医学遗传学实验

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整体实验安排实验一 人类外周血染色体标本制备

实验二 人类染色体Ｇ带标本制备及观察

实验三 遗传病基因突变分析 （ SSCP ）

实验四 进行性肌营养不良症（ DMD ）基因检

测

实验五 人类染色体核型分析

1. 人类外周血染色体标本制备

2. 聚合酶链反应（ polymerase chain

reaction ， PCR ）加样（实验三 ）

第一次 实验内容

1. 人类外周血染色体标本制备 (P3)

两人一组，做一份血 !!!● 实验目的： 初步掌握人类 染色体标本培

养制备的基本方法

● 实验原理：

正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在 G1 期或 G0 期，外周血细胞中是没有分裂相的。

1960 年， Nowell 和 Moorhead 证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素 (phytohaemagglutinin, PHA) 和其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。

Moorhead P S, Nowell P C, Mellman W J, Battips DMA Hungerford D A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp. Cell Res. 20:613-16, 1960

秋水仙素处理

低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。

● 实验准备

实验材料：人外周血 ( 淋巴细胞 ) 实验器具：离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、 培养瓶、离心管、注射器和针头（ 61/2 号）、吸管、量筒、火材、洒精灯、载玻片、染缸、试管架、玻璃铅笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。 药品和试剂：

采血

培养 (37℃0.5 ,72h ℃ ）

秋水仙素处理（终止培养前２ - ３ h ）

离心 (1000rpm, 10min)

低渗处理

预固定 , 离心

再固定 , 再离心

再固定 , 再离心

再固定 , 再离心

制片

● 实验步骤

制片方法（冷片）

每组制 3-4 片

2. PCR 加样

实验三 遗传病基因突变分析内容

双蒸水10*Buffer

MgCl2

dNTPs （ ATP/CTP/GTP/TTP ） Primer （引物 ） R + F

DNA 模板 Taq-DNA 聚合酶 石蜡油

PCR组分

聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ， PCR ）是一种体外由引物介导的特定 DNA 序列的扩增方法 .

变性： 95 ,1min℃

退火：温度和引物有关

延伸 ： 时间和待扩 增产 物长度有关 72 for Taq℃

Step 1 94C 5 分钟

Step 2 94C 30 秒 59C 30 秒 72C 30 秒

Step 3 72C 5 分钟

循环参数设置

30 cycles

双蒸水 18.5 l

10*Buffer 2.5 l

MgCl2 2 l

dNTPs 0.5 l

Primer R + F 0.7 l

DNA 模板 0.5 l （正常人 or 病人） Taq-DNA 聚合酶 0.3 l

石蜡油 1 滴

两人一组，做一份 PCR ，样品加入0.2ml 的薄壁离心管中