组织培养技术简介

组织培养基本概念• 组织培养（ Tissue Culture ）• 细胞培养（ Cell Culture ）• 器官培养（ Organ Culture ） 组织培养

体外培养（ In Vitro ） 细胞培养 器官培养

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对组织培养的评价• 优点

– 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动

– 便于使用摄影、摄电影和闭路电视等方法进行记录，直接观察活细胞变化

– 可用培养进行研究的细胞广泛– 便于使用不同的技术方法– 细胞培养技术已是分子生物学和基因工程的重要组成部分

对组织培养的评价– 易于施用物理、化学和生物因素等进行研究– 是生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段

• 不足– 人工培养环境与体内环境相比，仍有很大差异。因此在利用培养细胞做实验对象时，不应视为体内细胞完全一样，把实验结果推至体内，轻易做出与体内等同的结论

培养细胞生存环境、条件• 无污染环境• 温度• 气体环境和氢离子浓度• 体外培养细胞生存所需基本物质• 渗透压• 培养基• 附着底物

体外培养细胞成功率的分析• 培养成功与否的两步考虑

– 培养物是否贴附在底物上– 扩大再培养

• 影响培养成功的因素– 组织和细胞供体年龄– 培养条件– 贴附底物– 培养方法

• 是否成功的两步考虑– 培养物必须贴附在底物上– 扩大再培养

• 影响培养成功的因素– 组织和细胞供体年龄

组织培养设施和基本条件• 实验室设计

– 原则 防止微生物污染和有害因素影响– 要求 工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘

– 划分不同功能区或用铝合金隔板隔开– 无菌操作区应在室内较少走动的内侧– 清洗和消毒安置在另室

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组织培养设施和基本条件• 无菌操作设施和工作间

– 净化工作台• 侧流式• 直流式• 外流式• 优缺点• 延长滤垫使用寿命的方法 清洁无尘 纱布• 滤器淤滞的检测 气流 酒精灯火焰

组织培养设施和基本条件– 无菌操作室

• 更衣间• 缓冲间 应适当宽敞，可设培养箱和离心机• 操作间 大小适当• 无菌操作室无日光直射，结构以铝合金为上，天花板不宜高过 2.5M ，上半部透明，墙壁光滑无死角

– 清洗和准备区 清洗区应与其它区分开– 温育和贮存区– 观察和研究区

组织培养设施和基本条件• 实验室设备

– CO2培养箱• 质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过 0.

5 度• 培养容器需与外界保持通气状态• 箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）

• 水槽

组织培养设施和基本条件– 电热干燥箱

• 烘干和干热消毒玻璃器皿• 鼓风与升温同时进行， 100 度时可停止鼓风• 禁止先升温后鼓风• 100 度以下时再打开箱门• 金属器械、塑料制品、橡胶等不能在干燥箱内消毒

组织培养设施和基本条件– 显微镜– 水纯化装置

• 很少使用离子交换装置处理的水• 蒸馏水装置分金属和玻璃两种

– 洗刷装置• 人工洗刷• 超声洗涤装置• 玻璃吸管洗涤

组织培养设施和基本条件

– 抽滤装置– 细胞冷冻贮存器– 离心机

• 小型台式离心机符合分离细胞要求– 加样器

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组织培养设施和基本条件•器 械

– 解剖刀– 白内障刀– 解剖剪– 虹膜剪– 镊子

• 注意保护刀锋，钝刀对组织有伤害，不利细胞生长

组织培养设施和基本条件

• 培养器皿– 玻璃瓶皿

• 玻璃瓶– 500毫升、 250毫升、 100毫升

• 培养瓶• 培养皿• 吸管• 离心管

组织培养设施和基本条件

– 塑料瓶皿• 多孔培养板

– 4 、 6 、 24 、 96孔• 培养皿

– 30 、 60 、 100毫米• 培养瓶

培养用液• 水

– 离子交换水• 带有非离子物质和有机物，在组织培养中很少使用

– 蒸馏水• 玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水• 尽量减少开启次数• 存放时间不宜过长，一般不要超过 2周• 最好现制现用

培养用液• 平衡盐溶液

– Hanks– 配制离散细胞的消化液和洗涤液时，宜用钙、镁离子含量低的或无钙、镁离子的溶液

– 可配制成 10× 浓度的贮存液，用时稀释– 高压灭菌，冰箱保存– 浑浊或沉淀时，应重新配制

培养用液• 血清

– 为何使用血清– 血清的选择

• 国产杭州四季青• 进口• 同一品牌不同批号的产品存在差异

– 血清评价

培养用液• 合成培养基

– 合成培养基的评价• 有利于控制实验条件标准化• 只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生长

– 种类• RPMI 1640

• DMEM

• 神经元基础培养液

培养用液– 合成培养液的成分

• 氨基酸 几乎所有细胞在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置－ 20 度保存，用前加入培养液内。含谷氨酰胺的培养液在 4 度贮存 2周以上时，应重新加入谷氨酰胺

• 碳水化合物• 维生素• 无机离子• 其他

培养用液– 培养液的种类

• 生长培养液– 基本培养基 80%-90%

– 血清 10%-20%

– 抗生素（青霉素 100 单位 /ml 和链霉素 100µg/ml ）• 维持液

– 基本培养基 95%

– 血清 2%-5%

培养用液

– 无血清培养基• 组成

– 基础培养液– 附加成分（细胞外基质、营养成分、 生长因子）

培养用液• 培养基的选择

– 培养成败的关键– 经验法

• 来自各培养室或文献报道证明哪些培养基对培养某种细胞较合适，作为自己应用的依据

– 实验法• 多孔培养板做一组克隆形成率和细胞生长曲线

培养用液• 其它常用液

– 消化液• 胰蛋白酶溶液• EDTA溶液

– pH调整液• NaHCO3液• HEPES液

– 抗生素

清洗与消毒• 清洗

– 玻璃器皿的清洗• 浸泡 新瓶使用前用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。培养后的器皿立即浸入水中

• 刷洗 软毛刷沾洗涤剂洗涤• 浸酸 关键一环。时间不少于 6 小时，一般过夜。清洁液变绿应重新配制。

• 冲洗 洗涤装置与手工

清洗与消毒

– 胶塞的清洗• 新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理

• 常规清洗方法：水中浸泡 2%NaOH煮沸 10-20 分钟 自来水冲洗 1%盐酸浸泡 30分钟 自来水冲洗 蒸馏水清洗 2-3次 晾干

清洗与消毒

– 包装• 包装材料有皱纹包装纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒及金属消毒筒

• 局部包装• 全包装 小物品装饭盒，注意期限，标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花

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清洗与消毒• 消毒

– 物理消毒• 火焰• 紫外线消毒 空气、操作台表面。紫外灯距地面 2.

5米• 干热消毒 玻璃器皿 160 度保持 90-120 分钟• 湿热消毒 布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿某些液体 物品不宜过满 液体和橡胶制品 10磅 10 分钟 布类、金属器械、玻璃器皿 15磅 20分钟

清洗与消毒• 滤过消毒 培养用液 0.22 µm 微孔滤膜

– 化学消毒• 来苏尔• 新洁尔灭• 酒精

– 抗生素消毒– 气体消毒

组织培养的基本操作和培养技术

• 培养操作基本要领和要求– 无菌操作 成功或失败的首要条件– 培养前准备 操作卡片 用品置于场地，然后消毒

• 操作野消毒• 洗手和着装• 火焰消毒

组织培养的基本操作和培养技术

– 培养操作• 动作准确敏捷• 不用手触及已消毒物品• 操作面布局合理• 操作保持一定顺序• 培养用瓶和吸管的放置• 防止各种用液的交叉污染• 不向操作野讲话或咳嗽

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组织培养的污染、检测和排除• 污染途径

– 空气– 清洗消毒– 操作– 血清– 组织

组织培养的污染、检测和排除• 污染对细胞的影响

– 真菌污染• 大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面• 镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错

– 细菌污染• 培养液浑浊• 镜下可见菌体

组织培养的污染、检测和排除– 支原体污染

• 最常见、不易察觉• 大小介于 0.2-2 µm ，约 1% 可通过滤菌器• 对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效• “正常”感觉• 腺苷酸环化酶• 精氨酸• 检测

组织培养的污染、检测和排除

• 微生物污染的排除– 抗生素法– 加温除菌法– 动物体内接种除菌法– 巨噬细胞吞噬法

细 胞 冻 存

• 原理– 冰晶导致细胞损伤甚至死亡– 甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，避免冰晶

– 融化细胞时，速度要快，迅速通过最易受损的 -5-0 度

细 胞 冻 存• 冻存方法

– 细胞选择– 计数 密度达 5×106/ml– 冻存液 血清或培养液 9份＋甘油或二甲基亚砜 1份

– 分装– 封口