Espectroscopía de Fluorescencia

Ana Denicola

S0

S1

S2

hA

kNR IC

hF

fluorescencia

T1cruce intersistemas ISC

kNR ISC hP

fosforescencia

DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980)

conversión interna IC

relajación vibracional

relajación vibracional

LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado

Se alcanza el estado excitado por absorción de luz en:

FLUORESCENCIA estado singulete excitado, transición permitida, ns

FOSFORESCENCIA estado triplete excitado, transición prohibida, ms

QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reacción química

10-15 s

10-8 s

10-3 s

LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS:

• ABSORCION: ~ 10-15 seg

• CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg

• FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg

• FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” por simetría)

• RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg

Los pasos propiamente dichos de absorción y de emisión son extremadamente rápidos, tanto que los núcleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon). La absorción sólo da información del entorno inmediato a la molécula que absorbe.

La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la fluorescencia, entonces la molécula se relaja completamente y (en general) sólo vemos la emisión desde el estado S1.

La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee información de un entorno más amplio que el de absorción.

FLUORESCENCIA

• 1er. paso: absorción o excitaciónenergía suficiente para llegar a nivel

electrónico superior S1 o S2

λexc

• 2do. paso: emisión de luzenergía radiativa emitida menor que la

absorbida, λem > λexc

Corrimiento de Stokes

ESTADO EXCITADO

RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA:

Q = # fotones emitidos / # fotones absorbidos

0 < Q < 1

en términos de las constantes cinéticas de cada proceso:

Q = kF / (kF + kNR)

donde kNR son todos los procesos de decaimiento no radiativos

TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier vía)

= 1 / (kF + kNR)

TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si sólo volviera por fluorescencia

n = 1 / kF

se puede calcular a partir de y Q:

n = / Q

Rendimiento (Q) = fotones emitidos <1 fotones absorbidos

= constante de velocidad de emisión

= constante de velocidad de decaimiento no radiativo

= tiempo de vida intrínseca o natural,

sin ningún proceso no radiativo

= tiempo de vida medida

Parámetros a medir en fluorescencia

• Intensidad de fluorescencia (ISS)

• Espectros de excitación y emisión (IF vs λ)

• λmax(ex), λmax(em)

• Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q)

• Vida media del fluoróforo ()

• Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional)

• Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)

Intensidad de fluorescencia (estado estacionario) ISS

Intensidad resuelta en el tiempo ()

Pulso de luzIluminación continua

ESPECTROFLUORÍMETRO

ESPECTROFLUORÍMETRO

FUENTE DE LUZ Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (lase, LED)

MONOCROMADORES excitación y emisión vs FILTROS

ancho de banda

polarizadores

DETECTOR tubo fotomultiplicador (PMT)

MUESTRA geometría de iluminación de la muestra

La medida de IF es relativa a la geometría del equipo

Usar soluciones diluidas A < 0..05

Control con solo solvente

Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo

Filtrar la solución

Intensidad de Fluorescencia y concentración del fluoróforo

Efecto de filtro interno

Cuantificación del fluoróforo midiendo Intensidad de fluorescencia IF

IF (λex, λem) = IA Φ Z Z = factor instrumental

Φ= rendimiento cuántico de F

IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)

ε = coef. Absortividad a λexc

c = concentración del fluoróforo

IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l

IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas

Si Aλ << 1 IA = I0 (2.3 ε c l)

Fluoróforos en bioquímica

• Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del sistema

• Fluorescencia extrínseca agrego a la muestra un fluoróforo externo (sonda fluorescente)

Fluorescencia en:

• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano. Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados.

• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados

• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)

Fluorescencia en:

• NAD(P)H

• FAD, FMN

• Piridoxal fosfato (PLP)

• Clorofilas

• Indicadores fluorescentes (pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)

0.4 ns en solución1-5 ns unido a DH

4.7 ns en solución(2.3 ns FMN)0.3-1 ns unido a prot.

Phe Abundancia: 3.5%

ex = 260 nm, em= 282 nm (Q. ~ 5)

Insensible al entorno

Tyr Abundancia: 3.5%

ex = 275 nm, em= 303 nm (Q. ~ 220)

Insensible al entorno, quencheable

Ionizable, tirosinato emite (<Q)

Trp Abundancia: 1.1%

ex = 295 nm, em= 350 nm (Q. ~ 770)

Sensible al entorno, quencheable

Varias

Sondas fluorescentes para proteínas

DNS-Cl sensible a polaridad del entorno, fluorescencia polarizada

Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe y emite en el visible, alto rendimiento,

ε=80.000 M-1cm-1

Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto

rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH

Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos

Bases modificadas fluorescentes

GFP = Green Fluorrescent Protein

Formación espontánea del fluoróforo al plegarse

X

X*

hν

hν’

Relajación por solvente

Transferencia de energía

Quenching

Transferencia de carga

Disociación de H+

Formación de complejos

Formación de oligómeros

(ns)

Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia

H = hexano

CH = ciclohexano

T = tolueno

EA = acetato de etilo

Bu = butanol

Efectos del solvente y del entorno

k >> 1/ k 1/

Corrimientos de Stokes dinámicos

Ecuación de Lippert-Mataga

Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos

El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio continuo de constante dieléctrica (permitividad) uniforme

Solvatación de ionesSaturación dieléctrica en las cercanías del ión

consta

fhc GE

2

3)(

2

Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína)

HSA = albúmina humana

ANS = Anilinonaftalensulfonato (fluoróforo muy sensible a la polaridad entorno)

Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína)

Determinar constantes de unión de un ligando si este es fluorescente y su fluorescencia cambia con la unión o si la fluorescencia intrínseca cambia por efecto de la unión de un ligando

Emisión del triptofano es sensible al entorno (ej. desnaturalización de proteína)

N = nativa

U = desplegada “unfolded”

Usos de fluorescencia en bioquímica

• Localización subcelular• Cambios en la concentración • Interacciones moleculares• Cambios conformacionales• Distancias intra/intermoleculares• Difusión rotacional • Caracterización estructural• Actividad enzimática

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