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a.- Estándar externo y curva de calibración
Análisis Cuantitativo en Absorción UV - Visible
(aplicable a otras técnicas analíticas)
Ejemplo:
Se preparan 6 soluciones de conc. conocida de Cu+2
Se mide la absorbancia a max
Concentración
(mg/L )
Absorbancia Abs. Corregida
0 0,003 0
1,00 0,078 0,075
2,00 0,163 0,160
4,00 0,297 0,294
6,00 0,464 0,461
8,00 0,600 0,597
Nota:
Absorb. corregida = p.ej 0,003
(absorb. de la muestra) – (absorb. del solvente)
Curva de calibración:
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Conc / mg/L
Ab
s
Se ajusta a una recta:
y = 0.075x
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Conc / mg/L
Ab
s
Luego se toma la medición de la muestra
Absorbancia = 0,418
y = 0,0750x
Se interpola en la curva de calibración →
Concentración = 5,57 mg/L
y = 0.075x
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Conc / mg/L
Ab
s
b.- Adición de Standard
La MATRIZ es todo lo que está en la muestra exceptuando al analito.
Algunas veces ciertos componentes interfieren en el análisis Efecto de matriz
Preparación de estándares
La concentración y el volumen de la solución patrón agregada debe aumentar aprox.
en 30% de matraz en matraz.
Solución Patrón
Muestrade conc.
desconocida
Sol. patrón
Muestra
e
CxCs
Cx
Cs
Vx
Abs
orba
ncia
V (mL) de standard
(Vs)o
La concentración se determina gráficamente a partir de la ecuación de la recta o aplicando la relación:
Cx = -(Vs)oCs/Vx
(Vs)o = volumen de solución standard
Cs = conc. conocida del analito en el patrón
Vx = volumen (conocido) de la muestra
Ej: Determinación de hierro en alimentos por UV - VIS
Fe+3 (ac) + SCN-(ac) Fe(SCN)+2
(ac)
( max = 458 nm)
Uvas pasasCerealesGranos
Patrón 0,001 M Fe(NO3)3
(mL)
HCl 0,1 M (mL) Concentración Fe+3 (mM)
1 0 20 0,00
2 5 15 0,25
3 10 10 0,50
4 15 5 0,75
5 20 0 1,00
Curva de calibración (Absorbancia vs concentración)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,25 0,50 0,75 1,00
Conc (mM)
Ab
s
Interpolar los datos de las muestras
Luminiscencia
Fluorescencia* - Fosforescencia -
Quimioluminiscencia Fluorescencia* - Fosforescencia -
Quimioluminiscencia
Espectroscopía de Fluorescencia
Fluorita (CaF2)
Breve repaso:¿Qué le sucede a las
moléculas luego de la excitación? Breve repaso:¿Qué le sucede a las
moléculas luego de la excitación?
en colisiones se emite la energía (calor - NO RADIANTE)
RADIANTE
Fluorescencia Fosforescencia
Procesos de relajación
En un tiempo muy corto, el átomo o molécula (excitado) vuelve a su estado fundamental
Energía incidente Energía emergente
Calor Luz EMISIÓN
Luz Calor ABSORCIÓN
Luz Luz LUMINISCENCIA
Fluorescencia y Fosforescencia
Fluorescencia Fosforescencia
tiempo aprox 10-5 s tiempo > 10-5 sde minutos a horas
ocurre en ciertas moléculas (hidrocarburos poliaromáticos o heterociclos), llamados fluoróforos o colorantes fluorescentes.
Fluorescencia que implica el Desplazamiento de Stokes
Espines apareadosNo hay campo magnético neto
Espines desapareadosSí hay campo magnético
t de vida medio =10-5 a 10-8 s 10-4 o más
Fluorescencia Fosforescencia
Diamagnetismo Paramagnetismo
Estado singlete: espines apareados Estado triplete: espines desapareados
Fluorescencia
ConversiónInterna y
relajaciónvibracional
Absorción (excitación)
Diagrama de energía de Jablonski
Estado fundamental
Fosforescencia
Cruce entre sistemas
Conversióninterna
Estados vibracionalesde energía
Estados excitados singletes
Estadoexcitadotriplete
12
Procesos de Desactivación:
a) Relajación vibracional: colisiones con otras moleculas
- emisión > excitación (Stokes)- es eficiente, y el paso entre niveles vibracionales dura 10-12 s o menos.- la fluorescencia ocurre del nivel de menor energía vibracional del nivel electrónico excitado, pero puede llegar a cualquier nivel vibracional del estado fundamental.
b) Conversión interna : no entendido del todo- paso no radiante, a un estado electrónico de menor energía.- eficiente: ya que la mayoría de los compuestos NO fluoresce- más probables si hay solapamiento en los niveles de energía vibracional de 2 estados electrónicos.
Fluorescencia
ConversiónInterna y
relajaciónvibracional
Absorción (excitación)
Diagrama de energía de Jablonski
Estado fundamental
Fosforescencia
Cruce entre sistemas
Conversióninterna
Estados vibracionalesde energía
Estados excitados singletes
Estadoexcitadotriplete
12
c) Conversión externa: no entendido del todo
• desactivación via colisiones con el solvente• baja temperatura y/o elevada viscosidad genera menos
colisiones incrementa la fluorescencia o fosforescencia
d) Cruce entre sistemas: • se invierte el espín del electrón
- Cambio de multiplicidad en la molécula (singlete a triplete)- Es más probable si los niveles vibracionales se solapan- Mas común si la molécula tiene átomos pesados (I, Br), y es
más común en presencia de especies paramagnéticas (O2)
e) Fosforescencia:Desactivación desde un nivel electrónico ‘triplete” al estado fundamental produciendo un fotón
Procesos de Desactivación
Absorción 10-14 ~ 10-15 s Relajación Vibracional y Conversión
Interna 10-12 s ó menos Fluorescencia 10-9 ~ 10-7 s Fosforescencia 10-3 ~ 10 s
Variables que afectan la Variables que afectan la fluorescenciafluorescencia
Rendimiento cuántico
kf : fluorescencia kces: cruce entre sistemas kce: conversión externa kci: conversión interna kpd: predisociación kd: disociación
ces ce ci
Relación entre el número de moléculas que fluoresce y el total de moléculas excitadas eficiencia
0 ≤ < 1
Rupturas de enlace ( dependede la estructura del compuesto)
Tipos de Transiciones en Fluorescencia:
- Rara vez ocurre como consecuencia de absorbancia a menor a 250 nm
200 nm => 140 kJ/mol ruptura de enlaces
- No se observa fluorescencia * - Sí en * ó * n
Fluorescencia & Estructura:
.-usualmente compuestos aromáticos policondensados
.-baja energía de transición *
.-rendimiento cuántico aumenta con el número de anillos y grado de condensación.
.-la fluorescencia se favorece especialmente en estructuras rígidas
N HN
H2C
N
O
Zn
2
Ejemplos de compuestos fluorescentes:Ejemplos de compuestos fluorescentes:
Quinolina Indol Fluoreno 8-Hidroxiquinolina
H3C CH3
CH3
CH2OH
CH3 CH3 CH3
La Vitamina A experimenta fluorescencia en la región azul con una max de 500 nm.
Sistema altamente conjugado
Favorececruce entresistemas
Efectos de la Temperatura, Solvente & Efectos de la Temperatura, Solvente & pH pH ::
- disminuye temperatura aumenta fluorescencia (< conv. externa)- aumenta viscosidad aumenta fluorescencia (menos colisiones)- la fluorescencia depende del pH para compuestos con sustituyentes ácidos o
básicosSi hay más formas de resonancia se estabiliza el estado excitado
NH H
NH H
NH H
Formas de resonancia de la anilina
Efecto del O2 disuelto :
- si aumenta [O2] disminuye la fluorescencia oxidación de las especies fluorescentes las propiedades paramagnéticas favorecen el cruce entre sistemas
Aplicaciones de la FluorescenciaAplicaciones de la Fluorescencia- detectando especies inorgánicas al agregar un fluoróforo
IonIon ReactivoReactivoAbsorción Absorción
(nm)(nm)Fluorescencia Fluorescencia
(nm)(nm)Sensibilidad Sensibilidad
(ppm)(ppm)InterferenciInterferenci
aa
AlAl3+3+ ““Alizarin garnet Alizarin garnet R”R” 470470 500500 0,0070,007
Be, Co, Cr, Be, Co, Cr, Cu, FCu, F--,NO,NO3-3-, , Ni, PONi, PO44
-3-3, Th, , Th, ZrZr
FF--
Complejo de Al Complejo de Al con “Alizarin con “Alizarin garnet R”garnet R”
470470 500500 0,0010,001
Be, Co, Cr, Be, Co, Cr, Cu, FCu, F--,Fe, ,Fe, Ni,PO4-3, Ni,PO4-3, Th, ZrTh, Zr
BB44OO772-2-
BenzoínaBenzoína 370370 450450 0,040,04Be, SbBe, Sb
CdCd2+2+
2-(2-(oo--Hidroxifenil)-Hidroxifenil)-benzoxazolbenzoxazol
365365 AzulAzul 22NHNH33
LiLi++
8-8-HidroxiquinolinHidroxiquinolinaa
370370 580580 0,20,2MgMg
SnSn4+4+ FlavanolFlavanol 400400 470470 0,10,1 FF--, PO, PO443-3-, Zr, Zr
ZnZn2+2+ BenzoínaBenzoína -- VerdeVerde 1010B, Be, Sb, B, Be, Sb, iones iones coloreadoscoloreados
N
OH
O
O
OH
OH
HO N N
HO
SO3Na
C
O
C
H
OH
8-Hidroxiquinolina Flavanol “Alizarin garnet R” Benzoína
Ph
Límites de detección en Fluorescencia y Absorción LD en
fluorescencia son tres órdenes de magnitud mejores que en espectroscopía de absorción.
Método Lim. Det. (moles)
Lim. Det. Conc. molar
Ventajas
Absorc.UV-Vis
10-13 a 10-16 10-5 a 10-8 Menos restringid
a
Fluoresc 10-15 a 10-17 10-7 a 10-9 Más sensible