cái thành

thục ngoài tự nhiên có trọng lượng từ 100 - 300 g cho 300.000 - 1.200.000 trứng. Nếu

cắt mắt nuôi vỗ trong bể xi măng thì cho số lượng trứng từ 200.000 - 600.000 trứng.

19


Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ) trứng sau khi đẻ

được 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-28 oC sẽ nở thành ấu trùng (Nauplii). Tôm sú đẻ quanh

năm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3-4 và tháng 7-10.

Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm, con cái chừng 2 năm.

1.2.4 Tập tính ăn

Tôm sú là loại ăn tạp, thích các động vật sống và di chuyển chậm hơn là xác

thối rữa hay mảnh vụn hữu cơ, đặc biệt ưa ăn giáp xác, thực vật dưới nước, mảnh vụn

hữu cơ, giun nhiều tơ, loại 2 mảnh vỏ, côn trùng. Tôm sống ngoài tự nhiên ăn 85% là

giáp xác, cua nhỏ, động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, còn lại 15% là cá, giun nhiều tơ,

thuỷ sinh vật, mảnh vụn hữu cơ, cát bùn.

Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi nhiều hơn khi thuỷ triều rút. Nuôi tôm sú trong

ao thì hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối. Tôm bắt mồi bằng càng, sau

đó đẩy thức ăn vào miệng để gặm, thời gian tiêu hoá 4-5 giờ trong dạ dày.

1.2.5 Lột xác

Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng lên mức độ nhất

định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên. Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm. Sự

lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp lột xác nhưng không tăng thể

trọng.

Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy ra như sau: Lớp biểu bì

giữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theo

sau là phần bụng và các phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn

cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ với tôm nhỏ, 1-2 ngày

đối với tôm lớn. Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm với môi

trường sống thay đổi đột ngột. Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này, có

thể điều chỉnh môi trường nuôi kịp thời.

Hormone hạn chế sự lột xác lột xác (MIH, molt - inhibiting hormone) được tiết

ra do các tế bào trong cơ quan của cuống mắt, truyền theo sợi trục tuyến xoang, chúng

20


tích luỹ lại và chuyển vào trong máu, nhằm kiểm tra chặt chẽ sự lột xác. Các yếu tố bên

ngoài như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, đều có ảnh hưởng tới sự lột xác của tôm.

1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23]

Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau

Hình 1.2 Vi khuẩn Vibrio

Vibrio có hình que, ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0,5×3μm, hai đầu không

đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, qua nhiều lần cấy truyền thì tính chất phẩy khuẩn

biến mất, là vi khuẩn gram âm.Vibrio không tạo bào tử, không tạo giáp mô, di động

nhờ tiêm mao ở đầu. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tăng trưởng nhanh trong

môi trường có tính kiềm (8,5 - 9), ưa môi trường có muối với nồng độ khác nhau tùy

theo loài. Sống được ở nhiệt độ 16-42 oC. Chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị diệt

bởi các chất tẩy uế, đặc biệt nhạy cảm với sự khô, chỉ tồn tại 10 phút ở 55oC. [4]

Vibrio là một trong những tác nhân gây ra dịch bệnh lớn ở động vật giáp xác và

cá. Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng

thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100%.

Bệnh do Vibrio là một trong những nguyên nhân chính gây chết cho tôm nuôi

trên toàn thế giới. Loài vi khuẩn Vibrio phân bố rộng rãi , thường gây nhiễm trùng

trong các trại trại sản xuất giống cũng như trong ao nuôi tôm gây thiệt hại nghiêm

trọng. Bệnh do Vibrio gây ra chủ yếu là do một số loài như: V. harveyi, V. vulnificus,

V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. penaeicida …

21


Sự bùng nổ dịch bệnh có thể xảy ra khi nhân tố môi trường làm tăng nhanh số

lượng vi khuẩn tồn tại sẵn trong máu tôm ở mức thấp, hoặc bằng cách xâm nhập qua

rào cản vật chủ.

Vibrio xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua nhiều con đường như sau:

Lớp vỏ ngoài của động vật thủy sản là hàng rào bảo vệ hiệu quả chống lại mầm

bệnh. Tuy nhiên, Vibrio có thể gây bệnh trên vỏ và có thể xâm nhập qua vết thương ở

lớp vỏ ngoài hay lỗ chân lông.

Mang dễ bị tổn thương dẫn đến sự xâm nhập của vi khuẩn bởi vì mang chỉ được

bao bọc bởi lớp vỏ mỏng.

Tuyến tiêu hóa và ruột giữa không được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài nên mầm

bệnh từ nước, thức ăn, chất thải có thể xâm nhập vào trong cơ thể. [23]

Bệnh do Vibrio gây ra có thể là kết quả của môi trường nuôi xấu, do tôm đã yếu

vì mắc bệnh khác và trong một số trường hợp do độc lực mạnh của một số loài Vibrio.

Nếu tôm bị nhiễm cục bộ ở một số nơi trên bề mặt cơ thể do bị trầy xướt hay ở

đường ruột thì có thể thấy các triệu chứng như: tạo thành chổ viêm có bao và có thể có

màu đen trên thân, viêm ruột hay hoại tử đốm ở gan. Nếu tôm bị nhiễm toàn diện thì có

thể thấy các đốm đen ở cơ quan lympho, tim, mang,... [31]

Một số bệnh do Vibrio gây ra

V. salmonicida gây bệnh ở vùng nước lạnh.

V. parahaemolyticus, V. harveyi gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú.

V. alginolyticus gây bệnh đỏ dọc thân ấu trùng tôm sú.

V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V. anguillarum... gây bệnh đỏ

thân ở tôm sú thịt, ăn mòn vỏ giáp xác, gây bệnh máu vón cục ở cua, gây bệnh ấu trùng

nhuyễn thể. [5]

22


Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm

1.4 TINH HINH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ

BỆNH CHO TÔM [34, 36]

Nuôi trồng thủy sản với quy mô công nghiệp không thể tránh khỏi dịch bệnh

làm tôm chết, gây tổn thất cho người nuôi. Để đối phó với tình trạng dịch bệnh người ta

thường sử dụng kháng sinh (Tetracycline, Streptomycin....). Tuy nhiên khi sử dụng một

loại thuốc quá lâu, sử dụng không đúng liều lượng, thời điểm sẽ gây ra hiện tượng

kháng thuốc. Đáng lo ngại hơn là gen kháng có thể truyền cho thế hệ sau hoặc truyền

ngang giữa các tế bào vi khuẩn thông qua tiếp hợp, tải nạp, tạo những chủng vi khuẩn

mang gen kháng kháng sinh và có thể gây bệnh cho người. Khi đã xảy ra hiện tượng

kháng thuốc thì sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc phòng và điều tri bệnh cho vật nuôi,

dễ bùng phát các trận dịch khó kiểm soát, gây thiệt hại kinh tế.

Bên cạnh đó dư lượng thuốc kháng sinh ảnh hưởng đến giá trị xuất khẩu tôm.

Tôm xuất khẩu thường bị trả về do dư lượng kháng sinh còn quá nhiều. Dư lượng

thuốc còn lại trong thịt, nội tạng của vật nuôi, khi sử dụng vật nuôi làm thực phẩm

chúng sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

Ngoài kháng sinh người nuôi còn dùng nhiều hóa chất độc hại khác để tiêu diệt

các loài không mong muốn như dùng Sulfat đồng để diệt tảo, các chất diệt cá tạp như

Nicotin, các loại thuốc trừ sâu..... Các hóa chất này có thể tiêu diệt các loài không

mong muốn nhưng đồng thời cũng tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật có lợi cho ao nuôi.

[36]

Bên cạnh đó, mô hình nuôi tôm hiện nay đa phần không có hệ thống xử lý nước

thải. Do vậy lượng hóa chất cùng với nước thải của hệ nuôi đưa trực tiếp ra môi trường

ngoài gây ô nhiễm nguồn nước. Tiến sĩ khoa học Nguyễn Văn Trương - Viện Tài

Nguyên Sinh Thái cho rằng nếu chỉ có một vài hộ nuôi xả bỏ chất thải ra biển thì

không sao, nhưng vài chục ngàn hộ dân cùng thải nước như vậy ắt hẳn cả vùng biển bị

23


ô nhiễm, biển lại thông với sông nên ảnh hưởng càng thêm nghiêm trọng hơn. [34] Đặc

biệt, cần thận trọng khi sử dụng thuốc trừ sâu hữu cơ vì chúng có độc tính, gây ảnh

hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe con người do cơ chế tích lũy sinh học.

Tóm lại, vấn đề sử dụng hóa chất cũng như kháng sinh chỉ giải quyết tình trạng

bệnh trong nhất thời nhưng nó lại mang đến không ít tác hại trong đời sống và kinh tế.

Hóa chất và kháng sinh không chỉ tiêu diệt vi sinh vật có hại mà còn diệt luôn vi

sinh vật có lợi.

Hóa chất, kháng sinh có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe tôm.

Nguy cơ tạo ra vi sinh vật kháng thuốc, có thể truyền tính kháng thuốc cho tác

nhân gây bệnh cho người.

Ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái, đến quần thể sinh vật trong hệ sinh thái…

1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG

THỦY SẢN

1.5.1 Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8]

Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ "pro" có nghĩa là dành

cho và "biosis" có nghĩa là sự sống.[25] Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩa

khác nhau, nó được sử dụng lần đầu tiên năm 1965 để mô tả một chất được tạo ra bởi

một protozoon để kích thích sự tăng trưởng của một con khác.

Đến những năm 1970 nó được mô tả chất chiết từ mô có tác dụng tăng sinh mô.

Năm 1974, Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các vi

sinh vật và chất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng hệ vi sinh vật

ruột.

Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gần với hiện nay là “một vi sinh vật sống

bổ sung qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện vi sinh vật

đường ruột”. [8]

Năm 1992, Havenaar và Huis In’t Veld đưa ra định nghĩa về probiotic như sau:

“Probiotic là chế phẩm hay sản phẩm chứa vi sinh vật sống xác định với số lượng đủ có

24


thể làm thay đổi hệ vi sinh vật tại một phần của cơ thể ký chủ và nhờ đó tạo ra các hệ

quả có lợi cho sức khỏe ký chủ”.

Trải qua lịch sử, probiotic được định nghĩa ngày càng cụ thể hơn. Theo định

nghĩa hiện được thông qua bởi FAO/WHO năm 2001: “probiotic là những vi sinh vật

sống mà khi dùng với lượng thích hợp, kiểm soát chặt chẽ sẽ đem lại lợi ích sức khỏe

cho vật chủ”. [13, 5]

1.5.2 Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40]

1.5.2.1 Tiết ra các hợp chất ức chế [40]

Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn in-vitro kìm

hãm được các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Những nghiên cứu này cũng chứng

minh khả năng kìm hãm vi khuẩn khác của những dòng vi khuẩn thông thường dễ tìm

thấy trong môi trường.

Theo Sugita và cs (1997) những quần thể sinh vật này có thể tiết vào môi trường

những chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm vi khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể vi

sinh khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi

trường. Sự hiện diện những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể tiết trong ruột,

trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của vi

khuẩn cơ hội, gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Sản phẩm có thể là chất kháng sinh,

siderophore, men phân hủy, H2O2, acid hữu cơ…

Thành phần chất tiết ra khó có thể xác định được nên được gọi chung là chất ức

chế. Vi khuẩn lactic từ lâu được biết là loại tiết ra chất kháng vi khuẩn (bacteriocin)

chống lại các vi khuẩn Gram (+). Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản là

nhóm Gram (-). Vì vậy, tác động ức chế của vi khuẩn lactic trong nuôi trồng thủy sản

bị hạn chế nhưng nó là vi khuẩn không có hại và là đối tượng cạnh tranh chỗ cư trú.

Nhiều vi khuẩn khác cũng tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh

như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus. Cơ chế tiết ra chất chống lại

vi khuẩn gây bệnh trong các thử nghiệm ở mức tế bào in-vitro rất phổ biến trong môi

trường nước.

25


1.5.2.2 Cạnh tranh nơi cư trú [40]

Olsson và cs (1992) khẳng định cạnh tranh chỗ bám trong ruột của vật chủ có

ảnh hưởng rất quan trọng đến sức khoẻ của vật chủ. Việc bám dính được vào lớp màng

nhầy của ruột là rất cần thiết để vi khuẩn thiết lập quần thể trong hệ ruột của cá. Khả

năng bám dính lên thành ruột là tiêu chuẩn lựa chọn đầu tiên của vi khuẩn hữu ích. Sự

bám dính trên màng ruột có thể là chuyên biệt, không chuyên biệt.

Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng

cách tranh giành vị trí bám trên thành ruột hay trên bề mặt các mô khác. Người ta đã

chứng minh được khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt hoặc bên trong ruột, hay

niêm mạc ngoài của chủng Carnobacterium K1 làm cho chủng này cạnh tranh vượt trội

và ngăn cản được sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh ở cá như V. anguillarum và A.

hydrophila.

1.5.2.3 Cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng [40]

Nhiều quần thể vi sinh vật cùng tồn tại trong cùng một hệ sinh thái thì sẽ có sự

cạnh tranh về dinh dưỡng và năng lượng. Cạnh tranh trong giới vi sinh vật chủ yếu là

xảy ra ở nhóm dị dưỡng như cạnh tranh các chất hữu cơ mà chủ yếu là nguồn carbon

và năng lượng. Rico-Mora (1998) đã cho một dòng vi khuẩn được chọn lọc có khả

năng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ. Tác giả cấy vi khuẩn này vào bể nuôi

tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus thì vi khuẩn Vibrio này không phát triển và thử

nghiệm in-vitro không thấy có sự ức chế. Do đó chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh

tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ. Do vậy những dòng vi khuẩn chọn

lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng lượng và dinh dưỡng.

1.5.2.4 Tương tác với thưc vật thủy sinh [40]

Nhiều dòng vi khuẩn khác có khả năng kích thích sự phát triển của tảo.Tuy

nhiên theo các nghiên cứu gần đây một số dòng vi khuẩn có khả năng tiêu diệt một số

loài tảo, đặc biệt là tảo gây ra hồng triều. Những chủng vi khuẩn này có thể không tốt

đối với một số loài tảo có lợi trong nuôi trồng thủy sản.

26


1.5.2.5 Cải thiện chất lượng nước

Verschuere và cs (2000) cho rằng cải thiện chất lượng nước là một cơ chế tác

động của “vi sinh vật hữu ích” trong thủy sản khi đưa vi sinh vật hữu ích vào nước

giúp cải thiện chất lượng nước mà không có tác động trực tiếp lên cơ thể vật nuôi,

thường liên quan đến các nhóm Bacillus. [28]

Stanier và cs (1963) đã nghiên cứu được là nhóm vi khuẩn Gram (+) thường

phân hủy vật chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn nhóm Gram (-). Duy trì những mật độ

Gram (+) trong ao nuôi sẽ hạn chế được sự tích lũy vật chất hữu cơ trong ao trong suốt

quá trình nuôi, ổn định quần thể tảo nhờ sự sản sinh CO2 từ quá trình phân hủy các vật

chất hữu cơ.

Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi khuẩn

hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Chất lượng nước có liên quan mật thiết đến tính chất

nền đáy của thủy vực, quá trình hấp thụ và giải phóng các chất làm biến đổi chất lượng

nước, đặc biệt là sự hấp thụ và giải phóng dinh dưỡng của nền đáy.

Vũ Ngọc Út (1999) cho rằng các vi khuẩn có lợi phân huỷ các chất hữu cơ có từ

thức ăn dư thừa, các chất bài tiết của tôm cá và có thể ngăn ngừa sự phát triển của vi

khuẩn gây bệnh trong ao nuôi, giúp giảm ô nhiễm đáy ao.

Theo Nguyễn Đình Trung (2004), một trong những cơ chế hoạt động của men vi

sinh là các men có tác dụng phân huỷ các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất

hữu cơ đơn giản. Sau đó các chủng loại vi sinh vật phát huy tác dụng

Giảm ammonia: vi sinh vật dị dưỡng chuyển hoá các hợp chất hữu cơ đơn giản

thành các chất vô cơ (CO2, NH3). Xu thế tăng cao của NH3 được làm giảm do hai loài

vi sinh vật tự dưỡng theo chu trình sau

Nitrosomonas

NH4+ + 1,5 O2 —› NO2

- + 2H+ + H2O

Nitrobacter

NO2- + 0,5O2 —› NO3

-

27


Giảm tảo: vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ

trong ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muối

dinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy trì độ trong trong ao nuôi tôm các

tháng cuối không nhỏ hơn 30 cm.

Giảm bệnh: vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus nhờ môi trường thích hợp sẽ phát

triển số lượng rất lớn, cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của nguyên sinh động vật, các vi

sinh vật và Vibrio có hại, ngăn cản sự phát triển của chúng. Giảm các tác nhân gây

bệnh cho tôm nuôi.

Nhờ đó mà hạn chế sử dụng các hoá chất và thuốc kháng sinh, giảm thay nước

trong quá trình nuôi, góp phần cải thiện chất lượng nước trong hệ thống nuôi trồng

thủy sản.[40]

1.5.2.6 Nguồn dinh dưỡng và tăng cường khả năng tiêu hóa

Một số nghiên cứu cho rằng vi khuẩn probiotic có nhiều lợi ích cho quá trình

tiêu hóa của động vật thuỷ sản. Ở cá, Bacteroide và Clostridium spp. cung cấp cho vật

chủ các acid béo và vitamin. Ngoài ra, một số vi khuẩn có thể tham gia vào quá trình

tiêu hóa bằng cách sản xuất enzym ngoại bào như protease, lipase, cũng như cung cấp

yếu tố tăng trưởng cần thiết. Vi sinh vật có thể cung cấp như một nguồn thực phẩm bổ

sung và hoạt động của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa có thể là nguồn cung cấp vitamin

hay acid amin thiết yếu. [13]

1.5.2.7 Tăng cường đáp ứng miễn dịch [13]

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi vi khuẩn

probiotic. Đã có chứng minh cá hồi cầu vồng sử dụng vi khuẩn Clostridium butyricum

thì sức đề kháng của cá được tăng cường chống lại Vibrio bằng cách tăng cường hoạt

động thực bào của bạch cầu.

Rengpipat và các cộng sự báo cáo rằng việc sử dụng Bacillus sp. (dòng S11) đã

kích hoạt cả hai hệ thống miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào ở tốm sú (Penaeus

monodon). [24]

28


Balcazar đã chứng minh rằng một loài Bacillus ảnh hưởng tích cực lên sự tăng

trưởng và tỷ lệ sống của cá con tôm trắng trong hỗn hợp các chủng vi khuẩn (Bacillus

và Vibrio sp) và nêu ra một bảo vệ hiệu quả chống lại tác nhân gây bệnh là vi khuẩn

Vibrio harveyi và hội chứng virus đốm trắng. Bảo vệ này là do sự kích thích hệ miễn

dịch, bởi tăng cường hoạt động thực bào và hoạt tính kháng khuẩn. [14]

1.5.2.8 Hoạt động kháng virus

Một vài vi khuẩn probiotic có tác động kháng virus, mặc dù cơ chế này vẫn

chưa được biết, trong phòng thí nghiệm có thể chỉ ra, bất hoạt virus có thể được thực

hiện bởi hóa chất và những chất sinh học như: dịch chiết của tảo, sản phẩm ngoại bào

của vi khuẩn.

Kamei và cs (1988) đã báo cáo rằng chủng Pseudomonas spp., Vibrios spp.,

phân lập từ nơi ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHNV (infectious

hematopoietic necrosis virus) với tỉ lệ giảm > 50%.[25]

Direkbusarakom và cs (1998) đã phân lập được 2 chủng Vibrio.sp. NICA 1030

và NICA 1031 từ nơi ấp trứng tôm sú, 2 chủng này có hoạt tính kháng virus IHNV và

OMV (Oncorhynchus masou virus) với tỉ lệ giảm từ 62 và 99% tương ứng.[29]

1.5.3 Ưu điểm của probiotic trong phòng trị bệnh cho tôm

Probiotic giải pháp điều trị bệnh cho thủy sản an toàn, thuận lợi vì:

Hạn chế sự phát triển quá mức của vi khuẩn có hại.

Phân giải chất hữu cơ tích tụ nền đáy.

Phân giải khí độc được tạo thành từ nền đáy trong quá trình nuôi.

Cải thiện tiêu hóa trong đường ruột tôm, cá.

Hiệu quả tốt, chi phí cải tạo ao vụ sau thấp.

Nâng cao năng suất thu hoạch.

Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn.

Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi.

Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt.

29


Giảm chi phí thay nước.

Giảm chi phí sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong việc điều trị bệnh.

Do đó, sử dụng probiotic có tác dụng phòng bệnh, tăng tỷ lệ sống, nâng cao

nâng suất ao nuôi. Hơn nữa, sử dụng probiotic để quản lý ao nuôi còn có tác dụng hạn

chế sử dụng hóa chất bừa bãi, gây tác động xấu đến môi trường, hệ sinh thái và ảnh

hưởng đến chất lượng sản phẩm.

1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trong nuôi trồng

thủy sản [35, 39, 22, 9, 30]

1.5.4.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới [40]

Theo Balcázar và cs (2006), probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi

thủy sản. Nhưng việc sử dụng probiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản

chất của các vi sinh vật có ích và đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi.[13]

Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất

kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây

bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệu

quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn.

Theo Vijayabaskar và cs (2008), ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà cụ

thể là nhóm vi khuẩn Bacillus spp. trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh do

vi khuẩn A. hydrophila gây ra.

Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippin, khi việc sử

dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn

kháng thuốc, xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh đến con người nếu sử

dụng quá liều lượng. Do đó, probiotic được ứng dụng rộng rãi cho nghề nuôi tôm ở

Philippin, nghiên cứu của Moriarty (1999) cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm

bệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học.

Garriques và Arevalo, (1995) đưa dòng Vibrio alginolyticus vào bể ương ấu

trùng tôm (Litopenaeus vannamei) mỗi ngày. Tỷ lệ sống trung bình và trọng lượng tôm

30


cao nhất trong bể có thêm vi khuẩn hữu ích so với bể xử lý bằng kháng sinh

oxytetracyline và đối chứng. Số bể có bổ sung vi khuẩn Vibrio alginolyticus, không

thấy xuất hiện vi khuẩn gây bệnh V. parahaemolyticus, trong khi các nghiệm thức còn

lại có khoảng 10% mẫu có mặt vi khuẩn này.

Sugama và Tsumura (1998) đã cấy dòng BY-9 với mật độ 106 CFU/mL vào bể

ương ấu trùng tôm sú làm giảm mật độ Vibrio và cho tỷ lệ sống cao hơn đối chứng.

Griffith (1995) cho rằng nhờ đưa men vi sinh vào trong bể ương tôm giống ở

Ecuador trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ

sinh các bể nuôi, sản lượng tôm giống tăng 35% và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn

đến 94%.

Theo Maeda và Liao (1994) dòng PM-4 được cấy hàng ngày trong 7 ngày liền

vào vào bể ương ghẹ 200 m3 (Portunus trituberculatus), kết quả mật độ Vibrio tỷ lệ

nghịch với mật độ PM-4. Tỷ lệ sống trung bình của 7 lần thử nghiệm với PM-4 là

27,2%, tỷ lệ sống của 6 trên 9 lần thử nghiệm không có PM-4 là 6,8%.

Bên cạnh đó mô hình nuôi thuỷ sản thâm canh thường tích lũy nhiều vật chất

hữu cơ ở đáy ao do thức ăn dư thừa, phân và các chất thải khác của thuỷ sinh vật làm

môi trường sống của vật nuôi bị ô nhiễm tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát gây

thiệt hại lớn trong nuôi thuỷ sản. Chất lượng nước và việc kiểm soát bệnh là vấn đề rất

quan trọng trong các ao nuôi, nó có quan hệ trực tiếp và ảnh hưởng nhiều bởi hoạt

động của vi sinh vật. Vì vậy, vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thuỷ vực giữ vai

trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước đối với các hệ thống nuôi thuỷ

sản thâm canh. Moriarty (1996) đã kết luận hoạt động của vi sinh vật ảnh hưởng đến

chất lượng nước chủ yếu là sử dụng oxygen, tái tạo lại các dưỡng chất vô cơ và loại trừ

các sản phẩm độc trong trao đổi chất như NH3, NO2-, H2S.

Qiao Zhenguo và cs (1992) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng

cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) dùng cải thiện chất lượng môi

trường nước. [30]

31


Nghiên cứu của Graslund và cs (2003) cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan

sử dụng men vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùn

đáy ao nuôi.

1.5.4.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic ở Việt Nam [40]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng các men vi sinh để cải thiện

môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít. Trong

những năm gần đây Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh

và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá

tốt.

Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và cs (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng

chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm

tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còn

tăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng.

Theo Võ Thị Thứ và cs., (2006) thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nước

nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt

thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống

như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi. Tác dụng của chế phẩm lên sự tăng

trưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng nhanh.

[9]

Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh ES-01 và BS-01 của Trung tâm

nghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ nuôi trồng thủy sản Sóc Trăng góp phần đưa

năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ. Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý

chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc

phục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng năng

suất. [39]

Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu

mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà

32


hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình

nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh. [35]

Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cs (2000) tìm hiểu tác dụng của men

vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm

càng xanh với liều lượng 1g/m3 và nhịp sử dụng khác nhau. Tác giả cho biết với

nghiệm thức không sử dụng, sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì nghiệm

thức sử dụng hàng ngày là tốt nhất. Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột

ở ngày thứ 18, mật số vi khuẩn Vibrio tổng cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng

luôn giữ được ổn định. Điều này cho thấy hiệu quả tích cực của men vi sinh trong sản

xuất giống tôm càng xanh. [22]

Nghiên cứu Nguyễn Thanh Phương (2007) sử dụng 3 loại men vi sinh

Ecomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình

nước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển của ấu

trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng vi khuẩn Vibrio sp trong môi trường bể

ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm càng xanh khá cao, dao động từ 59,1 -

76,6%. Kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu về hiệu quả và phương thức sử

dụng men vi sinh trong môi trường ương nuôi tôm càng xanh nhằm cải thiện môi

trường và nâng cao năng suất ương ấu trùng.

Một số chế phẩm sinh học trong nuôi tôm có mặt ở Việt Nam

Chế phẩm của viện sinh học Nhiệt Đới TPHCM [35]

Chế phẩm Bio II gồm có: vi khuẩn Bacillus spp. ( 1011 CFU/g),

Lactobacillus spp (109 CFU/g), nhóm nấm men Saccharomyces spp. (108 CFU/g). Chế

phẩm này có tác dụng kích thích tiêu hóa của tôm.

Chế phẩm VEM thành phần gồm có: chế phẩm EM có thêm 2 chủng vi

khuẩn lactic (109 CFU/mL), nhóm Bacillus (109 CFU/mL), nhóm nấm men (107

CFU/mL) và nhóm vi khuẩn quang dưỡng (107 CFU/mL). Chế phẩm này làm tăng hiệu

quả đề kháng với vi sinh vật gây bệnh cho tôm và khả năng làm sạch môi trường ao

như: H2S, NH3, NO3.

33


Chế phẩm của Viện Công nghệ sinh học (trung tâm khoa học công

nghệ quốc gia) [9]

Chế phẩm sinh học BioF có chứa tế bào sống chủng vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus được sử dụng trong ao nuôi trồng thủy sản. Chế phẩm này có

tác dụng tăng khả năng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas và Vibrio gây

ra. Chế phẩm BioF có 9,2 x 108 - 8,9 x 109 CFU/g.

Chế phẩm sinh học BIOCHIE bào gồm một số chủng thuộc chi Bacillus

(Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và chi Lactobacillus

dùng để xử lý nước trong ao nuôi thủy sản. Các chủng trên có khả năng phân hủy các

hợp chất hữu cơ từ thức ăn và chất thải của tôm, làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu

trình thay nước, tăng độ oxy hòa tan. Chóng có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn

làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh.

BIOCHIE được dùng cùng với chế phẩm BioF ứng dụng cho nuôi tôm

thịt đã mang lại kết quả tốt. Liều lượng sử dụng là 1011 CFU/1000 m3 nước phun 15

ngày/lần. Chế phẩm BioF được trộn vào thức ăn với liều lượng 109 CFU /1kg thức ăn

(hay là 3g/1kg thức ăn) trong suốt quá trình nuôi.

Chế phẩm sinh học Bio.DW [35]

Là tập hợp các vi sinh được phân lập tuyển chọn nhằm làm sạch nền đáy và

phòng bệnh cho tôm nuôi công nghiệp. Chế phẩm ở dạng bột đóng gói do Viện Công

nghệ Sinh học thuộc Trung tâm khoa học công nghệ quốc gia nghiên cứu và ứng dụng.

Thành phần gồm 2 chủng nấm sợi Aspergillus oryzae và Aspergillus phoenecis NT1

và 2 chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis.

Cách dùng: 2 tuần/1 lần với liều lượng dùng 2,5 - 5 kg/ha.

Chế phẩm sinh học Men Bac [35]

Là sản phẩm của công ty TNHH Toba, Việt nam nhằm mục đích xử lý nước ao

nuôi tôm.

34


Thành Phần: Bacillus mensentericus, Lactobacillus acidophillus, Bacillus

subtillis, Streptococcus facium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Bacillus licheniformis,

Aspergilus oryzace, Saccharomyces cerevisiae, enzyme và các chất dinh dưỡng.

Công dụng: Phân hủy nhanh chóng thức ăn thừa, phân tôm, vỏ tôm ở đáy ao,

hấp thụ khí độc NH3, H2S, NO2, chống ô nhiễm đáy ao, tạo chất lượng nước tốt. Phòng

chống bệnh đen mang, phồng mang, đóng rong, mòn đuôi, phát sáng. Tạo nguồn vi

khuẩn tự nhiên có lợi cho ao nuôi, ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn có hại cho

tôm. Gia tăng hàm lượng oxy hòa tan trong nước, ổn định độ pH, màu nước. Giảm độ

đục của nước, tạo ra các chất dinh dưỡng vô cơ giúp tảo và các vi sinh vật có lợi phát

triển ổn định. Giúp tôm khỏe mạnh, mau lột xác, tăng trọng nhanh, đạt năng suất cao.

Cách dùng: rải trực tiếp xuống ao nuôi mà không cần phải hòa vào nước hoặc sục khí:

1kg/1000 m3, 10 - 15 ngày rải 1 lần.

Men vi sinh Bio - Probiotic tôm, cá [35]

Các vi sinh vật có lợi cho đường ruột: Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophillus, Saccharomyces cerevisae > 3.108 CFU/g. Các enzyme tiêu hoá: Amylase,

Cellulase, Protease.

Công dụng: tăng cường khả năng tiêu hoá và hấp thụ chất dinh dưỡng, hạn chế

được các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hoá và bệnh do vi khuẩn, tăng sức đề kháng của

tôm, tăng tốc độ sinh trưởng, tăng tỷ lệ sống, tăng năng suất và chất lượng cá, tôm nuôi

và giảm hệ số thức ăn.

Cách sử dụng: dùng cho mọi lứa tuổi của tôm; Dùng trong suốt quá trình nuôi

sẽ ngăn được bệnh phân trắng. Trộn đều 500g Bio-Probiotic cho 100kg thức ăn;

Trường hợp tôm, cá biếng ăn dùng liều gấp đôi.

Chế phẩm làm sạch nước và nền đáy ao nuôi tôm, cá Bio – DW [35]

Thành phần: các vi sinh vật hữu hiệu: Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophillus, Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisae. Các enzyme: Amylase,

Cellulase, Protease.

35

http://hoasinhvietnam.com.vn/home/detail.asp?iData=2784&iCat=627&iChannel=55&nChannel=Products

http://hoasinhvietnam.com.vn/home/detail.asp?iData=2779&iCat=627&iChannel=55&nChannel=Products


Tác dụng: phân huỷ nhanh thức ăn thừa, giảm lượng khí độc như H2S, NO3,

NH3, làm sạch nước và nền đáy ao nuôi tôm, cá công nghiệp đã bị ô nhiễm. Tăng

cường sự phân huỷ và chuyển hoá các chất thải hữu cơ, làm sạch và ổn định môi

trường và nền đáy ao nuôi tôm, cá công nghiệp. Tăng tỉ lệ sống và năng suất.

Cách sử dụng: hoà tan Bio-DW vào nước với tỉ lệ 1/50 rồi tạt đều khắp mặt

nước ao, đồng thời chạy hệ thống quạt nước hoặc hệ thống sục khí đáy. Không sử dụng

thuốc kháng sinh hoặc thuốc sát trùng trong vòng 2 ngày trước và sau khi dùng Bio-

DW. Cải tạo ao trước khi thả giống, dùng với lượng 200g/1000 m3.

+ Hai tháng đầu: 250g/1000 m3 nước; 10 ngày xử lý 1 lần.

+ Hai tháng sau: 500g/ 1000 m3 nước; 10 ngày xử lý 1 lần.

Trường hợp ao bị ô nhiễm quá nặng thì sử dụng 1000g/1000 m3 nước, sục khí hay

quạt nước suốt ngày đêm, mỗi tuần xử lý 1 lần cho đến khi nước hết ô nhiễm.

1.6 TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG TRONG

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

1.6.1 Trùn quế và phân trùn quế [38, 5]

Trùn đất có mặt ở khắp mọi nơi trên thế giới, với khoảng 4.500 loài, trong đó ở

Việt Nam có trên 110 loài, nhưng chỉ có sáu tới tám loài được nuôi để sử dụng và sản

xuất phân bón. Trong số đó có loài Eisenia fetida (trùn Quắn) và đặc biệt là loài

Perionyx excavatus (thường gọi là trùn đỏ hay trùn Quế) là được nuôi phổ biến nhất.

36


Trùn quế có tên khoa học là Perionyx excavatus, chi Pheretima, họ

Megascocidae (họ cự dẫn), ngành ruột khoan. Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường

sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với

phần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa

phương sống trong đất.

Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần, nhập nội và đưa vào

nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác

ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch. Kích thước trùn quế trưởng

thành từ 10 - 15 cm, nước chiếm khoảng 80 – 85%, chất khô khoảng 15 - 20%. Hàm

lượng các chất (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: protein: 68 - 70%, lipid: 7 -

8%, chất đường: 12 - 14%, tro 11 - 12%.

Do có hàm lượng protein cao nên trùn quế được xem là nguồn dinh dưỡng bổ

sung quý giá cho các loại gia súc, gia cầm, thủy hải sản… Ngoài ra, trùn quế còn được

trong y học, công nghệ chế biến thức ăn gia súc…

Phân trùn (vermicompost) là phân hữu cơ 100%, được tạo thành từ phân trùn

nguyên chất và một phần được phân hủy từ chất hữu cơ. Phân trùn chứa đựng hỗn hợp

vi sinh hoạt tính cao, chất xúc tác sinh học, phần cặn bã của cây trồng và động vật cũng

như kén trùn. Phân trùn gần như không mùi, nếu có cũng ít hoặc không gây ra sự khó

chịu cho người. Độ pH của phân trùn ~7.

Hình 1.4 Trùn quế

37


Những lợi ích mà phân trùn trong nông nghiệp.

Phân trùn có thể được bón, hấp thu một cách dễ dàng và hiệu quả ngay lập tức

mà không gây hiện tượng cháy cây.

Phân trùn giàu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước, có nhiều hơn 50% chất mùn,

ngoài ra còn có các khoáng chất cần thiết cho cây như N, P, K, Ca…

Phân trùn làm giảm tỷ lệ C/N của đất giúp cây trồng dễ hấp thụ hơn.

Phân trùn không những làm tăng tỷ lệ nảy mầm, kích thích tăng trưởng, cải tạo

đất, duy trì khả năng giữ nước mà còn có thể ngăn ngừa các bệnh về rễ. Chất mùn

trong phân loại trừ những độc tố và nấm, vi khuẩn hại trong đất giúp đẩy lùi những

bệnh của cây trồng.

Phân trùn có khả năng cố định kim loại nặng trong chất thải hữu cơ. Điều này

ngăn không cho cây trồng hấp thụ nhiều phức hợp khoáng hơn nhu cầu. Những phức

hợp khoáng này sau đó sẽ được phóng thích từ từ khi cây cần đến.

Phân trùn hoạt động như một rào cản ngăn ngừa mức độ pH quá cao vốn khiến

cây trồng không thể hấp thu dinh dưỡng từ đất.

Humic Acid trong phân trùn kích thích sự phát triển của cây trồng ngay cả ở

nồng độ thấp đồng thời kích thích sự phát triển về mật độ vi khuẩn trong đất.

IAA (Indol Acetic Acid) trong phân trùn là một trong những chất kích thích tăng

trưởng hữu hiệu cho cây trồng.

Phân trùn chịu được sự xói mòn và cũng gia tăng khả năng giữ nước của đất cho

cây.

Tại Philippin, trùn quế được liệt kê vào danh mục thức ăn có giá trị dinh dưỡng

cao cho nuôi trồng thuỷ sản.

Tại Việt Nam, từ năm 2000 đã có nhiểu nghiên cứu sử dụng trùn quế trong chăn

nuôi gà và heo, trên từ cở sở đó cũng bắt đầu có những nghiên cứu và ứng dụng trùn

quế trong nuôi trồng thủy sản. Như nghiên cứu quá trình tự phân của trùn quế nhằm tạo

ra sản phẩm giàu đạm làm thức ăn cho tôm và cá con, nghiên cứu sử dụng trùn quế như

là nguổn protein làm thức ăn cho cá trê lai.

38


Những ứng dụng từ trùn quế trong việc nuôi trồng thủy sản mang lại hiệu quả

kinh tế đáng kể, trùn quế được một số trung tâm khuyến ngư khuyên dùng làm thức ăn

cho tôm cá, giúp tăng sức đề kháng, giảm được nhiều bệnh do vi sinh vật. Đồng thời

phân trùn cũng được các trung tâm khuyến ngư khuyên dùng để xử lý ao tôm, gây màu

nước.

1.6.2 Chế phẩm sinh học từ trùn quế trong nuôi trồng thủy sản

Trong nông nghiệp, trùn quế được coi là loại thức ăn đạm cao cấp cho vật nuôi.

Các loài cá, baba, tôm, ếch, lươn, cua biển... đều rất thích ăn trùn. Đối với gia súc, gia

cầm, trùn là loại thức ăn bổ dưỡng. Tuy nhiên, trùn quế tươi chỉ có thể để không quá

một ngày ở nhiệt độ thường nên rất khó lưu trữ.

Từ thực tế đó, tiến sĩ Võ Thị Hạnh cùng các cs thuộc Phòng Vi sinh Viện Sinh

học nhiệt đới đã tạo ra 3 chế phẩm sinh học từ trùn quế trong đó chế phẩm BIO-T và

BIO-PT được dùng trong thủy sản.[32] Các chế phẩm này có thể được bảo quản, lưu

trữ trong thời gian dài, từ 6 - 10 tháng. Một ưu điểm nổi trội của các chế phẩm này là

vẫn giữ nguyên mùi trùn tươi, các chất dinh dưỡng không bị mất đi hoặc biến chất theo

thời gian.

Chế phẩm đầu tiên là BIO-T, dùng làm thức ăn cho tôm sú, cá tra, gà lương

phượng và vịt xiêm. Điều đáng nói là nếu sử dụng trùn quế tươi phải cần một lượng

nhiều gấp 10 lần so với BIO-T mới có hiệu quả tương tự. BIO-T được sản xuất bằng

cách sử dụng trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi khuẩn hữu ích và enzyme tiêu hóa

dùng trong chăn nuôi, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu dinh dưỡng (đạm protein

và amin cao), enzyme tiêu hóa, vi khuẩn hữu ích và các chất kháng sinh...

Chế phẩm BIO-PT được tạo ra bằng cách dùng phân trùn ủ lên men, sản phẩm

làm ra có mùi thơm, độ ẩm 40%, đạm tổng 2%, chất hữu cơ, kháng sinh và hỗn hợp vi

khuẩn hữu ích. BIO-PT dùng để gây màu và xử lý nước ao nuôi tôm dùng trong nuôi

trồng thủy sản.

Ngoài ra, công ty TNHH Trùn quế An phú cũng đã và đang cho ra thị trường

nhiều sản phẩm từ trùn và phân trùn quế phục vụ cho nuôi trồng thủy sản. [37]

39


Dịch trùn quế PROMIN: Không chỉ đơn thuần là chất dẫn dụ hấp dẫntôm, cá mà

dịch trùn quế Promin còn được xem như là một thức ăn bổ sung dạng nước với kháng

thể thiết yếu nhất có thể thay thế tất cả các loại như dầu mực, thức ăn bổ sung, vitamin

C, men vi sinh......và ngay cả kháng sinh khi cần thiết, loại bỏ hoàn toàn bệnh phân

trắng và đốm trắng trên tôm.

Phân trùn xử lý ao tôm: Qua tiến hành thử nghiệm trên thực tế đã cho thấy phân

trùn đem lại kết quả khả quan khi sử dụng phân trùn cho ao nuôi tôm, đặc biệt đối với

những ao hồ đã trải qua nhiều vụ nuôi. Sử dụng phân trùn từ 15-20 kg/1000 m2 cho ao

cần cải tạo và lượng tương ứng khi gây màu cho thấy quá trình gây màu nhanh hơn,

màu nước bền hơn so với các ao đối chứng. Đặc biệt áp dụng tốt cho các ao nuôi quảng

canh cũng như ao nuôi công nghiệp khi gây màu và với giá thành không phải là cao

(giá thị trường vào khoảng 3.500đ/kg).

Bột trùn Powder worm meal: giúp làm tăng khả năng tăng trưởng, phát triển cơ,

tăng trọng, bồi đắp lượng Protein và Acid amin thiếu hụt, tăng cường khả năng tình

dục, ngon miệng và làm cho thức ăn có vẽ hấp dẫn và lôi cuốn hơn đối với vật nuôi. Vì

thế sẽ tránh được trường hợp thừa thải thức ăn. Bột trùn được sử dụng như là một loại

thức ăn bổ sung, khi sử dụng kết hợp với tảo và Artemia, làm tăng khả năng bắt mồi.

Sử dụng bột trùn có thể tạo ra tôm chất lượng hơn so với các loại thức ăn thông

thường. Những nghiên cứu về kết quả sử dụng bột trùn cho thấy tôm khi sử dụng bột

trùn sẽ lớn hơn từ 50-100% và tôm hậu ấu trùng có khả năng chịu đựng stress, lên màu

tốt và đồng cỡ hơn so với các mô hình nuôi sử dụng thức ăn thông thường.

40


1.7 VI KHUẨN BACILLUS

1.7.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus

Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau

Hình 1.4 Vi khuẩn Bacillus

Chi Bacillus là một chi lớn và đa dạng của vi khuẩn thuộc họ Bacilliaceae. Đặc

điểm chung của chi này là những vi khuẩn hình que, gram dương, tạo hoặc không tạo

giáp mô. Bacillus là vi khuẩn dễ mọc, phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông

thường. Vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp từ 5 - 50oC, tối ưu là

35 - 40oC. pH thích hợp là 7 - 7,2. [4]

Khi gặp điều kiện môi trường không thuận lợi như cạn kiệt nguồn dinh dưỡng,

vi khuẩn sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ dạng hình cầu hay hình bầu dục được

gọi là bào tử. Mỗi tế bào chỉ sinh ra một bào tử. Bào tử có khả năng kháng nhiệt, kháng

với các tác nhân có hại như sự khô hạn, tia bức xạ, acid mạnh.... Trong thời kỳ nghỉ

không thấy bào tử thể hiện bất kỳ hoạt lực trao đổi chất nào, người ta gọi đó là trạng

thái sống ẩn. Bào tử có thể sống từ vài năm , vài chục năm.

1.7.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn [12]

Cấu trúc của bào tử khi được quan sát dưới kính hiển vi điện tử rất khác với tế

bào sinh dưỡng, nó phức tạp hơn tế bào sinh dưởng bởi có nhiều lớp:

41


Hình 1.5 Cấu trúc của bào tử

Lớp ngoài cùng: là nang bào hay là màng ngoài chiếm 2-3% khối lượng khô của

bào tử. Màng ngoài gồm 2 lớp: lớp ngoài cùng dày 6 nm, lớp trong dày 19 nm, thành

phần chủ yếu là lipoprotein, cũng có chứa một lượng nhỏ acid amin có tính thẩm thấu

kém.

Lớp áo bào tử: dày 3 nm, gồm khoảng 3- 15 lớp chủ yếu là protein sừng (chiếm

khoảng 50-80% protein tổng số của bào tử) và một số ít phospholipoprotein. Áo bào tử

có sức đề kháng cao với lisozyme, protease, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm

thấu kém với các cation.

Vỏ bào tử: chiếm thể tích 36-60% bào tử, chứa một lượng lớn peptidoglucan,

không chứa acid teichoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ có thể tới 20 atm, lượng chứa

nước là 70% (tế bào sinh dưỡng là 80%) cao hơn nhiều so với lượng chứa nước bình

quân trong bào tử (khoảng 40%).

Lớp lõi bào tử: là thể chất nguyên sinh của bào tử. Lõi bào tử cấu tạo bởi 4

thành phần: thành tế bào, màng bào tử, bào tử chất và nhân.

1.7.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus [17]

Quá trình hình thành bào tử trải qua một chuỗi các giai đoạn nối tiếp nhau. Kể

từ khi bắt đầu, quá trình hình thành bào tử cần 8 giờ. Để bắt đầu quá trình này, tế bào

42


phải đạt đến một giai đoạn nhất định trong vòng đời, có thể là do các kích thích nào đó

không thuận lợi cuả môi trường.

Đầu tiên là sự hình thành vách ngăn không đối xứng chia tế bào ra làm 2 phần:

phần tiền bào tử và phần tế bào mẹ. Phần tiền bào tử sau này phát triển thành bào tử

còn phần tế bào mẹ có nhiệm vụ cung cấp chất dinh dưỡng cho bào tử đến khi quá trình

hình thành bào tử hoàn tất.

Sau khi lớp vách ngăn được hình thành, các bản đồ gen sẽ lập trình tách ra và có

hai chương trình hoạt động riêng, một ở tế bào mẹ và một ở tiền bào tử. Chúng là quá

trình xây dựng phía bên ngoài (quá trình tổng hợp protein từ tế bào mẹ) và xây dựng

bên trong (quá trình sản xuất protein ở tiền bào tử).

Sau khoảng 3 giờ vách ngăn dịch chuyển đến bề mặt tiền bào tử ôm sát lấy tiền

bào tử để hình thành nên thể nguyên sinh. Thể nguyên sinh này nằm tự do trong tế bào

mẹ và được bao bọc lớp màng. Lớp vỏ sơ khai được hình thành giữa hai lớp màng của

bào tử.

Tiếp theo là sự hình thành lớp áo thông qua việc tổng hợp protein trong tế bào

mẹ xảy ra xung quanh tiền bào tử. Lớp áo này sẽ hiện rõ sau khoảng 5 giờ.

Bước cuối cùng của quá trình hình thành bào tử là tế bào mẹ bị teo dần và tách

khỏi bào tử con.

1.7.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản [40, 19, 20, 24,

28]

Probiotic là sản phẩm đang được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản để

tăng cường sự tăng trưởng và kháng bệnh cho thủy sản, đặc biệt là tôm sú. Vi khuẩn

được ứng dụng làm probiotic hiện nay phần lớn thuộc giống Bacillus. Do Bacillus có

khả năng tạo bào tử chịu được nhiệt thuận lợi cho quá trình sản xuất và bảo quản, có

khả năng sống sót trong pH thấp của dạ dày, có khả năng sinh enzyme và kháng sinh

có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.

43


Trong thủy sản, Bacillus có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay

nước và cải thiện môi trường, do có khả năng khử nitrate, phân hủy hợp chất hữu cơ

thải ra từ thức ăn thừa nhờ khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu cơ như protease,

amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh

vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio spp., Aeromonas spp., Edwardsiella spp.…

do chất lượng nước nuôi bị giảm. Ngoài ra, chúng còn có tác dụng giảm đáng kể tỷ lệ

chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hôi của môi trường nuôi.[20]

Rengpipat và Rukpratanporn (1998) cho rằng Bacillus S11 là vi khuẩn hữu ích

có thể bổ sung vào dung dịch giàu hóa Artemia trước khi cho ấu trùng tôm sú ăn. Kết

quả tôm ít bệnh hơn và phát triển nhanh hơn, đạt tỉ lệ sống 100% khi gây cảm nhiễm

với V. harveyi, trong khi kết quả đối chứng chỉ đạt 26%.[24]

Theo Moriarty (1998) sử dụng Bacillus trong nuôi tôm thịt ở Indonesia sẽ an

toàn trong 160 ngày, các trại không sử dụng Bacillus hầu như gặp thất bại, bệnh vi

khuẩn phát sáng do Vibrio thường làm tôm chết trước 80 ngày. [21]

Không chỉ vậy bào tử Bacillus cũng được sử dụng như một tác nhân sinh học

giúp giảm bệnh Vibrio trong hệ thống nuôi thuỷ sản. Gatesoupe (1991) đã nghiên cứu

và sử dụng bào tử vi khuẩn Bacillus IP5832 đưa vào môi truờng nuôi luân trùng dùng

làm thức ăn cho cá bơn.[15]

Meunpol và cs (2002) sử dụng probiotic với dòng vi khuẩn Bacillus S11 trộn

vào thức ăn viên công nghiệp cho ấu trùng tôm sú ăn. Sau khi cho ăn thức ăn trộn

probiotic trong 1 tháng thì cấy vi khuẩn Vibrio harveyi rồi xục ozon vào từng bể

(0,3333 - 0,341 mg O3/ mL). Tỉ lệ sống của tôm được xác định sau 6 ngày đạt cao nhất

75% so với nghiệm thức đối chứng tỷ lệ sống chỉ có 18%.[19]

Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh vật

hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Vì thế, Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố

vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến chất lượng nước, do vi

khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Vì vậy,

Bacillus spp. giúp giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan.[28]

44


Chương 2. V

ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

45


2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Thời gian: từ 02/2011 đến 05/2011.

Địa điểm: tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở

TPHCM.

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

25 chủng vi khuẩn Bacillus (F2, F3, F4, F5, F6, F7, F10, F11, F12, F13, F14, F17, F21,

F26, F27, F28, F33, F34, F35, F36, T1, T5, T9, T12) đã được phân lập từ trùn và phân trùn quế,

cung cấp bởi Phòng TN Công nghệ vi sinh Trường Đại Học Mở TP.HCM.

3 chủng vi khuẩn gây bệnh cho tôm: V. harveyi, V. parahaemolyticus, V.

alginolyticus được cung cấp bởi Phòng TN Công nghệ vi sinh Trường Đại Học Mở

TP.HCM.

Ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon Fabricus) sạch bệnh, ở giai đoạn PL12 đến

PL15 được thu ở trại giống Vũng Tàu. Sau khi đem về phòng thí nghiệm, tôm được

thuần hóa trong 12 giờ, với nhiệt độ nước từ 28-32 oC, độ mặn 16-18o/oo.

2.2.2 Môi trường - hóa chất

Môi trường Nutrient broth (NB) bổ sung 1,5% NaCl (w/v).

Môi trường Nutrient agar (NA).

Môi trường Nutrient agar (NA) bổ sung 1,5% NaCl (w/v).

Môi trường Pepton kiềm.

Môi trường Luria Bertani (LB).

Môi trường Blood agar (BA).

Môi trường Thiosulphate citrate bile salts sucrose agar (TCBS)

Bộ thuốc nhuộm Gram gồm: Crystal violet, Lugol, Fuchsine kiềm, cồn 96º.

Nước cất, nước cất vô trùng.

Dung dịch NaCl 0,85%, NaOH 40%, dung dịch H2O2 3%.

Nước biển thu từ Vũng Tàu.

46


2.2.3 Thiết bị - dụng cụ

2.2.3.1 Thiết bị

Máy bể ổn nhiệt MEMMERT

Máy chụp hình SONY

Kính hiển vi OLYMPUS

Tủ cấy ESCO

Máy Vortex Zx3, VELP

Tủ ấm MEMMERT

Tủ sấy MEMMERT

Nồi hấp HIRAYAMA

Microwave SHARP

Cân kỹ thuật

Một số thiết bị khác trong Phòng TN Vi Sinh.

2.2.3.2 Dụng cụ

Micropipet và đầu tip tương ứng

Que cấy

Đèn cồn

Đĩa petri

Erlen

Becher

Que trang

Ống nghiệm

Ống đong

Hộp nhựa 650 mL

…

47


2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Hình 2.6 Quy trình thí nghiệm

48


2.4 TÁI PHÂN LẬP BACILLUS

Tái phân lập và đinh danh sơ bộ vi khuẩn thử nghiệm bằng phương pháp thường

qui, nhuộm gram và thử catalase.

Sau khi nhận giống Bacillus chúng tôi tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria

trên đĩa môi trường NA, ủ 37oC/ 24 giờ.

Nhuộm Gram [1]

Nguyên tắc

Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (-) làm cho khả năng bắt màu

màng tế bào với thuốc nhuộm khác. Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai

nhóm vi khuẩn.

Thực hiện

Việc nhuộm Gram được thực hiện như sau:

Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch. Tạo huyền phù với vi khuẩn cần

nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô.

Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet. Để yên 1 - 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa

trôi thuốc nhuộm dư bằng nước.

Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước.

Tẩy cồn 96o từ 15 - 30 giây, sau đó rửa nước. Phủ hoàn toàn vết bôi với

Safranin O và để yên trong 1 phút. Rửa với nước.

Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát

dưới kính hiển vi với vật kính 100.

Đọc kết quả

Vi khuẩn Gram âm sẽ thấy màu hồng; Gram dương sẽ thấy màu tím; vi khuẩn

đã hình thành bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu nằm bên trong tế bào sinh

dưỡng bắt màu Gram, hoặc bào tử đã phóng thích ra ngoài sẽ tạo một rìa màu hồng

xung quanh khối trong suốt.

49


Thử catalase [1]

Nguyên tắc

Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý đều có enzyme catalase (trừ

Streptococcus sp.). Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2. Sự

thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt

khí, vì thế ta sử dụng đặc tính này để thử khả năng sinh enzyme catalase của vi khuẩn.

Thực hiện

Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính

sạch. Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính và quan sát.

Kết quả

Vi khuẩn sinh catalase sẽ sủi bọt khí (+), vi khuẩn không sinh catalase sẽ không

thấy sủi bọt (-).

2.5 THỬ ĐỐI KHÁNG

2.5.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc [26]

Nguyên tắc

Nhiều vi khuẩn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh làm ức chế sự phát

triển của vi khuẩn gây bệnh. Khi cấy vạch vi khuẩn thử nghiệm vuông góc với vạch đã

cấy vi khuẩn gây bệnh nếu khoảng cách từ vi khuẩn thử nghiệm đến chỗ vi khuẩn gây

bệnh bắt đầu sinh trưởng càng lớn thì khả năng ức chế càng mạnh, nếu vi khuẩn cần

kiểm tra không sinh chất ức chế vi khuẩn gây bệnh thì vi khuẩn gây bệnh vẫn phát triển

bình thường ngay điểm giao nhau của hai vạch này.

Thực hiện

Chủng vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NA,vi khuẩn gây

bệnh được tăng sinh trên môi trường pepton kiềm ở 37 oC/ 24 giờ.

Vi khuẩn gây bệnh được cấy thẳng vạch thứ nhất trên môi trường NA bổ sung

1,5% NaCl. Sau đó lấy vi khuẩn thử nghiệm vạch thẳng vuông góc với vạch thứ nhất ,

ủ ở 37 oC. Quan sát sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ.

50


Kết quả

Nếu tại điểm giao nhau của 2 vạch vi khuẩn gây bệnh không mọc thì vi khuẩn

thử nghiệm có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh ( kết quả dương tính ). Kết quả âm

tính khi vi khuẩn gây bệnh vẫn phát triển bình thường tại điểm giao nhau của 2 vạch.

Nếu tại điểm giao nhau của 2 vạch vi khuẩn thử nghiêm mọc trên đường vạch của gây

bệnh thì vi khuẩn thử nghiệm có khả xâm lấn vi khuẩn gây bệnh.

Hình 2.7 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc

2.5.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp [26]

Nguyên tắc

Nhiều vi khuẩn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh làm ức chế sự phát

triển của vi khuẩn gây bệnh. Nếu xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn thử nghiệm

đường kính vòng ức chế càng lớn thì vi khuẩn gây bệnh càng mẫn cảm với chất kháng

sinh do vi khuẩn thử nghiệm tiết ra.

Thực hiện

Chủng vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NA,vi khuẩn gây

bệnh được tăng sinh trên môi trường pepton kiềm ở 37 oC/ 24 giờ.

Cấy chấm vi khuẩn thử nghiệm thử nghiệm lên đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ, 48

giờ và 72 giờ ở 37 oC. Vi khuẩn gây bệnh được nuôi cấy trong NB bổ sung 1,5% NaCl

trong 24 giờ ở 37 oC, lấy 0,2 mL dịch nuôi cấy này trộn với 20 mL NA bổ sung 1,5%

51


NaCl (ở 40 - 45 oC) đổ nhẹ nhàng lên đĩa NA đã cấy chấm vi khuẩn thử nghiệm. Ủ 37 oC trong 24 - 48 giờ, quan sát vòng ức chế vi khuẩn. Thử nghiệm được lập lại 3 lần.

Kết quả

Đo đường kính vòng ức chế .

2.6 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY [27]

Sử dụng thử nghiệm đồng nuôi cấy để đồng nuôi cấy các chủng vi khuẩn thử

nghiệm (mật độ ban đầu 105, 107, 108, 109 CFU/ mL) với các chủng vi khuẩn gây bệnh

(mật độ ban đầu 103 CFU/ mL).

Nguyên tắc

Nhiều vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm

giảm mật độ của chúng.

Thực hiện

Chủng vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên NA, vi khuẩn gây bệnh được

tăng sinh trên pepton kiềm ở 37 oC/ 24 giờ.

Các chủng vi khuẩn này được pha trong NaCl 0,85% tạo huyền dịch vi khuẩn

sao cho mật độ vi khuẩn gây bệnh sao khi cho vào LB là 103 CFU/ mL và vi khuẩn thử

nghiệm đạt 105, 107, 108, 109 CFU/ mL.

Đồng nuôi cấy ở 37 oC trong 7 ngày.

Kiểm tra mật độ sau 24 giờ bằng phương pháp trãi đĩa trên TCBS.

Pha loãng dịch đồng nuôi cấy trong NaCl 0,85% đến mật độ đếm được.

Hút 0,1 mL ở 3 mật độ liên tiếp, mỗi mật độ trải trên 2 đĩa thạch TCBS,

lặp lại 3 lần. Ủ 37 oC /24 – 48 giờ.

Đếm khuẩn lạc và tính mật độ khuẩn lạc ban đầu.

52


Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng nuôi cấy

Công thức tính mật độ tế bào của chủng vi khuẩn khảo sát [10]

Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di,

được tính theo công thức là:

Mi (CFU/mL) = Ai X Di/V

Trong đó

Mi: Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu.

Ai: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa.

Di: Độ pha loãng.

V: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (mL).

Môi trường LB

Môi trường LB

Cấy trang trên TCBS để xác định mật độ Vibrio

Cấy trang trên TCBS để xác định mật độ Vibrio

Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Vibrio

Vi khuẩn Vibrio

53



BACILLUS

2.7.1 Thử khả năng gây dung huyết [1]

Nguyên tắc

Một vài loài vi sinh vật có khả năng sinh enzym hemolysin làm tan máu (dung

huyết). Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu BA (Blood Agar), có bổ sung 5 – 10%

máu cừu, tùy theo loài vi khuẩn, có 1 trong 3 loại tan máu sau:

Tan máu : tan máu không hoàn toàn.

Tan máu : tan máu hoàn toàn,vùng tan máu rộng.

Tan máu : không tan máu.

Thực hiện

Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy lên môi trường thạch máu BA, có bổ sung

5% máu cừu, có thể tiến hành với vi khuẩn đối chứng không dung huyết.

Cho vào tủ ấm 37 oC, ủ trong 24 giờ.

Đọc kết quả: Tùy loại vi khuần, sẽ cho 1 trong 3 kiểu tiêu huyết sau:

Tiêu huyết α (tiêu huyết không hoàn toàn): hồng cầu bị ly giải không hoàn toàn,

tạo nên vùng tiêu huyết nhỏ, mờ, hơi màu xanh.

Tiêu huyết β (tiêu huyết hoàn toàn): hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng

tiêu huyết rộng, sáng và trong bao quang khóm vi khuẩn trên thạch máu.

Tiêu huyết γ (không tiêu huyết): hồng cầu không bị ly giải nên không tạo ra

vòng tiêu huyết.

2.7.2 Thử nghiệm tính an toàn cho các chủng Bacillus lên ấu trùng

tôm sú [11]

Nguyên tắc:

Đánh giá tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử nghiệm lên ấu trùng tôm sú.

Thực hiện:

54


Nước biển được thu từ Vũng Tàu được pha đến độ mặn thích hợp cho tôm 16 –

18o/oo. Tiến hành lọc để loại bỏ tạp chất. Hấp ở 12 oC/1atm /20 phút. Ấu trùng sau khi

thuần hóa 12 giờ được cho vào nước biển đã để nguội theo lô thí nghiệm 60 ấu

trùng/300 mL/1 hộp thí nghiệm.

Vi khuẩn thử nghiệm được hoạt hóa trên NA ở 37 oC trong 18 - 24 giờ

Vi khuẩn được pha trong NaCl 0,85% tạo huyền dịch vi khuẩn sao cho mật độ

khi cho vào hộp thí nghiệm là 106 CFU/ mL.

Đọc kết quả

Theo dõi tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sau 24 giờ sau khi bổ sung vi khuẩn.

Các thử nghiệm được lặp lại 6 lần và được xử lý thống kê Anova một yếu tố

bằng phần mềm Excel. Kết quả được trình bày dưới dạng: trung bình (mm)±sai số

chuẩn.

Hình 2.10 Thuần hóa tôm

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an toàn cho các chủng vi khuẩn thử

nghiệm lên ấu trùng tôm sú

Thử nghiệm tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử

nghiệm trên ấu trùng tôm sú

Thử nghiệm tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử

nghiệm trên ấu trùng tôm sú

Đối chứng: ấu trùng tôm

(không vi khuẩn)

Đối chứng: ấu trùng tôm

(không vi khuẩn)

Vi khuẩn vi khuẩn thử

nghiệm 1 + ấu trùng tôm


nghiệm 1 + ấu trùng tôm


nghiệm 2+ ấu trùng tôm







Theo dõi tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ

Theo dõi tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ

55


Hình 2.11 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm

Hình 2.12 Hộp bố trí thí nghiệm

56


2.8 XỬ LÝ KẾT QUẢ

Kết quả được xử lý thống kê ANOVA của phần mềm Excel của Microsoft với

độ tin cậy P< 0,05. Kết quả trình bày gồm giá trị trung bìnhsai số.

57


Chương 3. KẾ

T QUẢ VÀ BÀN LUẬN

58


3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP BACILLUS

Tái phân lập 25 chủng Bacillus đã được phân lập từ trùn quế và phân trùn quế,

tất cả 25 chủng Bacillus đều thuần Gram dương, sinh bào tử, phản ứng catalase dương.

Các chủng phân lập từ trùn quế được ký hiệu T và từ phân trùn quế ký hiệu F,

kết quả được trình bày trong bảng 3.1.

Hình 3.13 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24h nuôi cấy.

Hình 3.14 Nhuộm gram Bacillus

59


Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập

ST

TMã

chủngĐặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể

Cat

alas

e

1 F2

Rìa nhăn, khuẩn lạc

khô, bám sát mặt thạch

Hình que, xếp thành chuỗi, gram

(+), nội bào tử+

2 F3

Rìa nhăn, bờ nhô cao,

khô



3 F4 Rìa tròn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram


4 F5 Rìa nhănHình que, xếp thành chuỗi, gram


5 F6 Rìa nhăn, lồiHình que, xếp thành chuỗi, gram


6 F7 Rìa nhăn, khô, dẹpHình que, xếp thành chuỗi, gram


7 F10 Rìa nhăn, mọc lan mạnhHình que, xếp thành chuỗi, gram


8 F11 Rìa nhăn, bờ nhô caoHình que, xếp thành chuỗi, gram


9 F12 Rìa nhăn, bóngHình que, xếp thành chuỗi, gram


10 F13 Rìa nhănHình que, xếp thành chuỗi, gram


11 F14 Rìa nhăn, bóng, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram


60


ST

TMã


Cat

alas

e

12 F17 Rìa tròn, khôHình que, xếp thành chuỗi, gram


13 F21 Rìa nhăn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram


14 F26 Rìa nhăn, khô,xù xìHình que, xếp thành chuỗi, gram


15 F27 Rìa nhăn, khuẩn lạc khôHình que, xếp thành chuỗi, gram


16 F28 Rìa nhăn, khôHình que, xếp thành chuỗi, gram




18 F34

Rìa nhăn, xù xì, mọc

phân lớp





20 F36 Rìa tròn, khôHình que, xếp thành chuỗi, gram


21 T1 Rìa nhăn, dẹp, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram


22 T4 Rìa nhăn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram


23 T5

Rìa nhăn, khuẩn lạc

khô, xù xì



61


ST

TMã


Cat

alas

e

24 T9 Rìa trơn, khuẩn lạc ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram


25 T12

Rìa nhăn, dẹp, ướt,

bóng



3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG

3.2.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc

Từ 25 chủng vi khuẩn Bacillus tái phân được thử khả năng đối kháng với 3

chủng vi khuẩn gây bệnh cho tôm: Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus,

Vibrio harveyi sử dụng phương pháp cấy vạch vuông góc và đọc kết quả sau 24 giờ, 48

giờ, 72 giờ nuôi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

62


Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp vạch vuông góc

STT ChủngV. parahaemolyticus V. alginolyticus V. harveyi

24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ

1 F2 - - - - - - + + +

2 F3 - - - - - - + + +

3 F4 - - - - - - - - -

4 F5 - - - - - - - - -

5 F6 - - - - - - + + +

6 F7 - - - - - - - - -

7 F10 - - - - - - - - -

8 F11 - - - - - - + + +

9 F12 - - - x x x - - -

10 F13 - - - - - - y + +

11 F14 - - - - - - - - -

12 F17 - - - - - - + + +

13 F21 - - - - - - - - -

14 F26 - - - - - - - - -

15 F27 - - - - - - y + +

16 F28 - - - - - - y + +

17 F33 - - - - - - - y y

18 F34 - - - - - - - - -

19 F35 - - - - - - - - -

20 F36 - - - - - - + + +

21 T1 - - - - - - - - -

22 T4 - - - - - - - - -

23 T5 - - - - - - y y y

24 T9 - - - - - - - - x

63


24 T12 - - - - - - - - -

Ghi chú

– -: không kháng

– +: kháng

– y: kháng yếu

– x : xâm lấn

Nhận xét

Trong 25 chủng Bacillus thử nghiệm chúng tôi nhận thấy tất cả các chủng không

kháng với V. parahaemolyticus, V. alginolyticus (ngoại trừ chủng F12) nhưng hầu hết

các chủng kháng với V. harveyi và có khả năng kháng tốt nhất ở 48 và 72 giờ.

6 chủng (F2, F3, F6, F11, F17, F36) kháng mạnh với Vibrio harveyi ở 24, 48, 72 giờ

ngoại trừ 2 chủng kháng yếu (F33,T5). 3 chủng (F13, F27, F28) kháng mạnh với Vibrio

harveyi chỉ ở 48 và 72 giờ.

12 chủng (F4, F5, F7, F10, F14, F21, F26, F34, F35, T1, T4, T12) không đối kháng với cả

3 chủng vi khuẩn gây bệnh.

Trong đó chỉ có chủng F12 xâm lấn V. alginolyticus ở 24, 48, 72 giờ và T9 xâm

lấn với V. harveyi ở 72 giờ.

Để khẳng định một lần nữa khả năng đối kháng chúng tôi tiếp tục tiến hành thử

nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.

Hình 3.15 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc

64


3.2.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp

Song song với phương pháp cấy vạch vuông góc, 25 chủng Bacillus cũng được

thử nghiệm khả năng đối kháng với 3 chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp đổ

thạch hai lớp.

Thử nghiệm được lặp lại 3 lần và được xử lý thống kê Anova một yếu tố bằng

phần mềm Excel. Kết quả được trình bày dưới dạng: trung bình (mm)±sai số.

65


Bảng 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.

Chủn

g

V. parahaemolyticus V.alginolyticus V. harveyi


F4 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

F5 0±0 5.33±0.33 15±0.58 0±0 0±0 0±0 15.33±0.8820.67±0 .3

323±0.58

F10 9.6±0.88 15.33±0.33 30±0.58 14.67±0.33 0±0 10.67±1.2 21.33±0.67 24.33±0.33 32.33±0.67

F12 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

F13 6.33±0.33 9.67±1.45 12.67±0.33 0±0 0±0 0±0 11±0.58 16.33±0.33 17.33±0.33

F17 0±0 0±0 12±0.58 0±0 0±0 23±0.58 23.67±0.33 29.33±0.33 24.67±0.88

F21 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

F26 10±1 10.67±1.33 8.67±1.67 0±0 0±0 0±0 10.33±0.33 14±0.58 15±0.58

F33 0±0 0±0 13.67±0.67 16.33±0.67 15±0 12.33±1.33 0±0 27.33±0.88 22.67±1.45

F35 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 19±0.58

F36 0±0 0±0 14.67±0.67 9.33±0.88 11±1.53 14.33±0.67 14.67±1.76 14.67±0.88 19±1

T4 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

F28 9.67±1.2 9.67±0.33 6.67±0.33 16±0.58 18.67±0.33 18±0.58 21.33±0.88 23.67±1.2 21.33±0.33

F11 0±0 6.33±0.88 14.67±0.33 10±0.58 15.33±0.88 16.33±0.67 20.33±0.33 23±0.58 20.67±0.67

66


Chủn

g

V. parahaemolyticus V.alginolyticus V. harveyi


F14 0±0 0±0 20.33±0.67 0±0 0±0 7.33±0.88 0±0 0±0 0±0

F27 0±0 9±1.15 13.67±0.88 12±1.15 15.33±0.67 14±0.58 15±7.94 23±1.73 21±2.08

F2 7±3.51 9.67±0.33 11±1.15 10±0 12±1 13.33±1.2 8.33±4.18 22±3.21 21.33±2.4

F3 0±0 9.67±0.33 11.33±5.7 0±0 0±0 0±0 10.67±0.67 14±0.58 18±9.17

F34 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

F6 8.67±0.33 12.33±0.88 11.67±2.03 10±0.58 7±3.51 14.67±0.33 14±0 18.67±0.33 12.33±6.94

F7 9.33±0.67 13±0 23.33±0.88 0±0 0±0 8.33±0.33 20.67±0.33 15± 0.58 19±0

T1 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

T12 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

T5 0±0 0±0 14.33±0.67 0±0 0±0 2.67±2.67 0±0 5.67±5.67 0±0

T9 10±0 16.33±3.18 21.33±0.67 0±0 0±0 10.33±1.2 12.33±0.33 17.33±4.63 20±1.73

67


Biểu đồ 3.1 Thử khả năng đối kháng của chủng Bacillus đối với V. parahaemolyticus

theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ

Biểu đồ 3.2 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V. alginolyticus

theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ


Biểu đồ 3.3 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V. harveyi theo

thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ

Trong 25 chủng vi khuẩn thử nghiệm thì hầu hết các chủng này đều đối kháng

với các vi khuẩn gây bệnh trừ 7 chủng (F4, F12, F21, F34, T1, T4, T12), đối kháng tốt nhất ở

48 giờ và 72 giờ.

Trong 18 chủng vi khuẩn còn lại thì có 13 chủng (F2, F5, F6, F7, F11, F27, F28, F33,

F10, F17, F36, T5, T9) kháng tất cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh. 3 chủng (F13, F26, F3)

kháng với khuẩn V. parahaemolyticus, V. harveyi. 1 chủng F14 kháng với V.

parahaemolytcus, V. alginolyticus và F35 chỉ kháng với V. harveyi.

Nhận xét :

Tổng hợp kết quả của 2 phương pháp thử đối kháng trên từ 25 chủng ban đầu

chúng tôi thu được 13 chủng (F2, F5, F6, F7, F11, F27, F28, F33, F10, F17, F36, T5, T9) kháng

tất cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu như : đối

kháng với Vibrio gây bệnh của Kurunasagar và cs (2005)[18], Vichai

Domrongpokkaphan và Wanchaitanawong (2006)[16], Nguyễn Văn Minh và cs (2010)

[5].


Sau khi thử nghiệm đối kháng bằng hai phương pháp vạch vuông góc và đổ

thạch hai lớp, chúng tôi chọn tiêu chí khả năng kháng với vi khuẩn gây bệnh như sau:

Đối kháng với tất cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh.

Và đối kháng mạnh với V. harveyi.

Với tiêu chí trên chúng tôi chọn được 6 chủng (F10, F2, F27, F33, F11, F28) để tiến

hành tiếp thử nghiệm đồng nuôi cấy.

Hình 3.16 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch 2

lớp


3.3 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY

6 chủng (F10, F2, F27, F33, F11, F28) được chọn lựa từ thử nghiệm đối kháng được

đồng nuôi cấy để xác định mật độ Bacillus có khả năng ức chế chủng vi khuẩn gây

bệnh.

Kết quả đồng nuôi cấy 6 chủng Bacillus (mật độ ban đầu 105, 107, 108, 109

CFU/mL) với ba chủng vi khuẩn gây bệnh: V. harveyi và V. parahaemolyticus, V.

alginolyticus (mật độ ban đầu 103 CFU/ mL) như sau.

3.3.1 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V.

parahaemolyticus


trên LOG10 CFU/mL)

Thời

gian

(ngày)

Mật độ vi khuẩn thử nghiệm ( LOG10 CFU/ mL)

F2-10 5 F2-10 7 F2-10 8 F2-10 9 DC

0 3,03±0,29 2,88±0,1 3,68±0,1 3,36±0,01 3,85±0,03

1 7,96±0,12 7,72±0,06 9,17±0,09 8,47±0,44 10,21±0,00

2 9,73±0,07 9,6±0,39 8,58±0,3 8,63±0,05 10,26± 0,09

3 7,12±0,23 7,91±0,35 7,03±0,32 6,76±0,15 10,56±0,52

4 6,96±0,68 6,98±0,01 7,92±0,17 6,86±0,03 11,11±0,06

5 6,96±0,06 7,7±0,01 6,77±0,04 6,55±0,2 11,29±0,15

6 7,14±0,01 6,85±0,04 6±0,01 5,11±0,06 11,26±0,02

7 6,13±0,85 5,68±0,02 5,18±0 4,98±0,02 10,68±0,10


Biểu đồ 3.4 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng

F2 ở những mật độ khác nhau

Theo biểu đồ 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F2 ở 4 mật độ (105, 107, 108,

109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô

109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp

2.1 lần so với đối chứng.



trên LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)

Mật độ vi khuẩn thử nghiệm

F10 10 5 F10 10 7 F10 10 8 F10 10 9 DC

0 3,37±0,03 2,94±0,05 3,48±0,09 4,05±0,01 3,85±0,03

1 8,75±0,05 7,85±0,04 7,2±0,06 8,92±0,07 10,21±0,00

2 10,12±0,02 8,8±0,06 7,54±0,18 8,38±0,02 10,26± 0,09

3 8,68±0,02 8,84±0,04 8,03±0,02 6,87±0,02 10,56±0,52

4 8,33±0 7,23±0,03 6,54±0,13 6,69±0,1 11,11±0,06

5 7,06±0,09 7,99±0,08 6,62±0,07 5,79±0,13 11,29±0,15

6 7,51±0,1 7,33±0,02 6,5±0,02 5,69±0,1 11,26±0,02

7 7,36±0,02 7,23±0,11 6,14±0,11 4,99±0,01 10,68±0,10


F10 ở những mật độ khác nhau.







trên LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)


F11 10 5 F11 10 7 F11 10 8 F11 10 9 DC

0 2,96±0,01 3,84±0,01 3,79±0,05 3,26±0,12 3,85±0,03

1 8,67±0,02 10,37±0,04 8,76±0 7,63±0,21 10,21±0,00

2 10,75±0,01 9,33±0.01 8,95±0,01 8,33±0,01 10,26± 0,09

3 8,51±0,05 8,61±0,16 9,69±0,1 9,09±0,13 10,56±0,52

4 8,14±0,03 6,65±0,03 7,76±0,03 7,72±0,02 11,11±0,06

5 7,92±0,02 6,43±0,02 7,04±0,02 6,41±0 11,29±0,15

6 7,76±0,04 6,56±0,29 6,52±0 6,44±0,02 11,26±0,02

7 7,63±0,01 6,61±0,07 5,74±0,17 5,77±0,04 10,68±0,10










trên LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)


F27 10 5 F27 10 7 F27 10 8 F27 10 9 DC

0 3,82±0,05 3,7±0,1 3,02±0,01 3,39±0,17 3,85±0,03

1 9,66±0,09 9,24±0,08 9,24±0,05 9,32±0 10,21±0,00

2 10,59±0,09 10,9±0 9,1±0,15 8,93±0,04 10,26± 0,09

3 10,21±0,02 10,32±0,02 8,76±0,07 7,92±0,55 10,56±0,52

4 8,57±0,27 7,61±0,01 6,95±0,05 7,59±0,11 11,11±0,06

5 8,64±0,05 8,38±0,01 6,83±0,2 7,09±0,12 11,29±0,15

6 8,32±0,03 7,92±0 6,83±0,22 7±0,06 11,26±0,02

7 7,67±0,11 6,72±0,07 5,95±0,03 5,5±0,06 10,68±0,10









trên LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)


F28 10 5 F28 10 7 F28 10 8 F28 10 9 DC

0 3,87±0,04 3,52±0,11 3,74±0,07 3,85±0,07 3,85±0,03

1 9,24±0,03 9,3±0,01 8,99±0 8,79±0,03 10,21±0,00

2 10,04±0,02 10,31±0,02 9,85±0,04 8,04±0 10,26± 0,09

3 8,48±0,05 8,9±0,02 8,74±0,1 7,94±0,13 10,56±0,52

4 8,14±0,08 7,71±0,05 8,11±0 8,25±0,13 11,11±0,06

5 7,85±0,01 7,8±0,02 7,52±0,07 7,79±0,08 11,29±0,15

6 7,94±0 7,86±0 7,24±0,11 6,79±0,09 11,26±0,02

7 7,89±0,02 7,5±0,06 6,45±0,01 6,41±0 10,68±0,10






109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7giảm gấp




trên LOG10 CFU/mL)

Thời

gian

(ngày)

Mật độ chủng vi khuẩn thử nghiệm

F33 10 5 F33 10 7 F33 10 8 F33 10 9 DC

0 3,44±0,18 3,21±0,12 2,99±0,00 3,46±0,09 3,85±0,03

1 9,91±0,13 9,57±0,30 8,10±0,19 8,10±0,01 10,21±0,00

2 10,64± 0,07 10,19±0,06 8,14±0,17 8,91±0,06 10,26±0,09

3 10,55±0,51 9,73±0,18 7,69±0,15 8,10±0,18 10,56±0,52

4 9,72±0,13 8,93±0,02 7,59±0,03 7,14±0,04 11,11±0,06

5 7,57±0,03 7,87±0,03 7,47±0,00 6,92±0,00 11,29±0,15

6 7,69±0,04 7,67±0,02 8,17±0,12 6,61±0,12 11,26±0,02

7 7,99±0,15 7,59±0,01 7,45±0,08 6,26±0,08 10,68±0,10


F33 ở những mật độ khác nhau.






Nhận xét chung:

Chúng tôi nhận thấy rằng 6 chủng vi khuẩn (F2, F10, F11, F27, F28, F33) ở những

mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V.

parahaemolyticus thì hầu như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt

ức chế mạnh ở mật độ 109 CFU/mL.

Nhìn chung sau 1 đến ngày 2 mật độ vi khuẩn gây bệnh tăng như đối chứng sau

đó mới bắt đầu giảm mạnh và có sự khác biệt rõ ràng do chất ức chế được tiết ra trong

2 ngày đầu còn ít chưa đủ ức chế vi khuẩn gây bệnh. Từ đó chúng tôi thấy rằng 6

chủng Bacillus trên có khả năng ức chế tốt V.parahaemolyticus sau 48 giờ.

Trong 6 chủng vi khuẩn thử nghiệm, 2 chủng F2 và F10 là đối kháng mạnh nhất

với V.parahaemolyticus thể hiện qua mật độ vi khuẩn gây bệnh vào ngày thứ 7 giảm

gấp 2.1 lần so với đối chứng (ở mật đô Bacillus 109 CFU/mL). Trong khi các chủng

khác chỉ giảm từ 1.7-1.9 lần.


3.3.2 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V.

alginolyticus


LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)


F2 10 5 F2 10 7 F2 10 8 F2 10 9 DC

0 2,87±0,17 3,31±0,31 3,09±0 2,39±0,21 3,91±0,02

1 9,93±0,04 9,16±0,06 9,61±0,28 9,45±0,05 9,73±0,25

2 10,28±0,05 10,43±0,19 11,96±0,02 9,2±0,03 11,24±0,09

3 11,27±0,03 11,28±0,04 11,38±0,04 11,37±0,03 11,7±0,07

4 9,91±0,18 9,55±0,16 9,8±0,22 8,68±0,02 13±0,11

5 9,62±0,19 8,96±0 8,09±0,04 8,94±0,06 11,71±0,16

6 9,89±0,07 8,06±0,02 7,78±0,4 7,31±0 11,68±0,09

7 8,74±0,18 7,57±0,25 7,06±0,09 6,63±0,44 11.38±0


Biểu đồ 3.10 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F2

ở những mật độ khác nhau


109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, đặc biệt ở mật đô 109

CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.7

lần so với đối chứng.


LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)


F10 10 5 F10 10 7 F10 10 8 F10 10 9 DC

0 2,7±0,71 3,95±0 3,89±0,04 3,05±0,15 3,91±0,02

1 11,22±0,06 11,3±0 10,37±0,01 10,15±0,06 9,73±0,25

2 10,59±0,11 10,61±0,03 11,44±0,13 10,75±0,16 11,24±0,09

3 10,7±0,48 9,72±0,14 10,4±0 10,27±0,08 11,7±0,07

4 10,37±0,01 9,65±0,14 10,39±0 10,28±0,01 13±0,11

5 10,18±0,06 9,63±0,17 9,37±0,02 8,96±0,02 11,71±0,16

6 9,96±0,02 9,09±0,17 9,27±0,01 7,76±0,15 11,68±0,09

7 9,67±0,14 8,6±0,32 7,9±0 7,28±0,03 11,38±0



ở những mật độ khác nhau.






Bảng 3.12 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. alginolyticus ( tính trên

LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)


F11 10 5 F1110 7 F1110 8 F1110 9 DC

0 3,84±0,03 3,26±0,59 3,08±0,34 2,99±0,05 3,91±0,02

1 10,44±0,19 10,29±0,3 10,12±0,32 9,12±0 9,73±0,25

2 11,26±0,05 11,09±0,06 9,7±0,01 8,61±0,05 11,24±0,09

3 9,7±0,02 9,33±0,25 8,82±0,04 8,91±0,16 11,7±0,07

4 9±0,03 8,36±0,19 8,43±0,02 7,99±0,05 13±0,11

5 8,87±0,03 8,06±0,19 8,21±0,07 7,78±0,2 11,71±0,16

6 8±0,03 7,53±0,04 7,87±0,03 7,62±0,1 11,68±0,09

7 7,86±0 7,41±0 7,29±0 7,3±0,05 11,38±0









LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)


F27 10 5 F27 10 7 F27 10 8 F27 10 9 DC

0 3,86±0,04 3,68±0,2 3,59±0,06 3,93±0,04 3,91±0,02

1 9,28±0,1 8,97±0,17 8,87±0,25 7,81±0,05 9,73±0,25

2 9,05±0,08 9,1±0,07 9,29±0,01 8,96±0,02 11,24±0,09

3 8,67±0,23 8,85±0,02 9,13±0,25 8,48±0,05 11,7±0,07

4 8,51±0,08 8,08±0,33 8,22±0,04 8,28±0,19 13±0,11

5 7,39±0,1 7,89±0,23 7,88±0,23 8,23±0,08 11,71±0,16

6 7,88±0,03 8,26±0,03 7,42±0,01 6,66±0,07 11,68±0,09

7 7,76±0,01 7,73±0,16 6,67±0,09 6,06±0,23 11,38±0









LOG10 CFU/mL)

Thời gian Mật độ vi khuẩn thử nghiệm


(ngày) F28 10 5 F28 10 7 F28 10 8 F28 10 9 DC

0 3,37±0,35 3,58±0,13 4,38±0,22 3,03±0,01 3,91±0,02

1 10,83±0,12 10,62±0,01 10,12±0,1 9,91±0,31 9,73±0,25

2 11,12±0,02 9,74±0,14 9,91±0,12 9,22±0,02 11,24±0,09

3 9,87±0,14 9,49±0,05 9,11±0,01 9,04±0,02 11,7±0,07

4 8,28±0,35 8,83±0,24 9,09±0,05 9,04±0,17 13±0,11

5 7,64±0,13 8,89±0,37 8,26±0,02 9,25±0 11,71±0,16

6 8,25±0,17 8,41±0,29 7,89±0,03 7,85±0,06 11,68±0,09

7 8,49±0,04 7,61±0,35 7,42±0,01 7,53±0,04 11,38±0








Bảng 3.15. Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL)

Thời gian

(ngày)

Nồn độ chủng vi khuẩn thử nghiệm

F33 10 5 F33 10 7 F33 10 8 F33 10 9 DC

0 3,45±0,39 3,05±0,00 3,38±0,21 3,77±0,14 3,91±0,02

1 10,14±0,34 9,31±0,24 9,46±0,25 9,30±0,22 9,73±0,25

2 10,44±0,02 8,06±0,12 9,60±0,65 9,35±0,03 11,24±0,09

3 8,03±0,18 8,76±0,12 7,63±0,02 8,50±0,09 11,70±0,07

4 8,07±0,03 7,83±0,10 8,10±0,18 8,31±0,15 13,00±0,11

5 7,76±0,03 8,11±0,32 7,74±0,15 7,45±0,08 11,71±0,16

6 8,34±0,04 8,29±0,16 6,91± 0,06 6,97±0,01 11,68±0,09

7 7,61±0,10 7,26±0,08 6,48±0,02 6,83±0,06 11,38±0,00








Nhận xét chung


mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V.alginolyticus thì

hầu như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ức chế mạnh ở mật độ

109 CFU/mL.

Nhìn chung sau ngày đầu tiên mật độ vi khuẩn gây bệnh tăng gần giống như đối

chứng sau đó mới bắt đầu giảm mạnh và có sự khác biệt rõ ràng do chất ức chế được


tiết ra trong ngày đầu còn ít chưa đủ ức chế vi khuẩn gây bệnh. Từ đó chúng tôi thấy

rằng 6 chủng Bacillus trên có khả năng ức chế tốt V. alginolyticus sau 24 giờ.

Trong 6 chủng vi khuẩn thử nghiệm, chủng F27 là đối kháng mạnh nhất với V.

alginolyticus thể hiện qua mật độ vi khuẩn gây bệnh vào ngày thứ 7 giảm gấp 1.9 lần

so với đối chứng (ở mật đô Bacillus 109 CFU/mL). Trong khi các chủng khác chỉ giảm

từ 1.7-1.9 lần.

3.3.3 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. harveyi

Bảng 3.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. harveyi (tính trên LOG10

CFU/ mL)

Thời gian

(ngày)


F2 10 5 F2 10 7 F2 10 8 F2 10 9 DC

0 3,03±0,29 3,49±0,07 3,03±0,07 3,07±0,06 4,74±0,03

1 8,59±0,06 7,57±0,04 7,49±0,04 7,97±0,02 9,37±0,35

2 10,36±0,02 10,97±0,19 10,06±0,03 9,71±0,36 10,31±0,42

3 8,16±0,09 8,94±0,05 8,9±0,12 9,14±0,34 9,27±0,49

4 7,62±0,08 6,88±0,21 8,58±0,02 7,8±0,21 9,5±0,08

5 7,79±0 6,88±0,07 7,13±0,03 5,42±0,24 9,4±0,02

6 7,05±0,02 6,86±0,05 6,74±0,05 5,46±0,08 9,62±0,2

7 6,82±0,07 6,67±0,16 5,8±0,19 4,76±0,16 9,57±0,09



những mật độ khác nhau


109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. harveyi, đặc biệt ở mật đô 109




CFU/ mL)

Thời gian Mật độ vi khuẩn thử nghiệm


(ngày) F10 10 5 F10 10 7 F10 10 8 F10 10 9 DC

0 3,37±0,03 2,94±0,05 3,48±0,09 4,05±0,01 4,74±0,03

1 8,75±0,05 7,85±0,04 7,2±0,06 8,92±0,07 9,37±0,35

2 10,12±0,02 8,8±0,06 7,54±0,18 8,38±0,02 10,31±0,42

3 8,68±0,02 8,84±0,04 8,03±0,02 6,87±0,02 9,27±0,49

4 8,33±0 7,23±0,03 6,54±0,13 6,69±0,1 9,5±0,08

5 7,06±0,09 7,99±0,08 6,62±0,07 5,79±0,13 9,4±0,02

6 7,51±0,1 7,33±0,02 6,5±0,02 5,69±0,1 9,62±0,2

7 7,36±0,02 7,23±0,11 6,14±0,11 4,99±0,01 9,57±0,09

Biểu đồ 3.17 Sự biến đổi mật độ của V .harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở





CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 2



CFU/ mL)

Thời gian

(ngày)


F11 10 5 F11 10 7 F11 10 8 F11 10 9 DC

0 3,46±0,17 3,74±0,2 2,95±0,04 4,62±0,15 4,74±0,03

1 8,77±0,1 8,57±0,08 9,24±0,09 9,25±0,04 9,37±0,35

2 10,69±0,06 10±0,03 10,33±0,02 10,18±0,09 10,31±0,42

3 9,04±0,05 8,66±0,16 8,63±0,05 8,46±0,05 9,27±0,49

4 9,37±0,08 7,29±0,02 8,37±0,03 6,31±0 9,5±0,08

5 8,84±0,1 7,64±0,02 7,09±0,03 5,6±0,07 9,4±0,02

6 8,67±0,17 7,27±0,02 7,58±0,04 5,35±0,09 9,62±0,2

7 8,06±0,24 7,19±0,08 7,24±0,04 4,97±0,49 9,57±0,09









CFU/ mL)

Thời gian

(ngày)


F27 10 5 F27 10 7 F27 10 8 F27 10 9 DC

0 3,31±0,03 3,29±0,12 3,44±0,04 3,3±0,11 4,74±0,03

1 8,74±0,09 8,75±0,14 8,84±0,03 8,4±0,08 9,37±0,35

2 8,32±0,14 7,14±0,41 7,62±0,06 8,13±0,15 10,31±0,42

3 8,14±0,19 7,07±0,45 6,88±0,31 7,65±0,17 9,27±0,49

4 7,21±0,09 7±0,07 7,18±0,14 6,52±0,17 9,5±0,08

5 6,9 ±0,06 6,66±0,09 6,66±0,09 6,34±0,11 9,4±0,02

6 6,74±0,14 6,08±0,13 6,32±0,05 4,93±0,17 9,62±0,2

7 6,18±0,28 4,7±0,04 4,96±0,03 4,39±0,07 9,57±0,09


Biểu đồ 3.19 Sự biến đổi mật độ của V.harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở








CFU/ mL)

Thời

gian

(ngày)


F28 10 5 F28 10 7 F28 10 8 F28 10 9 DC

0 3,15±0,11 3,82±0,06 4,37±0,29 3,84±0,1 4,74±0,03

1 8,84±0,33 9,28±0,03 8,63±0,07 8,48±0,09 9,37±0,35

2 10,5±0,06 10,63±0,11 10,41±0,37 10,16±0,01 10,31±0,42

3 9,87±0,04 9,09±0,17 9,95±0,01 6±0,09 9,27±0,49

4 8,67±0,02 7,78±0,01 7,49±0,01 5,86±0,06 9,5±0,08

5 6,2±0,06 7,33±0 5,97±0,23 5,69±0,2 9,4±0,02

6 7,57±0,14 7,91±0,03 6,6±0,08 5,3±0,11 9,62±0,2

7 7,16±0,04 6,71±0,01 5,78±0,2 4,42±0,08 9,57±0,09









CFU/ mL)

Thời gian

(ngày)

Mật độ chủng vi khuẩn thử nghiệm

F33 10 5 F33 10 7 F33 10 8 F33 10 9 DC

0 2,87±0,29 2,86±0,22 2,13±0,03 2,29±0,01 4,74±0,03

1 8,34±0,03 8,52±0,08 8,57±0,15 8,19±0,01 9,37±0,35

2 7,97±0,49 7,98±0,25 8,09±0,05 7,61±0,27 10,31±0,42

3 7,51±0,31 7,68±0,06 7,60±0,03 7,22±0,20 9,27±0,49

4 7,60 ±0,22 7,09±0,40 7,25±0,34 7,22±0,05 9,5±0,08

5 7,58±0,34 7,41±0,20 7,03±0,01 6,15±0,12 9,4±0,02

6 7,53 ±0,31 7,36±0,02 7,64±0,27 5,09±0,01 9,62±0,2

7 7,56±0,10 6,88±0,10 6,27±0,05 4,02±0,05 9,57±0,09








Nhận xét


mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V. harveyi thì hầu

như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ức chế mạnh ở mật độ 109

CFU/mL.

Nhìn chung sau 1 đến 2 đầu mật độ vi khuẩn gây bệnh tăng gần giống như đối

chứng sau đó mới bắt đầu giảm mạnh và có sự khác biệt rõ ràng do chất ức chế được


tiết ra trong ngày đầu còn ít chưa đủ ức chế vi khuẩn gây bệnh. Từ đó chúng tôi thấy

rằng 6 chủng Bacillus trên có khả năng ức chế tốt V. harveyi sau 24 - 48 giờ.


mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V. harveyi thì hầu

như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ức chế mạnh ở mật độ 109

CFU/mL.

Trong 6 chủng vi khuẩn thử nghiệm, chủng F33 là đối kháng mạnh nhất với V.

harveyi thể hiện qua mật độ vi khuẩn gây bệnh vào ngày thứ 7 giảm gấp 2.4 lần so với

đối chứng (ở mật đô Bacillus 109 CFU/mL). Trong khi các chủng khác chỉ giảm từ 1.9

- 2.2 lần

Nhìn chung 6 chủng vi khuẩn (F2, F10, F11, F27, F28, F33) đều có khả năng đối

kháng tốt với 3 chủng V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.harveyi, trong đó đối

kháng mạnh nhất với V.harveyi, sau đó tới V.alginolyticus và yếu nhất đối với

V.parahaemolyticus. Kết quả của thử nghiệm trên cũng cho thấy rằng Bacillus có khả

năng ức chế tốt với sự tăng trưởng của Vibrio sau 1 - 2 ngày. Điều này phù hợp với kết

quả của thử nghiệm đối kháng.

Nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus sp đã cho thấy rằng chúng có thể làm

giảm vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Như báo cáo của Vaseeharan và

Ramasamy (2003), đã sử dụng Bacillus subtilis BT23 để kiểm soát V. harveyi[27] ,

Rengpipat S và cs (1998) đã sử dụng Bacillus S11 để kiểm soát tác nhân gây bệnh V.

harveyi [24], và trong một báo cáo khác của Jose Luis Balcazar và Tyrone Rojas-

Luna (2007) cho thấy Bacillus subtilis UTM 126 có khả năng ức chế 3 chủng

V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.harveyi [14]. Trong thử nghiệm của tôi chủng

vi khuẩn Bacillus cũng có khả năng kiểm soát sự tăng trưởng của 3 chủng vi khuẩn

gây bệnh là V.parahaemolyticus, V. alginolyticus, V.harveyi ở mật độ Bacillus là 105,

107, 108, 109 CFU/mL. Vì vậy sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus sp. có thể bảo vệ các

loài thủy sản đối với các bệnh do vi khuẩn gây ra và có thể ứng dụng sản xuất probiotic

trong nuôi trồng thủy sản.


Hình 3.17 Trải đĩa kiểm tra mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với F27 mật độ

107 ở ngày 5


BACILLUS:

3.4.1 Thử khả năng gây dung huyết

Chúng tôi tiến hành thử khả năng sinh hemolysin của 6 chủng (F2, F10, F11, F27,

F28, F33). Đây là bước sàng lọc sơ bộ tính an toàn của các chủng thử nghiệm. Kết quả

được thể hiện ở bảng 3.22.

Bảng 3.22 Kết quả khả năng gây dung huyết

Chủng Hemolysin

F2 α

F10 γ

F11 γ

F27 γ

F28 α

F33 α


Ghi chú:

α tan máu không hoàn toàn

γ không tan máu

Nhận xét

Trong 6 chủng thử khả năng sinh hemolysin thì có 3 chủng gây tan máu không

hoàn toàn (F2, F28, F33), 3 chủng không gây tan máu (F10, F11, F27) và không có chủng

nào gây tan máu hoàn toàn.

Theo WHO/FAO thử nghiệm hemolysin là một bước sàng lọc tính gây bệnh của

các chủng để đảm bảo tính an toàn của probiotic.

Đã có một số nghiên cứu thử nghiệm tính an toàn của Bacillus, trong đó nghiên

cứu của Shafiqur và cs (2009) về Bacillus phân lập được từ ao tôm tỉ lệ dương tính

hemolysin là 51%.[26]

Hình 3.18 Kết quả thử khả năng gây dung huyết

3.4.2 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng

tôm sú

Ở thí nghiệm này ta nghiên cứu ảnh hưởng của 6 chủng Bacillus (F10, F2, F28,

F11, F27, F33) lên ấu trùng tôm. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được lặp lại 6 lần.

Mật độ vi khuẩn thử nghiệm bổ sung là 106 tế bào/mL. Sau 24 giờ theo dõi ta thu được

kết quả sau:


Bảng 3.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus

Chủng Tỷ lệ sống( %)

ĐC (không vi

khuẩn) 45,56±8,74

F10 23,61±7,48

F2 19,72±8,47

F28 19,17±11,27

F11 42,22±8,17

F27 34,72±3,56

F33 21,94±6,36

Biểu đồ 3.22 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus


Các chữ cái giống nhau cho thấy không có sự khác biệt về mặt thống kê .

Kết quả thí nghiệm cho thấy có 6 chủng Bacillus (F10, F2, F28, F11, F27, F33)

không có sự khác biệt so với đối chứng (P>0.05) nên 6 chủng trên an toàn với ấu trùng

tôm sú.

Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2009)

về nghiên cứu tính an toàn của một số chủng vi khuẩn lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm

sú, các chủng vi khuẩn an toàn cho ấu trùng tôm đều không có khác biệt về tỷ lệ sống

so với đối chứng về mặt thống kê sau 24 giờ thí nghiệm.[11]


Chương 4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ


4.1 KẾT LUẬN

Đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được kết quả như sau.

Tái phân lập sơ bộ được 25 chủng Bacillus. Sau thử nghiệm đối kháng với 3

chủng Vibrio gây bệnh cho tôm chúng tôi nhận thấy có 7 chủng vi khuẩn (F4, F12, F21,

F34, T1, T4, T12) không đối kháng với cả 3 vi khuẩn gây bệnh đang khảo sát. 18 chủng vi

khuẩn (F2, F3, F5, F6, F7, F10, F11, F13, F14, F17, F26, F27, F28, F33, F35, F36, T5, T9) có khả năng

đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Trong đó 13 chủng được quan tâm nhất (F2, F5, F6, F7,

F11, F27, F28, F33, F10, F17, F36, T5, T9) có khả năng đối kháng với cả 3 chủng vi khuẩn gây

bệnh .

Từ 13 chủng trên chúng tôi chọn được 6 chủng (F2, F10, F11, F27, F28, F33) tiến

hành đồng nuôi cấy với lần lượt 3 chủng vi khuẩn gây bệnh V. parahaemoluticus, V.

aginolyticus và V. harveyi. Kết quả cho thấy 6 chủng đều có khả năng kiểm soát sự

tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh.

Kết quả của thử nghiệm tính an toàn cho thấy 6 chủng Bacillus ( F10, F2, F28, F11,

F27, F33) gây tan máu yếu hoặc không gây tan máu và an toàn đối với ấu trùng tôm,

được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo và có tiềm năng lớn để làm probiotic

cho tôm.

4.2 KIẾN NGHỊ

Để hoàn thiện kết quả nghiên cứu và ứng dụng được trong thực tiễn chúng tôi

đưa ra một số đề nghị sau:

Khảo sát các đặc tính ứng dụng làm probiotic

Định danh chính xác các chủng Bacillus

Từ kết quả thí nghiệm 6 chủng Bacillus an toàn đối với ấu trùng tôm cần tiến

hành thí nghiệm về khả năng bảo vệ ấu trùng tôm đã gây nhiễm trước đó bởi các chủng

Vibrio. Sau đó lựa chọn những chủng vi khuẩn có tiềm năng để thí nghiệm với quy mô

lớn hơn.


Tiến hành tối ưu hóa môi trường cho các chủng Bacillus để ứng dụng sản xuất

chế phẩm vi sinh.

Dựa vào kết quả của những thí nghiệm trên, chọn những chủng vi khuẩn tốt nhất

đưa vào ứng dụng thực tiễn sản xuất chế phẩm vi sinh phòng và trị bệnh trên tôm.


TÀI LIỆU THAM KHẢOTIẾNG VIỆT

[1]. Tô Minh Châu, Phan Hữu Nghĩa, Nguyễn Văn Minh, (2006), Thực hành Vi sinh

cơ sở, Trường đại học Mở TPHCM.

[2]. Nguyễn Văn Hảo, Một số hiểu biết cần thiết về bệnh ở tôm, NXB Nông nghiệp.

[3]. Nguyễn Văn Hảo, (2003), Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thế giới và tại

Việt Nam, Viện NCNTTS II, pp.

[4]. Mai Nguyệt Thu Hồng, (2006), Giám định vi sinh vật học.

[5]. Nguyễn Văn Minh ,Dương Nhật Linh và cs., (2010), Phân lập và sàng lọc một

số vi khuẩn tiềm năng làm probiotic trong nuôi trồng thủy sản từ trùn quế

(Perionyx excavatus), Hội Nghị CNSH Thủy sản toàn quốc, pp.

[6]. Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Thị Kiều Trang, và Trương Quốc Phú, Biến động

mật độ vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) ghép với cá rô phi đỏ

ở Sóc Trăng, pp.

[7]. Trần Thị Tâm, Bệnh thường gặp ở tôm, NXB Nông nghiệp.

[8]. Nguyễn Văn Thanh ,Trần Cát Đông, (2006), Công nghệ sinh học dược, Đại học

Y Dược TP.HCM.

[9]. Võ Thị Thứ (2006), Hoàn thiện và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh

học phục vụ xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản: Hà Nội.

[10]. Trần Linh Thước, (2008), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực

phẩm và mỹ phẩm, nxb giáo dục.

[11]. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chủng vi

khuẩn lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú và cá chẽm hương trong điều kiện

phòng thí nghiệm.

TIẾNG ANH


[12]. Aroson A. I. ,Fitz-Jame P., (1976), Structure and morphogeniesis of the

bacterial spore coat, Bacteriol. Rev 40, pp.360-402.

[13]. Jose ´ Luis Balca ´zar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela, David

Cunningham, Daniel Vendrell, Jose ´ Luis Mu ´zquiz, (2006), The role of

probiotics in aquaculture, Veterinary Microbiology 114, pp.173-186.

[14]. Jose Luis Balcazar ,Tyrone Roja-Luna, (2007), Inhibitory activity of Probiotic

Bacillus subtilis UTM 126 against Vibrio Species confers protection against

Vibriosis in Juvenle Shrimp (Litopeaneaus vannamiei), Current Microbiology

55, pp.409-412.

[15]. Abel Antonio Carrias, (2011), Evaluation of Biological Agents for Controlling

Enteric Septicemia of Catfish pp.

[16]. Vichai Domrongpokkaphan ,and Penkhae Wanchaitanawong, (2006), In vitro

Antimicrobial Activity of Bacillus spp. Against Pathogenic

Vibrio spp. in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon), Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40, pp.

949 - 957.

[17]. Drisks.A., (1999), Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and Molecular

Biology Review 63, pp.1-20.

[18]. Karunasagar I. ,B. Kennedy M. Vinod, A. Vijay, A. Deepanjali, K. Umesh and

I. Karunasagar, (2005), Biocontrol of Bacterial Pathogens in Aquaculture with

Emphasis on Phage Therapy, Diseases in Asian Aquaculture V, pp.535-542.

[19]. Meunpola Oraporn ,E-mail The Corresponding Author Corresponding Author

Contact Information, Kanyajit Lopinyosiri and PiamsakMenasveta, (2002), The

effects of ozone and probiotics on the survival of black tiger shrimp (Penaeus

monodon) pp.

[20]. Moriarty D. J. W. ,và cs, (2005), Probiotics in aquaculture, AQUA Culture

AsiaPacific Magazine, pp.14-16.

[21]. Moriarty David J. W., Disease Control in Shrimp Aquaculture with Probiotic

Bacteria, pp.


[22]. Đặng Thị Hoàng Oanh, Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thanh Phương, The Effects of

Probiotics on Culture Conditions of Freshwater Prawn (Macrobrachium

rosenbergii) Larvae

Institute for Marine Aquaculture, College of Agriculture,Can Tho Unversity, Can Tho,

Vietnam pp.1-7.

[23]. Venkateswara Rao, Vibriosis in Shrimp Aquaculture, pp.1-9.

[24]. Rengpipat S., Piyatiratitivorakul S., Phianpaik W., Menasveta P., (1998), Effects

of probiotic bacterium on black tiger shrimp Peanaeus monodon survial and

growth, Aquaculture 167, pp.301-313.

[25]. Maloy Kumar Sahu, Swarnakumar N.S., Sivakumar K., Thangaradjou T.,

Kannan L., (2008), Probiotics in aquaculture: importance and future

perspectives, Indian J. Microbio, pp.

[26]. Shafiqur R. ,Niamul N. M. Shakila N. K., and Manjurul K. M., , (2009),

Application of probiotic bacteria: A novel approach towards ensuring food

safety in shrimp aquaculture, Journal of Bangladesh Academy of Sciences

33(1), pp.139-144.

[27]. Vaseeharan B. ,Ramasamy P., (2003), Control of pathogenic Vibrio spp. by

Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp

Penaeus monodon, Lett Appl Microbiol 36(2), pp.83-87.

[28]. Verschuere L. ,Sorgeloos P. Rombaut G., And Verstraete W., (2000), Probiotic

Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture, Microbiology and

Molecular Biology Reviews 64(4), pp.655–671.

[29]. Laurent Vershuere, Geert Rombaut, Patrick Sorgeloss, Willy Verstraete, (2000),

Probiotic Bacteria as Biological Control Agent in Aquaculture, Microbiology

and Molecular Biology Reviews 64(4), pp.655-671.

INTERNET


[30]. http://www.alken-murray.com/China98.htm, Application of Probiotics in

Aquaculture

[31]. http://www.tomboyaquafeed.com/benhdovidrio.htm, Bệnh do Vibrio trên tôm

lớn

[32]. http://haiduongdost.gov.vn/index, Chế phẩm sinh học từ trùn quế

[33]. http://agriviet.com/nd/620-dac-diem-sinh-hoc-va-hinh-thai-cua-tom-su/, Đặc

điểm sinh học và hình thái của tôm sú

[34]. http://www.ciren.gov.vn

[35]. http://www.hoasinhvietnam.com.vn

[36]. http://www.Nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2K6-08.htm

[37]. http://www.trunque.net/?frame=news_detail&id=35

[38]. http://thusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Ky-thuat-nuoi-trun-que, Kỹ thuật nuôi

trùn quế

[39]. http://www.monre.gov.vn/v35/default.aspx?

tabid=428&cateID=24&id=22323&code=1RTQG22323, Sóc Trăng phát triển

nuôi tôm bằng công nghệ sinh học theo hướng bền vững

[40]. http://thuysan2.forumvi.com/t153-topic, Sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi

trồng thủy sản

[41]. http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%B4m_s%C3%BA, Tôm sú

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%B4m_s%C3%BA

http://thuysan2.forumvi.com/t153-topic

http://www.monre.gov.vn/v35/default.aspx?tabid=428&cateID=24&id=22323&code=1RTQG22323

http://www.monre.gov.vn/v35/default.aspx?tabid=428&cateID=24&id=22323&code=1RTQG22323

http://thusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Ky-thuat-nuoi-trun-que

http://www.trunque.net/?frame=news_detail&id=35

http://www.Nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2K6-08.htm

http://www.hoasinhvietnam.com.vn/

http://www.ciren.gov.vn/

http://agriviet.com/nd/620-dac-diem-sinh-hoc-va-hinh-thai-cua-tom-su/

http://haiduongdost.gov.vn/index

http://www.tomboyaquafeed.com/benhdovidrio.htm

http://www.alken-murray.com/China98.htm

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả xử lý thống kê ANOVA một yếu tố thí nghiệm thử tính đối

kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.

Anova: Single Factor

VP-24

SUMMARY

Groups Count Sum Average Variance

F4 3 0 0.00 0.00

F5 3 0 0.00 0.00

F10 3 29 9.67 2.33

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 19 6.33 0.33

F17 3 0 0.00 0.00

F21 3 0 0.00 0.00

F26 3 30 10.00 3.00

F33 3 0 0.00 0.00

F35 3 0 0.00 0.00

F36 3 0 0.00 0.00

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 29 9.67 4.33

F11 3 0 0.00 0.00

F14 3 0 0.00 0.00

F27 3 0 0.00 0.00

F2 3 21 7.00 37.00

F3 3 0 0.00 0.00

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 26 8.67 0.33

F7 3 28 9.33 1.33

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 0 0.00 0.00

T9 3 30 10.00 0.00

ANOVA

Source of

Variation SS df MS F P-value F crit

Between Groups 1315.413 24 54.80889 28.15525

2.55E-

21 1.73708

Within Groups 97.33333 50 1.946667

Total 1412.747 74


VP-48

SUMMARY


F4 3 0 0.00 0.00

F5 3 16 5.33 0.33

F10 3 46 15.33 0.33

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 29 9.67 6.33

F17 3 0 0.00 0.00

F21 3 0 0.00 0.00

F26 3 32 10.67 5.33

F33 3 0 0.00 0.00

F35 3 0 0.00 0.00

F36 3 0 0.00 0.00

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 29 9.67 0.33

F11 3 19 6.33 2.33

F14 3 0 0.00 0.00

F27 3 27 9.00 4.00

F2 3 29 9.67 0.33

F3 3 29 9.67 0.33

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 37 12.33 2.33

F7 3 39 13.00 0.00

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 0 0.00 0.00

T9 3 49 16.33 30.33

ANOVA

Source of


Between Groups 2444.853 24 101.8689 48.66348

8.32E-

27 1.73708

Within Groups 104.6667 50 2.093333

Total 2549.52 74


VP-72

SUMMARY


F4 3 0 0.00 0.00

F5 3 45 15.00 1.00

F10 3 90 30.00 1.00

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 38 12.67 0.33

F17 3 36 12.00 1.00

F21 3 0 0.00 0.00

F26 3 26 8.67 8.33

F33 3 41 13.67 1.33

F35 3 0 0.00 0.00

F36 3 44 14.67 1.33

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 20 6.67 0.33

F11 3 44 14.67 0.33

F14 3 61 20.33 1.33

F27 3 41 13.67 2.33

F2 3 33 11.00 4.00

F3 3 34 11.33 97.33

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 35 11.67 12.33

F7 3 70 23.33 2.33

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 43 14.33 1.33

T9 3 64 21.33 1.33

ANOVA

Source of


Between Groups 5267.333 24 219.4722 39.95247 8.4E-25 1.73708

Within Groups 274.6667 50 5.493333

Total 5542 74


VA-24

SUMMARY


F4 3 0 0.00 0.00

F5 3 0 0.00 0.00

F10 3 44 14.67 0.33

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 0 0.00 0.00

F17 3 0 0.00 0.00

F21 2 0 0.00 0.00

F26 3 0 0.00 0.00

F33 3 49 16.33 1.33

F35 3 0 0.00 0.00

F36 3 28 9.33 2.33

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 48 16.00 1.00

F11 3 30 10.00 1.00

F14 3 0 0.00 0.00

F27 3 36 12.00 4.00

F2 3 30 10.00 0.00

F3 3 0 0.00 0.00

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 30 10.00 1.00

F7 3 0 0.00 0.00

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 0 0.00 0.00

T9 3 0 0.00 0.00

ANOVA

Source of


Between Groups 2630.986 24 109.6244 244.1635

4.68E-

43 1.74162

Within Groups 22 49 0.44898

Total 2652.986 73


VA-48

SUMMARY


F4 3 0 0.00 0.00

F5 3 0 0.00 0.00

F10 3 0 0.00 0.00

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 0 0.00 0.00

F17 3 0 0.00 0.00

F21 3 0 0.00 0.00

F26 3 0 0.00 0.00

F33 3 45 15.00 0.00

F35 3 0 0.00 0.00

F36 3 33 11.00 7.00

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 56 18.67 0.33

F11 3 46 15.33 2.33

F14 3 0 0.00 0.00

F27 3 46 15.33 1.33

F2 3 36 12.00 3.00

F3 3 0 0.00 0.00

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 21 7.00 37.00

F7 3 0 0.00 0.00

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 0 0.00 0.00

T9 3 0 0.00 0.00

ANOVA

Source of


Between Groups 3005.147 24 125.2144 61.37963 3.4E-29 1.73708

Within Groups 102 50 2.04

Total 3107.147 74


VA-72

SUMMARY


F4 3 0 0.00 0.00 0.00

F5 3 0 0.00 0.00 0.00

F10 3 32 10.67 4.33 1.20

F12 3 0 0.00 0.00 0.00

F13 3 0 0.00 0.00 0.00

F17 3 69 23.00 1.00 0.58

F21 3 0 0.00 0.00 0.00

F26 3 0 0.00 0.00 0.00

F33 3 37 12.33 5.33 1.33

F35 3 0 0.00 0.00 0.00

F36 3 43 14.33 1.33 0.67

T4 3 0 0.00 0.00 0.00

F28 3 54 18.00 1.00 0.58

F11 3 49 16.33 1.33 0.67

F14 3 22 7.33 2.33 0.88

F27 3 42 14.00 1.00 0.58

F2 3 40 13.33 4.33 1.20

F3 3 0 0.00 0.00 0.00

F34 3 0 0.00 0.00 0.00

F6 3 44 14.67 0.33 0.33

F7 3 25 8.33 0.33 0.33

T1 3 0 0.00 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00 0.00

T5 3 8 2.67 21.33 2.67

T9 3 31 10.33 4.33 1.20

ANOVA

Source of


Between Groups 3971.12 24 165.4633 85.58448 1.16E- 1.73708

32

Within Groups 96.66667 50 1.933333

Total 4067.787 74


VH-24

SUMMARY


F4 2 0 0.00 0.00

F5 3 46 15.33 2.33

F10 3 64 21.33 1.33

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 33 11.00 1.00

F17 3 71 23.67 0.33

F21 3 0 0.00 0.00

F26 3 31 10.33 0.33

F33 3 0 0.00 0.00

F35 3 0 0.00 0.00

F36 3 44 14.67 9.33

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 64 21.33 2.33

F11 3 61 20.33 0.33

F14 3 0 0.00 0.00

F27 3 45 15.00 189.00

F2 3 25 8.33 52.33

F3 3 32 10.67 1.33

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 42 14.00 0.00

F7 3 62 20.67 0.33

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 0 0.00 0.00

T9 3 37 12.33 0.33

ANOVA

Source of


Between Groups 5402.572 24 225.1072 21.15777

2.62E-

18 1.74162

Within Groups 521.3333 49 10.63946

Total 5923.905 73


VH-48

SUMMARY


F4 3 0 0.00 0.00

F5 3 62 20.67 0.33

F10 3 73 24.33 0.33

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 49 16.33 0.33

F17 3 88 29.33 0.33

F21 3 0 0.00 0.00

F26 3 42 14.00 1.00

F33 3 82 27.33 2.33

F35 3 0 0.00 0.00

F36 3 44 14.67 2.33

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 71 23.67 4.33

F11 3 69 23.00 1.00

F14 3 0 0.00 0.00

F27 3 69 23.00 9.00

F2 3 66 22.00 31.00

F3 3 42 14.00 1.00

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 56 18.67 0.33

F7 3 45 15.00 1.00

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 17 5.67 96.33

T9 3 52 17.33 64.33

ANOVA

Source of


Between Groups 8068.613 24 336.1922 39.0316

1.44E-

24 1.73708

Within Groups 430.6667 50 8.613333

Total 8499.28 74


VH-72

SUMMARY


F4 3 0 0.00 0.00

F5 3 69 23.00 1.00

F10 3 97 32.33 1.33

F12 3 0 0.00 0.00

F13 3 52 17.33 0.33

F17 3 74 24.67 2.33

F21 3 0 0.00 0.00

F26 3 45 15.00 1.00

F33 3 68 22.67 6.33

F35 3 57 19.00 1.00

F36 3 57 19.00 3.00

T4 3 0 0.00 0.00

F28 3 64 21.33 0.33

F11 3 62 20.67 1.33

F14 3 0 0.00 0.00

F27 3 63 21.00 13.00

F2 3 64 21.33 17.33

F3 3 54 18.00 252.00

F34 3 0 0.00 0.00

F6 3 37 12.33 144.33

F7 3 57 19.00 0.00

T1 3 0 0.00 0.00

T12 3 0 0.00 0.00

T5 3 0 0.00 0.00

T9 3 60 20.00 9.00

ANOVA

Source of


Between Groups 8073.333 24 336.3889 18.53723

2.53E-

17 1.73708

Within Groups 907.3333 50 18.14667

Total 8980.667 74

Phụ lục 2: Kết quả xử lý thống kê ANOVA một yếu tố thí nghiệm đồng nuôi cấy.


P33 OH

SUMMARY


P33- 10^5 3 10.31857 3.439524 0.093206

P33- 10^7 3 9.629715 3.209905 0.042058

P33- 10^8 3 8.994032 2.998011 4E-05

P33- 10^9 3 10.38382 3.461274 0.023206

DC P 3 11.53865 3.846215 0.003389

ANOVA

Source of


Between Groups 1.20525 4 0.301313 9.305568 0.002104 3.47805

Within Groups 0.323798 10 0.03238

Total 1.529048 14


P33 -1H

SUMMARY


P33- 10^5 3 29.73877 9.912925 0.046953

P33- 10^7 3 28.69577 9.565257 0.27181

P33- 10^8 3 24.29866 8.099554 0.103613

P33- 10^9 3 24.30013 8.100042 0.000428

DC P 3 30.64052 10.21351 1.59E-05

ANOVA

Source of


Between Groups 12.26218 4 3.065545 36.25117

6.34E-

06 3.47805

Within Groups 0.84564 10 0.084564

Total 13.10782 14


P33-2D

SUMMARY


P33- 10^5 3 31.92179 10.6406 0.016796

P33- 10^7 3 30.55694 10.18565 0.009867

P33- 10^8 3 24.43185 8.143949 0.082403

P33- 10^9 3 26.71999 8.906665 0.00943

DC P 3 30.77074 10.25691 0.023139

ANOVA

Source of


Between Groups 13.36374 4 3.340936 117.9406

2.27E-

08 3.47805

Within Groups 0.283273 10 0.028327

Total 13.64702 14


P33-3D

SUMMARY


P33- 10^5 3 31.65271 10.5509 0.189537

P33- 10^7 3 29.18331 9.727768 0.096583

P33- 10^8 3 23.06118 7.68706 0.063752

P33- 10^9 3 24.29208 8.097361 0.102389

DC P 3 31.66814 10.55605 0.008224

ANOVA

Source of


Between Groups 22.11143 4 5.527858 60.02212 5.93E- 3.47805

07

Within Groups 0.92097 10 0.092097

Total 23.0324 14


P33-4D

SUMMARY


P33- 10^5 3 29.15728 9.719092 0.051002

P33- 10^7 3 26.79972 8.93324 0.001643

P33- 10^8 3 22.7686 7.589534 0.002

P33- 10^9 3 21.43458 7.144861 0.003686

DC P 3 33.31806 11.10602 0.010463

ANOVA

Source of


Between Groups 31.00911 4 7.752278 563.4353

1.01E-

11 3.47805

Within Groups 0.13759 10 0.013759

Total 31.1467 14


P33-5D

SUMMARY


P33- 10^5 3 22.6966 7.565534 0.003492

P33- 10^7 3 23.62021 7.873405 0.002164

P33- 10^8 3 22.40934 7.46978 5.42E-05

P33- 10^9 3 20.76492 6.92164 6.09E-05

DC P 3 33.86157 11.28719 0.066678

ANOVA

Source of


Between Groups 36.61384 4 9.153459 631.707

5.69E-

12 3.47805

Within Groups 0.1449 10 0.01449

Total 36.75874 14


P33-6D

SUMMARY


P33- 10^5 3 23.07373 7.691243 0.004406

P33- 10^7 3 22.99827 7.666091 0.001779

P33- 10^8 3 24.52151 8.173838 0.353656

P33- 10^9 3 19.84073 6.613578 0.04095

DC P 3 33.79073 11.26358 0.00162

ANOVA

Source of


Between Groups 37.24041 4 9.310102 115.679

2.5E-

08 3.47805

Within Groups 0.804822 10 0.080482

Total 38.04523 14


P33-7D

SUMMARY


P33- 10^5 3 23.96627 7.988757 0.071863

P33- 10^7 3 22.77291 7.590969 0.000124

P33- 10^8 3 22.33925 7.446418 0.000966

P33- 10^9 3 18.77472 6.25824 0.01814

DC P 3 32.03663 10.67888 0.027094

ANOVA

Source of


Between Groups 32.05117 4 8.012792 338.9897

1.25E-

10 3.47805

Within Groups 0.236373 10 0.023637

Total 32.28754 14


H33 0D

SUMMARY


H33-10^5 3 8.624225 2.874742 0.245281

H33-10^7 3 8.572639 2.857546 0.139162

H33-10^8 3 6.376548 2.125516 0.002076

H33-10^9 3 6.869818 2.289939 0.000124

DCH 3 9.899273 3.299758 0.38378

ANOVA

Source of


Between Groups 2.738086 4 0.684521 4.442504 0.025428 3.47805

Within Groups 1.540846 10 0.154085

Total 4.278932 14


H33 1D

SUMMARY


H33-10^5 3 25.01912 8.339705 0.003557

H33-10^7 3 25.54642 8.515473 0.021433

H33-10^8 3 25.70204 8.567346 0.067114

H33-10^9 3 24.57909 8.193029 0.000124

DCH 3 27.12755 9.042517 1.376049

ANOVA

Source of


Between Groups 1.242082 4 0.310521 1.057432 0.426146 3.47805

Within Groups 2.936554 10 0.293655

Total 4.178636 14


H33- 2D

SUMMARY


H33-10^5 3 23.91381 7.971271 0.728595

H33-10^7 3 23.94052 7.980172 0.183821

H33-10^8 3 24.273 8.091 0.007778

H33-10^9 3 22.83136 7.610454 0.224629

DCH 3 24.8169 8.272301 0.728595

ANOVA

Source of SS df MS F P-value F crit

Variation

Between Groups 0.702825 4 0.175706 0.468945 0.757673 3.47805

Within Groups 3.746837 10 0.374684

Total 4.449662 14


H33-3D

SUMMARY


H33-10^5 3 22.54386 7.51462 0.190776

H33-10^7 3 23.04813 7.68271 0.009879

H33-10^8 3 22.79934 7.59978 0.002982

H33-10^9 3 21.64521 7.21507 0.11428

DCH 3 25.1284 8.376133 0.46897

ANOVA

Source of


Between Groups 2.203581 4 0.550895 3.500472 0.049171 3.47805

Within Groups 1.573774 10 0.157377

Total 3.777355 14


H33-4D

SUMMARY


H33-10^5 3 22.81154 7.603848 0.14487

H33-10^7 3 21.28074 7.093578 0.490861

H33-10^8 3 21.74139 7.24713 0.352293

H33-10^9 3 21.66572 7.221906 0.007873

DCH 3 25.48777 8.495925 0.021368

ANOVA

Source of


Between Groups 3.911505 4 0.977876 4.806398 0.020117 3.47805

Within Groups 2.03453 10 0.203453

Total 5.946034 14


H33- 5D

SUMMARY


H33-10^5 3 22.74191 7.580635 0.35176

H33-10^7 3 22.21527 7.405089 0.115276

H33-10^8 3 21.08781 7.02927 0.000148

H33-10^9 3 18.43521 6.145071 0.046789

DCH 3 25.19103 8.397011 0.001213

ANOVA

Source of


Between Groups 8.099208 4 2.024802 19.6512

9.95E-

05 3.47805

Within Groups 1.030371 10 0.103037

Total 9.129579 14


H33-6D

SUMMARY


H33-10^5 3 22.58877 7.52959 0.292104

H33-10^7 3 22.08189 7.360629 0.001434

H33-10^8 3 22.91335 7.637784 0.216205

H33-10^9 3 15.27981 5.093271 0.000196

DCH 3 25.8485 8.616166 0.123695

ANOVA

Source of


Between Groups 20.27593 4 5.068982 39.99925

4.02E-

06 3.47805

Within Groups 1.267269 10 0.126727

Total 21.5432 14


h33- 7d

SUMMARY


H33-10^5 3 22.676 7.558666 0.028524

H33-10^7 3 20.64521 6.881737 0.032658

H33-10^8 3 18.81657 6.272191 0.008648

H33-10^9 3 12.04752 4.015839 0.007035

DCH 3 25.71328 8.571093 0.026923

ANOVA

Source of


Between Groups 34.95308 4 8.73827 420.9709

4.28E-

11 3.47805

Within Groups 0.207574 10 0.020757

Total 35.16066 14


A33-0D

SUMMARY


A33-10^5 3 10.3631 3.4544 0.4473

A33-10^7 3 9.1418 3.0473 0.0000

A33-10^8 3 10.1502 3.3834 0.1361

A33-10^9 3 11.3016 3.7672 0.0623

DCA 3 11.7383 3.9128 0.0014

ANOVA

Source of


Between

Groups

1.38465789

7 4

0.3461644

7

2.6743359

3

0.0943676

1

3.47804969

1

Within Groups

1.29439413

6 10

0.1294394

1

Total

2.67905203

3 14


A33-1D

SUMMARY


A33-10^5 3 30.4323 10.1441 0.3519

A33-10^7 3 27.9381 9.3127 0.1739

A33-10^8 3 28.3742 9.4581 0.1878

A33-10^9 3 27.8992 9.2997 0.1443

DCA 3 29.1890 9.7297 0.1906

ANOVA

Source of


Between

Groups 1.5153023 4

0.3788255

8

1.8064035

3 0.2042284

3.47804969

1

Within Groups

2.09712596

6 10 0.2097126

Total

3.61242826

6 14


A33- 2D

SUMMARY


A33-10^5 3 31.3144 10.4381 0.0016

A33-10^7 3 26.4186 8.8062 0.0449

A33-10^8 3 28.7884 9.5961 1.2675

A33-10^9 3 28.0484 9.3495 0.0023

DCA 3 33.7346 11.2449 0.0269

ANOVA

Source of


Between Groups 11.0676642 4 2.766916062 10.29969828 0.001427909 3.478049691

Within Groups 2.68640497 10 0.268640497

Total 13.7540692 14


A33- 3D

SUMMARY


A33-10^5 3 24.0969 8.0323 0.0937

A33-10^7 3 26.2774 8.7591 0.0407

A33-10^8 3 22.8983 7.6328 0.0009

A33-10^9 3 25.5148 8.5049 0.0217

DCA 3 35.1045 11.7015 0.0137

ANOVA

Source of


Between

Groups

31.1390813

2 4

7.7847703

3

227.92753

5

8.9379E-

10

3.47804969

1

Within Groups

0.34154584

8 10

0.0341545

8

Total

31.4806271

7 14


A33-4D

SUMMARY


A33-10^5 3 24.1964 8.0655 0.0036

A33-10^7 3 23.5008 7.8336 0.0322

A33-10^8 3 24.2888 8.0963 0.1018

A33-10^9 3 24.9273 8.3091 0.0691

DCA 3 39.0067 13.0022 0.0341

ANOVA

Source of


Between

Groups

58.5812233

3 4

14.645305

8

304.13437

3

2.1468E-

10

3.47804969

1

Within Groups 0.48154063 10 0.0481540

2 6

Total

59.0627639

6 14


A33-5D

SUMMARY


A33-10^5 3 23.2943 7.7648 0.0031

A33-10^7 3 24.3388 8.1129 0.3073

A33-10^8 3 23.2079 7.7360 0.0644

A33-10^9 3 22.6644 7.5548 0.0179

DCA 3 35.1412 11.7137 0.0761

ANOVA

Source of


Between

Groups

37.3989671

8 4

9.3497417

9

99.697594

3

5.1488E-

08

3.47804969

1

Within Groups

0.93781017

1 10

0.0937810

2

Total

38.3367773

5 14


A33- 6D

SUMMARY


A33-10^5 3 25.0125 8.3375 0.0038

A33-10^7 3 24.8746 8.2915 0.0813

A33-10^8 3 20.7200 6.9067 0.0094

A33-10^9 3 20.9182 6.9727 0.0005

DCA 3 35.0543 11.6848 0.0249

ANOVA

Source of


Between Groups 45.1953254 4 11.29883136 470.6788197

2.45928E-

11 3.47804969

Within Groups 0.24005396 10 0.024005396

Total 45.4353794 14


A33-7D

SUMMARY


A33-10^5 3 22.8357 7.6119 0.0292

A33-10^7 3 21.7816 7.2605 0.0213

A33-10^8 3 19.4294 6.4765 0.0008

A33-10^9 3 20.5038 6.8346 0.0097

DCA 3 34.1514 11.3838 0.0000

ANOVA

Source of


Between

Groups

47.3683842

8 4

11.842096

1

969.49930

3

6.7389E-

13

3.47804969

1

Within Groups

0.12214651

5 10

0.0122146

5

Total

47.4905307

9 14


P21-0 d

SUMMARY


10 5 3 9.084576 3.028192 0.24405

10 7 3 8.643453 2.881151 0.029674

10 8 3 11.03663 3.678876 0.027094

10 9 3 10.09018 3.363392 0.000287

DC 3 8.857332 2.952444 0.00235

ANOVA

Source of


Between Groups 1.339935 4 0.334984 5.51949 0.013076 3.47805

Within Groups 0.606911 10 0.060691

Total 1.946846 14


P21-1 d

SUMMARY


10 5 3 23.86529 7.955098 0.043546

10 7 3 23.17125 7.723751 0.011429

10 8 3 27.51255 9.17085 0.026241

10 9 3 25.39933 8.466443 0.580748

DC 3 27.89676 9.298921 0.371628

ANOVA

Source of


Between Groups 5.958823 4 1.489706 7.206444 0.005341 3.47805

Within Groups 2.067186 10 0.206719

Total 8.026009 14


P21- 2D

SUMMARY


10 5 3 29.20217 9.734058 0.013571

10 7 3 28.79473 9.598244 0.444778

10 8 3 25.74036 8.580121 0.269258

10 9 3 25.89856 8.632854 0.007414

DC 3 27.17301 9.057671 0.046919

ANOVA

Source of


Between Groups 3.415347 4 0.853837 5.45973 0.013539 3.47805

Within Groups 1.563881 10 0.156388

Total 4.979229 14


P21-3D

SUMMARY


10 5 3 21.37153 7.123842 0.16067

10 7 3 23.71956 7.906521 0.361207

10 8 3 21.08591 7.028638 0.31606

10 9 3 20.29003 6.763345 0.070193

DC 3 31.35689 10.4523 0.237942

ANOVA

Source of


Between Groups 27.47334 4 6.868336 29.96467 1.52E-05 3.47805

Within Groups 2.292145 10 0.229214

Total 29.76549 14


P21-4D

SUMMARY


10 5 3 20.87453 6.958176 1.401518

10 7 3 20.93197 6.977322 0.000524

10 8 3 23.76104 7.920347 0.085877

10 9 3 20.57349 6.857831 0.003281

DC 3 33.18127 11.06042 0.000357

ANOVA

Source of


Between Groups 38.39445 4 9.598613 32.1765 1.1E-05 3.47805

Within Groups 2.983113 10 0.298311

Total 41.37757 14


P21-5 D

SUMMARY


10 5 3 20.8841 6.961365 0.012509

10 7 3 23.09621 7.698738 0.000302

10 8 3 20.31234 6.770779 0.004902

10 9 3 19.66082 6.553606 0.118746

DC 3 34.04062 11.34687 0.000597

ANOVA

Source of


Between Groups 47.6541 4 11.91353 434.6226 3.65E-11 3.47805

Within Groups 0.274112 10 0.027411

Total 47.92821 14


P21-6D

SUMMARY


10 5 3 21.40903 7.136342 0.000493 0.012824

10 7 3 20.54322 6.847741 0.00461 0.039202

10 8 3 18.01143 6.00381 0.000667 0.014915

10 9 3 15.32842 5.109473 0.010298 0.058588

DC 3 30.3195 10.1065 0.137325 0.213951

ANOVA

Source of


Between Groups 42.75085 4 10.68771 348.3754 1.1E-10 3.47805

Within Groups 0.306787 10 0.030679

Total 43.05764 14


P21-7D

SUMMARY


10 5 3 18.37892 6.126306 2.177144

10 7 3 17.05496 5.684986 0.000986

10 8 3 15.53339 5.177795 0.009092

10 9 3 14.93799 4.979331 0.000877

DC 3 27.90292 9.300974 0.03015

ANOVA

Source of


Between Groups 37.22139 4 9.305347 20.97453 7.49E-05 3.47805

Within Groups 4.436499 10 0.44365

Total 41.65789 14


A2-0D

SUMMARY


10 5 3 8.603821 2.86794 0.088762

10 7 3 9.916454 3.305485 0.293219

10 8 3 9.280152 3.093384 4.91E-05

10 9 3 7.176091 2.39203 0.12757

DC 3 11.73827 3.912755 0.001382

ANOVA

Source of


Between Groups 3.770658 4 0.942664 9.224051 0.002175 3.47805

Within Groups 1.021964 10 0.102196

Total 4.792622 14


A2- 1D

SUMMARY


10 5 3 29.78322 9.927741 0.005544

10 7 3 27.46582 9.155272 0.012017

10 8 3 28.84366 9.614552 0.230934

10 9 3 28.34805 9.449351 0.007226

DC 3 29.18897 9.729656 0.190605

ANOVA

Source of


Between Groups 1.025604 4 0.256401 2.872343 0.080156 3.47805

Within Groups 0.892655 10 0.089265

Total 1.918259 14


A2-2D

SUMMARY


10 5 3 30.84847 10.28282 0.008028

10 7 3 31.30033 10.43344 0.105242

10 8 3 35.87286 11.95762 0.001859

10 9 3 27.60552 9.20184 0.002982

DC 3 33.73464 11.24488 0.026877

ANOVA

Source of


Between Groups 13.01785 4 3.254461 112.2331 2.89E-08 3.47805

Within Groups 0.289973 10 0.028997

Total 13.30782 14


A2- 3D

SUMMARY


10 5 3 33.82291 11.2743 0.002825

10 7 3 33.8253 11.2751 0.004792

10 8 3 34.14428 11.38143 0.005487

10 9 3 34.12181 11.37394 0.003457

DC 3 35.1045 11.7015 0.013667

ANOVA

Source of


Between Groups 0.36996 4 0.09249 15.29933 0.00029 3.47805

Within Groups 0.060454 10 0.006045

Total 0.430413 14


A2-4D

SUMMARY


10 5 3 29.71791 9.90597 0.094871

10 7 3 28.64972 9.549908 0.074164

10 8 3 29.41091 9.803637 0.147688

10 9 3 26.05496 8.684986 0.000986

DC 3 39.00672 13.00224 0.034146

ANOVA

Source of


Between Groups 32.44025 4 8.110064 115.247 2.54E-08 3.47805

Within Groups 0.703712 10 0.070371

Total 33.14397 14


A2- 5D

SUMMARY


10 5 3 28.86806 9.622685 0.112784

10 7 3 26.88425 8.961417 5.63E-06

10 8 3 24.26031 8.086771 0.004105

10 9 3 26.83206 8.944022 0.010302

DC 3 35.14117 11.71372 0.076144

ANOVA

Source of


Between Groups 22.51845 4 5.629612 138.4286 1.04E-08 3.47805

Within Groups 0.40668 10 0.040668

Total 22.92513 14


A2- 6D

SUMMARY


10 5 3 29.67512 9.891706 0.015125

10 7 3 24.16665 8.055551 0.001768

10 8 3 23.34729 7.78243 0.47881

10 9 3 21.92245 7.307482 1.83E-05

DC 3 35.05431 11.68477 0.024905

ANOVA

Source of


Between Groups 39.68025 4 9.920064 95.27039 6.42E-08 3.47805

Within Groups 1.041254 10 0.104125

Total 40.72151 14


A2-7D

SUMMARY


10 5 3 26.23204 8.744014 0.10067

10 7 3 22.70388 7.567959 0.194098

10 8 3 21.18639 7.06213 0.022873

10 9 3 19.90135 6.633783 0.569392

DC 3 34.14873 11.38291 7.28E-06

ANOVA

Source of


Between Groups 43.63078 4 10.90769 61.48364 5.29E-07 3.47805

Within Groups 1.774081 10 0.177408

Total 45.40486 14


H2-0D

SUMMARY


10 5 3 9.084576 3.028192 0.24405

10 7 3 10.47966 3.493221 0.015864

10 8 3 9.090611 3.030204 0.014861

10 9 3 9.209515 3.069838 0.01237

DC 3 14.21589 4.73863 0.002265

ANOVA

Source of


Between Groups 6.476053 4 1.619013 27.97096 2.08E-05 3.47805

Within Groups 0.578819 10 0.057882

Total 7.054872 14


H2-1D

SUMMARY


10 5 3 25.76391 8.587971 0.011406

10 7 3 22.71265 7.570883 0.004124

10 8 3 22.48149 7.493829 0.005885

10 9 3 23.91033 7.97011 0.000915

DC 3 28.1181 9.3727 0.358803

ANOVA

Source of


Between Groups 7.419174 4 1.854793 24.33265 3.89E-05 3.47805

Within Groups 0.762265 10 0.076227

Total 8.181439 14


H2-2D

SUMMARY


10 5 3 31.07738 10.35913 0.000924

10 7 3 32.91142 10.97047 0.107183

10 8 3 30.17464 10.05821 0.00325

10 9 3 29.13354 9.71118 0.398198

DC 3 30.92023 10.30674 0.536302

ANOVA

Source of


Between Groups 2.569405 4 0.642351 3.070932 0.068361 3.47805

Within Groups 2.091714 10 0.209171

Total 4.661118 14


H2-3D

SUMMARY


10 5 3 24.47712 8.15904 0.022873

10 7 3 26.83203 8.944009 0.007075

10 8 3 26.69142 8.897141 0.044422

10 9 3 27.41162 9.137207 0.344958

DC 3 27.8169 9.272301 0.728595

ANOVA

Source of


Between Groups 2.232631 4 0.558158 2.431162 0.116057 3.47805

Within Groups 2.295848 10 0.229585

Total 4.52848 14


H2-4D

SUMMARY


10 5 3 22.86655 7.622182 0.017731

10 7 3 20.63196 6.877321 0.136366

10 8 3 25.75278 8.584259 0.001568

10 9 3 23.38881 7.79627 0.131494

DC 3 28.48777 9.495925 0.021368

ANOVA

Source of


Between Groups 11.98662 4 2.996656 48.56388 1.62E-06 3.47805

Within Groups 0.617054 10 0.061705

Total 12.60368 14


H21-5D

SUMMARY


10 5 3 23.37718 7.792392 0

10 7 3 20.64028 6.880094 0.01596

10 8 3 21.37508 7.125026 0.002718

10 9 3 16.27021 5.423404 0.179524

DC 3 28.19103 9.397011 0.001213

ANOVA

Source of


Between Groups 25.09701 4 6.274252 157.3158 5.55E-09 3.47805

Within Groups 0.398832 10 0.039883

Total 25.49584 14


H2-6D

SUMMARY


10 5 3 21.14543 7.048478 0.000966

10 7 3 20.57597 6.858658 0.006127

10 8 3 20.23049 6.743497 0.006162

10 9 3 16.3917 5.463899 0.021573

DC 3 28.8485 9.616166 0.123695

ANOVA

Source of


Between Groups 27.5558 4 6.888951 217.2845 1.13E-09 3.47805

Within Groups 0.317048 10 0.031705

Total 27.87285 14


H2-7D

SUMMARY


10 5 3 20.46598 6.821992 0.013951

10 7 3 20.00508 6.668361 0.080005

10 8 3 17.39633 5.798777 0.112784

10 9 3 14.26867 4.756224 0.081215

DC 3 28.71328 9.571093 0.026923

ANOVA

Source of


Between Groups 38.54045 4 9.635114 152.9979 6.36E-09 3.47805

Within Groups 0.629755 10 0.062975

Total 39.17021 14


P28-0D

SUMMARY


10 5 3 11.61194 3.870645 0.005798

10 7 3 10.57142 3.523806 0.036009

10 8 3 11.22656 3.742185 0.01307

10 9 3 11.54065 3.846883 0.013861

DC 3 8.857332 2.952444 0.00235

ANOVA

Source of


Between Groups 1.736192 4 0.434048 30.52922 1.4E-05 3.47805

Within Groups 0.142175 10 0.014217

Total 1.878367 14


P28-1D

SUMMARY


10 5 3 27.72048 9.240159 0.002138

10 7 3 10.57142 3.523806 0.036009

10 8 3 26.96691 8.98897 4.46E-05

10 9 3 26.36175 8.787249 0.002125

DC 3 27.89676 9.298921 0.371628

ANOVA

Source of


Between Groups 74.56245 4 18.64061 226.2516 9.27E- 3.47805

10

Within Groups 0.823889 10 0.082389

Total 75.38634 14


P28-2D

SUMMARY


10 5 3 30.12615 10.04205 0.001715

10 7 3 30.92958 10.30986 0.001088

10 8 3 29.54119 9.847063 0.005506

10 9 3 24.12414 8.041381 1.56E-05

DC 3 27.17301 9.057671 0.046919

ANOVA

Source of


Between Groups 10.15562 4 2.538906 229.7908

8.59E-

10 3.47805

Within Groups 0.110488 10 0.011049

Total 10.26611 14


P28-3D

SUMMARY


10 5 3 25.44273 8.48091 0.008202

10 7 3 26.70757 8.902523 0.000739

10 8 3 26.22926 8.743086 0.027441

10 9 3 23.82282 7.940941 0.051002

DC 3 31.35689 10.4523 0.237942

ANOVA

Source of


Between Groups 10.58882 4 2.647205 40.68546

3.71E-

06 3.47805

Within Groups 0.650651 10 0.065065

Total 11.23947 14


P28-4D

SUMMARY


10 5 3 24.42099 8.140329 0.017982

10 7 3 23.13164 7.710548 0.007175

10 8 3 24.33174 8.110581 1.13E-05

10 9 3 24.75243 8.250811 0.054607

DC 3 33.18127 11.06042 0.000357

ANOVA

Source of


Between Groups 22.2081 4 5.552025 346.4324

1.13E-

10 3.47805

Within Groups 0.160263 10 0.016026

Total 22.36836 14


P28-5D

SUMMARY


10 5 3 23.54402 7.848007 0.000237

10 7 3 23.40613 7.802045 0.000951

10 8 3 22.54623 7.515411 0.012761

10 9 3 23.36052 7.78684 0.021333

DC 3 34.04062 11.34687 0.000597

ANOVA

Source of


Between Groups 31.46059 4 7.865148 1096.075

3.65E-

13 3.47805

Within Groups 0.071757 10 0.007176

Total 31.53235 14


P28-6D

SUMMARY


10 5 3 23.83345 7.944483 0

10 7 3 23.57191 7.857305 3.64E-05

10 8 3 21.7337 7.244568 0.033911

10 9 3 20.36907 6.789689 0.022101

DC 3 30.3195 10.1065 0.137325

ANOVA

Source of


Between Groups 19.48695 4 4.871738 125.9675

1.65E-

08 3.47805

Within Groups 0.386746 10 0.038675

Total 19.8737 14


P28-7D

SUMMARY


10 5 3 23.66571 7.888571 0.000954

10 7 3 22.51188 7.503961 0.010463

10 8 3 19.36333 6.454443 0.000524

10 9 3 19.21945 6.406485 7.25E-05

DC 3 27.90292 9.300974 0.03015

ANOVA

Source of


Between Groups 17.04865 4 4.262161 505.4351

1.73E-

11 3.47805

Within Groups 0.084327 10 0.008433

Total 17.13297 14


A28-OD

SUMMARY


10 5 3 10.1181 3.3727 0.358803

10 7 3 10.73573 3.578578 0.05187

10 8 3 13.12857 4.37619 0.143553

10 9 3 9.08158 3.027193 0.000204

DC 3 11.73827 3.912755 0.001382

ANOVA

Source of


Between Groups 3.198647 4 0.799662 7.193644 0.005374 3.47805

Within Groups 1.111623 10 0.111162

Total 4.31027 14


A28-1D

SUMMARY


10 5 3 32.48359 10.82786 0.044708

10 7 3 31.8695 10.62317 0.000107

10 8 3 30.35313 10.11771 0.029996

10 9 3 29.72263 9.907545 0.293219

DC 3 29.18897 9.729656 0.190605

ANOVA

Source of


Between Groups 2.634974 4 0.658744 5.895997 0.010559 3.47805

Within Groups 1.117273 10 0.111727

Total 3.752247 14


A28-2D

SUMMARY


10 5 3 33.37468 11.12489 0.000767

10 7 3 29.20952 9.736505 0.058212

10 8 3 29.71517 9.905056 0.043961

10 9 3 27.66463 9.221544 0.001531

DC 3 33.73464 11.24488 0.026877

ANOVA

Source of


Between Groups 9.586654 4 2.396664 91.23357 7.92E-08 3.47805

Within Groups 0.262695 10 0.02627

Total 9.849349 14


A28-3D

SUMMARY


10 5 3 29.6103 9.8701 0.057333

10 7 3 28.4575 9.485834 0.00727

10 8 3 27.32097 9.106989 0.000288

10 9 3 27.12057 9.040191 0.001568

DC 3 35.1045 11.7015 0.013667

ANOVA

Source of


Between Groups 14.30556 4 3.576391 223.1711 9.92E-10 3.47805

Within Groups 0.160253 10 0.016025

Total 14.46582 14


A28-4D

SUMMARY


10 5 3 24.84223 8.280745 0.363898

10 7 3 26.48558 8.828526 0.177806

10 8 3 27.273 9.091 0.007778

10 9 3 27.12943 9.043143 0.082057

DC 3 39.00672 13.00224 0.034146

ANOVA

Source of


Between Groups 43.4038 4 10.85095 81.50208 1.37E-07 3.47805

Within Groups 1.331371 10 0.133137

Total 44.73517 14


A28- 5D

SUMMARY


10 5 3 22.90889 7.636296 0.049562

10 7 3 26.6807 8.893568 0.421207

10 8 3 24.76734 8.255781 0.000908

10 9 3 27.74759 9.249197 1.5E-06

DC 3 35.14117 11.71372 0.076144

ANOVA

Source of


Between Groups 29.21761 4 7.304403 66.66774 3.59E-07 3.47805

Within Groups 1.095643 10 0.109564

Total 30.31325 14


A28-6D

SUMMARY


10 5 3 24.74714 8.249048 0.083973

10 7 3 25.23937 8.413125 0.258615

10 8 3 23.67046 7.890154 0.002536

10 9 3 23.55 7.850001 0.009673

DC 3 35.05431 11.68477 0.024905

ANOVA

Source of


Between Groups 31.51178 4 7.877945 103.7381 4.24E-08 3.47805

Within Groups 0.759407 10 0.075941

Total 32.27119 14


A28-7D

SUMMARY


10 5 3 25.46264 8.487546 0.005004

10 7 3 22.82489 7.608296 0.36942

10 8 3 22.26834 7.422781 0.000606

10 9 3 22.60228 7.534092 0.004887

DC 3 34.14873 11.38291 7.28E-06

ANOVA

Source of


Between Groups 33.59706 4 8.399265 110.5387 3.12E-08 3.47805

Within Groups 0.759848 10 0.075985

Total 34.35691 14


H28-0D

SUMMARY


10 5 3 9.452553 3.150851 0.03433

10 7 3 11.45589 3.818631 0.009824

10 8 3 13.10547 4.36849 0.253658

10 9 3 11.50871 3.836236 0.029338

DC 3 14.21589 4.73863 0.002265

ANOVA

Source of


Between Groups 4.381819 4 1.095455 16.62732 0.000204 3.47805

Within Groups 0.658828 10 0.065883

Total 5.040647 14


H28-1D

SUMMARY


10 5 3 26.52168 8.840561 0.321608

10 7 3 27.83142 9.277141 0.002107

10 8 3 25.89679 8.632264 0.014861

10 9 3 25.42703 8.475678 0.024845

DC 3 28.1181 9.3727 0.358803

ANOVA

Source of


Between Groups 1.857033 4 0.464258 3.214084 0.061118 3.47805

Within Groups 1.444449 10 0.144445

Total 3.301482 14


H28-2D

SUMMARY


10 5 3 31.51188 10.50396 0.010463

10 7 3 31.88392 10.62797 0.03433

10 8 3 31.24092 10.41364 0.401975

10 9 3 30.48359 10.1612 0.000224

DC 3 30.92023 10.30674 0.536302

ANOVA

Source of


Between Groups 0.38596 4 0.09649 0.490646 0.74305 3.47805

Within Groups 1.966589 10 0.196659

Total 2.352548 14


H28-3D

SUMMARY


10 5 3 29.59799 9.865997 0.004238

10 7 3 27.2667 9.088901 0.082057

10 8 3 29.86187 9.953956 0.000373

10 9 3 18.01242 6.004138 0.022873

DC 3 27.8169 9.272301 0.728595

ANOVA

Source of


Between Groups 31.75342 4 7.938354 47.35719 1.82E-06 3.47805

Within Groups 1.676272 10 0.167627

Total 33.42969 14


H28-4D

SUMMARY


10 5 3 25.99989 8.66663 0.001073

10 7 3 23.33397 7.77799 0.00021

10 8 3 22.4738 7.491265 0.000126

10 9 3 17.56575 5.855251 0.010663

DC 3 28.48777 9.495925 0.021368

ANOVA

Source of


Between Groups 22.46573 4 5.616434 839.7795 1.38E-12 3.47805

Within Groups 0.06688 10 0.006688

Total 22.53261 14


H28-5D

SUMMARY


10 5 3 18.58576 6.195253 0.01173

10 7 3 21.979 7.326333 4.2E-06

10 8 3 17.90069 5.966898 0.155747

10 9 3 17.06311 5.687703 0.124278

DC 3 28.19103 9.397011 0.001213

ANOVA

Source of SS df MS F P-value F crit

Variation

Between Groups 27.75829 4 6.939571 118.434 2.23E-08 3.47805

Within Groups 0.585944 10 0.058594

Total 28.34423 14


H28-6D

SUMMARY


10 5 3 22.72221 7.57407 0.058562

10 7 3 23.73618 7.912059 0.002293

10 8 3 19.80061 6.600203 0.019633

10 9 3 15.89973 5.299909 0.038933

DC 3 28.8485 9.616166 0.123695

ANOVA

Source of


Between Groups 30.76185 4 7.690463 158.1647 5.4E-09 3.47805

Within Groups 0.486231 10 0.048623

Total 31.24808 14


H28-7D

SUMMARY


10 5 3 21.471 7.156999 0.005735

10 7 3 20.12121 6.707068 0.000654

10 8 3 17.32925 5.776418 0.123553

10 9 3 13.27439 4.424796 0.019417

DC 3 28.71328 9.571093 0.026923

ANOVA

Source of


Between Groups 43.43374 4 10.85843 307.9856 2.02E-10 3.47805

Within Groups 0.352563 10 0.035256

Total 43.7863 14

Phụ lục 3: : Kết quả xử lý thống kê ANOVA một yếu tố thí nghiệm thử tính an

toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú


SUMMARYGroups Count Sum Average Variance

ĐC 6 273.3333 45.55556 458.5185F10 6 141.6667 23.61111 336.0185F2A1 6 118.3333 19.72222 430.463F28 6 115 19.16667 761.9444F11 6 253.3333 42.22222 400.7407F27 6 208.3333 34.72222 76.01852F33 6 131.6667 21.94444 242.6852

ANOVASource of Variation SS df MS F P-value F critBetween Groups 4446.164 6 741.0273 1.916647 0.1055461 2.3717812Within Groups 13531.94 35 386.627

Total 17978.11 41 .

Documents

Nckh Hoan Chinh-ngoc Yen Linh