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Capítulo 6. Materiales y método

Evaluación del desempeño de humedales construidos con plantas nativas tropicales para el

tratamiento de lixiviado de rellenos sanitarios

6. Materiales y método | 48

6. MATERIALES Y MÉTODO

6.1 Localización

El trabajo de investigación se llevó a cabo en el invernadero o casa de mallas,

ubicada en la micro-estación de Biología del campus de Meléndez de la Universidad

del Valle, Cali – Colombia, (3o 22’ 23.64” N, 76o 31´ 54.15´´ O) Figura 14. Este trabajo se

realizó en un invernadero para minimizar el efecto de la precipitación pluviométrica,

y también como control de los enemigos naturales (plagas, insectos, entre otros) de

las especies a estudiar.

Figura 14. Ubicación de la zona del proyecto




6.2 Unidades experimentales

Se emplearon como unidades experimentales HCSSFH a escala de microcosmos,

construidos en fibra de vidrio de 450 gr y resina poliéster, de dimensiones: 0.6 m

largo, 0.3 m ancho y 0.5 m de altura total y una altura de nivel de agua de 0.4 m, las

unidades cuentan con pantallas perforadas a 0.05 m de distancia de las paredes de

entrada y de salida, con el fin de permitir una mejor distribución del flujo a la

entrada y salida de las unidades. Los esquemas de los reactores experimentales

utilizados en el estudio se muestran en la Figura 15 y 9, y en la Foto 1.

Figura 15. Esquema del humedal

Figura 16. Esquema del humedal




Foto 1. Unidades experimentales

El sistema de alimentación de los reactores se hizo a gravedad. Para garantizar el

suministro de lixiviado sintético con flujo continuo y controlado a los microcosmos,

se utilizó un sistema conformado por tanque plástico de almacenamiento y un

dispositivo de goteo, como se muestra en la Foto 2. Esta condición permitió que los

humedales funcionaran bajo flujo semi-continuo por espacio de ocho horas al día

con un caudal 0.010 m3.d-1, que equivale a un tiempo de retención hidráulica (TRH)

de tres días.

Foto 2. Sistema de alimentación unidades experimentales

Dado que se tuvo dos factores de trabajo (Plantas y carga de metales pesados), se

hizo necesario establecer la ubicación de los reactores en el área de estudio, lo cual

se hizo de manera aleatoria, empleando para ello el software R 2.10. Para generar la

aleatorización se emplearon los códigos que se muestran en el




Anexo 1. Dando como resultado la ubicación mostrada en la Figura 17.

Figura 17. Ubicación reactores

6.3 Especies Vegetales

Las especies utilizadas en la investigación fueron seleccionadas con base en los

resultados del trabajo de investigación “Efecto en el crecimiento y fisiología en 11

especies vegetales regadas con lixiviado del relleno sanitario de Presidente”. En el

cual las plantas fueron regadas con lixiviado real proveniente del relleno sanitario de

presidente y donde las especies que obtuvieron el mejor rendimiento en cuanto a

crecimiento y fisiología fueron: Colocasia esculenta (Oreja de Burro), Gynerium

sagittatum (Caña Brava), y Heliconia psittacorum (Heliconia), razón por la cual

fueron seleccionadas para el presente estudio. En la Foto 3, 4 y 5 se muestran las

plantas mencionadas.

Una vez definida la distribución de los reactores, fue necesario realizar un proceso

similar para la selección de las plantas a sembrar en cada reactor. Este trabajo se

efectúo empleando también el software R 2.10. Inicialmente se cultivaron alrededor

de cuarenta plantas de cada especie, la siembra de las especies vegetales se hizo

por esquejes y durante cuatro semanas se cultivaron y mantuvieron bajo la

condición de vivero, el cual se muestra en la Foto 6 y 7. El número de individuos

sembrados en cada reactor fue de tres para una densidad de 20 plantas por m2, lo

que implicó que en total se sembraron 18 plantas por especie vegetal. El universo

total de plantas por especie fue de: Heliconia Psittacorum 30; Gynerium Sagittatum

30, Colocasia esculenta 32, ya que solo se seleccionaron las especies en edad juvenil.

Las plantas fueron numeradas del 1 hasta al n, para de esta forma proceder

mediante el software R a seleccionar las plantas. Igualmente fue necesaria la

construcción de unos códigos para el uso del software R. Los códigos empleados se

muestran en el anexo 2.




Foto 3. Colocasia esculenta

Foto 4. Gynerium sagittatum




Foto 5. Heliconia psittacorum

Foto 6. Exteriores del Invernadero

Foto 7.Interior del Invernadero




6.4 Medio filtrante

El medio filtrante empleado en las unidades experimentales fue grava mediana de

diámetro 25.4 mm, cada unidad se llenó de grava hasta una altura de 0.45 m, con lo

que se obtiene un volumen de grava de 0.074 m3 por unidad. Previa al llenado de los

reactores con grava, este material fue lavado con abundante agua y una solución al

5% de hipoclorito de sodio para eliminar posibles microorganismos. En las siguientes

tablas se presentan las características de este material.

Tabla 7. Datos análisis de granulometría de la grava

Rangos de tamaño % ½ - ¾ 63,8 ¾ - 1 30,5 ¼ - ½ 4,6

Fuente: Laboratorio de Suelos, Universidad Nacional de Colombia, 2011.

Tabla 8. Características del medio filtrante

Tipo de Material

Tamaño Efectivo D10 (mm)

Porosidad n (%)

Conductividad Hidráulica ks (m3/m2/d)

Densidad real Kg m-3

Grava Media 25 38,86 1100,076 2650 Fuente: Laboratorio de Suelos, Universidad Nacional de Colombia, 2011.

Foto 8. Material de relleno

6.5 Lixiviado Sintético

Debido a la variabilidad que puede presentarse en las concentraciones de los contaminantes de interés a estudiar en el lixiviado, y que el objetivo central de esta etapa de la investigación era establecer la capacidad fitoremediadora de las especies vegetales (Colocasia esculenta, Heliconia psittacorum y Gynerium

sagittatum) y en la perspectiva de reducir potenciales efectos inhibitorios sobre este proceso, se hace necesario utilizar un sustrato sintético que simule las




características de un lixiviado estable, condición que también es recomendada en otros estudios de este tipo (Stottmeister, U., et al. 2006); (Cheng, S., et al., 2002); (Rahman, K., et al., 2011)

El lixiviado se preparó con características similares a un lixiviado real que ha sido parcialmente tratado a través de una laguna anaerobia de alta tasa y compuesto por los principales ácidos grasos volátiles (AGV’s) (ácido acético, ácido propiónico y ácido butanóico) encontrados después de la fermentación ácida durante el tratamiento primario de aguas residuales con lagunas anaerobias (Rodríguez, J., 2002).Para garantizar los valores promedio de los parámetros mencionados, el lixiviado sintético con el que se alimentaron las unidades experimentales se preparó diariamente.

Después de varias caracterizaciones realizadas en la cámara de entrada a la laguna 1

del relleno sanitario de Presidente reportados por BUGASEO (2010) para el periodo

2006-2010 y los valores obtenidos en las caracterizaciones de Torres y Vásquez

(2010) y ECOQUIMICA (2011) se establecen las características fisicoquímicas del

lixiviado sintético a preparar, para ello también se tiene en cuenta lo mencionado

anteriormente, se simula que el lixiviado es efluente de un sistema de laguna

anaerobia de alta tasa, la cual tiene una capacidad de eliminación de materia

orgánica del 60% y se emplea un factor de dilución de 5,5 obtenido en el trabajo de

investigación realizado por Torres, S., y Vásquez, R., 2010. Por lo anterior las

concentraciones teóricas del lixiviado sintético se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Concentración lixiviado sintético

Parámetro Concentración

C1 C2 Cd (µg L-1) 150 300 Pb (µg L-1) 750 1000 Hg (µg L-1) 30,5 60 Cr VI (µg L-1) 750 1000

DQO (mg/L) 491,3 DBO (mg/L) 213 N-NH4 (mg/L) 150 P-PO4 (mg/L) 3,6

La DQO utilizada fue en promedio de 500 mg.L-1. Acorde con los resultados

encontrados por Moreno (2009), la composición de la DQO del lixiviado de

Presidente luego de ser evaluada la biodegradabilidad anaeróbica fue de: C2:C3:C4

(ácido acético: propiónico: butanóico) 73%:23%:4% respectivamente, relación que fue

empleada para la preparación del lixiviado sintético y cuyos reactivos fueron ácido

acético (Merck, Darmstadt, Alemania, pureza > 99,9%), propiónico (Alfa Aesar, USA,

99,4% pureza) y butanóico (Panreac, USA, 99,5% pureza).

En el caso de los metales pesados se emplearon sales como cloruro de mercurio

(HgCl2) (Merck, 99,6% pureza); Sulfato de plomo (PbSO4) (Merck, 99,9% pureza);




Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) (Merck, 99,9% pureza) y granallas de Cadmio

(Merck, 99,9% pureza), buscando concentraciones entre 5 a 10 veces superior a la

concentración promedio encontrada en el lixiviado real.

Respecto al amonio, acorde con Clarke and Baldwin, 2002, concentraciones de este

contaminante superior a 200 mg/L son tóxicas para las plantas, razón por la cual se

optó trabajar con una concentración de 100 mg/L de amonio y para su preparación

se empleó cloruro de amonio (NH4Cl) (Merck, 99,9% pureza); En relación al Fosforo,

acorde con el análisis estadístico de los datos de caracterización para este nutriente

en el lixiviado real la concentración es de 10 mg/L, se trabajó con una concentración

de 7 mg/L y se empleó KH2PO4 (Merck,99% pureza); finalmente para los

micronutrientes, las concentraciones utilizadas se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10. Concentraciones de micronutrientes para 5 L de solución madre

Micronutrientes Concentración (mg/L)

Calcio (Ca) 0.075 Magnesio (Mg) 0.500 Manganeso (Mn) 0.500 Hierro (Fe) 5.000

Todos los elementos fueron preparados con agua destilada y de manera

independiente en soluciones stock de volumen entre 0,5 y 1 Litro según el

contaminante. Diariamente de las soluciones madres se tomaban alícuotas para la

preparación del Lixiviado sintético con el cual se alimentó los reactores. En la Tabla

11, se presentan los volúmenes de las alícuotas tomadas para la preparación diaria

del lixiviado sintético. Por la adición de los ácidos y las sales metálicas, el pH del

lixiviado descendió a valores de 4 unidades, razón por la cual se adicionó carbonato

de sodio que permitió elevar este parámetro a valores cercanos 6 unidades.

Tabla 11. Volúmenes empelados de solución madre (SM) en lixiviado sintético

SM Concentración

SM Vol. SM

(L)

Concentración contaminante en el LX mg L-1

Vol. (mL) SM para preparar

LX C1 C2 C1 C2 C1 C2

Cd+2 mg/L 100 100 1,0 0,15 0,3 39,6 79,2 Hg+2+ mg/L 111,7 220 0,4 0,0305 0,060 13,3 13,3 Pb+2 mg/L 2600 34000 1,0 0,75 1,0 16,7 16,7 Cr +6 mg/L 9600 12800 1,0 0,75 1,0 16,7 16,7 A Acético mg/L 491,3 1.3 358,6 1.0 A Propiónico mg/L 491,3 0.4 113 0.3 A Butanóico mg/L 491,3 0.1 19,7 0.1 Amonio g/l 1509,2 1 100 16,7 Fosforo g/l 84317 0,6 7 16,7

+ Solución madre preparada cada 15 días para minimizar formación de precipitados.




6.6 Diseño experimental

El tiempo de investigación se dividió en tres fases; Fase 1 montaje experimental;

diseño, construcción y puesta en marcha de las unidades experimentales; fase 2,

investigación experimental y fase 3 análisis de información, redacción de

documentos, artículo e informe final.

Para esta investigación se tuvo un diseño de experimento factorial con dos factores;

I) las especies de plantas; Gynerium sagittatum (S1), Colocasia esculenta (S2) y

Heliconia psittacorum (S3), y sin plantas (SP) y II) la concentración de metales

pesados en el lixiviado sintético (C1 y C2). La Tabla 12 describe los tratamientos de la

investigación.

Tabla 12. Descripción de los tratamientos

Tratamiento Especie Vegetal Concentración metal pesado 1 S1 C1 1 S2 C1 1 S3 C1 1 SP C1 2 S1 C2 2 S2 C2 2 S3 C2 2 SP C2

9 (control) S1 Agua limpia sin metales+ Hoagland 10 (control) S2 Agua limpia sin metales+ Hoagland 11 (control) S3 Agua limpia sin metales+ Hoagland

SP: Reactor sin Plantas.

Se instalaron dos líneas de tratamiento con humedales construidos a escala

microcosmos, tres unidades plantadas y una sin plantar. Cada línea trabajó en

diferentes concentraciones de metales pesados (C1 y C2). Como control se

instalaron tres unidades plantadas con las mismas especies vegetales, pero el riego

se realizó con agua del sistema de abasto de la ciudad de Cali, sin cloro, más

solución Hoagland. La Tabla 13, presenta los componentes de la solución Hoagland

empleada

Tabla 13. Componentes de la solución Hoagland.

Componente Cantidad (ml) Ca(NO3) 2.5 KNO3 2.5 MgSO4 1.0 Fe EDTA 0.5 Micronutrientes* 0.1

Cada línea de tratamiento por concentración de metales evaluados trabajó con dos

replicas para un total de ocho unidades experimentales. Así mismo las tres unidades




de control tuvieron su respectivo duplicado, seis reactores en total, para un total de

veintidós unidades experimentales de HCFSSH, como se muestra en la Figura 18.

La ubicación de los humedales se hizo aleatoriamente al igual que la asignación de

las plantas a sembrar en cada una de las unidades. Para ello se empleó el paquete

estadístico R 2.10 y para generar la aleatorización se empleó códigos en el programa

R los cuales se muestran en el Anexo 1.

Las unidades se ubicaron sobre estibas que elevaron los reactores

aproximadamente 15 cm sobre el nivel del suelo, esta elevación permite aislar

térmicamente las unidades ya que no están en contacto con el suelo y facilita la

recolección del efluente por que se da flujo a gravedad desde la salida de los

humedales hasta los recipientes donde se recolectó el efluente.

Los recipientes alimentadores de las unidades se ubicaron sobre las mesas que se

encuentran dispuestas cerca de las unidades experimentales como se muestra en la

Foto 9 para permitir flujo a gravedad.

Foto 9. Montaje experimental




Figura 18. Vista general montaje experimental

Los reactores se dispusieron en dos filas de once reactores cada una, ocho para ser

alimentadas con la carga uno (C1) y ocho para la carga dos (C2), los tres reactores

restantes corresponden a las unidades de control, las cuales se alimentaron con

agua del sistema de abasto de Cali (sin cloro) y solución Hoagland.

6.7 Toma de muestras

En cada una de las ocho unidades experimentales que trabajaron con las

concentraciones de metales pesados, las que han sido denominadas línea de

tratamiento 1 y línea de tratamiento 2, se ubicó a 0,25 m de la entrada en el sentido

del flujo un tubo de PVC de 50.8 mm de diámetro y largo igual a la profundidad de la

unidad (0.50 m) perforado (4 orificios de diámetro de 19 mm) a 0.20 m medidos

desde el fondo del reactor con el objeto de tomar muestras de agua y realizar las

determinaciones de los parámetros como temperatura, pH, conductividad eléctrica,

oxígeno disuelto y potencial redox en un punto intermedio del humedal. A igual

distancia en el sentido del flujo (0.25 m), se instaló un cilindro de diámetro 76,2 mm

en malla plástica (diámetro orificio malla de 19,05 mm), el cual se rellenó con grava y

al final del experimento, de este cilindro se tomaron las muestras de grava para la

determinación del contenido de metales pesados y análisis de microbiológico para

la identificación de los organismos de los dominios bacteria y archeas en el medio

filtrante. Estos cilindros se instalaron en los 22 reactores.




Foto 10. Muestras de grava y parámetros in-situ en los humedales

Además Se tomaron muestras en la matriz agua a la entrada y salida de las unidades

experimentales, así como en el tubo perforado ubicado en la mitad de cada reactor.

Las mediciones de los parámetros de respuesta de las unidades experimentales se

realizaron con una frecuencia acorde a la variable a determinar y variaron entre

diaria a quincenal durante ocho semanas, condición recomendada en otros trabajos

científicos realizados a nivel de microcosmos (Yang, L., et al., 2001; Fraser, L., et al.,

2004; Maine, M., et al., 2009). En este contexto, las variables de respuesta medidas,

la frecuencia y el total de muestras tomadas para los dos ensayos (C1 y C2) se

presentan en la Tabla 14.

Tabla 14. Parámetros y frecuencia de medición en entrada y salida

Variables Frecuencia Total muestras para C1 y C2 Unidad Temperatura 4/semanal 768 °C Conductividad eléctrica 4/semanal 768 µS/cm Potencial redox 4/semanal 768 mV pH 4/semanal 768 Un Oxígeno Disuelto 4/semanal 768 mg/L DQO total Semanal 136 mg/L NTK Semanal 136 mg/L N-NH4

+ Semanal 136 mg/L N-NO3

-- Semanal 136 mg/L P-PO4 Quincenal 68 mg/L DBO5 Quincenal 68 mg/L Cadmio-Cd2+ Quincenal 90 μg/L Plomo-Pb2+ Quincenal 90 μg/L Cromo-Cr6+ Quincenal 90 μg/L Mercurio-Hg2+ Quincenal 90 μg/L

Parámetros in-situ Lixiviado Toma de Muestra de grava




En las plantas se determinó la acumulación de los metales pesados en tejido

subterráneo (raíces) y aéreo (tallo, rama y hoja), labor realizada al inicio y final de la

experimentación, para lo cual se tomaron muestras de 4 a 5 gr peso en seco de cada

tejido de la planta.

La cosecha de las plantas se efectúo cortando la planta dos centímetros por encima

del nivel del medio filtrante de la unidad experimental, tomándose como el

componente aéreo de la planta la parte que está por encima del medio filtrante y de

donde se escogió las muestras para las determinaciones finales de contenido de

metales pesados (tallo, ramas y hojas) y la parte enterrada en el medio filtrante se

consideró el componente subterráneo (raíces) donde igualmente se hizo

determinaciones de contenido de metales. La Tabla 15 muestra un consolidado de

las determinaciones efectuadas en las especies vegetales para las dos condiciones

de trabajo.

Tabla 15. Medición de variables en plantas

Variables Tipo de muestra

Frecuencia Total muestras

para C1 y C2 Unidad

Cadmio-Cd2+ Puntual Inicio y final experimento 40 mg/kg

Plomo-Pb2+ Puntual Inicio y final experimento 40 mg/kg Cromo-Cr6+ Puntual Inicio y final experimento 40 mg/kg

Mercurio-Hg2+ Puntual Inicio y final experimento 40 mg/kg

6.7.1 Variables de seguimiento y de respuesta

Durante el desarrollo de esta investigación se realizaron análisis de DBO, DQO,

nitrógeno amoniacal, nitratos, nitrógeno total kjeldhal, fosfatos, cromo, plomo,

cadmio y mercurio a las muestras de entrada y salida del humedal.

Por otra parte se midió in situ pH, temperatura, conductividad eléctrica, potencial

redox y oxígeno disuelto para las muestras de entrada, salida y punto intermedio

del humedal. Los análisis mencionados anteriormente se realizaron bajo los

protocolos establecidos en APHA (2005).

6.8 Arranque de unidades experimentales.

Para reducir el tiempo de adaptación de los microcosmos, el sistema se trabajó bajo

condición batch. Los reactores se llenaron con 28 L de agua sin cloro, 5 L del

efluente de la laguna anaerobia del sistema de tratamiento de aguas residuales

domésticas de Ginebra, Valle del Cauca (Colombia), 14 L del efluente de un HCFSS

sembrado con Heliconia psittacorum que trata aguas residuales domesticas ubicado

en la PTAR-Ginebra. Bajo esta condición de batch los reactores trabajaron por tres

semanas.




Posteriormente, las plantas fueron sembradas en los reactores y estos funcionaron

bajo flujo semi-continuo, para lo cual se le aplicó durante ocho horas 10 L de agua

sin cloro, condición que se mantuvo por una semana. Luego durante una semana se

aplicó a las unidades lixiviado sintético solamente compuesto de materia orgánica

(ácidos grasos de cadena corta) con una concentración de 250 mg/L de DQO.

Finalmente, Antes de empezar la fase de experimentación para las variables

fisicoquímicas, se previó un tiempo de aclimatación de 20 días, tiempo que se

consideró suficiente para que el sistema alcanzara las condiciones de estado

estacionario. Se aplicó lixiviado sintético a evaluar (DQO definitiva y 50% de la

concentración de N-NH4, P-PO4, macro y micro-nutrientes). Durante este tiempo los

reactores operaron con el caudal de diseño (0,001 m3 d-1) y en condiciones de flujo

semi-continuo (8 horas por día).

6.9 Métodos de análisis de los datos

Para el análisis estadístico de los resultados medidas durante el experimento, se

efectúo la prueba de Anova de Medidas Repetidas en el software estadístico SPSS

versión 19 (2010), para realizar las comparaciones entre el conjunto de datos

obtenidos, y evaluar el efecto del tiempo en cada una de las variables estudiadas.

Así mismo, se determinó el supuesto de esfericidad probado a un nivel de

significancia del 5% (0,05) para establecer el tipo de análisis a realizar. Se utilizó el

estadístico F univariado, aplicando el índice corrector llamado épsilon. Para poder

utilizar el estadístico F univariado se corrigieron los grados de libertad de F. Este

índice corrector expresa el grado en que la matriz de varianzas – covarianzas se

aleja de la esfericidad y ofrece dos estimaciones: Greenhouse-Greisser (Greisser &

Greenhouse, 1958) y Huynh-Feldt (1976), siendo la primera de ellas la más

conservadora. Para el contraste de las pruebas de las hipótesis se utilizó una

significancia del 5%, con un nivel de confianza del 95%, y se realizó la prueba de

Tukey para evaluar la existencia de diferencias significativas entre los grupos de

datos.

6.9.1 Hipótesis científica:

Las especies tropicales S1, S2, S3 pueden eliminar los metales Cd+2, Pb+2, Hg+2 y Cr+6

presentes en el lixiviado, pero además pueden presentar diferencias en su

capacidad fitoremediadora.

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