미생물학 실습 시 실험실내 주의사항

미생물학 실습은 병원균을 직접 다루는 실험이므로 사고 발생시 여러분 자신은 물론 주변 동료에게도 위험이 미칠 수 있다는 사실을 명심하여 안전문제와 실습관리에 각별히 주의해 주시기 바랍니다 .

1. 실습실내에서는 책을 보기 위한 테이블과 실험을 위한 테이블 ( 세이프 매트 ) 을 구분하여 사용하십시오 . 다른 용도로 사용하지 않기 바랍니다 . 실험실의 창문은 반드시 닫아 두시기 바랍니다 .

2. 실험실내에서는 반드시 실험가운을 착용하여야 하며 가방이나 옷가지 등 실험에 불필요한 물품들은 실습실 캐비닛에 보관하십시오 . 가운의 단추를 풀어 헤치는 일이 없도록 합시다 .

3. 현미경 운반 시는 오른손으로 손잡이를 잡고 왼손으로 받침대를 받쳐서 감싸 안 듯이 하여 운반하시기 바랍니다 . 절대로 한 손으로 운반하는 일이 없도록 합시다 . 현미경에 유침유 (immersion oil) 를 사용한 후 (1,000 배 배율 검경시 ) 반드시 lens paper 를 사용하여 렌즈를 가볍게 누르면서 닦아주시기 바랍니다 . Lenz paper 이외의 다른 종이를 사용하거나 문질러서 닦는 일이 절대 없도록 합시다 .

4. 각 방에 배당된 cart 의 사용수칙은 다음과 같습니다 .

4-1. Cart 의 윗칸에 놓아두어야 하는 물건 :실험에 사용할 균주 , 각종 배지 및 시약 , 실험하고 남은 시약 , 피펫 , 스포이드 , bulb 등의 각종 실험기구 , 크레졸통 , lens paper 및 immersion oil, 슬라이드 글래스

4-2.Cart 의 아랫 칸에 놓아 두어야 하는 물건 : 실험에 사용하고 남은 균주 , 균을 배양하여 판독이 끝난 배지

5. Cart 의 크레졸 통에 실험에사용한 유리제품 (ex. 피펫 , 슬라이드 글래스 ) 과 면봉을 넣어 주십시오 . 기타 다른 기구 (ex. loop) 를 넣는 일이 없도록 합시다 .

6. Loop 는 반환하지 말고 실습방별로 cart 위 보관통에 보관하여 사용한 후 실습 마지막 날 일괄적으로 반환해 주시기 바랍니다 .

7. 실험에 사용할 plate 나 배양중인 plate, 실험이 다 끝난 plate 는 뚜껑이 아래로 향하도록 놓으시기 바랍니다 . Plate 나 tube 에 표시를 할 때는 name pen 만을 사용하시기 바랍니다 . 다른 필기구나 white 등은 사용하는 일이 없도록 합시다 .

8. 균을 흘렸을 경우 곧바로 조교선생님께 알려서 크레졸을 부어 소독이 되도록 하고 다른 안전사고 발생시에도 조교선생님께 즉시 알려서 필요한 조치를 취해 주시기 바랍니다 .

9. 알코올 램프는 불을 켠 채 이동을 금지하며 메탄올은 조교선생님을 통해 채우도록 하기 바랍니다 .

10. 실습 후 매일 청소당번을 정하여 청소를 해 주시기 바랍니다 .

서울대학교 의과대학 미생물학교실

염 색

1. 단 염색2. 그람 염색3. 항산성 염색

10 월 18 일 목요일

실습 재료 ( 개인실험개인실험 )

실습 균주 : Nutrient agar slant 에 준비됨

1. Bacillus subtilis

2. Escherichia coli 3. Mycobacterium abscessus

4. Staphylococcus aureus

Staining solution Lens paper

Alcohol lamp Slide glass

Corne forceps Immersion oil

1.단염색 (Simple staining) – B. subtilis, E. coli, S. aureus

원리

강염기인 methylene blue 를 사용하여 세균의 모양과 배열을 관찰할 수 있다 . : 세균의 세포에는 (-) charge 를 띤 nucleic acid 가

풍부 하므로 (+) charge 를 띤 basic dye 가 binding 하는

원리 .

우선 slide glass 를 불에 달군 후 빨간 색연필로 경계선을 그어준다 .

백금이로 물을 한방울씩 떨어뜨린다 .

단염색 과정

백금이가 ,빨갛게 될때까지위아래로 달군다

도말 도말 (Smear(Smear)

B. subtilis, E. coli, S. aureus

도말 도말 (Smear(Smear)

도말 표본을 공기 중에서 건조 (Drying)

단염색 과정 계속

고정 (Fixation)

불꽃 위로 2-3회 통과

단염색 과정 계속

염색 염색 (Staining)(Staining)

Methylene Blue

1분간 염색

단염색 과정 계속

수세 (Rinsing)

건조여지를 이용하여 물기를 흡입 제거주의 : 여지를 슬라이드 위에서 비비지 말 것

물이 직접 도말면에 닿지 않도록 뒷면에서 물을 흘린다

단염색 과정 계속

검경 (Microscopic observation): X 1000

유침유 (immersion oil)

단염색 과정 계속

<<E. coliE. coli>> <<B. subtilisB. subtilis>> <<S. aureusS. aureus>>

그람 염색은

세균의 중요한 분류 기준이 된다 .

Gram positive : primary stain(crystal violet) 을 유지

진청색 or 보라색 Gram negative : 탈색과정에 의해 primary stain 을 소실 counter stain(safranin) 에 의해 염색됨

적색 or 핑크색

Gram positive 세균은 cell 주위에 두껍고 , cross-linked, meshlike structure 를 가진 peptidoglycan layer 가 둘러싸고 있어 탈색되지 않고 crystal violet 을 유지하는 반면 , Gram negative 세균은 peptidoglycan layer 가 얇으므로 탈색제인 유기용매에 의해 crystal violet 상실 .

2. 그람염색 (Gram staining) ; E. coli, S. aureus, B. subtilis

그람 양성 균과 음성 균의 세포벽 구성의 차이

균 도말 , 건조 , 고정 ( 단염색과 동일 )

Crystal violet 으로 1 분간 염색 후 물로 세척

Gram’s iodine 으로 1 분간 처리 후

95% 에탄올로 15~20초 동안 탈색한다 .

물로 세척 후 Safranin 으로 20초 동안 대조염색한다 .

물로 세척 , 건조 , 검경 ( x 1000).

그람 염색 과정

<<E. coliE. coli>> <<B. subtilisB. subtilis>> <<S. aureusS. aureus>>

3. 항산성 염색 (Acid-fast staining)

- M. abscessus, S. aureus, E. coli -

50~90 개의 carbon 으로 구성된 Long-chain fatty acid (mycolic acid) 를 가지고 있는 세균들은 cell wall 이 lipid 가 풍부하여 hydrophobic 하고 염색약이 통과할 수 없다 .

Staining 과정 초기에 열을 가하여 일단 primary dye 가 들어간 후에는 acid-alcohol 로 처리해도 탈색되지 않는다 . 항산성 세균은 carbol fuchsin 에 의해 red 로 염색되고 Cellular background 나 다른 세균들은 blue 로 염색된다 .항산성이 있는 세균속에는 Mycobacterium, Nocardia 등이 있다 .

항산성 염색 원리

Carbol fuchsin 을 올려놓고 나무 집게로 slide glass 를 집어서 알콜램프 위에서 가열하여 증기가 오르면 빼낸다 . (끓지 않게 주의 ) 염색약을 보충하고 가열하는 것을

반복하며 이를 5 분간 지속한다 .

Acid alcohol 로 15~20초 동안 세척한다 .

물로 세척하여 acid alcohol 의 작용 중지시킨 후 methylene blue 로 20초 동안 대조염색한다 .

물로 세척 , 건조 , 검경 ( x 1000).

균 도말 , 건조 , 고정 ( 단염색과 동일 )

항산성 염색 과정

* 주의사항

염색과정 중 가열을 오래 해야 하므로 빨간색연필로 경계선을 그어서는

안되며 , 유리가 뜨거우므로 조심해야 한다 .

항산성 염색 과정 계속

<<M. M. abscessusabscessus>>

항산성 염색 결과