Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

Standar Nasional Indonesia

ICS 07.100.20

Badan Standardisasi Nasional

SNI ISO/TR 13843:2011

Kualitas air Pedoman validasi metode mikrobiologi

(ISO/TR 13843:2000, IDT)

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

BSN 2011 Hak cipta dilindungi undang-undang. Dilarang menyalin atau menggandakan sebagian atau seluruh isi dokumen ini dengan cara dan dalam bentuk apapun dan dilarang mendistribusikan dokumen ini baik secara elektronik maupun tercetak tanpa izin tertulis dari BSN BSN Gd. Manggala Wanabakti Blok IV, Lt. 3,4,7,10. Telp. +6221-5747043 Fax. +6221-5747045 Email: dokinfo@bsn.go.id www.bsn.go.id Diterbitkan di Jakarta

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

i BSN 2010

Daftar isi

Daftar isi....................................................................................................................................i

Prakata ....................................................................................................................................ii

1 Ruang lingkup................................................................................................................... 1

2 Istilah dan definisi ............................................................................................................. 1

3 Susunan dokumen............................................................................................................ 9

4 Konsep dasar.................................................................................................................. 10

5 Batasan dan karakteristik dari metode mikrobiologi ....................................................... 14

6 Model variasi matematika ............................................................................................... 17

7 Spesifikasi Praktek saat ini .......................................................................................... 26

8 Spesifikasi Pendekatan yang direkomendasikan ........................................................ 27

9 Penentuan dan ekspresi dari karakteristik kinerja .......................................................... 28

10 Prosedur dan tahapan validasi ..................................................................................... 32

11 Rancangan untuk menentukan spesifikasi ................................................................... 35

Lampiran A (normatif) Prosedur statistik dan program komputer ......................................... 37

Lampiran B (informatif) Contoh numerik............................................................................... 41

Lampiran C (informatif) Contoh dari eksperimen pengesahan ............................................. 53

Bibliografi .............................................................................................................................. 54

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Prakata

SNI ISO/TR 13843:2011 dengan Kualitas air Pedoman validasi metode mikrobiologi merupakan adopsi identik dari ISO/TR 13843:2000, Water quality -- Guidance on validation of microbiological methods. SNI ISO/TR 13843 ini disusun atas kerjasama Panitia Teknis 65-05 Produk Perikanan dengan Panitia Teknis 13-03 Kualitas Lingkungan dan Manajemen Lingkungan, dan telah dibahas dalam rapat konsensus lingkup panitia teknis 13-03 pada tanggal 27 Oktober 2009 di Jakarta yang dihadiri oleh wakil dari pemangku kepentingan (stakeholder) yaitu produsen, konsumen, pakar, dan pemerintah. SNI ini telah melalui tahap pemungutan suara pada tanggal 28 Januari 2011 sampai dengan 28 Maret 2011 dengan hasil disetujui menjadi SNI. Pengguna harus memperhatikan bahwa Standar Internasional mengalami revisi dan setiap acuan yang diterapkan adalah edisi terakhir. SNI ini disusun sesuai dengan ketentuan yang diberikan dalam: a) Pedoman Standardisasi Nasional (PSN) 03.1:2007, Adopsi Standar Internasional dan

Publikasi Internasional lainnya Bagian 1: Adopsi Standar Internasional menjadi SNI. b) Pedoman Standardisasi Nasional (PSN) 08:2007, Penulisan SNI. Dalam standar ini istilah ISO diganti dengan SNI ISO, dan istilah International Standards diganti dengan National Standards. Apabila pengguna menemukan keraguan dalam standar ini maka disarankan untuk melihat standar aslinya yaitu ISO/TR 13843:2000 (E) dan/atau dokumen terkait lain yang menyertainya.

ii BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

1 dari 56 BSN 2010

Kualitas air pedoman dalam validasi metode Mikrobiologi 1 Ruang lingkup SNI ISO bagian ini menjelaskan validasi metode Mikrobiologi, dengan penekanan khusus pada metoda kuantitatif selektif dimana perkiraan kuantitatif didasarkan pada penghitungan partikel mikroorganisme baik secara langsung, dengan bantuan dari sebuah mikroskop, ataupun tidak secara langsung, berdasarkan pada pertumbuhan (perbanyakan) sel mikroorganisme menjadi koloni atau kekeruhan dalam media cairnya. Prinsip dan prosedur dalam ruang lingkup ini dinyatakan secara umum dengan ada/tidak ada (A/T), angka paling memungkinkan (APM), jumlah koloni dan jumlah penghitungan langsung secara mikroskopis. SNI ISO bagian ini tidak diterapkan untuk validasi metode cepat atau modern yang sebagian besar berdasarkan pada pengukuran produk yang terbentuk atau perubahan yang terjadi dari aktivitas mikroorganisme, tetapi tidak mendeteksi individu partikel sel mikroorganismenya. 2 Istilah dan definisi Untuk SNI ISO 13843 ini, berlaku istilah dan definisi sebagai berikut. 2.1 akurasi dari pengukuran kedekatan dari suatu hasil uji dengan nilai acuan yang diterima CATATAN Istilah akurasi, ketika dipergunakan untuk suatu satuan hasil uji, melibatkan suatu kombinasi dari komponen acak dan suatu kesalahan sistematik atau komponen bias [ISO 3534-1:1993,3.11] 2.2 ukuran analit kuantitas tertentu yang digunakan dalam pengukuran CATATAN 1 Lihat acuan [5] CATATAN 2 Dalam mikrobiologi, analit didefinisikan secara ideal sebagai suatu daftar spesies yang telah didefinisikan secara taksonomi, dimana pada umumnya, secara praktis, analit hanya dapat didefinisikan pada taraf yang kurang tepat dibandingkan dengan definisi taksonomi. 2.3 porsi analisis, porsi uji volume dari suspensi partikel sel yang diinokulasi ke dalam suatu unit detektor CATATAN Contoh dari suatu unit detektor adalah cawan agar, membrane filter, tabung reaksi, dan bilik hitung mikroskopis (microscopic grid square). 2.4 rentang penggunaan kisaran dari suatu konsentrasi partikel sel yang secara rutin diukur oleh suatu metode.

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

2.5 karakteristik yang dikategorikan metode numerik yang dinyatakan sebagai frekuensi relatif berdasarkan penggolongan A/T atau +/-. 2.6 CFU, satuan pembentuk koloni CFP, partikel pembentuk koloni CATATAN Istilah ini diperkenalkan pada awalnya untuk menyatakan ide bahwa satu koloni mungkin berasal tidak hanya dari satu sel tetapi dari rangkaian atau kumpulan sel, kelompok spora, sebatang miselium dst. Istilah ini tidak tepat untuk menyetarakan jumlah koloni yang diamati dengan jumlah sel yang hidup yang ditanam di media pertumbuhan. Satuan tumbuh, partikel yang dapat hidup, propagul (2.27) dan kuman (2.13) adalah istilah dengan arti yang serupa tetapi menyatakan ide awal yang lebih baik dan dipakai tidak hanya untuk metoda penghitungan koloni tetapi juga untuk APM dan A/T. 2.7 Koefisien variasi CV simpangan baku (deviasi standar) relatif untuk suatu karakteristik non negatif, rasio dari simpangan baku untuk rata-rata CATATAN 1 Rasio mungkin dinyatakan sebagai suatu persentase. CATATAN 2 Istilah deviasi standar relatif kadang-kadang digunakan sebagai suatu alternatif untuk koefisien variasi, tetapi penggunaan ini tidak direkomendasikan. [ISO 3534-1:1993, 2.35] CATATAN 3 Dalam Laporan Teknis ini istilah koefisien variasi (CV) digunakan ketika simpangan baku relatif dinyatakan dalam persen (CV % = 100 RSD). 2.8 uji kolaboratif metode atau uji kinerja laboratorium dimana beberapa laboratorium bergabung dalam suatu eksperimen pengujian yang direncanakan dan dikoordinasikan oleh suatu laboratorium penyelenggara. CATATAN Uji kolaboratif sebagian besar terdiri dari dua jenis. Pengujian kalibrasi yang dilakukan antar laboratorium sehingga laboratorium yang berpartisipasi dapat saling membandingkan hasil analisisnya. Uji kinerja metode menghasilkan penilaian yang tepat (repeatability, reproducibility) dari data yang dikumpulkan ketika beberapa laboratorium yang berpartisipasi menganalisis contoh uji yang sama dengan menggunakan suatu metode yang distandardisasikan dengan ketat.

2 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 2.9 penghitungan koloni yang dikonfirmasi (diverifikasi) x Penghitungan koloni presumtive yang dikoreksi false positive-nya.

cnkpcx ==

(1)

Keterangan :

c adalah jumlah presumptive

p adalah tingkat positif yang benar

n adalah jumlah positif presumptive yang dipisahkan untuk dikonfirmasi;

k adalah jumlah tetap/yang dikonfirmasikan

2.10 diagram kontrol scattergram dua dimensi untuk memantau kinerja metode dengan nilai kontrol yang diperoleh dari suatu Studi Tipe A CATATAN Dalam diagram kontrol poros horisontal biasanya dalam skala waktu atau skala ordinat dan variabel kontrolnya adalah rata-ratanya atau beberapa ukuran presisi (s, CV, RSD). 2.11 detektor detektor partikel cawan dari matriks yang solid atau suatu tabung cairan berisi suatu media pertumbuhan untuk menghitung atau mendeteksi mikroorganisme yang hidup 2.12 seperangkat deteksi seperangkat detektor kombinasi dari cawan petri dan tabung dimana konsentrasi mikroorganisme dalam suatu contoh uji dapat ditentukan secara kuantitatif. CATATAN Seperangkat deteksi terdiri dari satu set cawan petri atau tabung yang digunakan untuk menentukan satu nilai hasil analisis. CONTOH Cawan petri paralel dari suatu suspensi, cawan petri dari pengenceran cairan yang berurutan, sistem tabung APM 3 x 5, cawan microtitre. 2.13 kuman kesatuan hidup yang mampu untuk menghasilkan pertumbuhan dalam media pertumbuhan Cf. propagul (2.27) 2.14 diagram panduan scattergram dua-dimensi untuk menyajikan data kinerja metode (kuantitas atau presisi) dengan nilai-nilai panduan tentatif (arbitary guide) atau nilai panduan yang diperoleh berdasarkan alasan Type B. CATATAN Dalam diagram panduan, poros horisontal biasanya jumlah koloni per detektor.

3 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

2.15 distribusi Poisson heterogen sebaran yang timbul ketika rata-rata dari suatu distribusi Poisson yang berbeda secara acak dari satu kejadian ke kejadian lain. CATATAN 1 lihat acuan [11] CATATAN 2 lihat juga distribusi binomial negatif (2.19). 2.16 batas deteksi (limit of detection) jumlah partikel x (per bagian analitis) dimana kemungkinan p0 dari suatu hasil negatif sama dengan 5 % CATATAN 1 Peluang dari hasil positif p (+) = 1 p0. CATATAN 2 a) Perhitungan dari x melalui distribusi Poisson:

( ) 00.320In0.05

1In1In0

==

=

=p

x

b) Perhitungan dari x melalui distribusi binomial: ( )

2

2

220 120105.01

22

uuupx

uuu ===

2.17 batas penentuan (limit of determination) konsentrasi partikel rata-rata yang paling rendah x per bagian analitis dimana ketidakpastian standar relatif yang diharapkan sama dengan suatu nilai yang ditentukan (RSD) CATATAN a) Perhitungan dari x melalui distribusi Poisson:

( )21

RSDx =

b) Perhitungan dari x melalui distribusi binomial negatif:

( ) ,1

22 uRSDx = diberikan faktor penyebaran yang melebihi = u

2.18 linieritas hubungan linier dari sinyal terhadap konsentrasi dari analit Cf. proporsionalitas (2.28)

4 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 2.19 distribusi binomial negatif suatu distribusi statistik yang tersebar berlebihan (overdispersed) dari penghitungan CATATAN 1 Variannya dapat dinyatakan sebagai:

222 u+= (2) Keterangan adalah rata-rata. CATATAN 2 Dalam SNI ISO bagian ini, faktor penyebaran yang berlebihan (u) diganti untuk eksponen terbalik (1/k) dari rumus standar untuk distribusi binomial negatif. 2.20 penyebaran yang berlebihan variasi dalam keacakan Poisson yang berlebihan. CATATAN Hal ini di deteksi secara kualitatif dengan indeks penyebaran Poisson, dan di ukur secara kuantitatif dengan menilai parameter u (faktor penyebaran yang berlebihan) dari distribusi binomial negatif. 2.21 faktor penyebaran yang berlebihan u merupakan ketidakpastian acak tambahan dari penentuan yang lebih dari distribusi Poisson, diukur sebagai deviasi standar relatif. 2.22 kesalahan tumpang tindih (overlap error) kesalahan bertumpuk (crowding error) pengurangan (depression) sistematis dari jumlah koloni karena beberapa koloni yang bersatu merata (confluence) CATATAN Secara kuantitatif, kesalahan tumpang tindih (overlapping) bergantung pada bagian ruang pertumbuhan yang tersedia bagi pertumbuhan koloni. 2.23 perhitungan paralel jumlah partikel atau jumlah koloni dalam bagian-bagian analitis yang sama yang diambil dari suspensi yang sama 2.24 distribusi poisson sebaran acak sepenuhnya dari jumlah partikel ketika pengambilan contoh uji suatu suspensi yang dicampur secara sempurna CATATAN Peluang P (k) dari pengamatan k dalam suatu bagian uji ketika rata-rata sama dengan yang dihitung dari

( ) = ek

kPk

! (3)

5 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

2.25 presisi kedekatan dari kesesuaian antara hasil uji bebas yang diperoleh menurut kondisi yang ditentukan. CATATAN Presisi tidak berhubungan dengan nilai sebenarnya atau nilai yang ditetapkan. Biasanya dinyatakan sebagai ketidaktepatan dan dihitung sebagai suatu simpangan baku dari hasil uji. 2.26 validasi primer validasi penuh penetapan tentang spesifikasi kinerja suatu metode baru dan/atau percobaan verifikasi sehingga suatu metode memenuhi kriteria kualitas yang diperoleh secara teoritis 2.27 propagul suatu kesatuan yang dapat hidup, sel vegetatif, kelompok sel, spora, kelompok spora, atau bagian dari miselium jamur yang mampu berkembang dalam suatu media pertumbuhan Cf. kuman (2.13) 2.28 proporsionalitas kesesuaian dari jumlah partikel yang diamati dengan volume (atau pengenceran) dari suatu bagian pengenceran yang dilakukan secara seri yang berasal dari suspensi yang sama. CATATAN Proposionalitas dihitung untuk evaluasi statistik sebagai statistik rasio yang kemungkinan log G2 dengan derajat bebas n -1. 2.29 metode kualitatif analisis yang responnya adalah salah satu dari ada atau tidak ada analit dalam suatu jumlah contoh uji tertentu CATATAN Lihat acuan [10] 2.30 temubalik (recovery) istilah umum untuk jumlah partikel yang dinilai dalam suatu uji bagian atau contoh uji, dengan memahami bahwa ada suatu jumlah partikel yang benar (walaupun tidak diketahui) yang mana jumlahnya 100 % atau kurang yang dapat ditemubalikkan oleh detektor 2.31 akurasi relatif tingkat kesesuaian antara respon yang diperoleh dengan metode acuan dan respon yang diperoleh dengan metode alternatif pada contoh uji yang identik CATATAN Lihat acuan [10]

6 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 2.32 perbedaan relatif d merupakan perbedaan antara dua nilai yang diukur dibagi dengan rata-ratanya ( )

BA

BABA

xxxx

xxxd +

== 2 (4)

d % = 100 d CATATAN Untuk tujuan praktis hasil nilai yang sama didapat dari perhitungan ( ) ( )BA xxd lnln = 2.33 temubalik relatif rasio (A/B) dari jumlah koloni yang diperoleh dengan dua metode yang diuji pada bagian uji yang sama dengan suspensi yang sama, dimana B adalah acuannya (ketika dapat digunakan). 2.34 standar deviasi relatif RSD Pendugaan simpangan baku suatu populasi dari suatu contoh uji untuk hasil n yang dibagi dengan rata-rata contoh uji itu

xsRSD =

(5)

Cf. Koefisien varian (2.7) 2.35 keberulangan (repeatability) kedekatan dari kesesuaian antara hasil dari pengukuran yang dilakukan untuk suatu ukuran yang sama dalam kondisi pengukuran yang sama. CATATAN 1 Lihat panduan pada pernyataan ketidakpastian dalam pengukuran [6]. CATATAN 2 Keberulangan dapat dihitung sebagai r = 2,8sr dimana sr adalah standar deviasi keberulangan. 2.36 reproduksibilitas (reproducibility) kedekatan dari kesesuaian antara hasil pengukuran yang dilakukan untuk suatu ukuran yang sama dalam kondisi pengukuran yang berbeda. CATATAN 1 Lihat panduan pada pernyataan ketidakpastian dalam pengukuran [6]. CATATAN 2 Reproduksibilitas dihitung sebagai R = 2,8 sR.

7 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

8 dari 56 BSN 2010

Keterangan :

sR adalah deviasi standar reproduksibilitas yang tersusun dari standar deviasi sL dan deviasi standard keterulangan sr antar laboratorium:

22 sss += rLR

( )ntF /lg=

(6)

2.37 ketangguhan (robustness) kekurangpekaan dari suatu metode analitis terhadap perubahan yang kecil dalam prosedur CATATAN 1 Lihat acuan [23] CATATAN 2 Untuk menguji ketangguhan, disarankan untuk menjalankan metode dengan kesalahan yang disengaja (abuse) namun terkontrol. 2.38 validasi sekunder dilakukan dengan percobaan untuk menunjukan bahwa fungsi metode baku sesuai dengan spesifikasi pihak pengguna. 2.39 selektivitas nyata F Perbandingan jumlah koloni target terhadap jumlah total koloni pada volume contoh uji yang sama

(7) Keterangan : t adalah konsentrasi yang nyata dari jenis target presumtif yang dinilai dengan menghitung koloni; n adalah konsentrasi dari jumlah total koloni 2.40 sensitivitas bagian dari jumlah total biakan positif atau koloni yang tepat sesuai dengan persyaratan dalam suatu pemeriksaan berdasarkan dugaan. 2.41 spesifisitas bagian dari jumlah total biakan negatif atau koloni yang tepat sesuai dengan persyaratan dalam suatu pemeriksaan berdasarkan dugaan. 2.42 standar ketidakpastian ketidakpastian dari hasil suatu ukuran yang ditunjukkan sebagai standar deviasi. CATATAN Lihat acuan [5] 2.43 evaluasi tipe A (dari ketidakpastian ) metode evaluasi ketidakpastian dengan analisis statistik dari observasi yang berseri.

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 CONTOH Pengamatan seperti : standar deviasi, simpangan baku relatif. CATATAN 1 Lihat acuan 5 dan 6. CATATAN 2 Keberulangan dan reproduksibilitas sering dinilai dengan menyelenggarakan uji metode kolaboratif dimana beberapa laboratorium menganalisis contoh uji yang sama yang diberikan oleh penyelenggara pusat. 2.44 evaluasi tipe B (dari ketidakpastian ) metode evaluasi ketidakpastian dengan menggunakan cara selain analisis statistik dari seri observasi seperti distribusi probabilitas yang diasumsikan berdasarkan pada pengalaman atau informasi lain CATATAN Lihat acuan [5] dan [6]. 2.45 ketidakpastian (dari pengukuran) parameter, yang dihubungkan dengan hasil suatu pengukuran yang mengkarakterisasi penyebaran nilai yang dapat mempengaruhi ukuran. CATATAN Lihat acuan [6] 2.46 ketidakpastian (dari hitungan) standar deviasi relatif dari hasil hitungan yang diulang dari koloni atau partikel pada cawan petri atau bidang pengukuran yang sama menurut kondisi yang ditentukan CONTOH kondisi yang ditentukan seperti orang yang sama atau orang yang berbeda dalam satu laboratorium atau laboratorium yang berbeda. 2.47 rentang validasi kisaran dari jumlah rata-rata partikel setiap bagian analitis untuk kepatuhan dari spesifikasi validasi (terutama linearitas) yang telah diterima. CATATAN Biasanya dinyatakan sebagai rentang dari penghitungan jumlah koloni yang dapat dipercaya. 3 Susunan dokumen Bagian pertama (ketentuan 4 sampai 8) dari Laporan Teknis ini berisi bahan informatif mengenai prinsip dasar, karakteristik, dan batasan dari metode Mikrobiologi, dan juga pada aspek umum validasi. Bagian kedua (ketentuan 9 sampai 11) adalah dokumen validasi aktual, berisi spesifikasi dan prosedur-prosedur yang direkomendasi untuk analisis penentuan. Konsep dan prinsip baik lama dan baru tidak sepenuhnya ditetapkan pada Laporan Teknis ini. Tiga lampiran dilampirkan. Lampiran A memperinci formula/rumus statistik yang sebagian besar relevan dengan dokumen ini, lampiran B berisi contoh-contoh numerik dan lampiran C memberikan rencana terperinci untuk dua percobaan valildasi.

9 dari 56

BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Uji statistik dalam pengertian ini bukan menjadi pemikiran utama. Perhitungan matematis digunakan sebagian besar untuk memberikan rangkuman yang tepat tentang data dan distribusi statistik untuk mendapatkan nilai panduan. Suatu tabel dari distribusi 2 adalah panduan yang paling sering digunakan. Dua program BASIC diberikan pada lampiran A yang dapat di-copy dengan mudah ke dalam komputer atau kalkulator yang dapat diprogram untuk membantu dalam perhitungan dasar yang paling sering dibutuhkan. 4 Konsep Dasar 4.1 Umum Selama statistik partikel diperhatikan, penghitungan mikroskopik mengikuti hukum yang sama seperti penghitungan yang dapat ditumbuhkan (viable), tetapi keduanya, dengan pengecualian metode mikrokoloni, terbebas dari masalah biologis yang berhubungan dengan pertumbuhan. Pewarnaan yang berbeda, komplek yang dilabel spesifik, atau pereaksi lain yang digunakan untuk menunjukan target analisis, tidak merubah prinsip pengukuran. Prinsip-prinsip validasi yang sama seperti metode selektif bagi pertumbuhan suatu koloni dapat juga digunakan. Penghitungan plak bakteriofag pada prinsipnya sama seperti pada penghitungan koloni bakteri. 4.2 Validasi 4.2.1 Umum Validasi adalah suatu proses memberikan bukti bahwa suatu metode mampu untuk menjalankan tujuan yang dimaksudkan untuk mendeteksi atau mengukur suatu mikroorganisme atau kelompok mikroorganisme yang spesifik dengan akurasi dan presisi yang memadai. Metode jumlah total tidak mempunyai suatu kelompok target yang dapat ditetapkan dan hanya dapat divalidasikan dalam hubungannya dengan metode lain atau terhadap presisi sesuai teori. Validasi digolongkan sebagai primer atau sekunder sesuai tujuan. 4.2.2 Validasi primer Validasi primer adalah suatu proses eksplorasi yang bertujuan untuk menetapkan batas operasional dan karakter kinerja suatu metode baru, dimodifikasi atau yang belum cukup dikarakterisasi. Validasi ini menghasilkan data numerik dan gambaran spesifik kinerja dan menyertakan suatu gambaran yang rinci dan jelas dari suatu target yang diinginkan (koloni, tabung atau plak yang positif). Validasi primer dilakukan dengan menggunakan skema uji yang dirancang secara khusus. Suatu laboratorium yang mengembangkan metoda sendiri (in house) atau memodifikasi metoda yang telah ada, sebaiknya melaksanakan langkah-langkah validasi primer. Penting sekali untuk diperhatikan bahwa para teknisi yang terlibat dalam validasi primer harus mempunyai pengalaman yang komprehensif dengan metode mikrobiologi yang lain.

10 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 4.2.3 Validasi sekunder Validasi sekunder (juga disebut verifikasi) dilakukan ketika suatu laboratorium memulai untuk menerapkan suatu metode yang dikembangkan di tempat lain. Validasi sekunder memfokuskan pada pengumpulan bukti sehingga laboratorium mampu untuk memenuhi spesifikasi yang ditetapkan dalam validasi primer. Saat ini spesifikasi tidak tersedia untuk sebagian besar dari metode. Hasil dari jaminan kualitas eksternal (lihat 4.2.8) mungkin harus digunakan sebagai langkah pertama ke arah validasi sekunder yang sempurna. Secara khusus, validasi sekunder menggunakan format yang dipilih dan disederhanakan dari prosedur yang sama seperti dalam validasi primer, tetapi dapat diperluas dalam waktu yang lebih lama. Contoh uji yang asli (natural) adalah bahan uji yang optimal dan pekerjaan validasinya hanya membahas prosedur dalam batasan operasional yang ditentukan dalam validasi primer. 4.2.4 Pengendalian mutu (AQC= Analytical Quality Control) Penggunaan dari metode yang valid dalam batasan spesifik yang dapat diandalkan tidak secara otomatis menjamin hasil yang valid. Pengendalian mutu penting dilakukan dalam analisis rutin sehari-hari untuk menjamin penggunaan metoda dengan benar dan berhasil. Pengendalian mutu adalah suatu proses berkelanjutan. Komponen utamanya adalah diagram panduan yang pembatasannya diturunkan dari spesifikasi metode (dari validasi primer) atau dari pertimbangan teoritis. Metode dari pengendalian mutu adalah perluasan dari proses analitis rutin, seperti replikasi pada tingkat yang berbeda, atau penghitungan sederhana yang tidak biasa dilakukan pada data rutin. Sebagai tambahan, juga digunakan bahan acuan, interkalibrasi dan contoh uji yang ditambahkan (spiked sample). Pengendalian mutu dibutuhkan dalam validasi primer dan sekunder. Hanya hasil yang valid dalam pengertian pengendalian mutu yang harus digunakan sebagai kriteria validasi dan karakteristik kinerja. Kelompok kerja nasional dan internasional telah menghasilkan banyak dokumen pengendalian mutu metode mikrobiologi (misalnya, acuan [1, 2, 3, 4, 7, 8, 20, 21, 24, 26]). Buku pedoman standar juga berisi bagian tentang subjek tersebut. Walaupun sangat penting untuk validasi, metode pengendalian mutu tidak diperinci dalam Laporan Teknik ini. Selanjutnya diasumsikan bahwa laboratorium mempunyai pengendalian mutu yang sesuai dan sistem jaminan kualitas internal dan eksternal yang berlaku. 4.2.5 Metode yang setara (equivalent) Adalah penting untuk menggunakan dua metode secara paralel pada contoh uji yang sama ketika mengembangkan suatu metode yang dikembangkan dan sudah digunakan sendiri (in-house), dan juga ketika mengumpulkan informasi untuk membenarkan penggunaan dari suatu metode alternatif. Kinerja metode berisi banyak aspek. Tidak ada uji tunggal dari kesetaraan metode, tidak juga ada kriteria numerik untuk itu. Satu metode mungkin lebih unggul dalam hal spesifisitasnya namun lebih rendah temubaliknya. Semua informasi kolektif tentang ketangguhan, presisi, dan spesifisitas yang diperoleh selama uji validasi dapat digunakan untuk perbandingan metode (contoh B.2, B.3, B.4 dalam lampiran B). Metode itu hanya perlu diuji secara paralel untuk perbandingan temubalik-nya.

11 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Metode terbaik adalah yang menghasilkan temubalik paling tinggi dari target mikroorganisme, jika tidak maka konfirmasi perlu dilakukan untuk penggunaan rutin. Suatu metode akan lebih disukai jika menghasilkan temubalik yang sedikit lebih rendah tetapi tidak memerlukan konfirmasi. Suatu metode dinyatakan tidak valid jika dalam validasi primernya memiliki frekuensi false negative dan false positive yang tinggi dan tidak dapat dikoreksi dengan menentukan target koloni yang lebih tepat. 4.2.6 Bahan uji Pendapat populer menyatakan bahwa validasi sebaiknya mensimulasi kegiatan rutin sebanyak mungkin. Contoh uji alami dengan konsentrasi microorganisme alami sebaiknya digunakan sebagai bahan uji utama. Ada pengecualian untuk beberapa keadaan. Bahan buatan (bahan acuan yang disertifikasi [CRM] dan spiked sample) digunakan dalam sistem jaminan mutu internal dan eksternal untuk menjamin profisiensi dasar dari laboratorium yang berpartisipasi dalam validasi metode. Spiking mungkin berguna dan bahkan perlu dalam validasi sekunder apabila sulit untuk mendapatkan contoh uji alami yang mengandung mikroorganisme target. Personil laboratorium akan dapat terbiasa dengan karakter target tersebut. Contoh uji negatif (blanko) sebaiknya dibatasi pada penjaminan mutu internal. Penyertaan blanko tersebut diantara contoh uji yang digunakan untuk kesetaraan metode, mungkin akan mengarah pada kesan yang tidak tepat dari suatu korelasi yang baik diantara dua metode. Jika diketahui di awal bahwa contoh uji alami tidak mengandung mikroorganisme target, maka contoh uji tersebut lebih cocok digunakan dalam seleksi menguji false positif dalam kegiatan validasi yang sesungguhnya. Rentang konsentrasi optimal untuk validasi metode Mikrobiologi adalah lebih sempit dibanding dengan rentang dalam penggunaannya. Konsentrasi yang tinggi tidak diperlukan. Contoh uji seperti itu menyerupai kultur biakan murni dan tidak dapat digunakan dalam pengukuran kinerja suatu metode atau pengujian laboratorium. Contoh uji dengan kandungan bakteri yang sangat rendah, diperlukan untuk keperluan analisis masalah kesehatan publik, tetapi tidak sesuai untuk perbandingan metode dan kegiatan validasi lainnya karena alasan statistik. Permasalahan ini sebagian besar dapat dihindari, karena metode mikrobiologi pada umumnya tidak sensitif terhadap konsentrasi di ujung skala terendah. Setiap individu kuman bereaksi dengan media , hampir tidak dipengaruhi oleh partikel-partikel lainnya dalam contoh uji. Jika suatu metoda memiliki temubalik yang rendah dibandingkan dengan yang lain, faktanya lebih mudah ditemukan dengan duapuluh atau tiga puluh partikel koloni yang tumbuh per cawan petri dibandingkan dengan atau atau beberapa saja. Metode yang dianalisis valid pada konsentrasi yang cukup untuk validasi, lebih dipercaya digunakan pada konsentrasi analit yang rendah. 4.2.7 Contoh uji- Keterwakilan (Representativeness) dan kecukupan (sufficiency) Teori statistik memberikan solusi untuk menghitung jumlah contoh uji yang diperlukan untuk pengujian berbeda atau perkiraan situasi yang berbeda [3, 13]. Untuk dapat menggunakan teori tersebut maka perlu ditetapkan besarnya pengaruh dan kekuatan terhadap sistem deteksinya. Perkiraan ketidakpastian (presisi) dari suatu penentuan sebaiknya tersedia dan sampling sebaiknya dilakukan secara acak.

12 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 Banyak atau semua persyaratan diatas sulit untuk dipenuhi di awal perencanaan dan pelaksaaan pengujian kinerja metode mikrobiologi. Teknik statistik, jika digunakan menyeluruh akan memberikan panduan umum. Jumlah dan variasi contoh uji yang diuji seharusnya cukup meyakinkan. Tanpa bantuan statistik, tidak ada cara pasti untuk memutuskan. Dalam beberapa kejadian, contoh uji pertama yang dipelajari mungkin memberikan jawaban bahwa metode itu tidak cukup baik. Biasanya, selalu dibutuhkan lebih banyak contoh uji. Mungkin memerlukan seribu contoh uji untuk membuktikan bahwa dua metode A/T tidak setara. Bila contoh uji terlalu sedikit akan membuang waktu saja. 4.2.8 Jaminan mutu eksternal dan uji kolaboratif lainnya Partisipasi dari beberapa laboratorium di dalam analisis suatu bahan homogen adalah dianggap penting, baik untuk kinerja metode dan kinerja laboratorium. (Setelah diketahui outliers dan dikeluarkan, sisa data dapat memberikan informasi yang penting pada kinerja metode dan profisiensi). Uji kolaboratif telah dikembangkan menjadi suatu cara yang secara luas digunakan untuk menguji karakteristik presisi dari metode kimia [34]. Namun agak prematur untuk merekomendasikan hal yang sama sepenuhnya pada mikrobiologi. Diasumsikan bahwa semua laboratorium yang berpartisipasi memiliki pengalaman beberapa tahun dan kemampuan menggunakan metode yang diuji. Saat ini ada kecenderungan bahwa eksperimen kolaboratif telah menjadi pengujian profisiensi laboratorium dan kegiatan pelatihan. Sejumlah metode Mikrobiologi telah digunakan selama beberapa dekade (misalnya, agar Endo untuk coliforms, mFC untuk coliforms thermotolerant, agar m-Enterococcus untuk enterococci intentinal) oleh ratusan laboratorium. Metode ini secara teoritis akan lebih sesuai digunakan dalam pengujian kolaboratif kinerja metoda Ketika membuat tes profisiensi kolaboratif untuk organisme target spesifik dengan menggunakan media selektif, contoh uji sebaiknya di-spiked dengan kultur murni atau campuran dari berbagai mikroorganisme. Alternatifnya menggunakan bahan acuan tersertifikasi. Ini adalah suatu kondisi yang dibuat dan disederhanakan. Hal ini dapat mengurangi kesulitan yang sering dialami oleh berbagai laboratorium dalam menggunakan metode untuk analisis contoh uji alami. Selama karakteristik kinerja terinci dari suatu metode mikrobiologi belum dinyatakan secara kuantitatif, tipe dari skema jaminan mutu eksternal (EQA) ini mungkin merupakan cara yang paling memuaskan untuk metoda validasi sekunder (verifikasi). 4.3 Detektor 4.3.1 Umum Secara umum medium pertumbuhan dan tempatnya adalah suatu detektor (2.11). Dua jenis detektor, padat dan cair, digunakan pada berbagai metode Mikrobiologi yang berbeda. Jenis detektor ini berhubungan erat dengan prinsip deteksi dan penghitungan yang berbeda: detektor cair dengan A/T dan APM, sementara detektor padat dengan penghitungan koloni. Semua bentuk validasi dalam mikrobiologi memfokuskan pada kinerja detektor.

13 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Seperangkat tabung (APM) atau satu seri dari cawan agar yang digunakan untuk analisis disebut sebagai seperangkat deteksi atau seperangkat detektor (2,12). Setiap tabung APM adalah satu detektor A/T. CONTOH Setiap sumur (well) dari suatu cawan mikrotitre adalah sebuah detektor A/T. Seluruh cawan ketika digunakan sebagai suatu sistem APM adalah seperangkat deteksi. 4.3.2 Perbandingan detektor Untuk sebagian besar metode penghitungan koloni, suatu media cair dengan komposisi kimia yang sama tetapi tanpa matrik padat (agar, membran filter) dapat digunakan. Pengaruh lingkungan padatan dapat dievaluasi dengan membandingkan jumlah koloni dengan perkiraan APM. Hal ini menunjukan bahwa reaksi deteksi target sama pada kedua tipe detektor dan jumlah dari tabung APM cukup besar untuk menyatakan presisi. Sensivitas dari detektor A/T dapat juga dievaluasi dengan perbandingan media cair-padat yang serupa. 4.4 Karakteristik Kinerja Karakteristik kinerja harus dapat dihitung dan diuji untuk digunakan dalam validasi. Istilah karakteristik kinerja dalam Laporan Teknik ini sebagian besar mengikuti penggunaan chemometric. Definisi semula dari istilah itu tidak selalu sesuai metode mikrobiologi, karena telah dimodifikasi dan disesuaikan berdasarkan kebutuhannya. Karakteristik kinerja yang tercantum dalam Laporan Teknik ini berhubungan dengan ruang lingkup (daftar situasi dan jenis contoh uji dimana metode dapat digunakan), presisi, linearitas, temubalik, batas kerja yang berkenaan dengan jumlah koloni tertinggi dan terendah yang dapat direkomendasikan per cawan, selektivitas, spesifisitas dan ketangguhan (ruggedness). Definisi dari istilah ini semua dan yang lainnya dapat ditemukan pada klausa definisi 2. 4.5 Spesifikasi Spesifikasi adalah pernyataan numerik atau kualitatif dari karakteristik kinerja atau dari batas kerja yang diturunkan darinya. Validasi primer sebaiknya memperhatikan hal berikut : a) identifikasi morfologi dari target (presumptif)

b) pernyataan mengenai kondisi inkubasi (suhu, waktu, atmosfir gas, kelembaban) dan karakteristik media (pH, stabilitas);

c) pernyataan mengenai batas kerja yang dapat dipercaya dalam hal jumlah plak dan koloni per detektor (cawan, membran filter) jika mungkin;

d) Pernyataan ketidakpastian dalam batas yang ditetapkan yang dapat dipercaya;

e) Ruang lingkup dan batasan. 5 Batasan dan karakteristik dari metode mikrobiologi 5.1 Temubalik analit Analit mikrobiologi terdiri dari partikel hidup yang utuh, dengan berbagai cara disebut satuan pembentuk koloni (CFU), partikel pembentuk koloni (CFP), kuman, profagul, dll (lihat klausa 2). Jumlah koloni yang diamati adalah suatu perkiraan dari jumlah partikel yang hidup.

14 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 Kegunaan pengujian kinerja dibatasi oleh ketidakmungkinan untuk mengetahui jumlah sebenarnya analit dalam suatu contoh uji atau bagian analitis. Detektor tidak mampu untuk mengetahui jumlah kuman secara tepat. Viabilitas didefinisikan dengan pertumbuhan, yaitu dengan metode itu sendiri. Temubalik mutlak tidak dapat ditentukan dan ketertelusuran (traceability) adalah tidak mungkin. Karena viabilitas bisa muncul berbeda pada detektor yang berbeda dan atau riwayat contoh uji yang berbeda. Temubalik relatif (yang menyertakan metoda dan acuan yang baru) adalah suatu karakteristik kinerja praktis walaupun nilai sebenarnya tidak diketahui. 5.2 Varian contoh uji Dalam lingkungan dan bahkan dalam contoh uji laboratorium, sebaran partikel tidak homogen. Varian sampling dari lingkungan bukan merupakan karakteristik dari metode. Tetapi varian sub sampling dari suatu contoh uji laboratorium dapat dipertimbangkan sebagai karakteristik dari metode. Tidak mungkin secara praktis melakukan pencampuran sempurna tanpa kehilangan beberapa sel hidup. Varian contoh uji tetap dapat menyebabkan masalah dalam validasi. Kinerja terutama presisi dan batas kerja atas, perlu ditentukan terpisah untuk matrik yang berbeda. 5.3 Distribusi dan sebaran berlebihan (overdispersion) dari partikel Variasi acak yang disebabkan oleh distribusi partikel yang tidak homogen diantara dua contoh uji yang paralel, bahkan dalam suspensi yang tercampur sempurna, adalah merupakan karakteristik dari metode mikrobiologi. [31]. Variasi acak dasar tidak dapat dihindari dan tidak berkaitan dengan ketrampilan teknis atau peralatan. Hal ini mengikuti hukum matematika yang dikenal dengan distribusi Poisson [28], maka dapat dihitung. Ketidaksempurnaan teknis dan banyak hal lainnya menyebabkan adanya variasi tambahan. Penentuan paralel bahkan lebih bervariasi daripada yang dijelaskan oleh distribusi Poisson. Situasi ini disebut sebaran yang berlebihan overdispersion [2.20]. Banyak argumen yang mendukung distribusi binomial negatif (2.19) sebagai suatu model sebaran yang berlebihan dalam mikrobiologi [11, 14, 15]. 5.4 Interaksi dalam detektor Banyak kesulitan yang timbul dari interaksi faktor biotik dan abiotik di dalam detektor. Detektor cair memiliki kelemahan dalam hal kemungkinan berbagai mikroflora yang tumbuh bersama dalam tabung yang sama. Detektor koloni memiliki kelemahan dalam hal kelebihan pertumbuhan dan tertutupnya koloni target oleh kotoran dan pertumbuhan dari non target. Pengamatan hasil menjadi sulit, tidak dapat diandalkan atau tidak memungkinkan. 5.5 Ketangguhan Metode Mikrobiologi tidak tangguh. Baik analit maupun pengotor adalah hidup. Hal ini menyebabkan timbulnya fenomena yang tidak diharapkan pada detektor. Para mikrobiologis sebaiknya dapat mengenal dan mengerti hal ini. Pengaruh matriks, tekanan inkubasi, kualitas dan asal campuran substrat, komposisi dari mikroorganisme dalam contoh uji dan pelatihan teknisi dapat mempengaruhi hasil.

15 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Sumber dari kurang tangguhnya metode mikrobiologi ada pada lima prinsip utama : contoh uji (sifat fisikokimia dan populasi mikroorganisme), kompetensi personil, penyiapan contoh uji, kondisi inkubasi, dan media deteksi. Dari semua ini, tiga terakhir sebaiknya distandardisasi. Validasi primer sebaiknya menetapkan batasan umum agar metode yang diharapkan menunjukkan kinerja yang baik. Rancangan statistik yang efisien untuk pengujian ketangguhan yang dikembangkan oleh AOAC [34] juga dapat digunakan dalam mikrobiologi. Dengan mempertimbangkan sifat hidup alami analit, kebebasan memilih dalam hal waktu reaksi (waktu inkubasi) dan suhu inkubasi, menyebabkan sering terjadi hal tak terduga. Penghitungan koloni lebih sensitif terhadap waktu dari yang diasumsikan secara umum. Sebagai contoh dalam standar internasional di beberapa negara yang berbeda sering kali menerapkan ketangguhan dalam batas yang tidak mungkin dilakukan. CONTOH Deskripsi metode deteksi dan penghitungan coliform memperbolehkan inkubasi selama 18 jam sampai 24 jam pada 36C 1C . Hal ini menyatakan stabilitas hasil yang dipengaruhi oleh variasi waktu dan temperatur inkubasi, kemungkinan lebih dari yang sebenarnya. Ketika temperatur menjadi salah satu dari faktor selektif (misalnya 44C untuk termotoleran coliform), bahkan posisi dari cawan dalam inkubator atau tumpukan cawan dapat mempunyai pengaruh yang kuat pada hasil analisis. Ini telah diakui pada beberapa standar dengan menentukan tumpukan tertinggi yang diperbolehkan (misalnya enam cawan). Penghilangan pengaruh penumpukan memerlukan inkubasi satu lapisan saja, yang dianggap tidak dapat dilaksanakan. Fitur ketangguhan penting lainnya yang jarang diperhatikan adalah penyimpanan contoh uji sebelum analisis. Dipercaya valid secara umum bahwa contoh uji toleran terhadap penyimpanan dalam refrigerator, misalnya sampai 24 jam [9]. Cekaman dingin (cold-stress) selama penyimpanan dalam refrigerator mungkin tidak penting dalam penghitungan jumlah koloni tetapi hal ini dapat menimbulkan kesalahan dalam metoda terutama metoda yang sangat selektif. Shock panas dan cekaman lainnya tidak umum tetapi sangat spesifik terhadap suatu metode. 5.6 Kesalahan bias (Spurious errors) Salah satu fitur khas dari sebagian besar metode penghitungan koloni mikrobiologi, adalah kecenderungan terjadinya permasalahan yang tidak diduga, terutama pada teknik cawan petri tunggal. Teknik lainnya yang berbeda (penanaman di cawan, sebar permukaan, filtrasi membran) tidak memiliki kecenderungan seperti diatas. Permasalahannya karena adanya satu koloni yang mengganggu, kelembaban, perbedaan suhu, padatan dan pengotor, kontaminan dan lainnya. Kejadian seperti ini tidak menggambarkan kinerja metode secara umum dan tidak masuk pertimbangan dalam validasi dan tidak dapat diprediksi dalam model matematika. Ketika sangat sering terjadi, maka metode jadi diragukan. Tetapi metode kultur cair kurang terpengaruh. Secara ilmiah kesalahan bias terjadi pada metode mikrobiologi sehingga sebaiknya disertakan dalam perkiraan ketidakpastian kinerja. Maka metode tersebut harus divalidasi pada saat digunakan. Salah satu hal yang perlu diperhatikan dalam Laporan teknis ini adalah bahwa kesalahan bias harus menjadi hal penting yang perlu diperhatikan dalam kegiatan harian jaminan mutu (AQC). Walaupun deteksi kesalahan bias sangat tergantung pada keahlian para teknisi, harus diupayakan untuk dapat mengenal dan menghilangkannya. Jika kesalahan bias sering ditemukan dapat menyebabkan kegagalan analisis, maka metode yang digunakan jelas tidak sesuai dengan tujuannya.

16 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 5.7 Diagram pedoman dan kontrol Prosedur analisis adalah proses dan hasil pengukuran atau penentuannya dianggap sebagai produknya. Maka ide dasar diagram kontrol yang berasal dalam suatu proses industri, akan dapat diterapkan dalam suatu proses analisis. Diagram kontrol ini akan membantu deteksi apakah terjadi perubahan yang mendadak atau laten pada proses jaminan mutu. Ketika permasalahannya tidak dapat lagi dikontrol, maka prosesnya dapat dihentikan dan diperbaiki. Kemungkinan mengontrol proses sangat terbatas. Yang paling umum dilakukan adalah menggunakan contoh uji acuan untuk menguji konsistensi temubalik (tidak adanya bias sistematik) dan analisis ganda untuk menguji presisi (keterulangan dan atau reproduksibilitas). Pemikiran ini sesuai untuk analisis kimia secara otomatis, tetapi tidak untuk analisis mikrobiologi. Hal ini mengasumsikan bahwa proses (seperti prosedur analisis) kinerjanya baik diawal, kemudian memburuk dengan cepat atau bertahap dan akhirnya menghasilkan kesalahan analisis. Sebenarnya sulit untuk menunjukkan kapan suatu metoda berada dalam kontrol atau tidak dapat dikontrol. Hasil analisis yang buruk mungkin tidak berhubungan dengan hasil lainnya dalam waktu yang bersamaan. Plot grafis sangat berguna dan menjadi alat praktis tidak hanya dalam jaminan mutu (AQC) tetapi juga dalam konteks validasi tertentu. Maka untuk alasan tersebut di atas, penggunaan dalam mikrobiologi sebaiknya terbatas untuk memberikan panduan dalam praktek analisis. Jangan digunakan untuk menyalahkan seluruh analisis atau hasilnya. Disarankan untuk istilah diagram kontrol sebaiknya dibatasi untuk mengontrol situasi yang jelas, seperti memantau suhu inkubasi. Istilah diagram panduan lebih cocok ketika mengillustrasikan kinerja metode mikrobiologi secara grafis. Walaupun demikian beberapa nilai panduan dapat dipilih untuk membantu pengambilan keputusan.

6 Model variasi matematika 6.1 Variasi dasar yang tidak dapat dihindarkan distribusi Poisson 6.1.1 Umum Peluang variasi jumlah partikel dalam suatu analisis yang paralel pada rentang kondisi optimum dari detektor mikrobiologi adalah seimbang jika suspensinya tercampur dengan baik (acak lengkap) dan tidak ada ketidakpastian teknis dari pengukurannya. Ini menciptakan suatu dilema khas mikrobiologi. Metode-metode penghitungan koloni, dalam sebagian besar aspek biologi dan teknis, kinerja terbaiknya terjadi ketika jumlah partikelnya sedikit namun presisi statistik tidak memadai.

17 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

6.1.2 Presisi dari detektor jumlah koloni Presisi biasanya dinytakan dengan istilah deviasi standar. Statistik dasar dari variasi penghitungan koloni koloni dapat dimodelkan secara matematika dengan distribusi Poisson. Varian (s2) dari distribusi Poisson adalah sama secara numerik dengan rata-rata (m) (persamaan dari rata-rata dan varian tidak membuktikan bahwa data mengikuti distribusi Poisson). Simpangan baku relatif (RSD) berbanding terbalik dengan rata-rata atau sevara umum dengan jumlah total (c) dari suatu set deteksi. ada dalam hubungan terbalik untuk jumlah rata-rata atau lebih secara umum terhadap jumlah total (c) dari satuan deteksi:

ccc 1

csRSD ===

(1)

CONTOH Suatu analisis dengan teknik cawan tunggal dari contoh uji suspensi yang tercampur dengan sempurna menghasilkan 48 koloni, maka secara teoritis akan mempunyai presisi relatif (RSD) dari 48/1 = 0.14 (CV = 14 %). Jika hasil 48 koloni tersebut berasal dari tiga cawan yang paralel, semisal 12 + 16 + 20 = 48, simpangan baku relatif dari rata-rata 48/3 = 16 akan jadi sama. Ketergantungan dari presisi relatif (CV, koefisien variasi) pada jumlah karakter (c) ditunjukkan pada gambar 1.

Gambar 1 - Koefisien dari variasi jumlah koloni dalam suatu suspensi campuran dengan sempurna mengikuti hukum distribusi Poisson.

Grafik itu menunjukkan mengapa jumlah koloni seperti 20, 25 atau 30 secara tradisional telah dianggap jumlah terendah yang dapat diandalkan. Model Poisson dapat digunakan untuk memperkirakan statistik ketidakpastian secara teoritis untuk penghitungan koloni dan sebaliknya dapat digunakan untuk membuat keputusan pada batas minimum berdasarkan presisi statistiknya. Ketidak pastian acak meningkatkan dengan cepat ketika jumlah koloni berkurang (Gambar 1). Dalam rentang hitungan di bawah sekitar sepuluh, biasanya terjadi apad analisis demi kepentingan kesehatan masyarakat, pengukuran-pengukuran tunggal tidak akan tepat sehingga tidak dapat dikarakterisasikan sebagai lebih baik daripada semikuantitatif.

18 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 Rentang jumlah 1 sampai 10 berkaitan dengan rentang yang menentukan karakter presisi dari 3 x 5 tabung APM yang umum. Menggolongkan penghitungan koloni kurang dari 10 sebagai semikuantitatif adalah sesuai dengan pendapat para pakar statistik bahwa desain 3 x 3 dan 3 x 5 lebih dianggap sebagai test-test mengukut tingkatan besaran daripada perkiraan kuantitas. (Tabung perkiraan APM 3 x 5 mempunyai rentang kepercayaan 95 % 95 % pada sekitar 0,5 unit logaritmik (12). 6.1.3 Presisi dari detektor APM Presisi dalam metode APM tergantung pada jumlah hasil penghirungannya sendiri, tetapi didalam beberapa cara yang lebih sulit dibandingkan dengan penhitungan koloni. Simpangan baku dari log APM adalah satu kurva bergelombang. Itu mempunyai banyak batas minimum sebagai tingkatan pengenceran dalam set deteksi. Sebagai suatu contoh, berikut ini adalah simpangan baku logaritmik dihitung untuk tabung 3 x 10 APM detektor yang dibuat dengan bantuan program komputer [19] (Gambar 2).

19 dari 56 BSN 2010

Gambar 2 - Simpangan baku logaritmik dari 3 x 10 tabung APM

Jumlah tabung positif pada susunan yang utuh diplot di absis. Kurva yang bergelombang memperlihatkan simpangan baku yang sebenarnya. Garis lurus horisontal adalah perkiraan Cochran's [12]. Cochran [12] mengusulkan suatu simpangan baku tetap untuk keseluruhan rentang APM. Perkiraan ini ditunjukan oleh garis horizontal didalam gambar 2. Di sini terlihat bahwa penyimpangan yang pasti, terjadi pada set tabung APM yang negatif. Sesuai dengan rumus Cochran's [12], presisi penilaian APM dalam skala logaritmik tergantung secara sederhana terhadap jumlah tabung (n) dan terhadap faktor pengenceran (f) antara pengenceran yang berurutan. Tetapan (konstanta) 0,58 dipilih "dengan mata" untuk pengenceran sepuluh kalilipat untuk memberikan gambaran yang sesuai dalam gambar 2. Jika faktor pengenceran antara pengenceran yang berurutan faktor kurang dari sepuluh, kemudian tetapan 0,55 dapat digunakan [12].

SD atau lg APM = 0,58nflg

(2)

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

95 % batas kepercayaan di banyak tabel APM didasarkan pada perkiraan Cochran didalam persamaan (2), tetapi akan digantikan dengan lebih tepat batas-batas "yang benar-benar" didalam tabel yang baru-baru ini diterbitkan. Simpangan baku dari nilai APM sekarang ini dengan mudah diperoleh dengan suatu program komputer yang sesuai, misalnya. [19]. Disamping sifatnya pendekatan, Rumus Cochran bermanfaat didalam perencanaan dan perbandingan metoda eksperimental (lihat contoh di bawah). CONTOH Diassumsikan suatu perkiraan berdasarkan pada sistem pendeteksian APM untuk sumur 3 x 32 dalam suatu cawan microtitre 96-sumur.,Dengan faktor pengenceran f = 3, maka simpangan baku log APM sesuai dengan rumus Cochran adalah:

0672,00149,055,0lg58,0lg ==nfAPMSD (3)

Dengan jumlah paralel tabung yang tinggi dan dengan faktor-faktor pengenceran kurang dari 10, sistem APM menjadi sama atau lebih baik dari pada metoda penghitungan koloni karena kondisi pertumbuhan yang lebih baik, penafsiran yang lebih mudah dan kurangnya kesalahan tumpang tindih. 6.1.4 Batas dari pendeteksian Model Poisson Pada konsentrasi partikel yang sangat rendah semua metoda mikrobiologi, termasuk APM dan penghitungan jumlah koloni, secara essensial menjadi sebuah metoda A/T. Perlu diperhatikan terutama dalam bidang kesehatan atau jaminan produk, dimana hasil penghitungan yang dibawah tiga atau empat sebagai hasil deteksi yang positif dari suatau keberadaan. Jika batas dari pendeteksian ditetapkan sebagai kemungkinan penilaian suatu hasil positif, maka akan tidak terbaca dalam grafik pada gambar 1. Peluang dari suatu hasil positif p(+) ketika distribusi Poisson berlaku dapat dihitung dari 4( ) mep =+ 1

Keterangan :

e adalah dasar dari logaritma alami;

m adalah rata-rata jumlah partikel setiap bagian analisis.

CONTOH Salah satu dari definisi populer untuk batas dari pendeteksian adalah konsentrasi di mana peluang pendeteksian keberadaan dari suatu analit setara dengan 95 % [p(+) = 0,95] Jika p(+) adalah dijadikan 0,95, kemudian e-m = 1 - 0,95 = 0,05. Penyelesaian persamaan untuk m menghasilkan In(0,05) =3,0. Jadi pada rata-rata jumlah 3, peluang untuk dari pendeteksian suatu partikel dalam bagian pengujian setara dengan 0,95 (dengan ketentuan bahwa distribusi Poisson berlaku).

20 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 6.2 Penyebaran yang berlebihan - Model binomial negatif 6.2.1 Umum Upaya pembuatan suspensi dasar, inokulasi dan penghitungan kolini tidak sepenuhnya lepas dari ketidakpastian. Setiap tahapan teknis menambah ketidakpastian pada total variabilitas dari pengukuran. Pengukuran secara paralel yang melibatkan semua prosedur analisis tidak dapat diharapkan untuk mengikuti distribusi Poisson. Penyebaran yang berlebihan, semisal variasi yang lebih besar daripada acak lengkap (dalam pengertian Poisson) diantara pengukuran paralel akan dapat diamati.. Penyebaran yang berlebihan adalah status normal dari analisis pengukuran mikrobiologi dan distribusi Poisson adalah satu perkecualian. Penyebab umum dari penyebaran yang berlebihan, terlepas dari bias kesalahan, telah mempengaruhi secara sebanding dengan rata-rata atau jumlah sebenarnya dari koloni hasil penghitungan koloninyang dideteksi dalam set deteksi. Argumentasi lain mengapa pada penyebaran yang berlebihan dari penghitungan mikrobiologi mengikuti pola ini telah dijelaskan seperti pada refernsi 11.14]. Sebagai dasar ketidakpastian karena penyebaran partikel dalam suspensi yang mengikuti distribusi Poisson, total varian s2 mungkin dapat ditulis sebagai

222 cucs += (5)

Keterangan :

u adalah atas faktor penyebaran yang berlebihan, simpangan baku relatif dari tambahan ketidakpastian;

c adalah jumlah koloni di keseluruhan susunan pendeteksian.

Bagian pertama dari varian (c) karena proses Poisson, sisanya (u2c2) karena pengaruh komdinasi semua faktor penyebaran berlebihan. Distribusi statistik seperti model varian ini disebut dengan suatu distribusi binomial nenatif (juga dikenal sebagai distribusi Poisson campuran atau heterologus). Sebagai akibatnya, simpangan baku relatif mungkin dapat dinyatakan sebagai :

21 uc

RSD += (6)

21 dari 56

BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

22 dari 56 BSN 2010

Gambar 3 memperlihatkan efek dari tingkat perbedaan dari penyebaran yang berlebihan di terhadap total relatif presisi (koefisien variasi). CATATAN Ketergantungan koefisien dari variasi (CV) terhadap jumlah (c) dari partikel yang dihitung dan variasi tambahan . GariskKurva lebih rendah: model Poisson dengan tanpa penyebaran yang berlebihan. Garis kurva yang lebih atas adalah binomial negatif dengan 15 % dan 30 % penyebaran yang berlebihan (u = 0,15 dan 0,30)

Gambar 3 - Efek dari penyebaran yang berlebihan terhadap CV

Jumlah koloni diperlukan untuk mencapai suatu total presisi relatif adalah relatif lebih tinggi dalam kondisi penyebaran berlebihan dibandingkan didalam kasus acak Poisson. Hal ini dapat dihitung dengan cara memecahkan persamaan (6) untuk jumlah koloni c:

22

1uRSD

c = (7) CONTOH Untuk mencapai simpangan baku relatif RSD = 0,2 ketika penyebaran yang berlebihan adalah u 0,15 memerlukan, sesuai dengan persamaan (7), jumlah koloni c = 1/(0,22 - 0,152) = 1/(0,04 - 0,0225) = 57, Presisi yang sama dicapai dalam suatu situasi acak secara penuh (Poisson) dengan jumlah koloni c = 1/0,22 = 1/0,04 = 25 CATATAN Jelas bahwa total presisi lebih rendah dari penyebaran yang berlebihan yang tidak dapat dicapai di dalam satu penentuan tunggal. Prosedur keseluruhan harus diulangi jika presisi yang lebih baik diperlukan. Dengan n penentuan paralel, total simpangan baku relatif mungkin dapat secara kasar diperkirakan dari

nu

c

21 +RSD = (8) Keterangan :

c adalah jumlah total koloni direkam; u adalah konstanta pada overdispersion; n adalah jumlah dari penentuan paralel.

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 6.2.2 Limit pendeteksian - Model binomial negatif Batas pendeteksian, jika didefinisikan dalam kaitannya dengan probabilitas dari suatu hasil positif dapat dihitung dari probabilitas negatif. Mengutip Anscombe [11] tetapi mengubah simbol yang digunakan dalam laporan teknis, probabilitas hasil negatif (probabilitas nol) diberikan dengan rumus:

( ) 2/120 1 ucup += (9) Menyelesaikan persamaan untuk c memberikan batas pendeteksian ketika peluang negatif dan faktor penyebaran yang berlebihan diberikan.

20 1

2

upc

u =

(10)

Sebagaimana bukti dari Gambar 2, batas pendeteksian adalah sedikit dipengaruhi oleh penyebaran yang berlebihan (lihat contoh di bawah). CONTOH Jumlah koloni rata-rata diperlukan dalam rangka untuk mencapai peluang 95 % dari suatu hasil positif dalam kondisi penyebaran berlebihan tergantung pada faktor penyebaran yang berlebihan. Bila mengasumsikan faktor penyebaran yang berlebihan u = 0.30. Penggantian langsung dari peluang hasil negatif P0 = 1 p(+) = 1 - 0,95;= 005; didalam persamaan. (10) menghasilkan ( ) 2/105,0 2 uc u = = (0,05-0,09- 1/0,09 = 3,44. Penilaian yang sesuai dengan distribusi Poisson (tidak ada pada /pada penyebaran yang berlebihan) akan jadi c=In (1/0,05) = 3,00 (lihat contoh m 6.2 4). 6.2.3 Mengukur penyebaran yang berlebihan Terdapat tiga cara utama untuk memperkirakan parameter u [20]. Metoda Anscombe I [11] effisien pada rentang nilai rata-rata dan faktor-faktor penyebaran yang diperlukan dalam validasi metode-metode penghitungan koloni. Ini mencakup penyelesaian persamaan (5) untuk menentukan u. Untuk bisa menggunakan metoda Anscombe I, suatu substansial seri (yang disukai lebih dari 30) dari observasi independen pada suatu contoh tunggal yang harus tersedia untuk menjadi dasar penilaian handal dari varian (s2) dan rata-rata (m) pada Persamaan (5) yang menghasilkan, ketika menggantikan m untuk c

2

22

mmsu = (11)

Untuk jadi efisien, observasi harus dibatasi pada jumlah koloni di dalam rentang kerja optimal. Rata-rata harus tidak pernah lebih kecil daripada 30. Hal ini dapat diterapkan terutama untuk memperkirakan u dalam experimen tunggal. CONTOH Untuk mendemonstrasikan kelayakan dari pada kalkulasi penyebaran yang berlebihan, suatu eksperimen dibuat untuk dengan bebas memperkenalkan penyebaran yang berlebihan dalam suatu penghitungan paralel 24 membran filtrasi yang dibuat dari suspensi kultur murni Enterococcus faecium, dimana 8 cawan petri diinokulasi oleh 8 ml, 10 ml dan 12 ml suspensi bakteri tersebut. Ini memperkenalkan suatu ketidaktepatan volume yang menyebabkan suatu jumlah perkiraan kasar penyebaran berlebih dari penghitungan 24 membran filter tersebut.

23 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Volume dihitung dari 8 ml x 8 ml, 8 ml x 10 ml, dan 8 ml x 12 ml mempunyai suatu rata-rata = 10 dan simpangan baku o= 1,633. Ketidakpastian standar relatif sehubungan dengan penyebaran yang berlebihan harus oleh karena itu adalah msu /= = 0,163 3 (CV = 16,33 %), jika volume persis seperti dinyatakan. 24 jumlah koloni yang diamati mempunyai suatu rata-rata m = 379,29 dan varian s2 = 4 586,54. Sesuai dengan persamaan (11), u2 = (4586,54 - 379,29)/379,292 = 0,0292. Karenanya, pada koefisien penyebaran yang berlebihan u = 0,029 2 = 0,1710 adalah dosis yang cukup untuk nilai yang diharapkan, mempertimbangkan bahwa itu hal ini juga meliputi hitungan dan ketidakpastian volume yang diabaikan didalam yang diharapkan u = 0,1633 (Seluruh 8 ml, 10 ml dan 12 ml ukuran yang dipercaya tepat.) Penilaian ketidakpastian yang dihitung diatas yang tidak secara umum sah, karena didasarkan hanya pada suatu contoh. Solusi kedua adalah juga didasarkan pada persamaan (5) tetapi mempertimbangkan beberapa contoh uji. Membagi persamaan dengan c menghasilkan

cucsY 21

2

+== (12) Kapanpun penentuan paralel tersedia, penilaian dari varian dan rata-rata dapat dihitung. Menghitung perbandingan dari masing-masing susunan yang menyediakan sejumlah besar pasangan (Y,c). Keserongan (slope) dari garis regresi disesuai dengan titik yang memberikan perkirakan dari u2 . Penyebaran acak tak bisa diacuhkan dan patut dipertimbangkan jika penilaian dari rata-rata serta varian adalah didasarkan pada contoh uji yang sedikit (jumlah yang sedikit dari analisis parelel) (lihat contoh B.7). Keuntungan dari pendekatan ini adalah bahwa penilaian dari penyebaran yang berlebihan pada seleksi jumlah contoh uji yang besar dan berbeda sehingga dapat digunakan dalam skala umum.

csY /2=

CATATAN Alasan di atas terpakai baik ketika mean (m) adalah jumlah koloni (partikel) yang tidak ditransformasi per set deteksidan set-set deteksi tersusun identik dalam semua analisis yang paralel. 6.2.4 Kelebihan pada tingkat detektor Penghitungan secara parallel dari suatu suspensi tunggal mungkin juga variasi lebih dari yang distribusi Poisson perbolehkan. Ini merupakan observasi klasik [16]. Pada level ini yang hanya menjadi kasus penyebab dispersi berlebihan adalah kesalahan pemipetan, penghitungan ketidakpastian dan kesalahan bias (kecelakaan). Dispersi berlebihan adalah suatu alat pengukuran yang handal yang dapat dideteksi dengan dispersi indeks ( )22 ,GX (lihat contoh B.6 dalam lampiran B). . 6.3 Statistik dan batas praktis 6.3.1 Umum Batas kerja bawah dalam metode mikrobiologi adalah masalah perluasan definisi. Batas atas adalah persyaratan ruang yang menjamin terjadinya interaksi koloni mikroorganisme. Pertikel mikroorganisme tumbuh bermultiplikasi jutaan kali untuk dapat dilihat sebagai suatu koloni dengan mata telanjang.

24 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 6.3.2 Batas bawah Ketika analisa dilakukan satu kali (satu cawan) maka batas bawah statistiknya dapat dinyatakan sebagai batas handal bawah dari penghitungan per cawan. Kehandalan didefinisikan oleh pilihan presisi. Batas bawah sebaiknya dipilih dekat dengan angka 20 koloni per set deteksi. Pada jumlah koloni yang kooefisien variasinya dalam kondisi random acak (Poisson) didapatkan ca 25% (6.1.4). Jika dispersi berlebih diketahui angkanya, penghitungan batas bawah dapat didasarkan pada model binomial negatif (6.2.2) 6.3.3 Batas atas Analisis A/T tidak memiliki batas atas. Seperti pada jumlah kuman dalam peningkatan bagian analisis peluang deteksi keberadaannya mendekati keyakinan. Dengan metode APM, partikel batas atas dapat melebihi ketika semua tabung pengenceran positif. Kesalahan ini tidak menggambarkan batas atas pada metode itu sendiri, hanya kesalahan pengenceran saja. Batas atas tidak dapat dihitung untuk alasan secara statistik karena presisi tidak bergantung pada satu cara langsung yang sederhana dalam jumlah partikel yang dimasukan dalam set deteksi. Ini adalah karakteriswtik prosedur APM yang presisinya dapat ditingkatkan dengan merubah konfigurasi set deteksi. (lihat 6.1). Dengan metode penghitungan koloni, teori ketelitian dapat menunjukan jumlah target koloni yang tetap dalam observasi deteksi. Prakteknya, metode penghitungan koloni mempunyai batas atas per deteksi yang bervariasi sesuai dengan kondisi test. Deteksi penghitungan koloni (cawan agar, membrane filter) menjadi tersumbat sumbatan atau jenuh untuk beberapa alasan, salah satunya adalah jumlah koloni-koloni target adalah hanya satu. Banyak kasus dan sehingga banyak cara untuk memenetukan batas atas. Salah satu kemungkinannya adlah menetukan jumlah koloni per cawan ketika jumlah ketidakpastian (termasuk kesalahan sistematik) meningkat kembali ke level seperti pada batas bawah. [30]. Pertimbangan lain adalah terjadinya pertumbuhan koloni yang sangat padat dan tumpang tindih oleh pertumbuhan non target. Fenomena seperti ini dapat secara kuantitatif diperbaiki dengan metode seleksi atau lebih ilmiah untuk menjelaskan penutupan ini, i.e. bagian ruang yang tersedia yang ditumbuhi oleh koloni. Bahkan kultur murni pun mempunyai batas atas tergantung pada penutupan target pertumbuhan koloni yang tidak sesuai. Beberapa fenomena dapat dilakukan dengan metode kuantitatif secara selektif , atau metode lain yang lebih mendekati, contohnya pemisahan pada koloni tersangka. Biakan murni mempunyai batas atas yanga dapat dipercaya [25]. Aspek ketiga adalah kehilangan proporsinya (tidak linier) yang terjadi pada pertumbuhan yang padat pada cawan. 6.4 Uji umum untuk keacakan deteksi dari penyebaran berlebihan Deviasi dari pengambilan secara acak (presentase kelebihan atau penyebaran yang rendah) dapat dideteksi secara efektif dengan satu dari dua tingkatan terbaik dari uji fit, viz. Indeks dispersi bakteri ( )22 ,DX , atau log-rasio kemungkinan statistic ( ). Perhitungan dari presentase indeks dapat dilihat pada lampiran A.

2G

25 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Dalam hal ini (cawan secara parallel) dimana sebaran berlebihan tidak mempunyai alasan teknis yang dapat diterima, kesesuaian dengan distribusi Poisson dapat digunakan sebagai suatu metode test kinerja analis [16a,33]. Karena kesederhanaannya, karakteristik ini sangat berguna sebagai alat AQC. 7 Spesifikasi Praktek saat ini Salah satu contoh bagaimana prosedur standar yang terbaik menyatakan karakteristik kinerja metode, dapat ditemukan dalam bagaimana Standard Methods for the Analysis of water and Wastewater (Metode Standar Analisa Air dan Air limbah) [8] mengintruksikan para pemakai menggunakan metodenya. Pada bagian yang berbeda dari prosedur membran filter untuk total coliform, para pengguna akan mendapatkan pernyataan yang berkaitan dengan spesifikasi: a) Ruang lingkup

Ruang lingkup metode ini dapat dilihat dari tabel yang merekomendasikan volume contoh uji untuk tipe air yang berbeda. Tabel ini memuat semua jenis air minum, air untuk rekreasi dan juga air limbah.

b) Ketahanan Inkubasi dan sensitivitas-waktu Peraturan utama diberikan sebagai berikut: "Inkubasikan selama 20 jam sampai 22 jam pada (35 0,5)C." Pada bagian lain dari perkecualian dokumen untuk peraturan utama disajikan. Contoh uji air yang didisinfeksi mungkin menyertakan organisma yang ditekan yang tumbuh relatif lambat dan menghasilkan maksimum kilapan dalam 22 jam sampai 24 jam. Mikroorganisme dari sumber-sumber yang tidak terganggu bisa menghasilkan kilap pada 16 jam sampai 18 jam, dan kilapan selanjutnya memudar setelah 24 jam sampai 30 jam.

c) Batas kerja yang dapat dipercaya Batas kerja yang dapat dipercaya dapat diduga dari : "Menghitung jumlah, menggunakan membran filter dengan 20 sampai 80 koloni...". Ini diikuti dengan reservasi lebih lanjut sehingga menghubungkan batas kerja dengan selektivitas: "...dan lebih daripada 200 koloni dari semua jenis setiap membran. "Beberapa alasan untuk hal tersebut ditemukan pada bagian lain dari dokumen itu: "Ukuran contoh uji akan ditentukan oleh kepadatan bakteri yang diharapkan, yang mana dalam contoh uji air minum akan dibatasi hanya dengan tingkat kekeruhan atau dengan tingkat pertumbuhan noncoliform pada media".

d) Identifikasi dan definisi Target

Semua bakteri yang menghasilkan sebuah koloni merah dengan suatu kemilau metalik di dalam 24 jam inkubasi pada 35C pada suatu media jenis Endo dianggap anggota-anggota dari kelompok coliform. Kemilau mungkin mencakup keseluruhan koloni atau mungkin nampak hanya dalam suatu area tengah atau pada keliling/batas luar." Ada pertimbangan lebih lanjut: "Media jenis Endo adakalanya mungkin menghasilkan koloni tidak normal berwarna merah gelap tanpa suatu kemilau metalik. Verifikasi dari berbagai jenis koloni khusus (kemilau) dan tidak normal (tidak-kemilau) akan mendeteksi false negative dan memberikan pengalaman dalam pengenalan koloni."

26 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 e) Keterbatasan dan spesifikasi lain

Dokumen standar juga menawarkan rekomendasi dan membuat usulan pentgingnya kontrol kualitas media dan peralatan analisis.

8 Spesifikasi Pendekatan yang direkomendasikan Secara umum, standar saat ini menyediakan sedikit bantuan untuk laboratorium yang menyakinkan bahwa mereka menerapkan metode yang baik dan memperoleh hasil yang valid. Apa yang nampaknya kekurangan adalah suatu presentasi ringkas dari apa yang laboratorium perlu lakukan untuk memverifikasi bahwa metode itu juga bekerja dengan baik di tangan mereka serta bagaimana cara untuk mengenali kinerja yang baik dari pencapaian yang tidak baik. Suatu bagian dari spesifikasi harus ditambahkan pada semua standar yang tertulis. Format untuk metode penghitungan jumlah koloni mungkin sebaiknya mencakup hal berikut:

a) Sensitivitas: dengan sedikit pengecualian (kasus menyebutkan) lebih dari 90% dari yang positif ditetapkan dari uji presumptif.

b) Selektivitas: pada umumnya lebih baik dari pada 1 (lihat definisi selektivitas). Hasil tidak valid jika selektivitas kurang dari 2.

c) Penghitungan ketidakpastian: simpangan baku relatif dari penghitungan duplo (ulangan) hitungan di dalam sebuah laboratorium pada umumnya kurang dari uZ = 0,05. Penghitungan ketidakpastian individual (satu orang) secara normal di bawah uZ= 0,03.

d) Penghitungan cawan paralel : Variasi ada di dalam distribusi Poisson. (Jika tidak, tingkat penyebaran yang berlebihan harus diberikan.)

e) Variasi intra-contoh uji mempunyai suatu koefisien ketidakpastian dengan penambahan kurang dari uX = 0,10 pada contoh uji air. Pada contoh uji benda padat, ketidakpastian yang ditambahkan harus tetap di bawah 0,15.

f) Proporsionalitas (linearitas) detektor tergantung pada selektivitas. Hal Itu cukup dengan batasan jumlah koloni yang diberikan di bawah ini:

Selektivitas Batas atas linearitas

(koloni target per cawan) 0 500 (kultur murni)

-0,5 sampai -1 200 sampai 100 -1 sampai -2 100 sampai 25 Dibawah -2 Hanya pendeteksian A/T

Dengan pertumbuhan koloni yang berlebihan, batas atas fungsional mungkin dicapai lebih cepat. Tanpa tergantung dari nilai selektivitas, jumlah tidak valid jika lebih dari 1/3 ruang yang tersedia ditempati oleh pertumbuhan (target dan non-target). Hal di atas hanyalah satu contoh bagaimana spesifikasi yang nyata dari kinerja metode ditampilkan. Spesifikasi seperti itu dapat diuji dengan rancangan yang sesuai. Nilai numerik diberikan sebagai ilustrasi. Nilai tersebut tidak untuk dipahami sebagai nilai baku sekarang ini.

27 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Jika informasi antara temubalik relatif dibandingkan dengan suatu acuan baku tersedia, hal itu juga harus diberikan. Jika data reproduksibilitas dari uji kinerja metode kolaboratif tersedia, maka harus ditambahkan sebagai informasi lebih lanjut. Sebagai tambahan, syarat pengujian, gambaran target dan tempat penyimpanan contoh uji harus ditetapkan. 9 Penentuan dan ekspresi dari karakteristik kinerja 9.1 Umum Karakteristik kinerja berdasar pada frekuensi dari jenis kategori kualitatif disebut secara katagoris pada pembahasan berikut ini. Dalam hubungannya dengan metode selektif, karakteristik kinerja ditentukan dengan verifikasi presumptif baik pada kultur yang positif maupun yang negatif. 9.2 Karakteristik Kategori yang berhubungan dengan kekhususan dan selektivitas 9.2.1 Umum Tinjauan kualitatif yang paling komprehensif dari kinerja metode didapat dengan mempelajari contoh uji alami. Contoh uji tersebut sebaiknya mencakup ruang lingkup yang lengkap dari metode, termasuk contoh uji yang berbeda, keadaan terkontaminasi dan musim yang berbeda. Suatu koloni atau suatu plak setara dengan satu uji A/T atau satu tabung dalam satu seri APM. Di dalam validasi primer kedua, kultur presumptif baik yang positif maupun yang negatif harus diverifikasi. Cara yang paling hemat biaya dan yang menarik secara biologis dari pengujian metode kultur cair (keduanya baik A/T dan APM) adalah menggunakan desain APM. Tabung-tabung dalam pengenceran yang memberikan hasil positif maupun negatif diseleksi untuk proses verifikasi. Tabung-tabung tersebut adalah pengenceran dimana tabung positif dihasilkan dari pertumbuhan satu sel atau sel yang sangat sedikit. Karakteristik kinerja yang berhubungan dengan selektivitas dan kekhususan bisa didefinisikan secara numerik (17). Karakteristik kinerja berhubungan dengan proporsi relatif dari koloni atau tabung yang diasumsikan positif atau negatif atas dasar pengaruh pertama (presumptif) yang kemudian dibandingkan dengan 'kebenaran" setelah verifikasi. Setelah uji verifikasi n dibuat, hasilnya dibagi ke dalam empat kategori: a) Jumlah positif presumptif ditemukan positif (positif sebenarnya);

b) Jumlah negatif presumptif ditemukan positif (negatif palsu);

c) Jumlah positif presumptif ditemukan negatif (positif palsu);

d) Jumlah negatif presumptif ditemukan negatif (negatif sebenarnya).

28 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 Frekuensi ini dapat dinyatakan dalam tabel 2 x 2:

Penghitungan Presumptif + -

+ a b a + b Perhitungan yang dikonfirmasi - c d c + d

a + c b + d n Karakteristik kinerja yang dihitung dari pengamatan ini ditetapkan sebagai berikut: 1. Sensitivitas = a/(a + b), bagian dari total positif yang ditetapkan dengan benar pada

penghitungan presumptif;

2. Kekhususan = d/(c + b), bagian dari total negatif yang ditetapkan dengan benar pada penghitungan presumptif;

3. Tingkat positif yang salah = c/(a + c), bagian dari positif yang diamati yang ditetapkan dengan salah;

4. Tingkat negatif yang salah = b/(b + d), bagian dari negatif yang diamati yang ditetapkan dengan salah;

Jumlah total uji adalah a + b + c + d = n.

5. Efisiensi E adalah suatu parameter tunggal umum, yang memberikan bagian dari koloni atau tabung yang ditetapkan dengan benar:

E = (a + d)/n.

Koloni tersebut harus diambil secara acak dari semua koloni (target dan non-target) yang dianggap sebagai suatu keseluruhan. Dengan kultur cair, semua positif dan negatif mungkin diuji pada proporsi aktualnya. Sehubungan dengan pengaruh yang kuat dari operator dan populasi mikroorganisme, tidak suatu pun dari karakteristik kinerja yang dirinci di atas dapat mempunyai suatu nilai tetap metode-spesifik. Validasi kedua hanya perlu memperhatikan hasil positif yang salah (false positif), kecuali jika tingkat sensitivitaslebih rendah dibandingkan dengan yang dispesifikasikan dan terjadi berulang. 9.2.2 Selektivitas Selektivitas dari suatu metode mikrobiologi ditetapkan dalam Laporan Teknis ini sebagai logaritma dari bagian koloni target presumptif (positif presumptif) terhadap total: ( )[ ]ncaF /lg += Selektivitas dapat menjadi rendah dalam beberapa jenis contoh uji atau selama musim tertentu sehingga suatu penghitungan target y ang dapat dipercaya tidak dapat diperoleh. Selektivitas sangat mempengaruhi rentang kerja atas.

29 dari 56

BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011

Selektivitas "presumptif" yang ditentukan di atas merupakan suatu alat yang diseleksi demi kenyamanan. Jika sumber-sumber daya tersedia, selektivitas riil yang didasarkan pada penghitungan yang diverifikasi dari positif yang benar, secara ilmiah lebih baik. Batasan ekonomis mungkin membatasi penggunaannya untuk perbandingan akhir diantara metode. Selektivitas yang nyata bervariasi sekali karena pengaruh musiman dan penyebab lain yang merubah kelimpahan relatif dari target dan latar belakang populasi . Ini bukan suatu konstan metode-spesifik. Meskipun demikian, selektivitas memberikan informasi tentang kinerja metode dan mungkin membantu memilih diantara alternatif. Berbagai macam kasus sebaiknya dipelajari. Karena tidak tersedia kriteria keputusan, tidak ada dasar untuk memutuskan jumlah spesifik yang cukup. Sebaiknya dikumpulkan cukup data untuk menyakinkannya. 9.3 Batas kerja 9.3.1 Batas bawah untuk pendeteksian dan penentuan Batas kerja bawah merupakan suatu persoalan definisi dalam semua metode (lihat ketentuan 6). Nilainya, batas harus dinyatakan sebagai jumlah cukup untuk koloni atau partikel yang paling rendah pada setiap rangkaian pendeteksian atau cawan paralel. 9.3.2 Batas atas Setiap metode, sebenarnya setiap individual analisis/penentuan, mempunyai suatu batas atas yang dapat dipercaya. Ini bukan angka tetap yang jelas, tetapi agak berada di daerah kabur dari jumlah koloni ketika jumlah penghitungan per cawan menjadi terlalu tidak meyakinkan untuk suatu penentuan yang valid. Batas kerja atas dari suatu detektor koloni disyaratkan sebagai berikut. a) Penyebaran berlebihan dari jumlah koloni paralel mungkin menjadi lebih nyata dan

lebih sering. Situasi itu dapat dikenal dengan pertolongan dari indeks penyebaran Poisson (Contoh B.3).

b) Jumlah koloni dari pengenceran yang berbeda (volume) tidak cocok. Proporsionalitas

(linearitas) hilang. Proporsionalitas dapat diuji dengan metode yang didasarkan pada indeks G2 (lampiran A, dan contoh B.4).

Uji proporsionalitas (linearitas) lebih efektif dari keduanya. Kedua fitur dapat diselidiki dengan penggunaan suatu uji proporsionalitas tunggal yang dirancang secara khusus (lampiran C) [27, 33] atau dengan mengumpulkan data pada elemen-elemen di atas dari uji terpisah. 9.4 Rentang Kerja dari Prosedur APM Batas praktis atas dan bawah dari prosedur APM merupakan kasus ekstrem ketika hanya satu tabung dalam set pendeteksian yang positif atau negatif. Oleh karena itu rentang aplikasi yang nyata dari suatu set pendeteksian 3 x 5 adalah 0,2 sampai 160 partikel per volume unit (bagian analitis) dari seri pertama (paling sedikit diencerkan), tanpa tergantung dengan media nutrien atau populasi target.

30 dari 56 BSN 2010

Ha k C

i p t a Ba d a n S

t a n d a r d i s a s i Na s i o n a l , C

o p y s t a n d a r i n i d i b u a t u n t u k p e n a y a n g a n d i we b s i t e d a n t i d a k u n t u k d i k o m

e r s i a l k a n

SNI ISO/TR 13843:2011 9.5 Presisi 9.5.1 Umum Setiap pengukuran analitis sebaiknya disertai dengan suatu perkiraan presisi, meskipun tidak mungkin untuk menentukan secara eksperimen presisi dari setiap penentuan individual. Oleh karena itu, ada kepentingan yang sungguh-sungguh dalam mendapatkan pernyataan presisi valid yang umum untuk metode yang berbeda. Idealnya, validasi primer sebaiknya memberikan suatu p