核酸抽取及杂交上海交通大学医学院

李莉 讲师李莉 讲师

第一部分 第一部分 DNADNA 提取提取总论总论

一、提取一、提取 DNADNA 总的原则：总的原则：

1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；

2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；污染应降低到最低程度；

3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；

4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如 RNARNA ，，也应尽量去除。也应尽量去除。

二、样本来源：二、样本来源：

理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取可以提取 DNADNA

样本选择取决于样本选择取决于试验目的试验目的

全血是基因组提取最常见的样本全血是基因组提取最常见的样本

血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的诊断的 60%60% 以上 以上

DNADNA 提取前样本采集、预处理和保存：提取前样本采集、预处理和保存：

（一）全血（一）全血

1.1. 抗凝剂抗凝剂 EDTA-Na2EDTA-Na2

或枸橼酸钠或枸橼酸钠

作为抗凝剂作为抗凝剂

不宜使用肝素不宜使用肝素

抗凝剂处理血抗凝剂处理血肝素肝素 柠檬酸柠檬酸 ** EDTA*EDTA*

-80-80℃℃ 保存保存 22 个月，第个月，第 1010 天收率天收率 90%90%

4 4 ℃℃

第四天收率第四天收率 90%90%

第第 1010 天提取天提取效果差效果差

第十天收率第十天收率 85%85%

室温室温提取效果差提取效果差 第四天收率第四天收率 90%90%

第十天提取效果差第十天提取效果差

mRNA 逆转录后 RT-PCR 结果（ 0 、 3 、6 个月）

A B C D

（二）血浆和血清（二）血浆和血清

血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的

标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞

等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床

上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检

测中测中

血浆血浆 DNADNA 又称为循环又称为循环 DNADNA ，是一种无细胞状态，是一种无细胞状态的胞外的胞外 DNADNA ，主要是游离的单链、双链，主要是游离的单链、双链 DNADNA 或或DNA-DNA- 蛋白质的混合物蛋白质的混合物

它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景

血浆血浆 DNADNA 成分的来源分为内源性和外源性两个部成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆的核酸是外源性血浆 DNADNA 最重要的成分最重要的成分

血浆DNA

内源性循环DNA

外源性循环DNA

自身基因组来源DNA

入侵的病毒、细菌等病原体

死亡细胞 活细胞释放

（三（三））体液体液 尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后

取沉淀提取体液中细胞的核酸取沉淀提取体液中细胞的核酸

对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，

采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸

（四）分泌物（四）分泌物

（以痰液为例）（以痰液为例）

痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部深部

咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前

应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细

胞和唾液等影响检测结果胞和唾液等影响检测结果

结核分枝杆菌的检测，可以用结核分枝杆菌的检测，可以用 NaOHNaOH 液化痰液化痰

液去除粘液和蛋白质液去除粘液和蛋白质；；非结核分枝杆菌的核非结核分枝杆菌的核

酸，使用生理盐水后取上清液酸，使用生理盐水后取上清液

痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检

测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率

三、三、 DNADNA 的收率的收率

样本类型样本类型 基因组基因组 DNADNA 收率收率

2020mgmg 肝脏组织肝脏组织 8 8 gg

100100mgmg 豆苗豆苗 10 10 gg

100100ll 全血全血 2 2 gg

22101066 培养细胞培养细胞 10 10 gg

四、四、 DNADNA 提取的基本步骤提取的基本步骤

11 、、核酸的释放：核酸的释放：

破裂细胞 释放核酸破裂细胞 释放核酸

机械法与非机械法机械法与非机械法

（非机械法中（非机械法中溶胞法溶胞法是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）

各种组织细胞破碎方法各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法 应用应用

ⅠⅠ 机械法机械法 11 匀浆法匀浆法 机体软组织机体软组织22 捣碎法捣碎法 动物韧性组织动物韧性组织33 研磨法研磨法 细菌、酵母细菌、酵母

ⅡⅡ 物理法物理法 11 超声法超声法 细胞混悬液细胞混悬液22 反复冻融法反复冻融法 培养细胞培养细胞33 冷热交替法冷热交替法 细菌、病毒细菌、病毒44 低渗裂解低渗裂解 红细胞红细胞

ⅢⅢ 化学法化学法 11 有机溶剂有机溶剂 细菌、酵母细菌、酵母22 去垢剂去垢剂 组织、培养细胞组织、培养细胞33 酶解法酶解法 细菌、酵母细菌、酵母

破裂细胞 、释放核酸

22 、核酸的分离与纯化：、核酸的分离与纯化：

将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其

他物质分离他物质分离

非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂

类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液

33 、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤

沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子

加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后

使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）

少数盐类可使用少数盐类可使用 70-75%70-75% 的乙醇洗涤的乙醇洗涤

44 、、 DNADNA 鉴定鉴定

DNADNA 的鉴定的鉴定

浓度鉴定浓度鉴定

纯度鉴定纯度鉴定

完整性鉴定完整性鉴定

浓度鉴定浓度鉴定

11 ）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定 DNADNA 在在 AA260nm260nm 的光吸收值。的光吸收值。 如计算如计算 DNADNA 浓度浓度

AA260260×× 稀释倍数稀释倍数 ×50×50 ＝ ＝ μg/mlμg/ml

紫外分光光度法只用于测定浓度大于紫外分光光度法只用于测定浓度大于 0.250.25ug/mlug/ml 的核的核酸溶液。酸溶液。

(A 值等于 1 时，相当于 50μg/ml 双链 DNA ， 40μg/ml 单链 DNA或 RNA ， 20μg/ml 单链寡核苷酸）

各种碱基的紫外吸收光谱

22 ）荧光光度法）荧光光度法

荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发

出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。

适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（ 1-1-

55ngng ））

EB 与 DNA 的结合

500l 全血提取的基因组 DNA 电泳

动物组织提取基因组 DNA

纯度鉴定纯度鉴定紫外分光光度法：紫外分光光度法：

在在 260260nmnm 和和 280280nmnm 处测定处测定 DANDAN 溶液的光吸收，纯的溶液的光吸收，纯的

DNADNA ，，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此

值表明有值表明有 RNARNA 的残留量。的残留量。

AA260260 与与 AA280280 之比应在之比应在 1.801.80 ；纯的；纯的 RNA ARNA A260260 与与 AA280280 之比之比

应在应在 2.02.0 。。

A260/A280A260/A280 比值是纯度检测的重要指标。比值是纯度检测的重要指标。

完整性鉴定完整性鉴定

凝胶电泳法：凝胶电泳法： 基因组基因组 DNADNA 电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，

可出现电泳图谱脱尾现象；可出现电泳图谱脱尾现象；

总总 RNARNA 电泳，观测各条带的含量，提示是否存在电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNARNA 降解；如加样槽中存在条带，可能是降解；如加样槽中存在条带，可能是 DNADNA 污污染。染。

55 、核酸的贮存——、核酸的贮存—— DNADNA 保存保存 11 ）短期贮存：）短期贮存：

4℃4℃或或 -20℃-20℃存放于存放于 TETE （（ tristris 和和 EDTAEDTA ））缓冲液中。缓冲液中。

TETE缓冲液的缓冲液的 PHPH 与与 DNA DNA 贮存有关，贮存有关， PHPH 为为 88时，可减时，可减

少少 DNADNA脱氨反应，脱氨反应， PHPH 低于低于 7.07.0 时时 DNADNA容易变性。容易变性。

22 ）长期贮存：）长期贮存：

TETE缓冲液中缓冲液中 -70℃-70℃保存数年；在保存数年；在 DNADNA 溶液中加一滴氯溶液中加一滴氯

仿可有效防止细菌和核酸的污染。仿可有效防止细菌和核酸的污染。

第二部分 基因组第二部分 基因组 DNADNA 的分的分离与纯化离与纯化

一、一、 DNADNA 样品准备样品准备

常见的标本：常见的标本：

血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等

生物组织：生物组织：

最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存

－ － 70℃70℃或液氮或液氮

二、二、 DNADNA 提取提取

（一）酚抽提法：（一）酚抽提法：

先用先用 EDTAEDTA 、 、 SDS SDS 、、蛋白酶蛋白酶 KK 破碎细破碎细胞，消化蛋白，然后用胞，消化蛋白，然后用 pH8pH8 的的 TrisTris饱和饱和酚或酚酚或酚 -- 氯仿抽提氯仿抽提 DNADNA ，，最后乙醇或异最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获丙醇进行沉淀。获 DNADNA 大小为大小为 100100 －－ 115050kbkb 。。

DNA 酚抽提法示意图

主要试剂的作用：主要试剂的作用：

EDTAEDTA ：： 1 1 二价金属螯合剂，抑制核酸二价金属螯合剂，抑制核酸

酶；酶；

2 2 降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性

SDSSDS 的作用：的作用：1 1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂

22 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸

释放出来释放出来

3 3 对对 RNARNA 、、 DNADNA 酶有抑制作用酶有抑制作用

4 4 与蛋白质形成与蛋白质形成 R-O-SO3 ….RR-O-SO3 ….R 蛋白质复合物，使蛋白质复合物，使蛋白质变性蛋白质变性

蛋白酶蛋白酶 KK ：：

水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化 DNADNA 酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质

蛋白酶蛋白酶 KK 与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能

力，而且在力，而且在 SDSSDS 、、 EDTAEDTA 存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可

同时使用同时使用

苯酚的特点：苯酚的特点： 蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制 DNADNA 酶活性酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取提取 DNADNA前苯酚用前苯酚用 Tris-HclTris-Hcl饱和，防止吸收过饱和，防止吸收过

多多 DNADNA ，，降低降低 DNADNA 的损失率的损失率 氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏 DNADNA

为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于 DNADNA 的分的分离？离？

苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自

由基，直接用于由基，直接用于 DNADNA 分离，会使磷酸二酯键断裂，分离，会使磷酸二酯键断裂，

造成造成 DNADNA 降解。降解。

氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并

用用 Ttis-HclTtis-Hcl 饱和酚，并调节至中性。饱和酚，并调节至中性。

PH8.0PH8.0 的的 TrisTris 溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNADNA 进入水相，减少在蛋白质层滞留。进入水相，减少在蛋白质层滞留。

在酚或酚在酚或酚 -- 氯仿中加入少许的异戊醇，是可氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。相，保持分相的稳定性。

DNADNA 的沉淀的沉淀11 ）无水乙醇沉淀）无水乙醇沉淀

沉淀前往往加入沉淀前往往加入 NaClNaCl 等盐离子，作用是中和核酸分子表等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。面的负电荷，有助于分子之间的聚集。

无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使 DNADNA 沉淀析出，无沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少水乙醇使用前冰冻，可以减少 DNADNA 沉淀析出过程释放热沉淀析出过程释放热量对量对 DNADNA 的损伤。的损伤。

22 ）异丙醇沉淀）异丙醇沉淀

除了使除了使 DNADNA 沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的 RNARNA 分子分子

（二） 甲酰胺解聚法：（二） 甲酰胺解聚法：

破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与 DNADNA

的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNADNA 。。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白高浓度甲酰胺可以裂解蛋白

质与质与 DNADNA 的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次

抽提的步骤抽提的步骤

甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的 DNADNA 样品。样品。

可得可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。

（三） 玻璃棒缠绕法：（三） 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇

上，然后用带钩或上，然后用带钩或 UU 型玻璃棒在界面轻型玻璃棒在界面轻

搅，搅， DANDAN 沉淀液绕于玻棒。生成沉淀液绕于玻棒。生成 DNADNA

约约 8080kbkb

DNA 玻棒缠绕法示意图

（四） 表面活性剂快速制备法：用（四） 表面活性剂快速制备法：用 Triton Triton

X-100X-100 或或 NP40NP40 表面活性剂破碎细胞，表面活性剂破碎细胞，

然后用蛋白酶然后用蛋白酶 KK 或酚去除蛋白，乙醇沉淀或酚去除蛋白，乙醇沉淀

或透析。或透析。

二、二、 DNADNA 的浓缩的浓缩

11 、固体聚乙二醇（、固体聚乙二醇（ PEGPEG ））浓缩：用透析浓缩：用透析

袋 外敷袋 外敷 PEGPEG 至合适量至合适量

22 、丁醇抽提浓缩：、丁醇抽提浓缩： DNADNA 溶液中水可分溶液中水可分

配到正丁醇或仲丁醇，但配到正丁醇或仲丁醇，但 DNADNA 不会。不会。

因此重复几次可显著减少因此重复几次可显著减少 DNADNA 体积体积

三、三、 DNADNA 回收回收

主要是从电泳中分离回收主要是从电泳中分离回收 DNADNA 片段片段

回收原则：尽量提高回收率回收原则：尽量提高回收率

去除回收去除回收 DNADNA 样品中的污染物样品中的污染物

（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收 DNADNA 片段片段

（一） 从琼脂糖凝胶中回收（一） 从琼脂糖凝胶中回收 DNADNA 片段片段

1.1. 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基 -- 纤维素膜插片电泳法纤维素膜插片电泳法

2.2. 电泳洗脱法电泳洗脱法

3.3. 冷冻挤压法冷冻挤压法

4.4. 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法

（一） 从琼脂糖凝胶中回收（一） 从琼脂糖凝胶中回收 DNADNA 片段片段

电泳到电泳到 DEAE-DEAE-纤维素膜 ：纤维素膜 ：

DEAEDEAE 是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的DNADNA 分子分子

在所需条带前插入在所需条带前插入 DEAT-DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带纤维素膜，继续电泳至条带DNADNA 都到膜上，取出洗下都到膜上，取出洗下

500500bp-5kbbp-5kb 的的 DNADNA片段回收率较好，纯度高。片段回收率较好，纯度高。但不适用但不适用于分子量超过于分子量超过 1010kbkb 和单链和单链 DNADNA

透析袋电洗脱 ：透析袋电洗脱 ：

切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后

继续电泳，继续电泳， DNADNA 出胶后进行抽提出胶后进行抽提 DNADNA回收。 回收。

低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶：

切下胶，加热到切下胶，加热到 65℃65℃熔化胶，然后抽提回收熔化胶，然后抽提回收

DNADNA 。。

方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶

等。 等。

琼脂水解酶：将含琼脂水解酶：将含 DNADNA 的凝胶进行消化，的凝胶进行消化，

琼脂糖水解成二糖，释放琼脂糖水解成二糖，释放 DNADNA ，，后使用酚后使用酚

抽提方法回收抽提方法回收 DNA DNA

（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收 DNADNA 片片段段 聚丙烯酰胺凝胶中回收聚丙烯酰胺凝胶中回收 DNADNA 的标准方法是压的标准方法是压

碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片段碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片段 DNADNA

回收的较好方法。回收的较好方法。

至今尚无一种方法既能有效回收至今尚无一种方法既能有效回收 DNADNA 大片段大片段

或微量的或微量的 DNADNA 片段，又能同时回收几种片段，又能同时回收几种 DNADNA

片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。

DNADNA 提取试验中常遇到的问题提取试验中常遇到的问题

基因组基因组 DNADNA 收率较低或无基因组收率较低或无基因组 DNADNA

样本材料太少样本材料太少 细胞破裂不够充分，细胞破裂不够充分， DNADNA 释放不完全释放不完全 离心力偏小离心力偏小 两相分离不完全… …两相分离不完全… …

DNADNA 降解的原因降解的原因

样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本不够新鲜，采集材料过陈旧

样本本身存在大量样本本身存在大量 DNADNA酶酶

提取提取 DNADNA 的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？

提取的基因组提取的基因组 DNADNA盐浓度过高盐浓度过高

基因组基因组 DNADNA 中乙醇未清除净中乙醇未清除净

基因组基因组 DNADNA 中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素

提取基因组提取基因组 DNADNA ，，有时加入蔗糖的原因有时加入蔗糖的原因

加入多糖，保护加入多糖，保护 DNADNA长度长度

质 粒 质 粒 DNA DNA 制 备制 备plasmid plasmid

extractionextraction

质粒简介质粒简介

质粒质粒 (plasmid)(plasmid) 是细菌内独立于染色体是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状并能自我复制的小环状 DNADNA 分子分子

其大小范围从其大小范围从 lkblkb至至 200200kbkb 以上不等。以上不等。

已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 ..

这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复

制和遗传的辅助性遗传单位。 制和遗传的辅助性遗传单位。

Chromosome DNA genome Plasmid DNA

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或

表达的重要媒介物，这种基因运载工具表达的重要媒介物，这种基因运载工具

在基因工程中具有极广泛的应用价值，在基因工程中具有极广泛的应用价值，

而质粒的分离与提取则是最常用、最基而质粒的分离与提取则是最常用、最基

本的实验技术． 本的实验技术．

质粒特性质粒特性1. 1. 分子相对小 分子相对小 2. 2. 含有高效的自主复制成分 含有高效的自主复制成分 3. 3. 不相容性不相容性 (incompatibility)(incompatibility)

4. 4. 转移性转移性5. 5. 选择的标记选择的标记 (selective markers)(selective markers)

6. 6. 限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口

质粒的结构特点质粒的结构特点

分子量相对较小分子量相对较小

共价闭合分子共价闭合分子

双链环状结构双链环状结构

具有更强的抗切割和抗变性能力

超螺旋 DNA 分子 线性 DNA 分子 半开环 DNA 分子

Plasmid vectorsPlasmid vectors

表达载体表达载体

载体含有载体含有 tactac 启动子、启动子、 LacLac 操纵基因、操纵基因、 SDSD序列、序列、 Lac ILac I 阻遏蛋白基因等阻遏蛋白基因等

Exprssion vector

细菌收集

纯化质粒 DNA

细菌培养

细菌裂解

质粒质粒 DNADNA 的提取和纯化的提取和纯化

质粒质粒 DNADNA 的提取和纯化的提取和纯化

一、细菌的培养 一、细菌的培养 (bacterial culture)(bacterial culture)

l   l   先分离单个菌落，接种到含少量适当先分离单个菌落，接种到含少量适当

抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生

长，质粒长，质粒 DNADNA 也在自主复制。也在自主复制。

对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程

度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对

数生长后期，加入氯霉素数生长后期，加入氯霉素

（（ chloromycetinchloromycetin ））抑制宿主蛋白质的合成抑制宿主蛋白质的合成

和染色体和染色体 DNADNA 的复制。质粒的复制。质粒 DNADNA 的复的复

制不受影响而大量扩增制不受影响而大量扩增

      所以使用氯霉素的主要目的，是在不所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量．养体积和细菌的数量．

      有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。过大所致。

二、细菌的收集二、细菌的收集 (bacterial collection)(bacterial collection)

细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为

了提高质粒了提高质粒 DNADNA 的纯度，离心弃上清，的纯度，离心弃上清，

细菌沉淀最好用细菌沉淀最好用 STESTE 或生理盐水悬浮，或生理盐水悬浮，

漂洗漂洗 l-2l-2 次，离心管壁上的液体也应该仔次，离心管壁上的液体也应该仔

细去除干净。细去除干净。

三、细菌裂解三、细菌裂解 细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂

法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不

同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主

菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后

加以选择加以选择。 。

质粒提取的方法质粒提取的方法 碱裂解法 碱裂解法 (Alkaline )(Alkaline )

煮沸裂解法煮沸裂解法 SDSSDS 裂解法裂解法 其他其他

质粒质粒 DNADNA 提取方法的选择提取方法的选择

      常用的煮沸法，碱法常用的煮沸法，碱法 ,,SDSSDS 法均可获法均可获

得较满意效果．至于有人采用碱法提取得较满意效果．至于有人采用碱法提取

小量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或小量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或

SDSSDS 法进行质粒法进行质粒 DNADNA 的大量分离，只的大量分离，只

是各个实验室的习惯问题是各个实验室的习惯问题 ..

选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒 DNADNA ，，应考虑应考虑以下因素：以下因素：

11．菌株类型（．菌株类型（ typetype ）） 22．质粒的大小．质粒的大小 ((size)size)

33．细菌染色体．细菌染色体 DNADNA 变性条件强弱的控变性条件强弱的控制制

((denaturation condition)denaturation condition)

质粒 DNA 的小量制备 2-5ml

质粒 DNA 的大量制备 500ml

大质粒（大质粒（ >>1515kbkb ））的处理方法：的处理方法：

采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、酶、 EDTAEDTA ，，后再使用后再使用 SDSSDS 裂解，使裂解，使 plasmidplasmid

损伤减少损伤减少

小质粒（小质粒（ <<1515kbkb ））的处理方法：的处理方法：

无需特殊处理，碱裂解方法等均可使用无需特殊处理，碱裂解方法等均可使用

四、细菌的裂解和质粒四、细菌的裂解和质粒 DNADNA 的提取的提取(bacterial and plasmid extraction)(bacterial and plasmid extraction)

在在 NaOHNaOH 存在的强碱性（存在的强碱性（ pH12.0pH12.0 ～～ 12.612.6 ））条件条件

下，用下，用 SDSSDS 破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的

蛋白质与蛋白质与 DNADNA 发生变性，释放出质粒发生变性，释放出质粒 DNADNA

（一）碱裂解法(Alkaline )

细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白

质和染色体质和染色体 DNADNA 形成大的复合物形成大的复合物

当当 pHpH 调至中性，质粒调至中性，质粒 DNADNA 重新恢复天然的超螺重新恢复天然的超螺

旋旋

在在高盐高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒条件下沉淀，经离心分离，质粒 DNADNA 保留保留

在上清液中在上清液中

在在 pHl2.0-12.6pHl2.0-12.6 碱性环境中，线性的碱性环境中，线性的

大分子量细菌染色体大分子量细菌染色体 DNADNA 变性，而共价变性，而共价

闭环闭环 ((CC)CC) 质粒质粒 DNADNA仍为自然状态。仍为自然状态。

BB 将将 pHpH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，调至中性并有高盐浓度存在的条件下，

染色体染色体 DNADNA 之间交联形成不溶性网状结构。大之间交联形成不溶性网状结构。大

部分部分 DNADNA 和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂 SDSSDS 的作用下形成的作用下形成

沉淀，而沉淀，而 CCCC 质粒质粒 DNADNA仍然为可溶状态。仍然为可溶状态。

CC 、、通过离心，可去除大部分细胞碎通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体片染色体 DNADNA 、、 RNARNA 及蛋白质，及蛋白质，质粒质粒 DNADNA 尚在上清中，再用酚、尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒氯仿抽提进一步纯化质粒 DNADNA 。。

碱裂解法示意图

1~4ml 培养细菌收集

细菌破裂溶解

染色体基因组和蛋白质变性、质粒变性

变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性

Solution I

Solution II

Solution III

分离、纯化质粒 DNA

碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分 ::(main regeants and components)(main regeants and components)

Solution I: Tris-HCl; EDTA; glucoseSolution I: Tris-HCl; EDTA; glucose

Solution II: NaOH; SDSSolution II: NaOH; SDS

Solution III: CH3COOHSolution III: CH3COOH

碱裂解提取质粒可能存在的问题碱裂解提取质粒可能存在的问题

少量纯化质粒是，多少菌液比较合适？少量纯化质粒是，多少菌液比较合适？ 2ml2ml 细菌可获得细菌可获得 10~1510~15μμgg 质粒质粒 加入加入 Solution II Solution II 后溶液应该澄清，如出后溶液应该澄清，如出现浑浊可能存在的情况？现浑浊可能存在的情况？

菌体量过大菌体量过大 菌液与菌液与 Solution ISolution I 混合不充分混合不充分

在热或碱的条件下时间过长会导致什么结果？在热或碱的条件下时间过长会导致什么结果？

质粒的超螺旋结构不可逆变性质粒的超螺旋结构不可逆变性

如：环状如：环状 DNADNA 不能被限制酶酶切不能被限制酶酶切

迁移速率在凝胶中是超螺旋近迁移速率在凝胶中是超螺旋近 22 倍倍

BrBr 染色较弱等染色较弱等

（二）煮沸裂解法（（二）煮沸裂解法（ boilingboiling ））

将细菌悬浮于含将细菌悬浮于含 TritonX-100TritonX-100 和溶菌酶和溶菌酶的缓冲液的缓冲液

中，中， TritonX-100TritonX-100 和溶菌酶能破坏细胞壁，再用和溶菌酶能破坏细胞壁，再用

沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与 DNADNA

变性。变性。

质粒质粒 DNADNA 因结构紧密不会解链，当温度下降后，因结构紧密不会解链，当温度下降后，

可重新恢复其天然超螺旋结构可重新恢复其天然超螺旋结构

通过离心去除变性的蛋白质和染色体通过离心去除变性的蛋白质和染色体 DNA, DNA, 然后然后

回收上清液中的质粒回收上清液中的质粒 DNADNA

煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。

对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如

HB101HB101 及衍生菌。及衍生菌。

（三）（三） SDSSDS 裂解法裂解法

将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和

EDTAEDTA 处理以破坏细胞壁，再用处理以破坏细胞壁，再用 SDSSDS 裂解去壁细裂解去壁细

胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚 //

氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒 DNADNA 。。

由 于 条 件 温 和 ，该法特别适用 于由 于 条 件 温 和 ，该法特别适用 于 大 质 粒大 质 粒

DNADNA （（ >15kb>15kb ））的提取。但有一部分质粒的提取。但有一部分质粒 DNADNA

会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。

（四）其它方（四）其它方法法

22 、牙签少量制备法、牙签少量制备法

1、 小量一步提取法

11 、 小量一步提取法、 小量一步提取法

直接将酚直接将酚 // 氯仿与细菌培养物混合，然后离氯仿与细菌培养物混合，然后离

心去除大部分蛋白质和染色体心去除大部分蛋白质和染色体 DNADNA ，，最后从上清最后从上清

液中回收质粒液中回收质粒 DNADNA 。。本法简单快捷、成本低，提本法简单快捷、成本低，提

取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。

（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法

用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落

制备质粒制备质粒 DNADNA 。。

由于制备的质粒由于制备的质粒 DNADNA 有较多污染，不能用于有较多污染，不能用于

分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。

质粒质粒 DNADNA 的纯化的纯化

１１ .. CsCl-EBCsCl-EB 法法

２２ ..　聚乙二醇沉淀法　聚乙二醇沉淀法

３３ ..　柱层析法　柱层析法

EB—CsClEB—CsCl 密度梯度离心法密度梯度离心法

EBEB 插入相邻的碱基之间，降低了插入相邻的碱基之间，降低了 DNADNA 的浮力密度，的浮力密度，

但超螺旋的但超螺旋的 DNADNA结合结合 EBEB 浮力密度降低较小，仅有浮力密度降低较小，仅有

0.0850.085g/cmg/cm33 。。

CsClCsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达 100%100%。。

超速离心将介质超速离心将介质 CsClCsCl形成一连续的密度梯形成一连续的密度梯度，在过量度，在过量 EBEB 存在下，蛋白质的密度最存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；小位于最上层； RNARNA密度最大沉于管底；密度最大沉于管底；DNADNA位于中间，由于不同结构的位于中间，由于不同结构的 DNADNA 与与

EBEB 结合度不一致，因此密度下降不一致，结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的故将线性、开环、闭环的 DNADNA区分开。区分开。

EB—CsCl密度梯度离心法示意图

   转基因动物，真核细胞转染及转基因动物，真核细胞转染及 DNADNA 外切酶酶切缺外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链失等实验，对闭合环状双链 DNADNA 的要求较高，一的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。般还是用超速离心法纯化质粒。

对于对于 DNADNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的量或中量提取的 DNADNA 样品，并不需要超速离心纯样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。化，一般可满足实验要求。

2 2 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法

分级沉淀，首先利用分级沉淀，首先利用 LiClLiCl 沉淀大分子沉淀大分子RNARNA ，，用用 RnaseRnase 酶消化小分子酶消化小分子RNARNA ；；在利用乙二醇选择性沉淀大质粒在利用乙二醇选择性沉淀大质粒DNADNA ，，再利用酚再利用酚 -- 氯仿抽提。氯仿抽提。

方法简单实用，但是不能区分环状或开方法简单实用，但是不能区分环状或开链质粒链质粒 DNADNA

3 3 柱层析法柱层析法 以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多

盐的条件下，盐的条件下， DNADNA 与硅基质可逆性的与硅基质可逆性的结合进行纯化。结合进行纯化。

多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用 5050%% 的乙醇洗去的乙醇洗去 RNARNA 和糖类物质，再加和糖类物质，再加入入 TETE 或水，离心洗脱。或水，离心洗脱。

RNARNA 的分离与纯化的分离与纯化RNA isolation and purification

每个细胞的每个细胞的 RNARNA 量约为量约为 1010-5-5 μμgg

80%-85% rRNA80%-85% rRNA

10%-15% 10%-15% tRNAtRNA

1%-5% 1%-5% mRNAmRNA

其他其他 RNARNA ：： hnRNAhnRNA 、 、

snRNA snRNA 、、 snoRNA…snoRNA…

组织材料组织材料 起始样品量起始样品量 Total RNATotal RNA 提取提取量量

bloodblood 1ml1ml 15~2015~20μμgg

lecukocyteslecukocytes 11×10×1077 个个 约约 100 100 μμgg

Liver tissueLiver tissue 1g1g 约约 5000 5000 μμgg

Culture cellsCulture cells 11×10×1077 个个 约约 100100μμgg

Renal tissueRenal tissue 1g1g 约约 30003000μμgg

Skeleton Skeleton tissuetissue

1g1g 约约 15001500μμgg

Cerebral Cerebral tissuetissue

1g1g 约约 15001500μμgg

一、关于一、关于 RNaseRNase 酶酶 RNARNA 易被易被 RNaseRNase 水解，水解， RNaseRNase 除胞内还广泛存在除胞内还广泛存在

于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中

RNaseRNase 具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键

RNaseRNase 分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳

定，去除变性剂后，定，去除变性剂后， RNaseRNase 的活性又可恢复。的活性又可恢复。

RnaseRnase 不需要二价阳离子激活不需要二价阳离子激活

去除去除 RNaseRNase 的污染及强有力地抑制其活性是的污染及强有力地抑制其活性是

RNARNA 制备成功与否的关键。制备成功与否的关键。

必须在总必须在总 RNARNA 提取分离的提取分离的最初阶段最初阶段，尽可能，尽可能

地灭活胞内地灭活胞内 RNaseRNase 的活性。的活性。

1. 内源性 RNA 酶（ intrinsic RNase ）

2.2. 外源性外源性 RNARNA 酶酶 (extrinsic RNase)(extrinsic RNase)

主要来源：主要来源： 被污染的缓冲液被污染的缓冲液

细菌或微生物污染，高压不能去除细菌或微生物污染，高压不能去除 RNARNA酶， 酶，

必须丢弃必须丢弃 自动移液装置自动移液装置

3.3.实验室采取避免实验室采取避免 RNARNA 酶污染的措施酶污染的措施 设置专门设置专门RNARNA移液装置移液装置 小份保存缓冲液小份保存缓冲液 设置专门的设置专门的 RNARNA 电泳装置电泳装置 准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNARNA 酶的器皿、 酶的器皿、

DEPCDEPC 处理水等处理水等 分离分离 RNARNA 过程中使用过程中使用 RNARNA 酶抑制剂酶抑制剂

1. 1. 变性剂变性剂 (denaturant)(denaturant)

选择性地使用选择性地使用 RNaseRNase 的变性剂的变性剂（如酚、氯仿及强（如酚、氯仿及强

烈的胍类变性剂）烈的胍类变性剂）

使用使用蛋白酶蛋白酶 K(proteinase K) K(proteinase K)

使用阴离子去污剂如使用阴离子去污剂如 SDSSDS 、、十二烷基肌氨酸钠或十二烷基肌氨酸钠或

脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠

二、二、 RNARNA 酶抑制剂和变性剂酶抑制剂和变性剂

胍类变性剂胍类变性剂 ((carbamidinecarbamidine)) ：胍盐是破坏蛋白质三：胍盐是破坏蛋白质三

维结构的离液剂。维结构的离液剂。

蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，

使蛋白质转换成随机卷曲状态。使蛋白质转换成随机卷曲状态。

盐酸胍抑制盐酸胍抑制 RNARNA 酶作用强，变性作用较异硫氰酸酶作用强，变性作用较异硫氰酸

胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键，在还原剂存在胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键，在还原剂存在

下断裂氢键。下断裂氢键。

联合 使 用联合 使 用 RNaseRNase 的特异抑 制 剂 （如的特异抑 制 剂 （如

RNasinRNasin 与与 DEPCDEPC 等）能极大地防止内源性等）能极大地防止内源性

RNaseRNase 对对 RNARNA 的降解。的降解。

2.2.RNARNA 酶抑制剂酶抑制剂 (RNase (RNase inhibitor)inhibitor)

（（ 11 ）） DEPCDEPC （（焦碳酸二乙酯）焦碳酸二乙酯） 高度活化的烷基化试剂，破坏高度活化的烷基化试剂，破坏 RNARNA 酶活性。酶活性。

用来灭活缓冲液或器皿中的用来灭活缓冲液或器皿中的 RNARNA 酶。酶。

O

C-CH2-CH3O

C-CH2-CH3

O

==

DEPC 水制备：0.1%DEPC 在 37°C 处理1h ，并高压灭菌 15min 。

玻璃制品和塑料制品应浸泡在 0.1% 的 DEPC 水溶液中， 37°C 处理 1h 或室温下过夜。

DEPC非选择性的修饰蛋白质和 RNA ，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化 RNA 的过程中不使用DEPC 。

（（ 22）） RNARNA 酶的蛋白抑制剂酶的蛋白抑制剂

许多许多 RNARNA 酶可以与该类蛋白质结合形酶可以与该类蛋白质结合形成非共价复合物从而是成非共价复合物从而是 RNARNA 酶失活。酶失活。

RNARNA 酶蛋白抑制剂与靶蛋白的亲和力大。酶蛋白抑制剂与靶蛋白的亲和力大。 商品化的商品化的 RNARNA 酶蛋白抑制剂的名称各酶蛋白抑制剂的名称各异（如异（如 RNAsinRNAsin 等）。等）。

3.3. 还原剂还原剂

加入加入 β-β- 疏基乙醇、二硫苏糖醇（疏基乙醇、二硫苏糖醇（ DTTDTT ））

等还原剂可以还原等还原剂可以还原 RNaseRNase 中的二硫键，有中的二硫键，有

利于利于 RNaseRNase 的变性、水解与灭活。的变性、水解与灭活。

RNARNA 提取实验前的准备提取实验前的准备

【【使用器具使用器具】】 尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用0.1%DEPC0.1%DEPC 水溶液在水溶液在 37℃37℃ 处理处理 12h12h ，后，后 120℃120℃ 高压高压30min30min ，去除残留，去除残留 DEPCDEPC

【【试剂配制试剂配制】】 无菌水须用无菌水须用 0.1%DEPC0.1%DEPC 处理后高温高压灭菌处理后高温高压灭菌 RNARNA实验试剂应实验试剂应 RNARNA 提取专用，避免其他试剂交叉污提取专用，避免其他试剂交叉污染染【【其他其他】】 实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在 RNARNA专专用区操作，操作过程中避免交谈用区操作，操作过程中避免交谈… …… …

三、酸性异硫氰酸胍三、酸性异硫氰酸胍 -- 酚酚 -- 氯仿一步氯仿一步法法

首先以含异硫氰酸胍、首先以含异硫氰酸胍、 β-β- 疏基乙醇和十二烷基肌氨酸疏基乙醇和十二烷基肌氨酸

钠的变性溶液裂解细胞。钠的变性溶液裂解细胞。

然后在然后在 pH4.0pH4.0 的条件下，酚的条件下，酚 // 氯仿抽提细胞裂解溶液。氯仿抽提细胞裂解溶液。

最后通过异丙醇沉淀与最后通过异丙醇沉淀与 75%75%的乙醇洗涤而获得总的乙醇洗涤而获得总 RNARNA 。。

本法具有简便、快速、经济、高效及提取的本法具有简便、快速、经济、高效及提取的 RNARNA 质质

量高等优点，能在量高等优点，能在 33 小时内迅速处理多个标本。小时内迅速处理多个标本。

总总 RNARNA 产量取决于标本的起始量，每产量取决于标本的起始量，每 mgmg 组织大约组织大约

能制备能制备 44 ～～ 7µ7µgg 总总 RNARNA ，，每每 101066个细胞大约为个细胞大约为 44 ～～

10µ10µgg 。 。

四、商品化的单相裂解试剂法分四、商品化的单相裂解试剂法分RNARNA 本法是异硫氰酸胍本法是异硫氰酸胍 -- 酚酚 -- 氯仿一步法的改进方案。氯仿一步法的改进方案。

以异硫氰酸胍以异硫氰酸胍 -- 酚的单相裂解液裂解细胞，再加入酚的单相裂解液裂解细胞，再加入

氯仿后形成两相。氯仿后形成两相。

变性的变性的 DNADNA 与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇

和异丙醇分级沉淀出来。和异丙醇分级沉淀出来。

保留于上层水相的保留于上层水相的 RNARNA ，，通过异丙醇沉淀与通过异丙醇沉淀与 75%75%乙醇乙醇

洗涤而制备。洗涤而制备。

四、商品化的单相裂解试剂法分四、商品化的单相裂解试剂法分 RNARNA

目前，该法已成为实验室最常用的总目前，该法已成为实验室最常用的总 RNARNA 提取提取

法，其产量及质量与前法相当。法，其产量及质量与前法相当。

Trizol

五、五、 mRNAmRNA 的分离纯化的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的除血红蛋白及组蛋白的 mRNAmRNA 外，绝大多数外，绝大多数 mRNAmRNA

在其在其 3´3´ 末端带有长短不同的末端带有长短不同的 polypoly （（ AA ））尾巴尾巴。。

利用碱基配对原则，通过利用碱基配对原则，通过 oligooligo （（ dTdT ）） -- 纤维素纤维素

或或 polypoly （（ UU ）） -- 琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很

容易地从总容易地从总 RNARNA 制品中分离纯化制品中分离纯化 mRNAmRNA 。。

1.1. oligooligo （（ dTdT ）） -- 纤维素柱层析法纤维素柱层析法

2. 2. oligooligo （（ dTdT ）） -- 纤维素柱离心法纤维素柱离心法

3. 3. oligooligo （（ dTdT ）） -- 纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法

4. 4. 磁性球珠分离法磁性球珠分离法

（（ 11 ）） oligo(dT)-oligo(dT)- 纤维素层析柱法纤维素层析柱法

（（ 22 ） ） oligo(dT)-oligo(dT)- 纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法

（（ 33 ）磁珠分离法）磁珠分离法

实验步骤实验步骤1 1 每每 mgmg 组织中加入组织中加入 11mlTrizolmlTrizol 试剂，高速破试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器）碎组织（使用高速组织捣碎器）

2 2 加入氯仿加入氯仿 0.20.2ml,ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分轻轻颠倒混匀，室温静置分层。层。

3. 3. 高速离心高速离心 1200012000rpmrpm ，， 4-8 4-8 °C°C ，， 1010 分钟分钟4.4. 吸上清液至新离心管中，约吸上清液至新离心管中，约 600600ulul

5 5 加入加入 500500ulul 异丙醇，混匀，室温静置异丙醇，混匀，室温静置 1010 分钟分钟

6.6. 高速离心高速离心 1200012000rpmrpm ，， 4-8 4-8 °C°C ，， 1010 分钟分钟7.7.弃上清液，沉淀为弃上清液，沉淀为 RNARNA

8.8. 加入加入 11mlDEPCmlDEPC 处理的处理的 75%75% 乙醇，混匀，乙醇，混匀， 77500500rpmrpm 离心， 离心， 4-84-8°C°C ，， 55 分钟分钟

9.9. 加入加入 DEPCDEPC 处理水处理水 3030ulul ，，混匀，混匀， 55-60 55-60 °C°C水浴水浴

10.3ul10.3ul 加入加入 297297ulDEPCulDEPC水，测定浓度和纯度水，测定浓度和纯度RNA 浓度（ μg /ml ） =A260×40 ×1/光径 ×稀释倍数

RNA 纯度 =A260/A280 比值为 2.0表明 RNA 较纯

RNARNA 鉴定鉴定

浓度鉴定浓度鉴定 紫外吸光光度法紫外吸光光度法 : :

AA260260×× 稀释倍数稀释倍数 ×× 4040 ＝ ＝ μg/mlμg/ml

(OD260-OD320)×(OD260-OD320)× 稀释倍数稀释倍数 ×× 4040 ＝ ＝ μg/mlμg/ml

纯度鉴定纯度鉴定 OD260/OD280 (1.8~OD260/OD280 (1.8~2.02.0))

RatioRatio<1.8 : <1.8 : 蛋白质污染蛋白质污染

Ratio>2.2 : RNARatio>2.2 : RNA 可能已经水解成单核苷可能已经水解成单核苷酸酸

注：测定吸光值，稀释液应使用ＴＥ注：测定吸光值，稀释液应使用ＴＥ

                                                                                

正常时， 28S

RNA 的荧光强度

约为 18S RNA

的 2 倍，否则提

示 RNA 的降解

完整性鉴定：

如何避免ＲＮＡ含量较低？如何避免ＲＮＡ含量较低？ ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ << １１ ..６５时可能６５时可能

存在的问题？存在的问题？

核酸的贮存——核酸的贮存—— RNARNA 保存保存

RNARNA 可溶于可溶于 0.30.3mol/Lmol/L 的醋酸钠溶液或双蒸水，的醋酸钠溶液或双蒸水，

在在 -70℃-70℃保存。保存。

RNARNA 可溶于可溶于 70%70% 的乙醇溶液或去离子的甲酰胺的乙醇溶液或去离子的甲酰胺

溶液中，可在溶液中，可在 -20 ℃-20 ℃保存。保存。

RNARNA 如果以如果以 DEPCDEPC （（焦碳酸二乙酯）可以抑制焦碳酸二乙酯）可以抑制

RNARNA 酶对酶对 RNARNA 的降解的降解