仪器分析仪器分析第三讲

主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时： 32 　

第 十 章第 十 章 紫外 紫外 -- 可见分光光度法可见分光光度法

第一节 紫外第一节 紫外 -- 可见分光光度法的可见分光光度法的

基本原理和概念基本原理和概念

第二节 紫外第二节 紫外 -- 可见分光光度计可见分光光度计

第三节 紫外第三节 紫外 -- 可见分光光度分析方法可见分光光度分析方法

第一节 第一节 紫外 - 可见分光光度的基本原理和概念的基本原理和概念

一、紫外 - 可见吸收光谱的产生——电子跃迁类型

二、相关的基本概念

三、吸收带类型及其与分子结构的关系

四、影响吸收带的因素

五、 Lamber-Beer’s 定律

一、紫外一、紫外 -- 可见吸收光谱的产生可见吸收光谱的产生11 ．分子吸收光谱的产生．分子吸收光谱的产生————分子中的价电子在不同分子轨道（能级）间的跃迁引起分子中的价电子在不同分子轨道（能级）间的跃迁引起

能级：电子能级、振动能级、转动能级能级：电子能级、振动能级、转动能级 跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程

若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到转变为电信号并记录下来，就可得到光强光强度变化对波长度变化对波长的关系曲线，即为的关系曲线，即为分子吸收光谱分子吸收光谱

转振电分 EEEE

c

hhE 能级差

22 ．分子吸收光谱的分类．分子吸收光谱的分类 分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序 分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序

转振电 EEE

远红外吸收光谱

红外吸收光谱

可见吸收光谱紫外

转

振

电

mevE

mevE

mevE

25~25005.0~005.0

25.1~251~05.0

25.1~06.020~1

3 ．紫外 - 可见吸收光谱的产生

由于分子吸收紫外由于分子吸收紫外 -- 可见光区的电磁辐射，分子可见光区的电磁辐射，分子中中

价电子（或外层电子）在不同的分子轨道之间价电子（或外层电子）在不同的分子轨道之间（能级）跃迁而产生。（能级）跃迁而产生。

电子能级的能量差 ΔEe 假如是 5eV，可计算出：

λ= hc/ΔE = 6.624×10-34×2.998×108/5×1.6×10-

19

= 2.48×10-7m=248nm

电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区(200-780nm)，称紫外—可见光谱 . 紫外 -可见光谱属于电子跃迁光谱。

电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带 .

4. 4. 紫外紫外 -- 可见吸收光谱的电子跃迁类型可见吸收光谱的电子跃迁类型

C O

H

n

H

分子中的价电子包括

σ 电子 → 形成单键

π 电子 形成双键

n 电子 非成键的

轨道：电子围绕原子或分子运动的几率；

轨道不同，电子所具有能量不同。

外层电子吸收辐射后，就从基态向激发态 ( 反键轨道 ) 跃迁。主要有四种跃迁所需能量 ΔΕ 大小顺序为：： n→π ＊ < π→π ＊ ≈ n→σ ＊ < σ→σ ＊

1.σ→σ ＊跃迁

所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。 饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区 ( 吸收波长 λ<150nm，只能被真空紫外分

光光度计检测到 )。如甲烷的 λ 为

125nm,乙烷 λmax 为 135nm。

电子跃迁类型电子跃迁类型

吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区（ 200nm左右），摩尔吸光系数

ε 一般在 104 L·mol － 1·cm － 1 以上，属于强吸收。

不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如：乙烯 π→π* 跃迁的 λ为165 nm ， ε 为 :1×104 L· mol-1·cm － 1 。

2. π→ π* 跃迁

3. n →π ＊跃迁 需能量最低，吸收波长 λ>200nm。吸收

谱带强度较弱。 ε :10 ～ 100之间 分子中孤对电子和π键同时存在时发生n→π ＊ 跃迁。＝ C ＝ O,=C=S,-N=N-

丙酮 n →π ＊跃迁的 λ 为 279nm 。

吸收波长为 200nm左右，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到 .

含非键电子的饱和烃衍生物 ( 含 N ， O， S

和卤素等杂原子 ) 均呈现 n →σ* 跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺， n →σ* 跃迁的 λ 分别为 173nm、 183nm和 227nm 。5. 电荷迁移跃迁6. 配位场跃迁

4. n→σ ＊跃迁

注：注： 紫外光谱电子跃迁类型： n—π* 跃迁

π—π* 跃迁 饱和化合物无紫外吸收 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系• 根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；• 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 →推测分子中

可能存在的基团（分子结构鉴定）

二、相关的基本概念二、相关的基本概念

1 ．吸收光谱（吸收曲线）

是以波长是以波长（（ nmnm ）为横坐标，吸光度）为横坐标，吸光度 AA （或（或

透光率透光率 TT ）为纵坐标所描绘的曲线。不同波）为纵坐标所描绘的曲线。不同波

长光对样品作用不同，吸收强度不同长光对样品作用不同，吸收强度不同 ..

400 480 560 640 720400 480 560 640 720

λλ ／／ nmnm

KMnOKMnO44 溶液光吸收曲线溶液光吸收曲线

2.0

1.6

A 1.2

0.8

0.4

525nm525nm

250 300 350 400 450250 300 350 400 450

λ / nmλ / nm

KK22CrCr22OO77 溶液的光吸收曲线溶液的光吸收曲线

2.02.0

1.61.6

A 1.2A 1.2

0.80.8

0.40.4

不同物质光吸收不同物质光吸收曲线曲线的形状是不同的的形状是不同的

吸收光谱的形状吸收光谱的形状与物质分子的结构有与物质分子的结构有关关

同一种物质对不同波长光的吸光度不同。

不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似 λmax 不变。

不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在 λmax 处吸光度 A

的差异最大。

看到：

物质的物质的 λmax 与其结构有关与其结构有关 ,,与与浓度无关浓度无关

2 ．吸收光谱特征 定性依据

吸收峰→ λmax

谷→ λmin

肩峰→ λsh

末端吸收→饱和

σ-σ 跃迁产生

3 ．生色团（发色团） 能吸收紫外 - 可见光的基团 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基 具 n 电子和 π 电子的基团。 产生 n→ π* 跃迁和 π→ π* 跃迁。 例： C ＝ C ； C ＝ O ； C ＝ N ；— N ＝N—

4 ．助色团 本身无紫外吸收，但可以使生色团或饱和烃吸收峰加强，同时使吸收峰长移的基团。

有机物：连有杂原子的饱和基团 例：— OH ， — NH2，— X, —OR，— SH ，

5 ．红移和蓝移 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基） 或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫

红移（长移） 吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）

6 ．增色效应和减色效应 增色效应：吸收强度增强的效应 减色效应：吸收强度减小的效应7 ．强带和弱带

εmax>104 → 强带 εmin<102 → 弱带

仪器分析仪器分析第四讲

主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时： 32 　

三、吸收带类型及其与分子结构的关系三、吸收带类型及其与分子结构的关系1 ． R 带：由含杂原子的不饱和基团的 n →π* 跃迁产生 C ＝ O ； C ＝ N ；— N ＝N—

• E 小， λmax250~400nm， εmax<100

• 溶剂极性↑， λmax↓ → 蓝移（短移）

2 ． K 带：由共轭双键的 π→ π* 跃迁产生 (—CH＝ CH—)n，— CH＝ C—CO—

• λmax >200nm， εmax>104

• 共轭体系增长， λmax↑→ 红移， εmax↑

3 ． B 带：芳香族化合物的主要特征吸收带 • λmax =230～ 270nm ，宽带；

• εmax=200

44 ． E 带：由苯环环形共轭系统的 π→ π* 跃迁产生 芳香族化合物的特征吸收带 • E1 180nm εmax>104 （常观察不到）

• E2 200nm εmax=7000 强吸收

• 苯环有发色团取代且与苯环共轭时， E2 带与 K 带

（ π→ π* ）合并， 一起红移（长移）

苯的 B 带吸收光谱

C

C H 3

On→;R 带

→;K 带

5. 电荷转移吸收带 指的是许多无机物 ( 如碱金属卤化物 ) 和某些有机物混合而得的分子配台物．在外来辐射激发下强烈地吸收紫外光或可见光，从而获得的可见或紫外吸收带 .

6. 配位体场吸收带 指的是过渡金属水合离子与显色剂 ( 通常是有机化合物 ) 所形成的配合物，吸收适当波长的可见光 ( 或紫外光 ) 从而获得的吸收带 .

四 . 影响吸收带的因素

1 ．位阻影响

CC

HH

max280nm顺式二苯乙烯不易形成共轭

max295.5nm反式二苯乙烯易形成共轭

2 ．跨环效应 n-π* 跃迁 R 带红移

3 ．溶剂效应 影响峰位置、强度、 ----- 光谱形状

对 λmax 影响：

n-π* 跃迁：溶剂极性↑， λmax↓蓝移

π-π* 跃迁：溶剂极性↑ ， λmax↑红移

对吸收光谱精细结构影响

溶剂极性↑，苯环精细结构消失

溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长 < λmax

*

*

*由于极性 ，所以，在由极性小到极性大的溶剂中，能量下降的顺序为

极性小 n

n极性大pEnE

*

*

红移np EE

pEnE

*

紫移np EE

极性大 极性小

溶剂极性大小

n-π* 中，基态极性大 n 电子与溶剂之间能形成氢键，使基态能量下降的大。

溶 剂溶 剂

*

*n

正己烷 CHCl3 CH3OH H2O

230 238 237 247

329 315 309 305

4 ． pH值的影响 影响物质存在型态，影响吸收波长

如酚类化合物由于体系的 pH 不同，其离

解情况不同，而产生不同的吸收光谱。

210.5,270nm 235,287nm

五、 五、 Lamber-Beer 定律

(( 一一 ) Lamber-Beer) Lamber-Beer 定律 定律

(( 二二 ) ) 吸光系数吸光系数

（一） （一） Lamber-BeerLamber-Beer 定律：定律：吸收光谱法基本定律

n

l

S

I

I

吸光质点数为

厚度为

物体截面为

透过光强为

入射光强为 0

描述物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和厚度间的关系的定律。

推到：假设一束平行单色光通过一个吸光物体

CABeer

lALamber

定律：

定律：1760年

1852年

取物体中一极薄层

x

x

dIS

dnk

S

dS

dnkdS

dn

I

透过薄层减弱的光强为

几率光子通过薄层被吸收的

不让光子通过的面积为

薄层的吸光质点数为

设入射光强为

S

dnk

I

dI

x

x

S

nE

I

I

S

nk

I

I

00

lgln

ClS

nCVn

l

VS 和由 -lgT＝ Ecl

0I

IT 透过率

Lambert-Beer 定律的数学表达式 A— 吸光度 E－吸光系数C－溶液浓度 l－比色皿厚度

吸收定律表明，当用一束平行波长的单色光垂直照射均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与溶液的浓度和厚度的乘积成正比 , 这是定量分析的理论基础。

-lgT＝ A＝ ECl

入射光 I0 透射光 It

透光率0I

IT t

T 取值为 0.0 % ~ 100.0 %

全部吸收 T = 0.0 %

全部透射 T = 100.0 %

T ↗ ，溶液对光的吸收 A ↘ ；

T ↘ ，溶液对光的吸收 A↗ 。

吸光度 A= lg1/T = lg Io/It = -lgT＝ Ecl

T与 C 间不是直线关系，不能用于定量分析

A 、 T 、 C 三者之间的关系 :

讨论：讨论：

Lamber-BeerLamber-Beer 定律的适用条件（前提）定律的适用条件（前提） 入射光为平行单色光入射光为平行单色光 ,, 垂直照射垂直照射 ..

溶液是稀溶液溶液是稀溶液 ( C<0.01 ( C<0.01 mol/L mol/L ))

在同一波长下，各组分吸光度具有加和性在同一波长下，各组分吸光度具有加和性 应用：多组分测定应用：多组分测定

cba AAAA总

仪器分析仪器分析第五讲

主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时： 32 　

（二）吸光系数和吸收光谱（二）吸光系数和吸收光谱11 ．吸光系数的物理意义：．吸光系数的物理意义：一定波长下，单位浓度、单位厚度的吸光度一定波长下，单位浓度、单位厚度的吸光度 ..

%1110 cmE

M

lC

A

22 ．吸光系数两种表示法：．吸光系数两种表示法：

11 ））摩尔吸光系数摩尔吸光系数 εε ：： 在一定在一定 λ 下，下， C=1mol/LC=1mol/L，， ll=1cm=1cm 时的吸光度时的吸光度

22 ））百分吸光系数百分吸光系数 / / 比吸光系数比吸光系数：： 在一定在一定 λ 下，下， C=1g/100mlC=1g/100ml，， ll=1cm=1cm 时的吸光度时的吸光度

33 ））两者关系两者关系

1%1cmE

1%1cmE1%1cmE

%11cmE

（ 1 ）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特

征常数； ε=f（ λ） （ 2 ）不随浓度 c 和光程长度 b 的改变而改

变。

在温度和波长等条件一定时， ε 仅与吸收物质

本身的性质有关，与待测物浓度无关；

（ 3 ）可作为定性鉴定的参数；

摩尔吸光系数 ε 的讨论

（ 4 ）同一吸收物质在不同波长下的 ε 值是不同 的。在最大吸收波长 λmax处的摩尔吸光系数，

常以 εmax表示。 εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力。

（ 5 ） εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用

光度法测定该物质的灵敏度越高。（ 6 ）若共存物互相不影响性质，即 ε不变，总

吸光度是共存物吸光度的和。

六、偏离 Beer 定律的因素

依据 Beer 定律， A 与 C 关系应为经过原点的直线。偏离 Beer 定律的主要因素

（一）化学因素（二）光学因素（三）透光率的测量误差

（一）化学因素 Beer 定律适用的另一个前提：稀溶液，浓度过高会使 C 与 A 关系偏离定律。

浓度影响——离解、缔合与溶剂作用， 二聚体吸收峰

酸效应 例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

2CrO42- ＋ 2H ＋ =

Cr2O72- ＋H2O

( 黄色 ) (橙色 )

溶液中 CrO42- 、 Cr2O7

2- 的颜

色不同，吸光性质也不相同 .

故此时溶液 pH 对测定有重要影响。 控制溶液条件，避免偏离现象，减少误差

（二）光学因素1 ．非单色光的影响： Beer 定律应用的重要前提——入射光为单色光

选择较纯单色光 选 λmax 作为测定波长

仪器使用的是连续光源，用单色器分光，由于单色器色散能力的限制和出口狭缝要保持一定的宽度，不可能得到纯的单色光。

22 ．杂散光的影响：．杂散光的影响： 杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染 造成 ; 与所选波长相距较远 . 杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值。

33 ．反射光和散色光的影响：．反射光和散色光的影响： 浑浊溶液浑浊溶液产生产生散射散射 和和 反射反射 ，从而产生“假吸，从而产生“假吸

收”，实测吸光度增大，导致定律的偏离。收”，实测吸光度增大，导致定律的偏离。注：一般可用空白对比校正消除。注：一般可用空白对比校正消除。44 ．非平行光的影响：．非平行光的影响： 使光程↑，使光程↑， A↑A↑ ，吸收光谱变形。，吸收光谱变形。

适宜测量范围7.0~2.0

%20~%65

：

：

A

T测定结果相对误差较小

（三）透光率的测量误差（三）透光率的测量误差———— ΔTΔT

在不同吸光度范围内读数也可引入不同程度的读数误差。这些误差来源于光源不稳、检测器、 显示器和噪音等误差的总和，所以也称之“测量误差”，这些误差最后都反映在读数上，表 现为“读数误差”。

T=0.368; A=0.4343, 测定误差最小

第二节 紫外第二节 紫外 -- 可见分光光度可见分光光度计计

光源 单色器 吸收池 检测系统

记录装置

一、组成部件及其作用

紫外可见分光光度计 （ 195--820nm ）

种类： 钨灯或卤钨灯——可见光源 350~2500nm

氢灯或氘灯——紫外光源 150~400nm

1. 光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度 , 稳定。

氘灯 氢灯 钨灯

/nm

钨灯（热辐射光源）

400 6008001000

氙灯（气体放电光源）

氢灯

强度

3 ．吸收池 (( 比色皿比色皿 )) ：用于盛待测及参比溶液。

玻璃——能吸收 UV 光，仅适用于可见光区 石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（盛样品溶液和空白溶液的比色杯应匹配，

对光的吸收和反射应一致）

比色皿必须与光束方向垂直。

每套比色皿的质料、厚度应

完全相同，以免产生误差。

2. 单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。狭缝、准直镜、色散元件

5 ．记录装置：讯号处理和显示系统

把放大的信号以 A 或 T 的方式显示或记录下来

4 ．检测器：将光信号转变为电信号的装置

光电池、光电管、光电倍增管、二极管阵列检测器

0.575

光源 单色器

吸收池

检测器 显示

（一）（一）基本类型 11 ．单光束分光光度计：．单光束分光光度计：

二、 分光光度计的基本类型

特点：结构简单，操作方便，适用于常规分析。

仪器分析仪器分析第六讲

主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时： 32 　

721 型分光光度计

可见分光光度计

紫外 - 可见分光光度计

22 ．双光束分光光度计．双光束分光光度计

特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差。 消除光源强度变化所引起的误差

经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度 .

3.多光道二极管阵列检测的分光光度计

光源发出的光先通过检光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到栅色散成多色光，射到阵列元件上。阵列式接阵列元件上。阵列式接收器上的光信号用电子收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取学的方法快速扫描提取出来，出来， 1/10ms1/10ms内获得内获得从从 190190～～ 820nm820nm范范围的全光光谱围的全光光谱 。 。

（二）光学性能1.1. 波长范围波长范围2.2. 波长准确度波长准确度3.3. 波长重现性波长重现性4.4. 透光率测量范围透光率测量范围5.5. 吸光度测量范围吸光度测量范围6.6. 光度准确度光度准确度7.7. 光度重复性光度重复性8.8. 分辨率分辨率9.9. 杂散光杂散光

（三）仪器的校正 波长、吸光度的准确度、吸收池的光学性能检查校正波长、吸光度的准确度、吸收池的光学性能检查校正

1.1. 波长校正 ：氢灯（氘灯）发射的原子谱线， 波长校正 ：氢灯（氘灯）发射的原子谱线， 486.13nm486.13nm，，

656.28nm656.28nm

2.2. 吸光度校正：吸光度校正： 0.005mol/L0.005mol/L 的重铬酸钾硫酸溶液。的重铬酸钾硫酸溶液。

3.3. 吸收池的校正：吸收池的校正：

AA 、、 BB 杯分别装入参比溶液和试样溶液，测定二者的杯分别装入参比溶液和试样溶液，测定二者的 AA 值。值。

两个比色杯交换溶液，再测定，两次测定的两个比色杯交换溶液，再测定，两次测定的 AA 差值应小于差值应小于1%1%

第三节 紫外第三节 紫外 -- 可见分光光度分析方法可见分光光度分析方法

一、定性分析一、定性分析

二、定量分析二、定量分析

定性鉴别定性鉴别纯度检查和杂质限量测定 纯度检查和杂质限量测定

单组分的定量方法单组分的定量方法多组分的定量方法多组分的定量方法

一、定性分析

定性鉴别的依据→吸收光谱的特征定性鉴别的依据→吸收光谱的特征 吸收光谱的形状吸收光谱的形状 吸收峰的数目吸收峰的数目 吸收峰的位置（波长）吸收峰的位置（波长） 吸收峰的强度吸收峰的强度 相应的吸光系数相应的吸光系数

相同化合物 相同化合物 × × 吸收光谱相同吸收光谱相同

11 ．对比吸收光谱特征．对比吸收光谱特征数据数据同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较： 吸收峰 谷 所在波长 肩 峰

吸光系数：不同化合物具有相同吸收基团， 但摩尔质量不同，吸光系数不同。

22 ．对比．对比 AA 或吸光系数的或吸光系数的比值比值：： 例：

45.3~15.3550

36188.1~70.1278

361

550361278

12

A

A

A

A

VB

，

三处最大吸收，，

定性鉴别：药典规定

33 ．．对比吸收光谱的一致性 与标准品吸收光谱核对 与文献所载标准图谱核对

二 、 纯度检查二 、 纯度检查

1 ．杂质检查

1 ）峰位不重叠： 找 λ→ 使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量

2 ）峰位重叠： 主成分强吸收，杂质无吸收 / 弱吸收

与纯品比较， E↓ 。 杂质强吸收 >> 主成分吸收→与纯品比较， E↑;

3 ）有吸收的杂质使光谱变形。

2 ．杂质限量的测定： 允许存在的限量

（ 1 ）杂质的吸光度值 例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算 2mg/mL -0.05mol/L的HCL 溶液， λ 310nm下测定 规定 A310≤0.05 即符合要求的杂质限量≤ 0.06%

%06.01002

101.1%

/101.1

100/101.1

1435

05.0

3

3

4

%11

肾上腺酮

mlmg

mlg

lE

AC

cm

（ 2 ）峰 - 谷吸光度比值

纯品碘解磷定： A294 / A262 =3.39

有杂质存在，杂质在 262nm 有吸收，

使 A294 / A262 < 3.39 。

A 峰 / A 谷 最小限定值

三、单组分的定量方法三、单组分的定量方法

11 ．吸光系数法 ．吸光系数法 22 ．标准曲线法 ．标准曲线法 33 ．对照法：外标一点法．对照法：外标一点法

lECA 定量依据：

仪器分析仪器分析第七讲

主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时： 32 　

三、单组分的定量方法三、单组分的定量方法

11 ．吸光系数法 ．吸光系数法 22 ．标准曲线法 ．标准曲线法 33 ．对照法：外标一点法．对照法：外标一点法

lECA 定量依据：

11 ．吸光系数法（绝对法）．吸光系数法（绝对法）

要求单色光前提：

lE

AmLgCi

]100/[

l

ALmolCi

]/[或

%100% 样C

Ci i

例：维生素例：维生素 BB1212 的水溶液在的水溶液在 361nm361nm 处的百分吸光处的百分吸光系数为系数为 207207 ，用，用 1cm1cm 比色池测得某维生素比色池测得某维生素 BB1212 溶溶液的吸光度是液的吸光度是 0.4140.414 ，求该溶液的浓度。，求该溶液的浓度。

解：解：

mLgmLglE

AC /0.20100/002.0

1207

414.0

例：精密称取例：精密称取 BB1212 样品样品 25.0mg25.0mg ，用水溶液配成，用水溶液配成 100ml100ml 。。

精密吸取精密吸取 10.00ml10.00ml ，又置，又置 100ml100ml 容量瓶中，加水至刻容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在度。取此溶液在 1cm1cm 的吸收池中，于的吸收池中，于 361nm361nm 处测定吸处测定吸光度为光度为 0.5070.507 ，求，求 BB1212 的百分含量的百分含量？？

解：解：

mLgmLgCi /1045.2100/1045.21207

507.0 53

mgWB i 50.2410010

10010450.2 5

12 的量

%0.98%1000.25

5.24%100%12

样W

WB i

22 ．校正曲线法．校正曲线法

条件前提：固定仪器和测定CACKA

样样同上条件

固定条件

查得测定样品

曲线分别测定配制标准系列过程：

CA

ACA

~

芦丁含量测定mLmg

mLmLmLmg

250.3

255~0/200.0

样品标样分别移取

0.028mg/mL

3 ．对照法：外标一点法

标样与样品浓度相近

；截距为

固定仪器和测定条件；前提：

0

S

iSi A

ACC

sC

iC

C

λ 一定，分别测定 Ci

Cs 吸光度 Ai 和 As

例：例： 维生素维生素 BB1212 的含量测定的含量测定

精密吸取精密吸取 BB1212 注射液注射液 2.50mL2.50mL ，加水稀释至，加水稀释至 10.00mL10.00mL ；另；另配制对照液，精密称定对照品配制对照液，精密称定对照品 25.00mg25.00mg ，加水稀释至，加水稀释至1000mL1000mL 。在。在 361nm361nm 处，用处，用 1cm1cm 吸收池，分别测定吸光吸收池，分别测定吸光度为度为 0.5080.508 和和 0.5180.518 ，求，求 BB1212 注射液注射液的浓度以及标注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该示量的百分含量（该 BB1212 注射液的标示量为注射液的标示量为 100μg / mL100μg / mL ））

解：解：

mLgCC ii /1.98518.0

508.0

1000

100000.25

10

5.2

%1.98%100%12 标示量

含量 iCB

1 2

A

B

实际测出A

四、多组分的定量方法

cba AAAA总定量依据：

三种情况：1 ．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） 两组分在各自 λmax下不重叠→分别按单组分定量

a

a

aaaa

E

ACCEA

1

111 由

b

b

bbbb

E

ACCEA

2

222 由

bb

aa

AE

AE

222

111

；测定

；测定过程：

22 ．两组分吸收光谱部分重叠．两组分吸收光谱部分重叠 λ1→测 A1→b组分不干扰→可按单组分定量测 Ca

λ2→测 A2→a组分干扰→不能按单组分定量测 Cb

baba

aa

AEE

AE

2222

111

；和测定

；测定过程：

a

a

aaaa

E

ACCEA

1

111 由

bb

aababa CECEAAA

22222由

ba

aba

bE

CEAC

2

22

33 ．两组分吸收光谱完全重叠．两组分吸收光谱完全重叠————混合样品测定混合样品测定

（ 1 ）解线性方程组法（ 2 ）等吸收双波长消去法

（（ 11 ）解线性方程组法）解线性方程组法

baba

baba

AEE

AEE

2222

1111

；和测定

；和测定

bb

aababa CECEAAA

11111

bb

aababa CECEAAA

22222

baba

bbabba

aEEEE

EAEAC

1221

1221

baba

abaaba

bEEEE

EAEAC

1221

2112

（（ 22 ）等吸收双波长法）等吸收双波长法

消除消除 aa 的影响测的影响测 bb

baba

baba

AAA

AAA

222

111

babbaabababa AAAAAAAAA )()( 212121

aa AAa 2121 和的等吸收点选

bb

bbb

bbba

CE

CEE

AAA

)( 21

21

b

ba

bb

ba

bE

A

EE

AC

21

消去消去 bb 的影响测的影响测 a a

注：须满足两个基本条件注：须满足两个基本条件• 选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点• 选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大

bb AAb '2'1'2'1 和的等吸收点选

aa

aaa

aaba

CE

CEE

AAA

)(

'

21

'2'1

a

ba

aa

ba

aE

A

EE

AC

''

'2'1

11 ．取咖啡酸，在．取咖啡酸，在 165℃165℃ 干燥至恒重，精密称取干燥至恒重，精密称取 10.00mg10.00mg ，加少量，加少量 乙醇溶解，转移至乙醇溶解，转移至 200mL200mL 容量瓶中，加水至刻度线，取此溶容量瓶中，加水至刻度线，取此溶 液液 5.00mL5.00mL ，置于，置于 50mL50mL 容量瓶中，加容量瓶中，加 6mol/L6mol/L的的 HCL 4mLHCL 4mL ，加，加 水至刻度线。取此溶液于水至刻度线。取此溶液于 1cm1cm 比色池中，在比色池中，在 323nm323nm 处测定吸处测定吸 光度为光度为 0.4630.463 ，已知该波长处的 ，求咖啡酸百分，已知该波长处的 ，求咖啡酸百分 含量？含量？

9.927%11 cmE

mLgmLgCi /10900.4100/10900.419.927

463.0 64

mLgC /10000.550

5

200

1000.10 63

样

%0.98%10010000.5

10900.4%100%

6

6

样

咖啡酸C

Ci

50

5

200

1稀释因子注：

解：解：

22 ．精密称取．精密称取 0.0500g0.0500g 样品，置于样品，置于 250mL250mL 容量瓶中，加入容量瓶中，加入 0.02mol/L HCL0.02mol/L HCL 溶解，稀释至刻度。准确吸取溶解，稀释至刻度。准确吸取 2mL2mL ，稀释，稀释

至至 100mL100mL 。以。以 0.02mol/L HCL0.02mol/L HCL 为空白为空白 ,,在在 263nm263nm 处用处用 1cm1cm 吸吸

收池收池 测定透光率为测定透光率为 41.7%41.7% ，其摩尔吸光系数为，其摩尔吸光系数为 1200012000 ，被测物，被测物

分分 子量为子量为 100.0100.0 ，试计算，试计算 263nm263nm 处 和样品的百分含量。处 和样品的百分含量。

%11cmE

12000.100

120001010%11

ME cm

mLgmLg

lE

T

lE

ACi

/10165.3100/10166.3

11200

417.0lglg

64

mLgC /10000.4100

2

250

0500.0 6样

%15.79%10010000.4

10165.3%100%

6

6

样

样品C

Ci

1 饱和碳氢化合物 只有 跃迁。如： CH4 125 nm； CH6 135 nm

2 含杂原子饱和化合物 ， 跃迁。如： 表 10-5

含孤立生色团（不饱和、不饱和杂原子化合物） 有 ， ， ， 跃迁。 如

*

* *n SC,NC,OC

* * *n *n

SC,NC,OC , CC

五、结构分析

（一）有机化合物的紫外吸收光谱

（ 3 ）共轭烯、炔

分子中有双键，但不共轭，只有双键吸收峰，

有 ， 跃迁。如：

也在远紫外区。

但如果形成共轭，使波长向长波移动。

共轭体系增加，跃迁所需能量越小，吸收峰长移增 加，吸光系数增大。

* nm165CC,nm173CC

共轭分子

烯    (nm)

乙烯 

 

己三烯

165

165

217

268

334

max

10000

2×10000

21000

43000

121000

癸五烯

CC

CCCCC

CCC

CCCC

CCCCCCCC

CCCCCC

随着共轭体系增大 λ

向长波移动 ε

逐渐增

加

丁二烯

（ 4） α， β－不饱和醛、酮、酸、酯

羰基 — C —

OO

醛和酮—C=C—C—H ，O

—C=C—C—RO

没有共轭时 C＝ C和 C

＝ O

200nm处强吸收 280nm处有羰基

*n

有 α,β－不饱和键时，形成共轭200～ 260nm

310－ 350nm

溶剂对不饱和醛、酮影响较大，极性溶剂使 带红移使 带蓝移。

* *n

*

酸、酯含有

* *n

*n

n n

pE

nE

**

红移np EE

pEnE

*

紫移np EE

羰基 — C —

OO

与助色团 -OH, -OR 相连后 —C—OH ，O

—C—OR

O

酸、酯与醛、酮比较， 吸收波长较长， 吸收波长短

*

（ 5 ） 芳香族化合物

maxE1 184 60000

E2 204 8000B 255 200

lg

(nm)255184 204

B

E1 E

2

苯环上有取代基时，三个带都长移，吸收长度增加。

（二）有机化合物结构的研究1. 从吸收光谱中初步推断官能团： 220-800nm 无吸收，饱和碳氢化合物、胺、腈、醇、醚、 氯代烃、氟代烃，没有共轭体系，没有醛、酮； 210-250nm 有吸收，可能有两个共轭单位； 260-300nm 有强吸收，可能含有 3-5 个共轭单位 250-300nm 有弱吸收带，有羰基； 250-300nm 有中强吸收带，有苯环存在； 有颜色（ 可见区有吸收带 ），共轭生色团在 5 个以上。2. 异构体的推断： （ 1 ）结构异构体 : 不同，相应的吸光系数不同。 （ 2 ）顺反异构体：一般顺式异构体波长短，反式异构体波长长。3. 化合物骨架的推断：未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一 致，可能二者具有相同的发色团。

max

六 比色法：六 比色法：可见分光光度法，吸收可见光。

不吸收可见光的无色物质，可以通过显色反

应， 转化成有色物质，测定吸光度，进行

定性定量分析。

特点：灵敏度高、选择性强，操作简便。

（一）显色反应及条件

1. 对显色反应的要求①被测物质与所生成的有色物质之间，必须有确定的定量关系，方能使反应产物的吸光度准确地反映被测物的含量。②反应产物必须有足够的稳定性，以保证测得的吸光度有一定的重现性。③如试剂本身有色，则反应产物的颜色与试剂颜色须有明显的差别，即产物与试剂对光的最大吸收波长应有较大差异，才能分辨产物的吸收与试剂的吸收。④反应产物的摩尔吸光系数足够大 (103～ 105)，才能有足够的灵敏度。⑤显色反应须有较好的选择性，才能减免干扰因索。对于萃取比色法．应有足够大的分配比．保证萃取完全．

2. 2. 反应条件反应条件

（（ 11 ）试剂与溶剂）试剂与溶剂

（（ 22 ）酸碱度）酸碱度

（（ 33 ）时间）时间

（（ 44 ）温度及其它）温度及其它

3. 3. 反应条件的控制反应条件的控制 : :

通过实验确定，描绘吸光度 - 条件曲线；（ A-T， A-

pH, A-C)

（二）测定方法（二）测定方法 A = K C