产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养

产前诊断中绒毛、脐血、产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养羊水取样及标本培养

南京大学附属鼓楼医院妇产科南京大学附属鼓楼医院妇产科产前诊断中心产前诊断中心

李洁副主任医生李洁副主任医生20062006 年年 1111 月月

产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院

产前诊断指征产前诊断指征

夫妇任一方有染色体异常；夫妇任一方有染色体异常；曾生育过染色体病患者；曾生育过染色体病患者；夫妇任一方为单基因病患者；夫妇任一方为单基因病患者；曾生育过单基因病患者；曾生育过单基因病患者；有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产

或新生儿死亡史；或新生儿死亡史；


产前诊断指征产前诊断指征

羊水过多的孕妇；羊水过多的孕妇；夫妇任一方曾接触致畸因素；夫妇任一方曾接触致畸因素；孕妇年龄大于孕妇年龄大于 3535 岁；岁；有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。产前筛查高风险的孕妇产前筛查高风险的孕妇超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇


产前诊断的方法产前诊断的方法羊膜腔穿刺取样（羊膜腔穿刺取样（ amniocentesisamniocentesis ））绒毛穿刺取样（绒毛穿刺取样（ chorion villus chorion villus

sampling,cvssampling,cvs ））脐带血取样（脐带血取样（ periumbilical cord blood periumbilical cord blood

sampling,PUBSsampling,PUBS ））植入前诊断（植入前诊断（ preimplantaton genetic preimplantaton genetic

diagnosis,PGDdiagnosis,PGD ））


产前诊断的方法产前诊断的方法胎儿组织取样（皮肤、肝脏）胎儿组织取样（皮肤、肝脏）胎儿镜（胎儿镜（ fetoscopefetoscope ））胚胎镜（胚胎镜（ embryoscopeembryoscope ））胎儿超声波图象（胎儿超声波图象（ fetal ultrasound fetal ultrasound

imagingimaging ））母体外周血胎儿细胞检测（母体外周血胎儿细胞检测（ cell-storincell-storin

gg ））


绒毛穿刺取样绒毛穿刺取样——历史历史 19751975 年我国鞍山钢铁公司铁东医院首次年我国鞍山钢铁公司铁东医院首次

问世（经宫颈盲吸法，准确率问世（经宫颈盲吸法，准确率 95%95% ，自然，自然流产率流产率 9.3%9.3% ，出生婴儿未发现异常），出生婴儿未发现异常）

莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸样）样）

19831983 您您 Ward Ward 和和 Brambati Brambati 分别于英分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析分析


绒毛穿刺取样绒毛穿刺取样——时间时间

妊娠妊娠 9—119—11 周周


绒毛穿刺取样绒毛穿刺取样——抽取量抽取量20mg20mg 左右（染色体核型分左右（染色体核型分

析约需析约需 10mg10mg ，， DNADNA 分析分析约需约需 5mg5mg ，生化测定约需，生化测定约需5-10mg5-10mg ））


绒毛穿刺取样绒毛穿刺取样——并发症并发症

胎儿丢失胎儿丢失胎儿肢体发育缺陷（胎儿肢体发育缺陷（ LRDLRD ））


CVSCVS 并发症并发症——胎儿丢失胎儿丢失 CVSCVS 的流产率不比的流产率不比 amniocentesisamniocentesis 高高经宫颈和经腹取样安全性相同经宫颈和经腹取样安全性相同

（（ Jackson,1992Jackson,1992 ））多胎取样高于单胎取样多胎取样高于单胎取样

（（ Pergament,1992Pergament,1992 ））


CVSCVS 并发症－并发症－ LRDLRD 19991999 年年 WHOWHO 发布发布 CVSCVS 综合性资料认为综合性资料认为

CVSCVS 与与 LRDLRD 无关（无关（ 216216 ，， 381381 例例 CVSCVS中中 115115 例出现例出现 LRDLRD 发生率发生率 11 ：： 18811881 ，，总的人群发生率总的人群发生率 11 ：： 16421642 ））

世界各地相关资料综合，世界各地相关资料综合， 99 周以下周以下 CVSCVS 出出现现 LRDLRD 的机会高，但原因尚不清楚的机会高，但原因尚不清楚

CVSCVS 不应在小于孕不应在小于孕 1010 周的条件下进行周的条件下进行


绒毛穿刺取样绒毛穿刺取样——方法方法

经宫颈（经宫颈（ transcervicaltranscervical ））经腹（经腹（ transabdorminatransabdormina

ll ））


CVSCVS 方法方法——经宫颈取样经宫颈取样 BB 超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实

时超声诊断仪，经腹探头频率时超声诊断仪，经腹探头频率3.53.5MHz,MHz, 经阴道探头频率经阴道探头频率 5 - 5 - 77MHzMHz 。。

采用特制较细的滋养层活检导管（多采用特制较细的滋养层活检导管（多聚乙烯导管），其塑料导管外径聚乙烯导管），其塑料导管外径 1.4 – 1.4 – 1.6 1.6 mm,mm,长长 2020cm,cm, 带有导管芯，导带有导管芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探子。管前端稍弯，外形似宫腔探子。

导管另一端连接导管另一端连接 10-20ml10-20ml含有含有 2-2-4ml4ml 生理盐水的注射器生理盐水的注射器


CVSCVS 方法方法——经腹取样经腹取样双针活检系统由双针活检系统由 11根长根长 1515cmcm 、、外径外径

1.21.2mmmm 的的 1818 号引导套针，及号引导套针，及 11根长根长2020cmcm 、、外径外径 0.80.8mmmm 的的 2222 号活检针组成。号活检针组成。

在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织组织 ,, 连接含连接含 2-42-4mlml 生理盐水的生理盐水的 2020mlml 注注射器，以射器，以 55mlml 的负压上下移动活检针吸取的负压上下移动活检针吸取绒毛组织绒毛组织


CVSCVS 注意事项注意事项

动作要轻柔动作要轻柔穿刺部位在胎盘绒毛叶穿刺部位在胎盘绒毛叶抽吸次数不宜过多抽吸次数不宜过多


羊膜腔穿刺羊膜腔穿刺——历史历史 19561956 年年 FucksFucks 进行羊膜腔穿刺行胎儿性进行羊膜腔穿刺行胎儿性

别鉴定及胎儿别鉴定及胎儿 RhRh 溶血诊断溶血诊断 19661966 年年 Mark steeleMark steele 和和 Roy BregRoy Breg 从羊从羊

水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析型分析


羊膜腔穿刺羊膜腔穿刺——时间时间

16—2016—20 周周


羊膜腔穿刺羊膜腔穿刺——抽取量抽取量20—30ml20—30ml


抽取的羊水用途抽取的羊水用途

核型分析核型分析————诊断染色体病诊断染色体病 DNADNA 分析分析————诊断单基因病诊断单基因病生化测定生化测定————诊断诊断 NTDNTD 、代谢性疾病、代谢性疾病


羊水穿刺羊水穿刺

穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部超声波定位引导超声波定位引导采用采用 2222号或号或 2121号带芯长腰穿刺针头号带芯长腰穿刺针头垂直、快速进针垂直、快速进针抽取羊水抽取羊水 2ml2ml弃置，换空针抽取羊水弃置，换空针抽取羊水


羊膜腔穿刺羊膜腔穿刺——并发症并发症胎儿丢失胎儿丢失羊膜腔感染羊膜腔感染羊水渗漏羊水渗漏穿刺部位的出血、血肿穿刺部位的出血、血肿


羊穿并发症羊穿并发症 ------ 胎儿丢失胎儿丢失 19761976 年，年， Nihd Registry Nihd Registry 报道流产率报道流产率

3.5%3.5% 19861986 年，年， Tabor et al Tabor et al 报道流产率报道流产率 1.7%1.7% 19951995 年，年， Bombard et al Bombard et al 报道流产率报道流产率

1.3%1.3% 20002000 年年 , Antsaklis , Antsaklis 报道流产率报道流产率 2.1%2.1%


脐带血穿刺脐带血穿刺——历史历史 19721972 年，年， ValentiValenti 用儿科膀胱镜在中期妊用儿科膀胱镜在中期妊

娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血标本。血标本。

19791979 年，年， RodeckRodeck 和和 CampellCampell 应用胎儿应用胎儿镜行脐带血管穿刺，但由于并发症高，应镜行脐带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到限制。用受到限制。

19831983 年，年， Ternand DaffosTernand Daffos 超声引导下超声引导下经皮脐血管穿刺取血（经皮脐血管穿刺取血（ CordocentesisCordocentesis ））


脐带血穿刺脐带血穿刺——时间时间

1616 周周——分娩（最佳分娩（最佳 24—2824—28周）周）


脐带血穿刺脐带血穿刺——取血量取血量 3—5ml3—5ml 2020 周后抽取周后抽取 6—8ml6—8ml 对胎儿循环无不良影对胎儿循环无不良影响响


脐带血穿刺脐带血穿刺——适应症适应症胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的

FGRFGR 、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性 XX 综综合症等）合症等）

胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、代谢性疾病等）代谢性疾病等）

胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）


脐带血穿刺脐带血穿刺——并发症并发症穿刺部位的出血穿刺部位的出血脐带血肿脐带血肿短暂性胎心减慢短暂性胎心减慢宫内感染宫内感染胎儿丢失（流产、早产）胎儿丢失（流产、早产）大多数并发症为短暂性和非致命性大多数并发症为短暂性和非致命性


脐带血穿刺并发症脐带血穿刺并发症——胎儿丢失胎儿丢失 Maxwell 1991Maxwell 1991 年报道胎儿超声结构筛查示年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率为正常超声者脐穿的流产率为 1%1% （（ 1/761/76 ）；）；异常超声者流产率为异常超声者流产率为 7%7% （（ 5/765/76 ）；胎儿结）；胎儿结构明显异常者流产率为构明显异常者流产率为 25%25% （（ 9/369/36 ））

Antsaklis 1998Antsaklis 1998 年报道胎儿超声结构筛查示年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率正常超声者脐穿的流产率 1%1% （（ 2/1912/191 ）；）；异常超声者流产率为异常超声者流产率为 13%13% （（ 11/8411/84 ））


脐带穿刺部位脐带穿刺部位


脐血穿刺脐血穿刺——确定胎儿血样确定胎儿血样血红蛋白电泳血红蛋白电泳 Kleihauer-BetkeKleihauer-Betke 试验：胎儿红细胞在酸试验：胎儿红细胞在酸

中稳定中稳定 APTAPT 试验：试验： NNaaOHOH 中胎儿血为粉红色中胎儿血为粉红色有核红细胞的出现有核红细胞的出现


脐血穿刺脐血穿刺——排除脐血中母血污染排除脐血中母血污染

XX 染色体染色体 DMDDMD 基因内部基因内部 55 对对 CACA重复序列的连锁分析重复序列的连锁分析

绒毛组织、羊水细胞、绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养脐血细胞培养


绒毛组织的培养绒毛组织的培养直接法直接法培养法（悬浮培养、贴壁培养）培养法（悬浮培养、贴壁培养）


绒毛组织的染色体检查绒毛组织的染色体检查——直接法直接法

孕早期孕早期 Langhan’sLanghan’s 细胞有较高的有丝分裂细胞有较高的有丝分裂活性，能提供足以分析的良好有丝分裂相，活性，能提供足以分析的良好有丝分裂相，较绒毛培养简易可靠、操作简单快速较绒毛培养简易可靠、操作简单快速


绒毛组织的染色体检查绒毛组织的染色体检查——直接法直接法绒毛组织的分离洗脱绒毛组织的分离洗脱加秋水仙素（终浓度加秋水仙素（终浓度 2ug/ml2ug/ml ，可一次加，也可，可一次加，也可

分次少量加）分次少量加） 3737OOC 5%CO2培养箱培养 45 分钟低渗（ 1%枸橼酸钠低渗 10 分钟或 1%枸橼酸钠和 0.075mol/l 1 ： 1 低渗 40 分钟）

预固定（甲醇：冰醋酸 3 ： 1 ） 10 分钟固定（甲醇：冰醋酸 3 ： 1 ） 10-20 分钟冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打）制片


绒毛组织的染色体检查绒毛组织的染色体检查——悬浮培养法悬浮培养法

绒毛挑选洗脱绒毛挑选洗脱绒毛组织剪成小块入培养瓶（绒毛组织剪成小块入培养瓶（ 25ml25ml 培养培养瓶每瓶瓶每瓶 10mg10mg ））

加特定培养液加特定培养液 3ml3ml 培养培养 3-63-6 天天收获（加秋素、低渗、固定、制片）收获（加秋素、低渗、固定、制片）


绒毛组织的染色体检查绒毛组织的染色体检查——贴壁培养法贴壁培养法

绒毛组织挑选洗脱绒毛组织挑选洗脱绒毛组织剪成小块绒毛组织剪成小块加加 0.25%+0.02%EDTA 5ml 370.25%+0.02%EDTA 5ml 37OOC 摇床

中 20 分钟加培养基终止消化，离心后弃上清加培养

基接种培养 5-10天收获


羊水细胞培养羊水细胞培养——细胞类型细胞类型成纤维样细胞（成纤维样细胞（ FF 细胞）细胞）上皮样细胞（密集型上皮样细胞上皮样细胞（密集型上皮样细胞 -E-E 细胞、细胞、镰刀样上皮细胞、圆形上皮细胞）镰刀样上皮细胞、圆形上皮细胞）

羊水样细胞（羊水样细胞（ AFAF 细胞）细胞）


羊水细胞培养羊水细胞培养——收获方法收获方法原位法原位法消化法消化法刮取法刮取法


羊水细胞培养中存在的问题羊水细胞培养中存在的问题 ————污染污染

细菌细菌真菌真菌支原体支原体病毒病毒其他细胞其他细胞


羊水细胞培养中存在的问题羊水细胞培养中存在的问题 ————母体细胞污染母体细胞污染

若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎儿诊断为嵌合体儿诊断为嵌合体

母体细胞在培养中占优势母体细胞在培养中占优势


羊水细胞培养中存在的问题羊水细胞培养中存在的问题 ————母体细胞污染的预防母体细胞污染的预防

羊水穿刺时，把最先抽得的羊水穿刺时，把最先抽得的 1-2ml1-2ml 羊水弃羊水弃掉掉

染色体多态现象的测试染色体多态现象的测试羊水细胞、母体细胞的羊水细胞、母体细胞的 HLAHLA 组织定型鉴别组织定型鉴别


羊水细胞培养中存在的问题羊水细胞培养中存在的问题 ————细胞不生长、不贴壁细胞不生长、不贴壁

最常见的原因是支原体污染最常见的原因是支原体污染培养基培养基 PHPH 不适当，偏酸（＜不适当，偏酸（＜ 6.46.4 或偏碱＞或偏碱＞

7.47.4 均不利均不利最合适的穿刺时间最合适的穿刺时间 16-2016-20 周周


羊水细胞培养中存在的问题羊水细胞培养中存在的问题 ————细胞及染色体收获少细胞及染色体收获少

每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透明透亮的圆形细胞）明透亮的圆形细胞）

滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消

化的时间化的时间羊水中胎脂多时羊水中胎脂多时 3-53-5 天可轻轻动一动，减天可轻轻动一动，减少胎脂贴壁占据空间少胎脂贴壁占据空间

低渗时间短于外周血（一般低渗时间短于外周血（一般 3-53-5 分钟）分钟）


脐带血细胞培养脐带血细胞培养

量少于外周血（一般量少于外周血（一般 5ml5ml 注射器小于注射器小于 1414滴）滴）

其他同外周血其他同外周血


Thanks!

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