磁珠式核酸提取体系磁珠式核酸提取体系

核酸提取的总体要求 核酸提取的总体要求 高质量：纯度高并且尽可能不破坏核酸高质量：纯度高并且尽可能不破坏核酸 高产量：样本量一定时尽可能提取多的高产量：样本量一定时尽可能提取多的

核酸核酸 高通量：同时提取多个标本高通量：同时提取多个标本 自动化：降低劳动量；生物科技的飞速自动化：降低劳动量；生物科技的飞速

发展，需要处理的核酸样本迅速增多，发展，需要处理的核酸样本迅速增多，自动化提取核酸成为一种迫切需要的选自动化提取核酸成为一种迫切需要的选择。择。

磁粒法核酸提取的特点磁粒法核酸提取的特点 步骤：步骤：

裂解→核酸结合→洗涤→洗脱裂解→核酸结合→洗涤→洗脱 特点：特点：

提取时间短提取时间短 不使用酚、氯仿不使用酚、氯仿 用磁分离替代离心分离易于自动化，可以实现用磁分离替代离心分离易于自动化，可以实现

高通量提取高通量提取 目前处于市场发育阶段，是未来发展的方向目前处于市场发育阶段，是未来发展的方向 主要产品为国外产品：主要产品为国外产品：

PromegaPromega 、、 RocheRoche 、、 KingFisherKingFisher 、、 DynalDynal 等，等，大多需要与专用仪器配套大多需要与专用仪器配套

提取方式提取方式 时间时间 自动化自动化 酚、氯仿酚、氯仿经典方法经典方法 长长 难难 有有玻璃粉法玻璃粉法 短短 难难 没有没有离心柱法离心柱法 短短 难难 没有没有

磁粒法磁粒法 短短 容易容易 没有没有

各种提取方式操作比较各种提取方式操作比较

磁粒法核酸提取基本步骤磁粒法核酸提取基本步骤 裂解细胞或病毒颗粒裂解细胞或病毒颗粒 核酸与磁粒结合核酸与磁粒结合 磁分离弃上清磁分离弃上清 洗涤缓冲液洗涤磁粒洗涤缓冲液洗涤磁粒 磁分离弃上清磁分离弃上清 洗脱液将核酸从磁粒洗脱洗脱液将核酸从磁粒洗脱 磁分离弃磁粒，收集上清磁分离弃磁粒，收集上清

结 合 洗涤 洗脱

磁粒法提取核酸示意图

磁粒提取试剂操作方式磁粒提取试剂操作方式

磁架磁架 磁笔磁笔 自动提取仪自动提取仪

裂解 结合 磁分离 吸去废液

洗涤 洗脱

磁架提取核酸示意图

裂解 结合 转移磁粒 洗涤

洗脱转移磁粒

磁笔提取核酸示意图

自动仪器提取自动仪器提取

自动提取的原理与磁笔提取相同，只是用机器的运转代替手工操作，实现高通量提取和减少工作量。

磁珠提取方法的优化磁珠提取方法的优化 裂解：裂解液配方，作用时间和温度等裂解：裂解液配方，作用时间和温度等 结合：结合液的选择和用量等结合：结合液的选择和用量等 洗涤：洗涤液配方等洗涤：洗涤液配方等 洗脱：洗脱时间和温度等洗脱：洗脱时间和温度等

主要实验结果主要实验结果 与其他方法或类似商业化试剂盒的比较与其他方法或类似商业化试剂盒的比较

核酸提取的灵敏度： 核酸提取的灵敏度： HCV RNAHCV RNA ，， HIV HIV RNARNA ，， HBV DNAHBV DNA

与与 Qiagen Qiagen 磁珠式核酸提取试剂盒的比较磁珠式核酸提取试剂盒的比较 HCV RNAHCV RNA 提取比较提取比较

Ct值方法

HCV样本1

HCV样本2

HCV样本3

Promega 体系平行 1 27.60 30.21 27.39

Promega 体系平行 2 27.72 30.84 27.20

Qiagen kit 平行 1 27.86 39.00 28.82

Qiagen kit 平行 2 27.33 33.58 28.55

HBV DNAHBV DNA 提取比较提取比较

方法 HBV样本 1 HBV样本 2

Promega 体系平行 1 26.65 32.78

Promega 体系平行 2 26.84 32.52

Qiagen kit 平行 1 26.70 32.96

Qiagen kit 平行 2 26.71 32.28

提取灵敏度实验提取灵敏度实验 阳性样本梯度稀释阳性样本梯度稀释

国家灵敏度参考品国家灵敏度参考品

HCV RNAHCV RNA 提取提取

HCV 阳性样本 10 倍稀释梯度： 100,10-1,10-2,10-3,10-4

磁珠提取与柱提取法比较（数据见下页）

稀释组 柱提取 磁珠提取

10-0 24.13 24.34 25.28

10-1 27.15 29.20 28.57

10-2 31.23 33.34 32.64

10-3 35.34 35.87 35.39

10-4 38.16 38.07 38.69

磁珠提取方法与柱提取法及水溶液梯度稀释样本比较

磁珠提取与柱提法的提取效果相当。在低浓度样本提取方面，荧光增量与稀释组无显著差异，此方法在去除样本中抑制物方面效果良好。

HCV RNAHCV RNA 国家标准品检测国家标准品检测

10 份阳性参考品 : P1~P10

HCV 阳性参考品 Ct HCV 阳性参考品 Ct

P1 34.58 P6 ND

P2 ND P7 36.18

P3 36.96 P8 ND

P4 34.81 P9 32.16

P5 35.44 P10 36.73

HIV RNAHIV RNA 提取提取 HIV 阳性样本梯度稀释成 1/5 ， 1/25 ， 1/50 ， 1/100 和1/200五个浓度，提取 RNA ，原样本提取后用 TE 按相同比例稀释，上机比较。

稀释组 磁珠提取

1 - 28.88

1/5 32.09 31.29

1/5 35.78 33.93

1/50 37.17 35.59

1/100 38.83 36.12

1/200 - 37.33

HIV 样本稀释梯度： 1/5 ， 1/25 ， 1/50 ， 1/100 和 1/200

HIV 核酸国家参考品检测

HIV RNA 灵敏度和定量参考品： B2 － B5 （至少检出 B2-B3 ）

HIV RNA 线性参考品： A2 － A5 。

HIV RNAHIV RNA 荧光定量标准曲线荧光定量标准曲线 , , 线形相关系数 :0.9907

HIV 阳性参考品 :P1, P2, P3, P5, P7, P8

HIV 阳性参考品 Ct HIV 阳性参考品 Ct

P1 32.94 P5 26.42

P2 35.98 P7 28.93

P3 37.61 P8 32.55

HIV 阳性参考品检测

中检所中检所 HBVHBV 核酸定量标准品检测核酸定量标准品检测

灵敏度参考品

L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6

理论浓度对数值

8.342 7.619 6.649 5.672 4.715 3.636 2.043

Ct 15.04 16.97 20.40 22.04 26.34 29.03 35.17

HBVHBV 核酸定量标准品：核酸定量标准品： L0L0 ～～ L6L6 （（ L0L0 ～～ L5L5 必须检出，必须检出， L6L6 仅供参仅供参考）考）

HBVHBV 核酸定量标准品荧光定量标准曲线核酸定量标准品荧光定量标准曲线