6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

1. 시료 채취

- 충분한 혼합- duplicate sampling- 날자, 시간, 장소, lot 번호 명기- 샘플 채취 후 5℃ 보관- 샘플 채취 후 24시간 내 검사

2. 총균수 측정(직접현미경 계수법)

- 세균(생균+사균) 검사- 정확성 낮으나 신속함- 1cm2 구획 내에서 관찰 (breed slide 이용) - sample 고정 -> 지방제거 -> 염색 -> count - 현미경시야 20군데 이상 count - 세균덩어리 : 1개로 count - 세균이외의 다른 세포도 count

☞ 세균계수법 (세균수/ml)① 현미경시야 넓이 계산(slide micrometer 이용)② 현미경시야당 평균세균수 = 전체세균 / 현미경 시야수③ 1cm2 당 현미경시야수 = 1cm2 / 현미경 시야면적-> calculation (cells/ml) = ② x ③ x DF

☞ 우유 및 유제품의 위생적 품질 측정의 방법으로 미생물 검사

- 대상 : 총균수, 생균수, 대장균군, 병원성 세균 검사

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

3. 생균수 측정

1) SPC (standard plate count)- spc agar 에서 colony 형성 CFU count -> 적정 희석 필요- dilution solution -> KH2PO4 buffer 0.25M (pH 7.2) - 배지 spc agar medium

- tryptone(0.5%) : digested casein - yeast extract(0,25%) – nitrogen source- glucose(0.1%) : carbon source- agar (1~1.5%) : solidifying agent

☞ Procedure A. dilution by 10 fold or 100 fold

1 ml + 99ml -> 10-2

1 ml + 9ml -> 10-3

--

B. add sample to plateC. add and mix agar solnD. incubate 72 hr at 30℃E. colony count

- incubation 완료 후 즉시 혹은 4℃에서 24시간 내

☞ agar medium- 44 ~ 46℃, 10 ~ 12ml 사용- 제조 후 3시간 내에 사용- dilution -> agar 더하기 : 20분이내에

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

2) 저온세균(PBC)- spc와 동일한 방법- 7℃, 10 일 or 25℃, 72시간 배양- 배지온도 45℃ 이하에서 사용

3) 호열성세균(thermophilic)- 55℃, 48시간 배양- 수분증발방지 -> parafilm sealing

4) 내열성(thermoduric)- 63℃, 30분 살균 후(in water bath) spc와 동일한 방법으로 30℃에서 count

5) 산생성균(유산균)- BCP(bromo cresol purple, pH indicator ) 0.004~0.006 % 첨가한 SPC 배지 사용- 35 ~ 37℃, 72시간 배양 -> 황색 colony count (below pH 5.2)

6) 단백분해균- 10% 탈지유 혼합 SPC 배지 사용 -> 균일한 탁도 유지- 35 ~ 37℃ or 20 ~ 22℃(butter, cheese), 48 -72 시간- colony 주변 clear zone 형성 -> 양성

7) 지방분해균 : spirit blue agar, Rhodamine 6G 이용

8) 효모 및 곰팡이- 총균수 : 현미경으로 직접 측정- 생균수 측정

-> PGA(potato glucose agar)배지 이용 세균의 SPC 와 동일한 방법으로 측정

9) 병원성균 및 기타세균 : selective 배지 혹은 미생물에 따른 특정의 배양조건에서 배양후 균수 측정

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

☞ spc counting 방법

100

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

☞ spc counting 방법

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

4. 대장균군 (coliform bacteria)

- Gram –- no spore, rod shape- 유당분해 -> 가스 생성- 환경위생의 지표균- 60℃, 15 – 20분 가열 -> 일반적으로 사멸 -> 우유처리과정의 위생성검사에 이용- 추정시험 -> 확정시험 -> 완전시험으로 구분

A. 추정시험- 액체배지 : BGLB(Brilliant Green Lactose Broth)

- 2% BGLB 배지에 0.1 – 1ml 접종- 35℃, 48시간 배양 후 -> gas 생성 -> 추정시험 양성 -> 다음 단계로

- 고체배지 : deoxycholate agar, violet red bile agar (VRBA) 이용- 35℃, 20시간 배양 -> 0.5mm 이상 암적색 colony -> 양성 -> cfu/ml 결정

VRBA 결과

* BGLB 결과1. No inoculation2. Positive3. Negative

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

B. 확정시험- BGLB 배지에서 gas 형성 시- EMB(Eosine Methylene Blue), Endo 배지이용 colony 형성

- 전형적 대장균 colony -> 확정시험 양성 -> 완전시험으로- 아전형적 colony 형성 -> 완전시험으로- 음성집락 -> 음성

C. 완전시험- 확정시험의 EMB, Endo 배지에서 아전형적 colony 형성 시- colony sample 이용 유당 bouillon 발효관에서 개스생성여부 확인 -> 양성- 양성의 경우 -> 그람음성, 무포자 확인 -> 완전시험 양성

EMB 결과

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

□ 원유 및 유제품에서의 미생물학적 위해요소(HACCP)

Severe Moderate Moderate(Extensive spread) (Limited spread)

Brucella Salmonella spp. S. aureus

L. monocytogenes E. coli O157:H7 Y. enterocolitica

Shigella spp. Cl. perfringens

C. jejuni

B. cereus

L : Listeria, S : Staphylococcus, Y : Yersinia, Cl : Chlorobacter, C : Campylobacter, B : Bacillus

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

□ 우리나라의 유가공품에 대한 미생물기준(축산물의 가공기준 및 성분규격, 농림부고시)

우유류

• 세균수 : 1ml당 20,000 이하(멸균제품의 경우 55℃, 또는 37℃에서 2주

간 보관 후 표준평판법에 의할 때 음성이어야 한다)

• 대장균군 : 1ml당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)

• 유산균수 : 1ml당 1,000,000이상(단, 유산균 첨가제품에 한한다)

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

□ 우리나라 원유의 위생등급 분포

0

20

40

60

80

100

(%)

1997 76.1 13.3 5.5 4.9

2000 90.1 6.4 2.2 1.3

2001 92.5 4.8 1.5 1.2

Grade 1 Grade 2 Grade 3 Grade 4

6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험

□ 우유류 유통기간 자율화배경(2002. 7. 1)

원유위생관리의 향상으로 원유의 병원성 미생물의 오염이

감소되고, 1등급 원유가 90%이상을 차지

우유류 제조업체 생산시스템의 자동화체제로의 전환에 따른

철저한 위생관리

Cold chain system 도입으로 유통시스템의 혁명

우유 생산제조업체의 기술수준 향상으로 품질관리에 만전

○ 제조물책임법(Product Liability) 실시 (2002.7.1)

○ 우유류 유통기한 자율화 (2002.7.1)

○ HACCP제도 정착

□ 우유류 관리 시스템 변화