8. DRBC Thành ph S · PDF fileTrang {PAGE } 6.5. Yêu cầu viết báo cáo - Nêu cơ chế lên men ethanol - Quy trình các bước tiến hành lên men sữa chua

.

Trang { PAGE }

Pha dung dịch chất chỉ thị : Hòa tan 8g bromthymol blue vào hỗn hợp 250 ml ethanol 90% và 250 ml nước cất Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút

8. Môi trường DRBC _ Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol

Thành phần Số lượng Đơn vị

Glucose Peptone K2HPO4 MgSO4 Rose bengal (5%w/v) Dichloran (0,2% w/v trong ethanol) Chloramphenicol* Agar Nước cất pH cuối (25oC)

10 5 1

0,5 0,5 1

0,1 15

1000 7,0 ± 0,2

g g g g

ml ml g g

ml

* Chloramphenicol để nguội đến 50oC mới bổ sung vào Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút Chú ý :

- Môi trường có chứa dichloran và rose bengal nên ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh , vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm.

- Rose bengal là chất dễ bị phân hủy trong ánh sáng, nên cần giữ môi trường trong tối.

.

Trang { PAGE }

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút 5. Môi trường thạch nấm men – nấm sợi (Yeast Mould Agar)


Bột chiết nấm men Bột chiết malt Peptone Dextrose Agar Nước cất pH cuối (25oC)

3 3 5

10 20

1000 6,2 ± 0,2

g g g g

ml ml

* Đường có thể là glucose, saccharose hoặc lactose

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút 6. Môi trường MRS (Man, Rogosa, Sharpe)


Peptone Bột Lab-Lemco Bột chiết nấm men Glucose Sorbitan mono-oleate K2HPO4 Sodium acetate 3H20 Triammonium citrate MgSO4.7H20 MgSO4.4H20 Agar Nước cất pH cuối (25oC)

10 8 4

20 1 2 5 2

0,2 0,05 10

1000 6,2 ± 0,2

g g g g

ml g g g g g g

ml

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút 7. Môi trường lên men


Đường* Peptone Bột chiết nấm men Dd chất chỉ thị Nước cất pH cuối (25oC)

5 10 5 2

1000 7,0 ± 0,2

g g g

ml ml

* Đường có thể là glucose, saccharose hoặc lactose

.

Trang { PAGE }

PHỤ LỤC 1. Môi trường Cao thịt – Pepton


Cao thịt Pepton NaCl Agar Nước cất pH cuối

5 10 5

15 1000

7,0 ± 0,2

g g g g

ml

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút 2. Môi trường Czapek – Dox

Thành phần Số lượng Đơn vị NaNO3 K2HPO4 MgSO4

KCl FeSO4

Saccharose Agar Nước cất pH cuối (25oC)

2,0 1,0 0,5 0,5 0,1 30 15

1000 7,3 ± 0,2

g g g g g g g

ml

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút 3. Môi trường PDA _Potato Dextrose Agar


Khoai tây* Dextrose Agar Nước cất pH cuối (25oC)

200 20 20

1000 5,6 ± 0,2

g g g

ml

* Dịch chiết từ 200 g khoai tây có thể thay thế bằng 4 g bột chiết khoai tây

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút 4. Dung dịch pha loãng SPW _ Salt Pepton Water


NaCl Pepton Nước cất

85 10

1000

g g

ml

.

Trang { PAGE }

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm, nước và mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2005

2. Lê Văn Việt Mẫn - Lại Mai Hương, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM, 2006

3. Nguyễn Thành Đạt – Mai Thị Hằng, Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục, 2000 4. Giáo trình thực tập Vi sinh năm IV, Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học tự

nhiên Tp. HCM, năm học 2000 – 2001 5. Adams M.R., Moss M.O. Food Microbiology 3rd ed. – Chapter 10 Method for the

microbiological examination of foods, RSC, 2008

.

Trang { PAGE }

6.5. Yêu cầu viết báo cáo - Nêu cơ chế lên men ethanol - Quy trình các bước tiến hành lên men sữa chua

- Giải thích các thông số trong từng quá trình.

6.6. Tiêu chí đánh giá Bảng 6.2. Tiêu chí đánh giá bài 6

STT Tiêu chí đánh giá Điểm 1 Ý thức tổ chức, kỷ luật 1 2 An toàn, vệ sinh 1 3 Thời gian 1 4 Chuẩn bị 1 5 Thao tác :

- Pha chế môi trường lên men đúng - Kiểm tra các thông số biến đổi trong quá

trình lên men (VD : pH)

1,0 1,0

6 Kết quả:

- Xác định hàm lượng acid lactic tạo ra trong quá trình lên men hoặc gián tiếp quá sự giảm giá trị pH.

- Thảo luận kết quả

1,0

1,0

7 Báo cáo - Hình thức trình bày báo cáo - Nội dung bài báo cáo đầy đủ yêu cầu đề ra

0,5 1,5

TỔNG 10

6.7. Câu hỏi thảo luận 1. Mục tiêu của việc đo hàm lượng chất khô trong dịch sữa nguyên liệu? 2. Tại sao phải ủ dịch lên men ở 40 – 43 oC? 3. Nếu thay đổi nhiệt độ lên men thì chất lượng sản phẩm có thay đổi không và thông

số nào sẽ thay đổi theo? 4. Ngoài định tính acid lactic sinh ra trong quá trình lên men sữa chua bằng pH kế,

người ta có thể sử dụng phương pháp nào để chứng minh acid lactic sinh ra một cách chính xác ?

.

Trang { PAGE }

6.3. Các bước tiến hành Quy trình công nghệ lên men sữa chua:

Sữa tươi

Làm ấm

Phụ gia Phối chế Sữa bột

Cấy men Men giống

Rót hộp Hũ nhựa

Ủ

Bảo quản

Sản phẩm Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu và các phụ liệu. Bước 2. Xác định hàm lượng chất khô của sữa bằng Brix kế. Bước 3. Tính toán hàm lượng các chất phụ gia và sữa bột cần phối chế (điều chỉnh độ Brix > 16% và thêm các phụ gia khác ...) Bước 3. Duy trì nhiệt độ canh trường ở 40 – 45 oC. Bước 4. Cấy men vào canh trường theo tỷ lệ 10% men giống. Bước 5. Sau khi khuấy đều men vào sữa, xác định pH điểm đầu và rót dịch sữa vào hũ nhựa Bước 5. Ủ ở 40o C trong 5 – 6 giờ. Bước 6. Sau 6 giờ lên men, xác định pH điểm cuối và bảo quản sữa chua trong tủ lạnh ở 2 – 4 oC 6.4. Kết quả

- Đánh giá các thông số kiểm soát quá trình lên men (pH, nhiệt độ (oC)…) - Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men

.

Trang { PAGE }

các sản phẩm phụ diacetin, ester và các acid hữu cơ bay hơi nên sữa chua bổ dưỡng và có hương vị thơm ngon. Có thể sản xuất bằng phương pháp lên men tự nhiện (nhờ hệ VSV nhiễm tự nhiên) và phương pháp cấy giống thuần khiết. 6.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

Bảng 6.1. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 6 A. HÓA CHẤT:

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 1 Bông thấm nước 1,0 kg Lưu từ đầu

2 Cồn 950+ 700 2 + 3 lít

3 Sữa đặc /sữa tươi 1 hộp 2 tổ

4 Sữa chua 1 hộp 1 tổ

5 Gelatin Tinh khiết 60 g 1 lớp

B. DỤNG CỤ :

STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Cốc thủy tinh 100ml 2 cái 1 tổ 2 Cốc thủy tinh 250ml 1 cái 1 tổ 3 Đũa thủy tinh 1 cái 1 tổ 4 Nồi vừa 1 cái 1 tổ 5 Cốc thủy tinh 1000ml 10 cái 1 lớp 6 Nhiệt kế 00-1000C 5 cái 1 lớp 7 Đồ khui sữa hộp 1 cái 1 lớp 8 Túi nylon nhỏ 8cm x 15cm 150 g SV chuẩn bị

C. THIẾT BỊ :

STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Nồi hấp tiệt trùng 1 cái 1 lớp 2 Tủ ấm 1 cái 1 lớp 3 Tủ lạnh 1 cái 1 lớp 4 Bếp điện 10 cái 1 lớp 5 pH kế 2 cái 1 lớp 6 Brix kế 10-30% 2 cái 1 lớp

.

Trang { PAGE }

BÀI 6. LÊN MEN LACTIC

Mục tiêu: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:

- Thực hiện quá trình lên men lactic - Nhận biết dấu hiệu lên men lactic

6.1. Cơ sở lý thuyết Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường với sự tích lũy acid lactic trong môi trường. Con người đã biết ứng dụng hiện tượng này từ lâu để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà…), ủ chua thức ăn cho gia súc hay sản xuất acid lactic phục vụ cho ngành công nghiệp thuộc da, dệt nhuộm, công nghiệp thực phẩm… Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù các loại vi khuẩn này không đồng nhất với nhau về mặt hình thái (hình que ngắn, dài, hình cầu), song về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất. Tất cả đều là những vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử và hầu hết không di động. Thu nhận năng lượng từ việc phân giải hydrate carbon và tiết ra acid lactic. 6.1.1. Cơ chế lên men lactic Khi thủy phân đường trong điều kiện kỵ khí, VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang pyruvate tạo thành acid lactic để tái tạo NAD+

NADH NAD+ C6H12O6 CH3COCOOH CH3 - CHOH - COOH + Q

Căn cứ vào sản phẩm sinh ra, quá trình lên men lactic được chia làm 2 kiểu: Lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đường tạo thành sản phẩm chủ yếu là acid lactic (95%).

VSV lên men lactic đồng hình: - Giống Streptococcus: S. cremoris, S. lactis, S. thermophillus… - Giống Lactobacillus: L. bulgaricus, L. acidophillus, L. platarum…

Lên men lactic dị hình Khi lên men các vi khuẩn chỉ tạo ra 60% acid lactic phần còn lại là acid acetic, rượu ethanol, glycerin và một số sản phẩm khác. VSV lên men lactic dị hình: Lactobacillus brasicar fermentatae, Leuconostoc mesenteroides, Escherichia coli… 6.1.2. Lên men sữa chua Sữa chua là loại sản phẩm lên men từ sữa tươi. Sữa chua có giá trị dinh dưỡng cao và có hương vị thơm ngon nên được nhiều người ưa thích. Ở nhiều quốc gia, sữa chua là món ăn hàng ngày của nhân dân. Vì sữa chua có hàm lượng acid lactic cao nên protein sữa không tiếp tục bị phân giải nữa, mà bị đông tụ. Bên cạnh đó, quá trình lên men còn tạo ra

.

Trang { PAGE }

5.4. Yêu cầu viết báo cáo - Nêu nguyên tắc các phương pháp định lượng trực tiếp và gián tiếp VSV - Trình bày cơ chế lên men ethanol. - Nêu các bước tiến hành quá trình lên men ethanol. - Phân tích các yếu tố làm ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol



- Kỹ thuật đếm khuẩn lạc chính xác trên máy đếm khuẩn lạc.

- Hoạt hóa và định lượng trực tiếp tế bào nấm men trên kính hiển vi

- Nấu cơm nếp không khê, cháy.

0,5

1,0

0,5

6 Kết quả: - Sản phẩm cơm rượu lên men không bị hư - Giải thích và biện luận các hiện tượng lên

men ethanol

1,0 1,0


0,5 1,5

TỔNG 10

5.6. Câu hỏi thảo luận 1. Nêu nhược điểm và ưu điểm của phương pháp đếm VSV bằng buồng đếm hồng

cầu. 2. Trong công nghiệp lên men, người ta thường sử dụng phương pháp định lượng

VSV nào nhất, tại sao? 3. Hãy phân tích sự khác biệt của phương pháp định lượng VSV trực tiếp và gián

tiếp? 4. Trong kỹ thuật lên men cơm rượu, tại sao ta phải để 1/4 - 1/3 thể tích trống trong

vật chứa cơ chất lên men? 5. Ngoài phương pháp cảm quan, người ta còn dùng phương pháp hóa học để định

tính ethanol được sinh ra trong quá trình lên men cơm rượu. Nêu phương pháp đó.

.

Trang { PAGE }

Bước 5. Để cơm nếp đã gieo men vào trong vật chứa từ 2/3 – 3/4 thể tích (tuỳ theo hình thù của vật chứa) và bịt lại bằng màng bao PVC (màng mỏng dùng để bao đĩa thức ăn).

Bước 6. Ủ ở 30 oC, 3 - 4 ngày sẽ cho sản phẩm cơm rượu.

.

Trang { PAGE }

10-1 số đếm nhỏ hơn 25 thì kết quả ghi: < 2,5 x 10-2 CFU/g. Hình 5.6. Số lượng và dạng khuẩn lạc trên Petri sau nuôi cấy

5.3.1.2. Phương pháp đếm trực tiếp – Phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu

Bước 1. Nghiền viên nấm men và cân 1 g bột nấm men Bước 2. Cho 1 g bột nấm men vào 49 ml nước cất (37 oC), lắc đều và đưa vào tủ ấm (37

oC) để hoạt hóa 20-30 phút. Bước 3. Dịch bột nấm men được lấy ra từ tủ ấm được pha loãng gấp 4, 8, 16, 32 lần. Bước 4. Chọn độ pha loãng sao cho trên một buồng đếm có 5 – 10 tế bào/1 ô lớn. Bước 5. Chọn 5 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm và đếm 5 ô này. Bước 6. Trong một ô lớn, đếm tế bào nấm men quy định theo đường dzích dzắc từ trái

sang phải của dải các ô nhỏ và nếu tế bào nấm men nằm ở trên cạnh bên phải và cạnh đáy của ô vuông nhỏ thì thuộc về ô đó.

Bước 7. Lấy số trung bình cộng của số tế bào nấm men trong một ô lớn (A) rồi tính theo công thức trên ta được số lượng tế bào nấm men có trong 1 g bột nấm men.

Hình 5.7. Cách cho dịch vi sinh vật vào buồng đếm

Lưu ý : Mẫu cần đếm là bột nấm men dễ có sai số do chất mang là tinh bột dễ nhầm lẫn với tế bào nấm men

5.3.2. Lên men cơm rượu Bước1. Vo gạo nếp trắng hay nếp lứt (đã ngâm được 30 – 60 phút), thêm nước và đưa lên

bếp nấu. Bước 2. Khi cơm sôi, vặn bếp điện nhỏ lại và lót lên bếp 1 miếng amiante để âm cho tới

khi cơm chín. Bước 3. Xới cơm ra một cái thau nhựa sạch, để nguội nơi lặng gió. Bước 4. Khi cơm nếp nguội đến 35 – 40 oC (ấm ấm), ta rắc bột nấm men vào với tỷ lệ 35

– 40 tỷ tế bào/1kg cơm nếp và đảo đều bằng bao tay nylon hay đũa tre. Lưu ý: không nên đảo quá nhiều làm nhão cơm thì lên men sẽ không đạt.

.

Trang { PAGE }

Petri có > 250 khuẩn lạc Petri có 25 – 250 khuẩn lạc Petri < 25 khuẩn lạc Petri có khuẩn lạc mọc loang

Bước 2. Dùng viết lông phân mặt đáy Petri thành 4 phần bằng nhau hay dùng máy đếm khuẩn lạc (nếu có).

Bước 3. Mỗi một khuẩn lạc đếm được đánh dấu một chấm mực bằng bút đếm khuẩn lạc Bước 4. Khi có tổng số số khuẩn lạc ở các đĩa Petri thì áp dụng công thức (*) suy ra số

lượng VSV có trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích thực phẩm. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trên 1 g mẫu được tính như sau:

{EMBED Equation.3} (*) Trong đó: A là số tế bào vi khuẩn /1g mẫu N là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn ni là số lượng đĩa cấy tại một độ pha loãng V là thể tích dịch cấy vào Petri fi là độ pha loãng tương ứng

Ví dụ: Phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1 gram thịt heo sống đã qua bảo quản 3 ngày ở 10 oC. Kết quả:

Độ pha loãng (fi) 10-3 10-4 Đĩa số 1 (n1) 224 20 Đĩa số 2 (n2) 235 26

Áp dụng công thức, ta có kết quả: {EMBED Equation.3}

Hình 5.5. Đếm khuẩn lạc TS VKHK (Môi trường cao thịt-pepton)

Các kết quả của tổng số vi khuẩn hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân. Trường hợp khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là một khuẩn lạc. Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250, ví dụ ở nồng độ 10-4 số đếm > 250 thì kết quả ghi: > 2,5 x 10-6 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở nồng độ

.

Trang { PAGE }

4 Đường Saccharose 60 g 5 Cồn 950+ 700 1+2 lít 6 Gạo nếp lức 1 kg SV chuẩn bị, 2 tổ 7 viên nấm men 10 viên SV chuẩn bị, 1 tổ 8 Màng bao PVC (wrap PVC) Bao thức ăn 1 cuộn 9 Túi nilon PP/PE Loại 1 kg 100 g SV chuẩn bị, 1 lớp

B. DỤNG CỤ : STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Ống nghiệm Þ =18mm 80 cái

Đồ lưu nhận từ buổi 1 2 Hộp petri Þ =100mm 80 cái 3 Bình tam giác 250 ml 22 cái 4 Ống hút 1ml 30 cái 5 Ống hút 10ml 1 cái 1tổ 6 Quả bóp cao su 1 cái 1tổ 7 Bình tia 500ml 1 cái 1tổ 8 Đèn cồn 1 cái 1tổ 9 Cốc thủy tinh 100ml 2 cái 1tổ

10 Cốc thủy tinh 250ml 1 cái 1tổ 11 Cốc thủy tinh 1000ml 1 cái 1lớp 12 Giá để ống nghiệm 1 cái 1tổ 13 Giá để ống hút 1 cái 1tổ 14 Đũa thủy tinh 1 cái 1tổ 15 Giấy lau kính 2 tờ 1tổ 16 Buồng đếm hồng cầu 1 cái 1tổ 17 Lame + lamelle 2 hộp 1 lớp 18 Cân đồng hồ 2kg 2 cái 1tổ 19 Đũa tre Dài 1 đôi 1tổ 20 Chậu vừa 10 cái Lưu buổi 5, trả buổi cuối 21 Cối và chày 1 bộ 1 tổ 22 Nồi vừa 1 cái 1tổ 23 Ống hút nhỏ giọt 5 cái 1lớp 24 Pipetman + Đầu típ 1 ml 1 + 5 cái 1tổ

C. THIẾT BỊ : STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Nồi hấp tiệt trùng 1 cái 1lớp 2 Tủ ấm 1 cái 1lớp 3 Tủ lạnh 1 cái 1lớp 4 Cân điện tử 1 cái 1lớp 5 Bếp điện 1 cái 1 tổ 6 Cân đồng hồ 1 cái 1 tổ 7 Kính hiển vi 1 cái 1 tổ 8 Máy đếm khuẩn lạc 2 cái 1lớp

5.3. Các bước tiến hành 5.3.1. Định lượng VSV 5.3.1.1. Phương pháp đếm gián tiếp – Phương pháp đếm khuẩn lạc Bước 1. Sinh viên lấy kết quả từ các đĩa Petri đã cấy trải (kết quả bài 4), chọn đếm đĩa

Petri có số lượng 25 – 250 khuẩn lạc.

.

Trang { PAGE }

Quá trình lên men ethanol nhờ nấm men là cơ sở của việc sản xuất các loại rượu, bia, cồn và glycerin. Quá trình này còn được ứng dụng trong sản xuất bánh mì (làm nở bột mì) và một số loại nước giải khát. 5.1.3.1. Cơ chế quá trình lên men ethanol Tinh bột { EMBED Equation.3 } Dextran { EMBED Equation.3 } Glucose

EMP Pyruvate

Acetaldehyde

pH 4 - 5 Ethanol

Khi phân huỷ đường trong điều kiện kỵ khí, VSV chuyển hydro từ NADH đến acetaldehyde tạo thành rượu ethanol để tái tạo NAD+. Sản phẩm tạo thành là ethanol và CO2 Phương trình phản ứng :

NADH NAD+ C6H12O6 CH3COCOOH CH3CHO C2H5OH + CO2 + 113,4 Kj Các VSV tham gia trong quá trình lên men rượu ngoài giống Saccharomyces (S. cerevisiae, S. ellipsoideus), Schizosaccharomyces còn có nấm mốc Mucor (M. rouxii) hay vi khuẩn Sarcina (S. ventriculi)... 5.1.3.2. Quy trình lên men cơm rượu

Nếp trắng Nếp lức (Ngâm 30 – 60 phút)

Vo gạo Vo gạo

Nấu

Để nguội (35 – 40 oC)

Phối trộn Nghiền mịn Men ngọt

Ủ (30 oC, 3 – 4 ngày)

Sản phẩm cơm rượu 5.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị

Bảng 5.3. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị bài 5 A. HÓA CHẤT:

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 1 Nước cất 6 lít Lưu từ đầu

2 Bông không thấm nước 1,0 kg 3 Bông thấm nước 0,5 kg

.

Trang { PAGE }

Phương pháp đếm khuẩn lạc được thực hiện bằng kỹ thuật hộp đổ hay hộp trải với các thiết bị hỗ trợ (máy đếm khuẩn lạc, bút đếm khuẩn lạc) để đọc kết quả. Trong phương pháp này cần thực hiện nhiều độ pha loãng theo bậc 10 với mật độ tế bào thích hợp để có được số lượng tế bào riêng rẽ trên môi trường thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào trên 1 đĩa quá lớn, các khuẩn lạc sẽ mọc chồng chéo lên nhau không thể đếm được. Nếu mật độ tế bào trên 1 đĩa quá nhỏ, sẽ không có giá trị thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối ưu trên 1 đĩa được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín (FDA, AOAC) là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. 5.1.2.1. Phương pháp đo độ đục Mật độ VSV có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua độ cản quang (độ đục) của tế bào. Tế bào VSV cản các chùm sáng (λ, 550 – 610 nm) chiếu qua và màn chắn ánh sáng phía sau sẽ nhận được ánh sáng ít hơn so với các chùm sáng chiếu đến. Tỷ lệ ánh sáng nhận trên ánh sáng chiếu đi cho ta được giá trị mật độ quang (OD_Optical density) tuyến tính với mật độ tế bào VSV có trong mẫu. Dựng đường tương quan tuyến tính theo ví dụ sau: Lấy dịch huyền phù tế bào pha loãng ở các cấp độ khác nhau để có được các giá trị theo bảng sau:

Bảng 5.2. Các giá trị tương quan giữa mật độ quang và số lượng tế bào vi sinh vật Độ pha loãng (lần) Nước cất 5 4 3 2 1 OD610nm 0 0,16 0,28 0,44 0,61 0,71 Mật độ tế bào đếm trực tiếp (Triệu tế bào/ml) 0 5 10 15 20 25

Mật độ tế bào của đường tuyến tính có thể được đếm trực tiếp bằng buồng đếm hay kính hiển vi huỳnh quang.

Hình 5.4. Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và số lượng tế bào VSV

Đường tuyến tính được thể hiện bằng hàm số y = ax + b (x là giá trị OD của mẫu cần xác định, y là kết quả mật độ tế bào có trong mẫu) 5.1.3. Lên men ethanol Rượu ethanol là một loại sản phẩm lên men đường phổ biến của nhiều nhóm VSV. Song tác nhân lên men chủ yếu là nấm men, đặc biệt là loài Saccharomyces cerevisiae. Nhiều loài vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí tùy tiện cũng có khả năng tạo thành rượu như là một sản phẩm chủ yếu hay một sản phẩm phụ của quá trình lên men hexose và pentose.

.

Trang { PAGE }

Loại lưới đếm (Grid

type)

Chiều cao (h)

Kích thước ô vuông

nhỏ (mm) Buồng đếm (Chamber) Lưới đếm

(Grid)

Thoma 0,1 0,05 { INCLUDEPICTURE

"http://www.evolution.unibas.ch/ebert/lab/img/thoma.jpg" \*

MERGEFORMATINET }

{ INCLUDEPICTURE "http://www.evolution.unibas.ch/ebert/lab/img

/thoma.gif" \* MERGEFORMATINE

T } Semen 0,01 0,10

{ INCLUDEPICTURE "http://www.evolution.unibas.ch/ebert/lab/img/semen.jpg" \*

MERGEFORMATINET }


/semen.gif" \* MERGEFORMATINE

T } Neubauer cải

tiến 0,1 0,05

{ INCLUDEPICTURE "http://www.evolution.unibas.ch/ebert/lab/img/neubauer2.gif" \* MERGEFORMATINET }


/neubauer.gif" \* MERGEFORMATINE

T } Bürker 0,1 0,05

{ INCLUDEPICTURE "http://www.evolution.unibas.ch/ebert/lab/img/semen.jpg" \*

MERGEFORMATINET }


/buerker.gif" \* MERGEFORMATINE

T }

Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang Để quan sát và đếm trực tiếp trên kính hiển vi huỳnh quang, người ta phải nhuộm VSV bằng các chất phát huỳnh quang như: acridin cam (AODC), 4,6-dianidino-2-phenyl indol (DAPI), flourescent isothiocyanate (FITC). Số đếm nhận được từ phương pháp này luôn cho kết quả cao khoảng gấp đôi so với phương pháp đếm gián tiếp bằng khuẩn lạc. Sự khác biệt này phản ánh sự chọn lọc của môi trường, điều kiện nuôi cấy VSV, một phần tế bào bị chết hay bị tổn thương không thể mọc thành khuẩn lạc được. Số lượng VSV đếm trực tiếp bằng kính hiển vi tương đương với số lượng tế bào thực tế có trong mẫu.

5.1.2. Phương pháp định lượng gián tiếp 5.1.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào VSV còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia và tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Do vậy, phương pháp này còn có tên là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hay đếm đĩa (plate count). Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc VSV tuỳ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy.

.

Trang { PAGE }

Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bào quanh bởi hai đường rãnh hai bên. Đĩa đếm có hình tròn, thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm vì thế khi phủ lên 1 lá kính thì độ sâu của đĩa đếm đồng đều nhau. Buồng đếm Neubauer cải tiến có 16 hoặc 25 ô lớn hình vuông, mỗi ô lớn gồm 16 ô nhỏ hình vuông .

Hình 5.3. Buồng đếm Neubauer cải tiến

Chiều cao buồng đếm (h): h = 0,1 mm Cạnh 1 ô vuông nhỏ: 50 µm = 0,05 mm = 1/20 mm Diện tích của 1 ô vuông nhỏ: (1/20) mm x (1/20) mm = (1/400) mm2

Diện tích 1 ô vuông lớn (S): (1/400) mm2 x 16 = (1/25) mm2 Thể tích 1 ô vuông lớn (V): (1/25) mm2 x 0,1 mm = (1/250) mm3

Khi thực hiện quan sát VSV cần pha loãng mẫu sao cho mỗi ô lớn trong buồng đếm khoảng từ 5 – 10 tế bào VSV. Sau đó nhỏ 1 giọt mẫu lên buồng đếm và đậy lại bằng lá kính, quan sát ở vật kính 10X để tìm đúng lưới đếm rồi chuyển sang vật kính 40X. Chọn 5 ô lớn, gồm 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa. Các ô được chọn phải có số lượng mang tính đại diện cho cả buồng đếm. Kết quả được bao nhiêu lấy số trung bình cộng của 5 ô đó (A). Số tế bào có trong 1 ml mẫu ban đầu được tính theo công thức:

{ EMBED Equation.3 } (Tế bào/ml)

Trong đó: A. - số tế bào trung bình trong 1 ô vuông lớn. 1000 - hệ số chuyển đổi từ mm3 sang ml

(1 ml = 1 cm3 = 103 mm3) F – hệ số pha loãng của mẫu trước khi đếm V – Thể tích của 1 ô vuông lớn

Bảng 5.1. Các loại buồng đếm

.

Trang { PAGE }

Hình 5.2. Cấu tạo buồng đếm Neubauer cải tiến

.

Trang { PAGE }

BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT LÊN MEN ETHANOL Mục tiêu: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:

- Định lượng vi sinh vật bằng một số phương pháp phân tích gián tiếp và trực tiếp - Thực hiện quá trình lên men ethanol - Nhận biết các dấu hiệu lên men ethanol

5.1. Cơ sở lý thuyết 5.1.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật Sự hiện diện của VSV có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau, như: - Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu bằng kính hiển vi quang học

hoặc bằng kính hiển vi huỳnh quang. - Đếm gián tiếp bằng số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định hoặc đo độ đục

(mật độ quang) của tế bào… Sau đây là một số phương pháp thường dùng để định lượng VSV:

5.1.1.1. Phương pháp định lượng trực tiếp Vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như: nấm men, tảo… có thể được định lượng bằng cách đếm trực tiếp bằng buống đếm trên kính hiển vi. Phương pháp này có ưu điểm là có thể xác định được ngay lượng tế bào trong mẫu, nhưng lại có nhược điểm là không xác định được tế bào còn sống hay đã chết, dễ lầm tế bào VSV với các hạt vật thể khác có trong môi trường và dịch huyền phù VSV phải có mật độ tế bào phải lớn. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Hình 5.1. Buồng đếm hồng cầu

.

Trang { PAGE }

4.4. Yêu cầu viết báo cáo - Nêu nguyên tắc của kỹ thuật lấy mẫu dạng rắn, lỏng, và bán rắn - Trình bày các quy trình các bước từ lấy mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng và cấy

mẫu. - Phân biệt sự khác nhau của kỹ thuật hộp đổ và hộp trải.



- Pha chế môi trường đúng - Lấy mẫu đúng kỹ thuật

- Pha loãng đúng kỹ thuật, chuẩn xác. - Cấy mẫu đúng kỹ thuật

0,5 0,5 0,5 0,5

6 Kết quả: - Đếm khuẩn lạc các đĩa cấy - Tính kết quả đúng

1,0 1,0


0,5 1,5

TỔNG 10

4.6. Câu hỏi ôn tập 1. Hãy nêu các nguyên nhân làm sai lệch kết quả thường gặp khi phân tích VSV ? 2. Trong kỹ thuật phân tích tổng số VKHK, tại sao môi trường thạch được đổ ở 45 oC. 3. Trong chỉ tiêu phân tích tổng số NM-NM, tại sao ta không sử dụng kỹ thuật hộp đổ

mà lại sử dụng kỹ thuật hộp trải ? 4. Khi sử dụng môi trường Czapek-Dox thay thế môi trường DRBC trong phân tích

tổng số NM-NM có ảnh hưởng đến kết quả phân tích không ? Giải thích ?

.

Trang { PAGE }

Bước 3. Đặt đĩa Petri trên mặt phẳng ngang, xoay nhẹ đĩa Petri theo hai chiều ngược nhau mỗi chiều từ 3 – 5 lần để dịch VSV dàn đều ở mặt đáy của đĩa Petri và trộn đều trong môi trường cấy.

Bước 4. Đậy đĩa Petri, để đông tự nhiên. Bước 5. Gói giấy và ủ ở nhiệt độ thích hợp.

Hình 4.5. Phương pháp phân tích vi sinh bằng kĩ thuật hộp đổ

.

Trang { PAGE }

Bước 5 Dùng pipetteman với đầu tip vô trùng (hay pipette 1ml vô trùng) hút 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm (theo hình) để được các độ pha loãng tiếp theo.

Bước 6 Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy vortex mixer hay lắc mạnh bằng tay ta được các độ pha loãng.

4.3.2. Kỹ thuật hộp trải Sử dụng các đĩa Petri chứa môi trường Cao thịt-pepton và Czapek-Dox đã hấp khử trùng. Các Petri chứa môi trường Cao thịt –pepton dùng để phân lập vi khuẩn. Các Petri chứa môi trường Czapek-Dox dùng để phân lập nấm men hay nấm mốc. Các bước thực hiện: Bước 1. Dùng micropipette và đầu tip vô trùng hút 0,1 ml dịch VSV lên bề mặt môi

trường thạch đĩa trong không gian vô trùng. Bước 2. Nhúng đầu que trang trong cốc thuỷ tinh chứa cồn 70o, đốt trên ngọn lửa đèn cồn

để khử trùng. Để đầu que trải nguội trong không gian vô trùng (gần ngọn lửa đèn cồn).

Bước 3. Mở đĩa Petri, dùng que trang gạt đều giọt VSV trên bề mặt thạch. Dùng que trang gạt xoay đều trên bề mặt thạch. Trong khi gạt, xoay đĩa Petri tới lui 3 – 4 lần, mỗi lần ½ chu vi cho dịch VSV được trải đều khắp trên bề mặt môi trường.

Bước 4. Rút que trang khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo từng đối tượng VSV mục tiêu.

Hình 4.4. Mô hình kỹ thuật hộp trải

4.3.3. Kỹ thuật hộp đổ - Pha chế môi trường cao thịt-pepton như ở bài 2. - Chuẩn bị Petri, gói giấy không thấm nước. - Chuẩn bị ống nghiệm thạch, gói giấy không thấm nước.

Hấp khử trùng Sau khi hấp khử trùng, thực hiện các bước sau: Bước 1. Dùng micropipette và đầu típ vô trùng hoặc pipette đã vô trùng chuyển 1 ml dịch

VSV lên đĩa Petri vô trùng chưa có môi trường. Bước 2. Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trường nóng chảy ở 45 oC vào đĩa Petri đã cấy giống

VSV.

.

Trang { PAGE }

9 Cồn 950+ 700 1+2 lít 10 Nước mía 100 ml 1 lớp, SV chuẩn bị 11 Giấy nhôm 1 cuộn


1 Ống nghiệm Þ =18mm 80 cái Đồ lưu nhận từ buổi 1 2 Hộp petri Þ =100mm 80 cái 3 Bình tam giác 250 ml 22 cái 4 Ống hút 1ml 30 cái 5 Ống hút 10ml 2 cái 8 Đầu típ 1000 µl 80 cái Đã lưu từ buổi 3 7 Micropipette 1000µl 1 cái 1tổ

10 Quả bóp cao su 1 cái 1tổ 13 Que trải 1 cái 1tổ 15 Đèn cồn 1 cái 1tổ 16 Cốc thủy tinh 100ml 3 cái 1tổ 17 Cốc thủy tinh 250ml 2 cái 1tổ 18 Cốc thủy tinh 1000ml 2 cái 1lớp 19 Giá để ống nghiệm 1 cái 1tổ 20 Giá để ống hút 1 cái 1tổ 21 Đũa thủy tinh 1 cái 1tổ 22 Bình tia 1 cái 1tổ

C. THIẾT BỊ :

STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

2 Nồi hấp tiệt trùng 1 cái 1lớp 3 Tủ sấy 1 cái 1lớp 4 Tủ cấy 1 cái 1lớp 5 Tủ ấm 1 cái 1lớp 6 Tủ lạnh 1 cái 1lớp 7 Bể điều nhiệt Memmert Có giá đỡ 1 cái 1lớp 9 Cân điện tử 2 cái 1lớp

10 Bếp điện 10 cái 1lớp 11 Máy đếm khuẩn lạc 1 cái 1lớp 4.3. Các bước tiến hành 4.3.1. Kỹ thuật pha loãng mẫu Mẫu thực phẩm có thể là dạng rắn hoặc dạng lỏng Bước 1 Cân 10,0 g (hoặc 25,0 g) hoặc hút 10,0 ml (hoặc 25,0 ml) mẫu vào bình tam

giác đã có 90 ml (hay 225 ml) SPW. Bước 2 Nếu là mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) hay xay mẫu

trong cối vô trùng tối đa 2,5 phút. Bước 3 Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta được mẫu có độ pha loãng

10-1

{ EMBED ACD.ChemSketch.20 }

Hình 4.3. Kỹ thuật pha loãng

.

Trang { PAGE }

thành những khuẩn lạc riêng biệt. Từ đó chúng ta có thể gián tiếp xác định được mật độ tế bào hay bào tử gọi chung là CFU (Coloning Form Unit) có trong thực phẩm cũng như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật.

4.1.4. Kỹ thuật hộp trải (spread plate) Là kỹ thuật pha loãng theo bậc 10 dịch chứa VSV thành các mức pha loãng khác nhau và chuyển 0,1 ml dịch ở các mức pha loãng lên bề mặt môi trường thạch. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.

Hình 4.1. Kỹ thuật hộp trải

Chú ý: Người ta cũng thường dùng kỹ thuật này để nuôi cấy, phân lập hay phân tích tổng số nấm men-nấm mốc…

4.1.5. Kỹ thuật hộp đổ (pour plate) Là kỹ thuật pha loãng giống VSV như kỹ thuật hộp trải, nhưng kỹ thuật này chuyển 1ml dịch pha loãng lên hộp Petri vô trùng, sau đó đổ môi trường nóng chảy ở 45 oC (trong bể ổn nhiệt) lên đĩa và xoay vòng theo hai chiều ngược nhau vài lần để cho các tế bào phân tán vào môi trường. Sau thời gian ủ, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc mọc dưới và trên môi trường thạch. { INCLUDEPICTURE "http://www.practicalbiology.org/data/images/originals/making-a-

pour-plate-adding-agar-600-329.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 4.2. Kỹ thuật hộp đổ

Chú ý: Kỹ thuật hộp đổ thường được áp dụng trên đối tượng vi khuẩn, ví dụ như phân tích chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí

4.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị Bảng 4.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 4

A. HÓA CHẤT: STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 DRBC 1500 ml

Lưu từ đầu

2 Cao thịt 10 g 3 Pepton 40 g 4 Agar 60 g 5 NaCl 200 g 6 Nước cất 6 lít 7 Bông không thấm nước 1,0 kg 8 Bông thấm nước 0,5 kg

.

Trang { PAGE }

- Tiến hành kiểm nghiệm. Trường hợp có nhiều mẫu hàng chưa kiểm nghiệm ngay một lúc thì phải đảm bảo điều kiện bảo quản sao cho vi sinh vật trong thực phẩm không bị thay đổi cho đến khi kiểm nghiệm.

- Trong trường hợp mẫu có khối lượng lớn hoặc thể tích lớn, ta cần tiến hành lấy mẫu trong điều kiện an toàn vi sinh vật để tránh cho vi sinh vật từ môi trường xung quanh nhiễm thêm vào mẫu vừa lấy.

4.1.1.4. Lấy mẫu thực phẩm dạng lỏng Các loại thực phẩm dạng lỏng, như nước chấm, nước mắm, nước tương, dầu ăn… thường được chứa đựng trong các thùng to hay bồn thì dùng ống cao su sạch, khô đem cắm vào những vị trí trên, dưới, giữa, bên cạnh để hút . Sau đó trộn đều các mẫu đó, rồi mới lấy lượng mẫu chính xác để phân tích. Đối với các loại thực phẩm lỏng đóng gói, chai, hộp… mẫu lấy sẽ giữ nguyên bao bì. Sau đó khuấy hoặc lắc đều cho kỹ trước khi hút.

4.1.1.5. Lấy mẫu thực phẩm dạng rắn Thực phẩm là một khối rắn to, đồng nhất, lấy mẫu ở các góc, ở trong giữa. Sau đó, mẫu được đem nghiền, trộn đều, rồi mới đem cân và cho vào túi dập mẫu. Thực phẩm dạng bột đem trộn đều, cân và cho vào túi dập mẫu. Đối với các nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm ở dạng rắn, như gạo, cà phê, hạt tiêu, trà, … có thể dung cây xăm hay dụng cụ chuyên dụng khác để lấy mẫu trên, dưới, giữa, cạnh các bao. Rồi được chia mẫu trung bình trong các máy chia mẫu. Trường hợp thực phẩm đặc lẫn lỏng không đồng nhất Xay nát mẫu thực phẩm đặc lẫn lỏng thành một khối đồng nhất. Sau đó cân một lượng xác định theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích. Thường mẫu được định lượng là 10 hoặc 25 gram. 4.1.2. Ghi kết quả kiểm nghiệm Kết quả kiểm nghiệm được ghi trong một phiếu kiểm nghiệm bao gồm: - Tên và địa chỉ cơ quan kiểm nghiệm. - Số thứ tự mẫu hay mã số mẫu ghi trong sổ kiểm nghiệm. - Tên mẫu thực phẩm thử và tên nhà sản xuất. - Tên cơ quan lấy mẫu và gửi mẫu. - Ngày giờ tiếp nhận mẫu tại PTN. - Trạng thái bao bì. - Yêu cầu kiểm nghiệm. - Kết quả phân tích Chú ý: Kết quả kiểm nghiệm cần ghi theo yêu cầu kiểm nghiệm. Phiếu kiểm nghiệm do người phụ trách ký và có chữ ký duyệt của thủ trưởng. 4.1.3. Kỹ thuật pha loãng Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng theo bậc 10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW. Sau khi pha loãng dịch pha loãng sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng hoặc phân lập vi sinh vật

.

Trang { PAGE }

4.1.1.2. Nguyên tắc gửi mẫu và bảo quản mẫu - Mẫu thực phẩm gửi kiểm nghiệm được giữ trong bao bì ban đầu của nó, hoặc được chứa trong những dụng cụ không làm ảnh hưởng đến thực phẩm, tốt nhất là trong các bao bì đã khử trùng và để trong điều kiện lạnh. - Trường hợp thực phẩm phải gửi đi xa kiểm nghiệm, hoặc có nghi vấn, tranh chấp phải đóng gói kỹ, phía ngoài dán giấy có đóng dấu lên nút buộc hoặc kẹp seal chì cẩn thận, tránh mẫu thực phẩm bị đánh tráo. - Thực phẩm bị hư hỏng phải đảm bảo gửi gấp đến nơi kiểm nghiệm trong thời gian ngắn nhất để cho kết quả chính xác tình trạng của thực phẩm đó. - Thực phẩm gửi đến PTN phải có phiếu yêu cầu kiểm nghiệm kèm theo nhãn dán bao gồm:

o Cơ quan hoặc nhà máy sản xuất. o Ngày, giờ lấy mẫu, nơi lấy mẫu. o Cơ quan lấy mẫu, lý do lấy mẫu. o Nơi gửi kiểm nghiệm. o Yêu cầu kiểm nghiệm. o Biên bản lấy mẫu : Tên kiểm nghiệm viên lấy mẫu, cơ quan lấy mẫu. Nhà máy sản xuất và địa chỉ. Lý do lấy mẫu. Loại hàng và lượng hàng lấy mẫu. Lượng mẫu hàng. Những lời chỉ dẫn cần thiết. Chữ ký của đại diện hai bên hữu quan.

Chú ý: - Trường hợp mẫu hàng đã hỏng khi xác định rõ bằng trạng thái cảm quan, chỉ lấy mẫu hàng khi

chủ hàng không xác nhận sự hư hỏng của hàng.

- Trường hợp có sự khiếu nại về kết quả kiểm nghiệm, mẫu lấy lại phải tiến hành kỹ hơn, tỷ lệ lấy mẫu phải cao hơn.

- Mẫu lấy kiểm nghiệm phải giữ lại 40% để làm đối chứng khi có khiếu nại thời hạn lưu mẫu từ 1 đến 3 tháng, tùy theo mức độ dễ hư hỏng của mẫu hàng.

4.1.1.3. Chuẩn bị thử mẫu Thực phẩm khi đưa đến PTN cần tiến hành theo trình tự sau: - Kiểm tra bao bì, xem có hợp lệ hay không. - Kiểm tra lại phiếu gửi kiểm nghiệm, biên bản lấy mẫu, dán nhãn hoặc seal chì, xác

định loại thực phẩm… - Xác định yêu cầu kiểm nghiệm. - Vào sổ nhận mẫu hàng kiểm nghiệm với các lời chỉ dẫn ghi chú cần thiết.

.

Trang { PAGE }

BÀI 4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

Mục tiêu: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: - Thực hiện được thí nghiệm lấy mẫu phân tích - Thực hiện được kỹ thuật pha loãng bậc 10 - Thực hiện được kỹ thuật hộp trải và hộp đổ

4.1. Cơ sở lý thuyết 4.1.1. Phương pháp lấy mẫu thực phẩm

Lấy mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm để xác định chất lượng bằng cảm quan và phân tích trong phòng thí nghiệm (PTN) là khâu đầu tiên rất quan trọng trong công tác phân tích, góp phần vào tính chính xác của kết quả kiểm nghiệm và xử lý thực phẩm sau này. 4.1.1.1. Nguyên tắc lấy mẫu - Mẫu thực phẩm phải có tính chất đại diện cho cả một lô hàng thực phẩm đồng nhất. Lô hàng đồng nhất: là lô hàng bao gồm những sản phẩm có cùng một tên gọi, cùng một loại phẩm chất và cùng một khối lượng, đựng trong bao bì cùng 1 kiểu, cùng một kích thước, sản xuất trong cùng một thời điểm nhất định theo cùng một quy trình công nghệ. - Trước khi lấy mẫu trung bình, phải xem xét lô hàng có đồng nhất không và kiểm tra tình trạng bao bì của lô hàng đó. - Tỉ lệ lấy mẫu từ 0,5 ÷1,0% tùy theo số lượng, nhưng mỗi lần không ít hơn lượng cần thiết để phân tích. - Mẫu hàng lấy để đưa đi kiểm phải là mẫu trung bình. Nghĩa là sau khi chia thành lô hàng đồng nhất, mẫu sẽ lấy đều ở các góc, ở các phía trên dưới, giữa lô hàng và trộn đều.

Bảng 4.1. Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích STT Tên thực phẩm Lượng mẫu Đơn vị

1 Thịt và các sản phẩm của thịt 200 ÷ 500 gram 2 Cá, tôm, cua (nguyên con) 200 ÷ 500 gram 3 Trứng 5 ÷ 10 Quả 4 Nước mắm, nước chấm 500 ÷ 750 ml 5 Dấm 500 ÷ 750 ml 6 Sữa tươi 500 ÷ 750 ml 7 Dầu, mỡ 500 ÷ 750 ml 8 Rượu các loại 750 ÷ 1000 ml 9 Bột ngũ cốc, sản phẩm của bột 250 ÷ 500 gram 10 Bánh, mứt, kẹo 250 ÷ 500 gram 11 Gia vị, muối 50 ÷ 100 gram 12 Phẩm màu 20 ÷ 50 gram 13 Đồ hộp, nước giải khát 5 ÷ 10 hộp, chai

Tùy theo lô hàng và yêu cầu kiểm nghiệm, thực phẩm có thể lấy nhiều hơn mức trên.

.

Trang { PAGE }



- Kỹ thuật cấy giống - Kỹ thuật phân lập vi sinh vật

1,0 1,0

6 Kết quả: - Phân lập được khuẩn lạc riêng biệt - Đường ria đúng kỹ thuật

1,0 1,0


0,5 1,5

TỔNG 10

3.5. Câu hỏi ôn tập

1. Người ta phân lập VSV từ môi trường tự nhiên dựa trên những nguyên tắc gì? 2. Trong một nhà máy lên men bia, do sơ ý về kỹ thuật, người ta đã làm mất một

giống nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao. Em hãy đề xuất các bước tiến hành phân lập giống nấm men có đặc tính trên để thu hồi và tàng trữ nó.

3. Trình bày phương pháp phân lập vi sinh vật bằng kĩ thuật cấy ria và kĩ thuật pha loãng kết hợp với cấy trải?

.

Trang { PAGE }

Phân lập vi sinh vật - Kỹ thuật cấy ria trên đĩa thạch Sử dụng các đĩa Petri đã được chuẩn bị từ bài 2: Petri chứa môi trường Cao thịt-pepton và Czapek-Dox hoặc DRBC đã hấp khử trùng. Các Petri chứa môi trường Cao thịt –pepton dùng để phân lập vi khuẩn. Các Petri chứa môi trường Czapek-Dox hoặc DRBC dùng để phân lập nấm men hay nấm mốc.

Hình 3.2. Kỹ thuật cấy ria trên đĩa thạch

3.3. Yêu cầu viết báo cáo - Trình bày nguyên tắc phân lập vi sinh vật - Trình bày các kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật

1. Lắc đều ống nghiệm nuôi cấy VSV

2. Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa cho đến khi nóng đỏ

3. Mở nút bông và khử trùng miệng ống nghiệm

4. Nhúng que cấy vào canh khuẩn để lấy giống

5. Tiệt trùng miệng ống nghiệm và để que cấy có VSV trong không gian vô trùng

6. Tiệt trùng nút bông và đóng nút bông ống nghiệm

7. Tay trái mở nắp Petri, tay phải cầm que cấy ria trên bề mặt thạch

8. Khử trùng que cấy sau khi cấy ria xong

.

Trang { PAGE }

Các bước tiến hành 3.2.1. Kỹ thuật cấy ria 3.2.1.1. Kỹ thuật cấy ria trên ống nghiệm thạch nghiêng Sử dụng các ống nghiệm đã được chuẩn bị từ bài 2: ống thạch nghiêng môi trường Cao thịt-pepton và Czapek-Dox. Ống nghiệm thạch nghiêng môi trường Cao thịt –pepton dùng để cấy ria các giống vi khuẩn. Ống ngiệm thạch nghiêng môi trường Czapek-Dox dùng để cấy ria giống nấm men hay nấm mốc. Bước 1. 2 ống nghiệm được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út và lòng bàn tay

của tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que cấy, mở nút bông của ống chứa VSV, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa để khử trùng.

Bước 2. Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng vào canh trường lấy một ít sinh khối vi sinh vật mà không để đầu que cấy chạm vào thành và miệng ống nghiệm.

Bước 3. Mở nút bông ở ống thạch cần cấy, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi đưa que cấy vào đáy ống nghiệm ria theo đường dzích dzắc từ dưới kéo về hướng miệng ống nghiệm.

Bước 5. Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại. Bước 6. Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để

que cấy. Bước 7. Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy, ghi tên vi sinh vật và ngày

gieo cấy.

.

Trang { PAGE }

3.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị Bảng 3.1. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 3

A. HÓA CHẤT: STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 DRBC 1500 ml

Lưu từ đầu

2 Cao thịt 10 g

3 Pepton 40 g

4 Agar 60 g

5 NaCl 200 g

6 Nước cất 6 lít

7 Bông không thấm nước 1,0 kg

8 Bông thấm nước 0,5 kg

9 Giống vi sinh Giáo viên chuẩn bị

10 Giấy sticker A4 có nhiều miếng nhỏ

8 miếng Lớp


1 Ống nghiệm Þ =18mm 80 cái

Đồ lưu 2 Hộp petri Þ =100mm 80 cái 3 Bình tam giác 250 ml 22 cái 4 Ống hút 1ml 30 cái 5 Ống hút 10ml 1 cái 1tổ 8 Đầu típ 1000 µl 80 cái Lưu buổi 3 9 Pipetman 1 cái 1tổ

10 Bình tia 500ml 1 cái 1tổ 11 Quả bóp cao su 1 cái 1tổ 12 Que cấy vòng 1 cái 1tổ 13 Que cấy thẳng 1 cái 1tổ 14 Que trang 1 cái 1tổ 15 Đèn cồn 1 cái 1tổ 16 Cốc thủy tinh 100ml 2 cái 1tổ 17 Cốc thủy tinh 250ml 1 cái 1tổ 18 Cốc thủy tinh 1000ml 2 cái 1lớp 19 Giá để ống nghiệm 1 cái 1tổ 20 Giá để ống hút 1 cái 1tổ


1 Nồi hấp tiệt trùng 1 cái

1 lớp

2 Tủ sấy 1 cái 3 Tủ cấy 1 cái 4 Tủ ấm 1 cái 5 Tủ lạnh 1 cái 6 Bể điều nhiệt 1 cái 7 Cân điện tử 2 cái 8 Bếp điện 10 cái 9 Lò vi ba 1 cái

.

Trang { PAGE }

- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc nhiễm khuẩn lúc gieo cấy.

- Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáy ống nghiệm.

Lưu ý: Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút que cấy ra, chú ý phải giữ que cấy thẳng, nhẹ nhàng và không làm cho môi trường bị nứt nẻ. 3.1.2. Phân lập vi sinh vật VSV tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài VSV. Việc phân lập 1 loài nhất định trong quần xã VSV dựa vào khả năng phân tách các tế bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc. Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng để phân tách tế bào VSV kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo ưu thế tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau: 3.1.2.1. Kỹ thuật hộp ria (streak plate) Là kỹ thuật phân tách hỗn hợp VSV bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao cho các tế bào riêng rẽ nhau ra. Sau khi được ủ trong một thời gian, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành do sự sinh sản, phân chia từ một tế bào ban đầu. Trong kỹ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn hảo tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau đây là môt số kỹ thuật ria thường dùng:

Kỹ thuật ria chữ T (T streak) Kỹ thuật ria liên tục (continuous streak) Kỹ thuật ria 4 góc (quadrant streak) Kỹ thuật ria tia (radiant streak)

Hình 3.1 Các kiểu ria trên môi trường thạch Chú ý: Sau mỗi vùng ria, người ta phải tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Kỹ thuật hộp trải (học ở bài 4)

.

Trang { PAGE }

BÀI 3. KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT Mục tiêu: Sau khi học xong, sinh viên có khả năng:

- Thực hiện các kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật - Thực hiện các kỹ thuật phân lập vi sinh vật

3.1. Cơ sở lý thuyết 3.1.1. Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật Mục đích của việc gieo cấy VSV để nhân giống vi sinh vật; phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nước, đất...) cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa của đối tượng VSV mục tiêu. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng Dùng que cấy vòng và làm theo trình tự các bước như sau: - Ồng nghiệm được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út và lòng bàn tay của

tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que cấy, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa.

- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy chạm vào thành và miệng ống nghiệm.

- Đầu que cấy có dính VSV được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn. - Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi

đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ que cấy. - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại. - Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để que

cấy. - Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy: ghi tên vi sinh vật và ngày gieo cấy. Chú ý : Khi cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm kia có thể cầm hai ống

nghiệm cùng một lúc trên cùng bàn tay trái. Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm thạch nghiêng Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi lấy được sinh khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào trong ống nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên. Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng. Các bước tiến hành cũng tương tự như mục 1.1 và 1.2, nhưng có điểm khác như sau:

.

Trang { PAGE }



- Pha môi trường không bị cháy khét, lợn cợn hoặc kết tủa.

- Làm tiêu bản cho hình ảnh quan sát mẫu đẹp

1,0

1,0

6 Kết quả: - Môi ường trên đĩa đều, phẳng, không vẩn

đục. - Môi trường sau đổ không bị nhiểm VSV

1,0

1,0


0,5 1,5

TỔNG 10

2.6. Câu hỏi thảo luận (1). Trong kỹ thuật nuôi cấy VSV, mỗi loài hoặc mỗi nhóm VSV khác nhau, tại sao cần

phải pha chế các loại chất khác nhau và hàm lượng cũng khác nhau? (2). Khi pha chế môi trường Czapek-Dox, tại sao phải cân riêng thành phần K2HPO4

và cho vào sau khi trộn chung ½ thể tích agar nóng chảy và ½ thể tích hỗn hợp các chất hòa?

(3). Hãy cho biết tại sao môi trường thạch đĩa cần phải được úp ngược sau khi làm nguội?

(4). Giải thích tại sao môi trường nuôi cấy cần nên được làm nguội khoảng 45-55oC trước khi chúng được rót vào đĩa Petri?

.

Trang { PAGE }

Sau khi pha chế môi trường Cao thịt-pepton và Czapek-Dox còn đang nóng chảy, phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm có 7 – 8 ml môi trường. Sau đó, làm nút bông bằng bông không thấm nước và bịt nắp ống nghiệm. Sau khi hấp tiệt trùng, Các ống nghiệm thạch nghiêng sẽ được để nghiêng < 25o sao cho phần thạch nghiêng khoảng 1/2 - 2/3 ống nghiệm. Không được để môi trường chảy gần miệng và nút bông. Để yên, chờ cho môi trường đông lại. Đem bảo quản ở nhiệt độ ở 4oC.

2.3.7. Đổ đĩa Bước 1. Đĩa Petri sau khi hấp tiệt trùng phải được sấy khô Bước 2. Tắt quạt, lau khu vực làm việc, lau tay bằng cồn 70o C và khi mặt bàn khô cồn

rồi đốt đèn cồn. Bước 3. Chờ cho môi trường nguội đến 45 –55o C, dùng khăn trắng đã hấp tiệt trùng cầm

bình tam giác đổ môi trường vào các đĩa Petri với độ dày 3 – 4 mm tính từ đáy lên trong không gian vô trùng gần ngay trên ngọn lửa đèn cồn. Trong quá trình đổ đĩa, sinh viên không được nói chuyện và làm các động tác mạnh gây xáo trộn không khí.

Bước 4. Đặt đĩa Petri trên mặt phẳng ngang, chờ cho đông thạch, gói lại và bảo quản. Chú ý : Bình thường chúng ta phải làm các thao tác này trong tủ cấy vô trùng. 2.4. Yêu cầu viết báo cáo

- Nêu vắn tắt cơ sở lý luyết về dinh dưỡng VSV - Trình bày dụng cụ, hóa chất và thiết bị cần thiết trong bài. - Nêu các bước tiến hành pha chế môi trường dinh dưỡng cơ bản, hấp khử trùng và

đổ môi trường vào đĩa Petri. - Ý nghĩa của việc bao gói và hấp khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy VSV

- Nhận xét và thảo luận các nguyên nhân bị nhiễm VSV trong quá trình đổ đĩa.

.

Trang { PAGE }

khi hấp, môi trường sẽ bị đẩy hết ra ngoài do áp lực tăng khi gia nhiệt trong quá trình hấp.

- Cuốn giấy bình tam giác : Bình tam giác cũng sẽ được cuốn giấy như phần của miệng ống nghiệm.

- Cuốn giấy dụng cụ khác : Các dụng cụ cũng được cuốn giấy như: các loại que cấy, pipette, cốc thủy tinh, khăn lau…

2.3.5. Hấp tiệt trùng môi trường và dụng cụ Môi trường để hấp tiệt trùng: Các bình tam giác và các ống nghiệm chứa môi trường cao thịt-pepton, Czapek-Dox… Dụng cụ để hấp tiệt trùng: Đĩa Petri, ống nghiệm, que cấy vòng, que trang, khăn trắng... Tất cả đều được bao bằng giấy trước khi cho vào nồi hấp. Cách vận hành nồi hấp cơ (tại PTN): Bước 1. Kiểm tra mực nước ở trong khoảng an toàn Bước 2. Bật công tắc để gia nhiệt trước (10 – 15 phút) Bước 3. Đặt các dụng cụ và dụng cụ chứa môi trường vào buồng hấp Bước 4. Kiểm tra và đóng các valve xả và valve an toàn Bước 5. Đậy nắp và vặn ốc đối xứng nhau từng đôi một Bước 6. Khi đồng hồ áp lực chỉ 0,4 – 0,5 kg/cm2 thì xả khí lần một cho tới khi đồng hồ

áp lực chỉ 0,1 kg/cm2 hay khi thấy luồng khí xả xuất hiện dòng khí trắng liên tục thì đóng valve xả

Bước 7. Chờ cho đồng hồ áp lực chỉ 1 atm hay nhiệt độ chỉ 121 oC, tính giờ và canh 15 phút

Bước 8. Hết giờ, mở valve xả khí từ từ, khi áp suất càng giảm thì mở valve càng lớn Bước 9. Khi đồng hồ áp lực chỉ 0 kg/cm2 và valve xả không còn thấy dòng khí xả màu

trắng, mở nắp nồi hấp và lấy dụng cụ và dụng cụ chứa môi trường trong nồi hấp ra.

Cách vận hành nồi hấp tự động : Bước 1. Mở nắp nồi hấp ra, lấy hai cái giỏ inox nhỏ và 1 cái giỏ inox lớn ra. Bước 2. Cho nước cất vào nồi hấp sao cho ngập con ốc cảm ứng mực nước khoảng 1 – 2

cm (bên cạnh vòng điện trở). Sau đó cho giỏ inox lớn vào nồi. Bước 3. Cho các dụng cụ và môi trường vào các giỏ nhỏ, rồi đưa vào nồi hấp. Bước 4. Đóng nắp nồi hấp và khóa valve exhaust. Bước 5. Bật CP ở bên hông, cài đặt thông số 121 oC, 15 phút, bấm nút ‘set’ và bấm nút

‘start’. Bước 6. Khi nồi hấp có báo hiệu ‘tit…tit…’ lần 2, mặt hiển thị báo nhiệt độ 97 oC và có

đèn báo ‘complete’ chớp chớp màu đỏ, thì mở nồi hấp ra, chờ 1 phút cho bớt nóng và lấy dụng cụ và môi trường ra.

2.3.6. Làm ống nghiệm thạch nghiêng Ống nghiệm thạch nghiêng dùng để nuôi cấy và giữ giống theo phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh.

.

Trang { PAGE }

Bước 4. Đổ ½ thể tích dịch chứa thành phần các muối khoáng vào ½ thể tích dịch agar đang sôi, khuấy đều và tắt bếp.

Bước 5. Khi nhiệt độ môi trường hạ xuống 50 oC, cho K2HPO4 vào hỗn hợp ở bước 4 và khuấy đều.

Bước 6. Phân phối vào các dụng cụ chứa, làm nút bông không thấm nước, bịt nắp giấy , dán nhãn tên nhóm và tên môi trường, và đem đi hấp tiệt trùng.

2.3.3. Làm nút bông Cách làm này dùng để ngăn nhiễm vi sinh vật từ ngoài vào môi trường trước vào sau khi cấy vi sinh vật. Bước 1. Dùng tay xé một miếng lớp bông hình chữ nhật, gấp các rìa miếng bông vào trong cho gọn không bị xù. Bước 2. Cuốn chặt lại thành nút sao cho vừa khít ống nghiệm (không quá chặt, nhưng cũng không quá lỏng). Người ta cũng có thể làm nút bông bằng cách cuốn vải mùng bên ngoài và cột lại bằng một sợi chỉ sao cho có thể đưa nút bông vào và lấy ra một cách dễ dàng (cách làm này tốt nhưng phải mất nhiều công sức và thời gian). 2.3.4. Bao giấy dụng cụ : Mục đích là ngăn ngừa vi sinh vật nhiễm vào môi trường trước và sau khi cấy; để tránh vỡ dụng cụ bằng thủy tinh trong quá trình thao tác. Tốt nhất là dùng giấy không thấm nước. Vì giấy thấm nước dễ bị rách trong quá trình thao tác sau khi hấp khử trùng. Trong phòng thí nghiệm vi sinh vật, người ta thường cuốn giấy trên nhiều dụng cụ : - Cuốn giấy ống nghiệm : tùy theo mục đích của việc nuôi cấy mà nên cuốn theo từng

kiểu cho phù hợp : o Mục đích là giữ giống : Người ta cuốn giấy tạo thành như một nắp chụp có thể lấy

ra và chụp vào dễ dàng. Vì nắp chụp này sẽ được dùng đi dùng lại nhiều lần sau mỗi lần lấy giống trong ống nghiệm ra. Ở kỹ thuật này, mép cuốn sau cùng sẽ gấp nhét hoặc được dán bằng băng keo, nhưng không dùng thun cột.

o Mục đích là phân tích : nắp giấy ống nghiệm sử dụng một lần rồi bỏ. Nên ta có thể cuốn đơn giản hơn và giữ mép giấy bằng một sợi thun.

- Gói giấy đĩa Petri : Bước 1. Đặt 1 hoặc 2, 3 cái đĩa trên một tờ giấy hình chữ nhật đã được cắt phù hợp. Bước 2. Túm lấy hai cạnh nhỏ của hình chữ nhật gấp cuộn mép 2 – 3 lần cho chặt vừa các đĩa. Bước 3. Sau đó ấn hai đầu mép còn lại xuống và gấp mép hình tam giác nhọn ở giữa như gói quà. Bước 4. Gấp ngược hai hình tam giác đó xuống sao cho chồng đĩa đè lên nếp gấp.

- Cuốn giấy bó ống nghiệm có chứa môi trường: Bó ống nghiệm thường từ 4 – 6 ống sẽ được cuốn xung quanh đáy ống nghiệm. Chiều cao giấy từ đáy lên 1/3 ống nghiệm và được cột lại bằng một sợi thun. Phần trên miệng ống nghiệm cũng cuốn tương tự như ở phần đáy và để hở ở phần giữa của bó ống nghiệm. Cần phân biệt được phần đầu và đáy của bó ống nghiệm để tránh cho vào nồi hấp để lộn ngược và kết quả sau

.

Trang { PAGE }

3 Bình tam giác 250 ml 22 cái 4 Ống hút 1ml 30 cái 5 Ống hút 10ml 1 cái 1tổ 6 Bình tia 500ml 1 cái 1tổ 7 Cốc thủy tinh 100ml 2 cái 1tổ 8 Cốc thủy tinh 250ml 1 cái 1tổ 9 Giá để ống nghiệm 1 cái 1tổ

10 Giá để ống hút 1 cái 1tổ 11 Đũa thủy tinh 1 cái 1tổ 12 Quả bóp cao su 1 cái 1tổ 13 Cốc thủy tinh 500ml 2 cái 1 lớp 14 Giấy báo 2 kg SV chuẩn bị 15 Thun buộc 1 g SV chuẩn bị 16 Kéo 1 cái 17 Hộp quẹt 1 cái 18 Tấm amiang 1 cái 1 tổ

C. THIẾT BỊ

STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 1 Nồi hấp tiệt trùng 1 cái Lớp 2 Tủ sấy 1 cái Lớp 3 Tủ ấm 1 cái Lớp 4 Tủ lạnh 1 cái Lớp 5 Bể điều nhiệt 1 cái Lớp 6 Cân điện tử 2 cái Lớp 7 Bếp điện 1 cái 1 tổ 8 Lò vi ba 1 cái Lớp 9 pH kế Để bàn 1 cái Lớp

2.3. Các bước tiến hành 2.3.1. Pha chế môi trường Cao thịt – pepton : Bước 1. Cân agar cho vào ½ thể tích nước định sẵn cho các nhóm. Sau đó, nấu sôi trên

bếp điện (có miếng amiante) cho agar nở hết. Bước 2. Cân thành phần cao thịt, pepton và NaCl của môi trường theo công thức cho

trước. Sau đó, hòa tan chúng vào ½ thể tích nước còn lại. Bước 3. Đổ ½ thể tích dịch chứa cao thịt, pepton và NaCl vào ½ thể tích dịch agar đang

sôi, khuấy đều và tắt bếp. Bước 4. Phân phối vào các dụng cụ chứa, làm nút bông không thấm nước, bịt nắp giấy,

dán nhãn có tên nhóm và tên môi trường, và đem đi hấp tiệt trùng. 2.3.2. Pha chế môi trường Czapek – Dox: Bước 1. Cân agar cho vào ½ thể tích nước định sẵn cho các nhóm. Sau đó, nấu sôi trên

bếp điện (có miếng amiante) cho agar nở hết. Bước 2. Cân thành phần khoáng có khả năng gây tủa (K2HPO4) với các muối khoáng

khác để riêng. Bước 3. Cân các muối khoáng còn lại của môi trường theo công thức cho trước. Sau đó,

hòa tan chúng vào ½ thể tích nước còn lại.

.

Trang { PAGE }

Hấp bằng nhiệt ẩm ở 121 oC, 1 kg/cm2 (1 atm 1 bar 1 kg/cm2) trong 15 – 30 phút tiêu diệt hoàn toàn các dạng sống của VSV.

Bảng 2.2. Mối quan hệ giữa nhiệt độ và áp suất Áp suất (kg/cm2) Nhiệt độ (oC)

0,00 0,25 0,50 1,00 1,50 2,00

100 107 112 121 129 135

2.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị 2.2.1. Môi trường và hóa chất

Bảng 2.3. Thành phần của một số loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường cao thịt – pepton Môi trường Czapek - Dox

Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Cao thịt 3 g NaNO3 2,0 g FeSO4 0,1 g Pepton 10 g K2HPO4 1,0 g Sucrose 30 g NaCl 5 g MgSO4 0,5 g Agar 20 g Agar 20 g KCl 0,5 g Nước cất 1000 ml Nước cất 1000ml pH cuối 7,3 ± 0,2

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị Bảng 2.4. Dụng cụ và thiết bị bài 2

A. HÓA CHẤT:

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 DRBC 1500 ml

Lưu từ đầu

2 Cao thịt 10 g

3 Pepton 40 g

4 Agar 60 g

5 NaCl 200 g

6 HCl Dd 20% 20 ml

7 NaOH Dd 20% 20 ml


9 Bông không thấm nước 1,0 kg

10 Bông thấm nước 0,5 g

11 Cồn 950+ 700 1+2 lít B. DỤNG CỤ :

STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Ống nghiệm Þ =18mm 80 cái Lưu 2 Hộp petri Þ =100mm 80 cái

.

Trang { PAGE }

Là loại môi trường được pha chế sẵn (có thể là tổng hợp hay bán tổng hợp) dạng khô với các thành phần được định sẵn bởi nhà sản xuất. Cho nên, các loại môi trường đông khô này hạn chế sự biến động các thành phần của môi trường . Người ta thường dùng những loại môi trường này để phân tích VSV.

Ví dụ : Môi trường định lượng tổng số nấm men – nấm mốc DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol, sản phẩm của hãng Merck). Môi trường hộp đổ PCA _Plate count agar (hãng Merck cung cấp).

2.1.3. Pha chế môi trường 2.1.3.1. Chuẩn bị môi trường lỏng Cân từng thành phần của môi trường. Hòa tan từng thành phần môi trường trong một lượng nước nhỏ. Sau đó trộn lẫn tất

cả tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau và thêm nước cho đủ thể tích xác định.

Kiểm tra pH môi trường bằng pH kế và chỉnh pH bằng dung dịch HCl và NaOH. Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa, đóng nút bông (bông không thấm

nước), bịt nắp giấy hay vặn nắp đối với ống nghiệm có nắp. Hấp tiệt trùng (121 oC, 15 phút) trong nồi hấp và làm nguội ở nhiệt độ phòng, gieo

cấy VSV ngay hoặc đem đi bảo quản trong tủ lạnh ( 4oC). 2.1.3.2. Chuẩn bị môi trường rắn và bán rắn Đối với môi trường có chứa chất làm đặc như : agar, gelatin cần phải nấu chảy agar

trong ½ thể tích nước dùng để pha môi trường. Cân và khuấy tan các thành phần khác của môi trường trong ½ lượng nước còn lại. Khi agar tan chảy hoàn toàn, trộn lẫn dung dịch các chất dinh dưỡng với dung dịch

có chứa agar với nhau, khuấy đều. Phân phối môi trường đang nóng chảy vào các dụng cụ chứa. Các bước tiếp theo tương tự như môi trường lỏng

2.1.4. Khử trùng dụng cụ và môi trường VSV có thể bị tiêu diệt bởi các tác nhân như : nhiệt độ, tia bức xạ, lọc và hóa chất. Đối PTN vi sinh thường người ta khử trùng dụng cụ và môi trường bằng nhiệt, trong một số trường hợp khi môi trường có thành phần dễ bị phân huỷ bởi nhiệt độ thì người ta dùng phương pháp lọc. Khử trùng bằng nhiệt khô : Các dụng cụ thuỷ tinh có thể được khử trùng bằng cách sấy ở 170 – 180 oC trong 2

giờ. Các dụng cụ khử trùng dạng này cần được gói và cuốn giấy trước khi cho vào tủ sấy.

Các que cấy có thể được khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Khử trùng bằng nhiệt ẩm : Đun ở 63 oC trong 30 phút hoặc 72 oC trong 15 phút có thể tiêu diệt được VSV gây

bệnh hay VSV hoại sinh trong thực phẩm. Đun ở 100 oC có thể tiêu diệt được tế bào sinh dưỡng VSV.

.

Trang { PAGE }

Là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không có tính chọn lọc, làm giàu mật độ của các VSV hiện diện trong mẫu. Loại môi trường này giàu dinh dưỡng không có các chất ức chế tăng trưởng chọn lọc, có tác dụng phục hồi và giúp sự tăng trưởng đồng thời của nhiều loại VSV hiện diện trong thực phẩm nhưng ít nhiều bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm.

Ví dụ : Nước muối pepton (SPW_ Saline Pepton Water) kích thích sự tăng trưởng của các loài vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceace trong kiểm nghiệm một số chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm.

Môi trường tăng sinh (enrichment media) Là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối tượng VSV cần kiểm nghiệm và ức chế sự tăng trưởng của các loài VSV khác do có chứa các chất ức chế tăng trưởng đặc hiệu.

Ví dụ: Môi trường Tetrathionate là môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella. Môi trường Listeria enrichment Broth I & II (LB I & II) là môi trường tăng

sinh chọn lọc cấp I và II cho Listeria. Môi trường chọn lọc (selective media) Là môi trường rắn dùng để phân lập các khuẩn lạc đơn của đối tượng cho VSV mục tiêu. Các môi trường phân lập khác nhau có mức độ chọn lọc khác nhau. Thông thường để phân lập và xác định VSV, người ta sử dụng vài môi trường có mức chọn lọc khác nhau. Mức độ chọn lọc có thể kiểm soát bằng các chất ức chế tăng trưởng, thành phần môi trường, nhiệt độ, oxi…

Ví dụ: Môi trường DRBC là môi trường chọn lọc nấm men – nấm mốc nhưng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn.

Môi trường phân biệt (differential media) Là môi trường rắn có chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối tượng VSV mục tiêu.

Ví dụ: Môi trường thạch máu Trypticase Soy Sheep là môi trường phân biệt một số loài vi khuẩn có khả năng làm tan huyết xung quanh khuẩn lạc, như Bacillus cereus, B. thuringiensis và B. mycoides với loài vi khuẩn không có khả năng làm tan huyết B. anthracis sau 24 giờ.

Môi trường chọn lọc – phân biệt (selective – different media) Là môi trường kết hợp giữa công dụng chọn lọc và phân biệt nhờ sự sử dụng kết hợp các hóa chất khác nhau.

Ví dụ: Môi trường Manitol Salt Agar chứa muối có nồng độ cao (7,5%) giúp sự tăng trưởng chọn lọc của Staphylococcus trong khi ức chế sự tăng trưởng của đa số các VSV khác. Mặt khác manitol và chỉ thị pH trong môi trường giúp nhận diện các khuẩn lạc Staphylococcus dựa vào khả năng lên men manitol sinh acid làm đổi màu của chỉ thị đỏ phenol.

Môi trường thử nghiệm sinh hóa Là môi trường dùng để xác định một hoặc một vài đặc điểm sinh hóa của của chủng VSV đã được phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để định danh chủng phân lập.

Ví dụ: Môi trường MIR (Motility Indol Red) dùng để xác định tính di động, khả năng tạo indol và khả năng phân giải urea của một chủng phân lập.

Môi trường đông khô thương phẩm

.

Trang { PAGE }

Nồng độ thích hợp của các gốc kiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 g /ml

Nồng độ thích hợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 g/ml (1 g = 10-6 g ) 2.1.2. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường nơi cung cấp đầy đủ các thành phần về dinh dưỡng (nguồn nitơ, nguồn carbon, khoáng đa-vi lượng, chất sinh trưởng...) cho sự phát triển của VSV. Tuỳ theo mục đích mà thành phần, hàm lượng các chất trong môi trường là khác nhau. Môi trường có thể được phân loại theo cấu trúc, thành phần và công dụng. 2.1.2.1. Phân loại môi trường nuôi cấy VSV theo cấu trúc Môi trường lỏng Thường dùng để tăng sinh, thử nghiệm sinh hóa, nhân giống thứ cấp, lên men… của VSV. Môi trường lỏng không chứa chất làm đặc môi trường , như : agar, gelatin...

Vídụ : Môi trường cao malt lên men bia (lên men chìm) Môi trường rắn Ngoài các thành phần dinh dưỡng, môi trường rắn là môi trường có thêm thành phần làm đặc (agar, gelatin...). Người ta thường dùng loại môi trường này để phân lập VSV, quan sát khuẩn lạc, định lượng VSV (trong phân tích các chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men-nấm mốc...) hay nghiên cứu những đặc tính khác của VSV.

Ví dụ : Môi trường thạch Hansen nuôi cấy nấm men Môi trường bán rắn Giống như môi trường rắn, nhưng môi trường bán rắn có hàm lượng chất làm đặc ít hơn nên cấu trúc của môi trường mềm và xốp hơn. Người ta thường dùng nó trong việc xác định khả năng chuyển động của VSV.

Ví dụ : Môi trường thạch mềm Oxford xác định khả năng di động của Listeria monocytogenes

2.1.2.2. Phân loại môi truờng nuôi cấy VSV theo thành phần Môi trường tổng hợp Là loại môi trường có thành phần hóa học xác định, được pha chế từ những hóa chất tinh khiết.

Ví dụ : Môi trường nuôi cấy nấm men-nấm mốc Czapek-Dox Môi trường tự nhiên Là loại môi trường chứa các thành phần có nguồn gốc từ tự nhiên, không có thành phần hóa học rõ ràng.

Ví dụ : Môi trường nuôi cấy nấm mốc cám trấu Môi trường bán tổng hợp Là loại môi trường vừa có một số thành phần hóa học xác định vừa có một số thành phần có nguồn gốc từ tự nhiên gồm những hỗn hợp chất chưa xác định rõ.

Ví dụ: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn thạch máu cơ bản, nuôi cấy nấm men – nấm mốc PGA (Potato, Glucose, Agar) 2.1.2.3. Phân loại môi truờng nuôi cấy VSV theo công dụng Môi trường tiền tăng sinh (preenrichment media)

.

Trang { PAGE }

BÀI 2. KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

Mục tiêu: Sau khi học xong, sinh viên có khả năng:

- Phân biệt các loại môi trường nuôi cấy và phân tích. - Pha chế được các loại môi trường cơ bản. - Áp dụng được các phương pháp tiệt trùng môi trường, dụng cụ - Bao gói dụng cụ - Đổ môi trường vào đĩa Petri, làm ống nghiệm thạch nghiêng

2.1. Cơ sở lý thuyết 2.1.1. Dinh dưỡng vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết khác nhau. Thành phần dinh dưỡng này tuỳ thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh vật. Ví dụ: Có loài vi sinh vật cần nhiều protein, nhưng cần ít glucide; Có loài cần nhiều nguyên tố vi lượng, nhưng có loài cần ít; Có loài trong quá trình phát triển không thể thiếu các chất tăng trưởng. Mọi cơ thể sống đều được cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O và N gọi là các nguyên tố thiết yếu của sự sống. Nhìn chung các nguyên tố thiết yếu không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài ra các nguyên tố thiết yếu, trong các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa lượng như: S và P, các nguyên tố vi lượng như: Fe, Cu, Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I…Vì thế trong thành phần dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ thể thực vật, động vật hoặc VSV. Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 – 0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%.

Bảng 2.1. Nhu cầu khoáng đối với một số vi sinh vật

Loại muối khoáng Nồng độ cần thiết (%) Vi khuẩn Vi nấm và xạ khuẩn

K2HPO4 0,2 – 0,5 1 – 2 KH2PO4 0,2 – 0,5 1 – 2 MgSO4.7H2O 0,1 – 0,2 0,2 – 0,5 MnSO4.7H2O 0,005 – 0,01 0,02 – 0,1 FeSO4.7H2O 0,005 – 0,01 0,05 -0,2 Na2MoO4 0,001 – 0,005 0,01 – 0,02 ZnSO4.7H2O - 0,02 – 0,03 CoCl2 0,03 0,06 CaCl2 0,01 – 0,03 0,02 – 0,1 CaSO4.5H2O 0,001 – 0,005 0,001 – 0,05

Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin, các acid béo, các thành phần của màng tế bào...

.

Trang { PAGE }

- Hình thức trình bày báo cáo - Nội dung bài báo cáo đầy đủ yêu cầu đề ra

0,5 1,5

TỔNG 10

1.6. Câu hỏi thảo luận 1. Nêu kỹ thuật chỉnh kính hiển vi khi quan sát trạng thái sống và trạng thái chết. 2. Sau khi quan sát hình thái của VSV, em hãy nêu sự khác biệt cơ bản về hình dạng

của vi khuẩn, nấm men và nấm mốc ? 3. Sau khi thao tác với VSV, người ta thường dùng cồn 70o để tiệt khuẩn tay và nơi

làm việc mà không dùng cồ 90o hay 60o, giải thích ?

.

Trang { PAGE }

Hình 1.26. Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím

{ INCLUDEPICTURE "http://3.bp.blogspot.com/_X5UZqPW3nj4/RXhFxtYitkI/AAAAAAAAABM/i

Abqr0vIV3I/s320/gram+neg.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.27. Vi khuẩn Gram âm (có màu hồng đỏ)

1.4. Yêu cầu viết báo cáo - Trình bày các quy tắc an toàn trong PTN vi sinh vật - Trình bày các kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm đơn và nhuộm kép (nhuộm Gram). - Vẽ kết quả quan sát hình thái của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn - Phân biệt hình thái của ba nhóm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc



- Điều chỉnh kính quan sát thấy mẫu vật - Làm tiêu bản cho hình ảnh quan sát mẫu đẹp

1,0 1,0

6 Kết quả: - Vẽ hình 3 mẫu nấm men, nấm mốc và vi

khuẩn - Phân biệt được hình thái của 3 nhóm vi sinh

vật

1,0

1,0

7 Báo cáo

.

Trang { PAGE }

Bước 6. Nhìn vào thị kính, điều chỉnh ốc chỉnh thô từ từ cho đến khi thoáng thấy vật thì điều chỉnh ốc chỉnh tinh để trông rõ vật.

1.3.2. Tạo tiêu bản quan sát khuẩn ty nấm mốc (hay khuẩn ty xạ khuẩn) Để quan sát nấm mốc hay xạ khuẩn người ta cần tạo một trong hai dạng tiêu bản là tiêu bản nhuộm sống và tiêu bản phòng ẩm. Nhưng với thời lượng thực hành có giới hạn nên chúng ta chỉ thực hiện tiêu bản nhuộm sống. Các bước tạo tiêu bản nhuộm sống khuẩn ty nấm mốc: Bước 1. Sử dụng que cấy móc lấy một ít khuẩn ty nấm mốc, rửa bớt bào tử bằng cách đặt

sinh khối khuẩn ty vào dung dịch xà phòng (nước rửa chén) pha loãng và khuấy nhẹ.

Bước 2. Đặt sinh khối khuẩn vào giọt carbofuchsin trên phiến kính. Dùng hai que cấy móc hoặc 1 que cấy móc và 1 que cấy thẳng để tách rời các sợi khuẩn ty trong giọt carbofuchsin trên phiến kính và đậy lá kính.

Bước 3. Đặt lên bàn mẫu, quan sát bằng vật kính 10X để tìm ảnh và chuyển qua vật kính 40X để quan sát chi tiết.

1.3.3. Nhuộm Gram (tiêu bản nhuộm màu kép) Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm kép để phân biệt hai nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm do Han Christian Gram người Đan Mạch lần đầu tiên mô tả vào năm 1844. Khi cùng nhuộm màu tế bào theo cùng phương pháp, tế bào vi khuẩn G(+) vẫn giữ được màu tím, còn vi khuẩn G(-) bị mất màu tím. Tiến hành: Bước 1. Cho 1 giọt sinh khối vi khuẩn lên phiến kính, cố định vi khuẩn trên phiến kính

bằng cách hơ khô vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. Chú ý không để quá gần ngọn lửa làm cháy vết bôi.

Bước 2. Nhuộm vết bôi bằng dung dịch tím kết tinh, nhỏ 2 giọt methyl violet lên vệt bôi, giữ 30 giây. Tiếp theo, dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm, rồi hơ khô.

Bước 3. Nhuộm vết bôi bằng dung dịch Lugol, nhỏ 2 giọt I2/KI lên vết bôi, để 1 phút. Sau đó, dùng bình tia chứa cồn 95% rửa thật sạch phẩm nhuộm đến khi mất hết màu, rồi rửa lại bằng nước và hơ khô.

Bước 4. Nhuộm vết bôi bằng safranin (hoặc carbofuchin), nhỏ 2 giọt safranin lên vết bôi, để yên 30 giây. Sau đó, rửa vết bôi bằng nước, hơ khô, nhỏ 2 giọt dầu soi kính lên vệt bôi và quan sát ở vật kính 100X.

.

Trang { PAGE }

2 Tủ sấy 1 cái Để giới thiệu cho học sinh, không dùng 3 Tủ cấy 1 cái

4 Tủ ấm 1 cái 5 Tủ lạnh 1 cái 6 Bể điều nhiệt 1 cái 7 Cân điện tử 1 cái 8 Máy dập mẫu 1 cái 9 Máy lắc (votex) 1 cái

10 Kính hiển vi quang học 1 cái 1tổ 11 Lò vi ba 1 cái Lớp

1.3. Các bước tiến hành 1.3.1. Tạo tiêu bản quan sát vi khuẩn và nấm men 1.3.1.1. Tạo tiêu bản quan sát VSV ở trạng thái sống hay còn gọi là tiêu bản giọt

ép (quan sát VSV ở vật kính 40X) Bước 1. Lấy một phiến kính sạch cho một giọt nước hay 1 giọt phẩm màu methylene

blue (0,1%). Sau đó cho VSV hòa tan trong giọt nước hay giọt màu loãng đó. Bước 2. Đậy lá kính sao cho chân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu, nghiêng

một góc 45o và hạ lá kính xuống để không có bọt khí.

Hình 1.25. Cách làm tiêu bản quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống

Bước 3. Đặt phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, quan sát ở vật kính 10X, dùng ốc chỉnh thô nâng bàn vật mẫu chạm tới vật kính, đặt mắt vào quan sát, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu xuống cho đến khi thấy ảnh VSV rồi dùng nút chỉnh tinh vặn để xem rõ ảnh VSV. Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật di chuyển phiến kính đến vùng muốn quan sát trong thị trường.

Bước 4. Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính 40X và điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh.

Chú ý : Ngoài nấm men và vi khuẩn, đối tượng quan sát cũng có thể là bào tử nấm mốc... 1.3.1.2. Tạo tiêu bản quan sát VSV ở trạng thái chết (tiêu bản nhuộm màu đơn) Bước 1. Cố định VSV bằng cách cho một giọt sinh khối VSV trải đều lên phiến kính sạch,

hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi khô (không còn ướt, nhưng không được cháy).

Bước 2. Cho 1 giọt (lớn) phẩm nhuộm đơn (methylene blue 0,1% hoặc Carbofuchsin 0,1% ) lên vết VSV đã cố định để trong 5 phút.

Bước 3. Rửa nước bằng đầu xịt của bình tia cho đến khi sạch màu và làm khô bằng ngọn lửa đèn cồn (có thể dùng giấy mềm để thấm nhẹ nước, nhưng không dùng giấy mềm để lau).

Bước 4. Nhỏ một giọt dầu cèdre lên vết nhuộm, đưa lên bàn mẫu. Bước 5. Nâng tụ quang, mở chắn sáng. Nhìn từ ngoài, hạ vật kính 100X xuống chìm vào

giọt dầu cèdre.

.

Trang { PAGE }

1 Dầu soi kính 40 ml 1lớp 2 Dd lau kính Xylol 30 ml 1lớp

3 Dd xanh methylen 1% 30 ml 1lớp

4 Lugol(I2/KI) Bộ nhuộm

Gram

20 ml 1lớp 5 Safranin 20 ml 1lớp

6 Methylviolet 20 ml 1lớp

7 DRBC 1500 ml

Lưu từ đầu

8 Cao thịt 10 g

9 Pepton 40 g

10 Agar 60 g

11 NaCl 200 g


13 Bông không thấm nước 0,8 g

14 Bông thấm nước 500 g

15 Đường Saccharose 250 g

16 Cồn 950+ 700 2 + 3 lít 17 Giống vi sinh Giáo viên chuẩn bị

18 Giấy báo 3 kg SV chuẩn bị

19 Thun buộc Vòng sợi 100 g SV chuẩn bị B. DỤNG CỤ :

STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 1 ống nghiệm Þ =18mm 80 cái 1lớp lưu 2 Hộp petri Þ =100mm 80 cái 1lớp lưu 3 Bình tam giác 250 ml 22 cái 1lớp lưu 4 Ống hút 1ml 30 cái 1lớp lưu 5 Ống hút 10ml 2 cái 1lớp lưu 6 Ống hút nhỏ giọt 5 cái 1 lớp 7 Micropipette 1000µl 1 cái 1 tổ 8 Đầu típ 1000 µl 1 cái 1 tổ 9 Que trải 1 cái 1 lớp

10 Lame + lamelle 2 hộp 1 lớp 11 Giấy lau kính 20 tờ 1lớp 12 Que cấy vòng 1 cái 1tổ 13 Que cấy thẳng 1 cái 1tổ 14 Bình tia 500ml 1 cái 1tổ 15 Đèn cồn 1 cái 1tổ 16 Cốc thủy tinh 100ml 2 cái 1tổ 17 Kẹp vi sinh 1 cái 1tổ 18 Giá để ống nghiệm 1 cái 1 tổ 19 Rổ đựng dụng cụ 2 cái 1lớp, lưu


1 Nồi hấp tiệt trùng 1 cái 1lớp

.

Trang { PAGE }

Hình 1.23. Kính hiển vi huỳnh quang

Kính hiển vi điện tử: Kính hiển vi điện tử (Transmission electron microscope_TEM) là loại kính không sử dụng các chùm tia sáng để khuyếch đại hình ảnh vật quan sát qua thấu kính như kính hiển vi quang học. Kính hiển vi điện tử sử dụng các chùm điện tử và khuếch đại hình ảnh nhờ các cụm điện từ trường, hình ảnh được chiếu lên một màn huỳnh quang.

Hình 1.24. Kính hiển vi điện tử

Người ta dùng kính hiển vi điện tử để quan sát và nghiên cứu các bào quan của vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và hình thái-cấu trúc của virus hay các đại phân tử sinh học. 1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 1.2.1. Dụng cụ và hóa chất

Bảng 1.1. Dụng cụ và hóa chất bài 1 A. HÓA CHẤT:

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

.

Trang { PAGE }

Hình 1.21. Kính hiển vi soi nổi Kính hiển vi đối pha: Kính hiển vi đối pha (Phase contrast microscope_PCM) được sử dụng để quan sát VSV sống không nhuộm màu. Khi xuyên qua vật thể có độ dày mỏng khác nhau, ánh sáng có cường độ không thay đổi nhưng pha bị thay đổi. Có thể làm tăng độ rõ của ảnh bằng cách biến sự thay đổi pha thành thay đổi cường độ nhờ bộ phận đặc biệt của kính.

Hình 1.22. Kính hiển vi đối pha

Kính hiển vi huỳnh quang: Kính hiển vi huỳnh quang (Flourescent microscope_FM) là loại kính được lắp bộ nguồn các ánh sáng kích thích có độ dài sóng khác nhau để kích thích tạo huỳnh quang. Phần lớn VSV không có khả năng phát huỳnh quang hoặc có nhưng rất yếu. Tuy nhiên có thể nhuộm tế bào VSV bằng các phẩm nhuộm huỳnh quang khác nhau. Nhờ vậy có thể quan sát, theo dõi chuyên biệt bào quan hoặc đại phân tử đang quan tâm, trong khi tế bào vẫn sống, tăng trưởng.

.

Trang { PAGE }

Vi khuẩn có kích thước rất nhỏ mắt thường không thể thấy được. Cho đến năm 1676 Antony Leuwenhook hoàn thiện kính hiển vi đầu tiên của nhân loại và người ta có thể thấy được hình ảnh của các loại vi khuẩn. Ngày nay chúng ta đã chế tạo ra rất nhiều loại kính hiển vi khác nhau có thể thấy hình ảnh của vi sinh vật rõ nét từ ngoài vào trong tế bào, thậm chí cả các bào quan và đại phân tử sinh học (protein, lipid…). Kính hiển vi quang học: Kính hiển vi quang học (optical microscope) là hệ thống dùng để phóng đại VSV có kích thước nhỏ. Độ phóng đại có thể từ vài chục lần đến 2000 lần. Cấu tạo: Thị kính: nơi đặt mắt nhìn. Vật kính: nơi kề sát với mẫu quan sát, tiếp nhận ánh sáng từ mẫu vật đi qua. Bàn mẫu: nơi để phiến kính có chứa mẫu cần quan sát. Tụ quang: Nơi tiếp nhận ánh sáng từ nguồn sáng (đèn) để hội tụ lại thành chùm

sáng hẹp Ốc tụ quang: điều chỉnh tụ quang lên hay xuống khi quan sát mẫu nhuôm màu hay

mẫu sống. Ốc chỉnh thô (ốc thứ cấp): nâng lên hay hạ bàn mẫu xuống để thay đổi tiêu cự ở

tốc độ lớn. Ốc chỉnh tinh (ốc vi cấp): giống như ốc chỉnh thô nhưng thay đổi tiêu cự ở tốc độ

vi cấp cho phép nhìn được ảnh nét hơn.

Hình 1.20. Kính hiển vi quang học

Kính hiển vi soi nổi: Kính hiển vi soi nổi (Stereoscopic microscope) là dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10 – 60 lần thường dùng và quan sát trên những vật có kích thước tương đối lớn. Nguồn sáng thường được chiếu từ phía trên xuống vật và phản xạ vào kính, nhờ vậy có thể quan sát vật thể ở trạng thái không gian ba chiều.

.

Trang { PAGE }

Được dùng để đảm bảo tính vô trùng khi thao tác với VSV. Không khí trong tủ cấy vô trùng được lọc bằng màng lọc vô trùng. Trong tủ có đèn UV (Ultra Violet) để khử trùng môi trường trong tủ cấy. Trước khi thực hiện, bật đèn UV từ 30 - 60 phút, bên ngoài tủ phải được che lại bằng màn tối màu.

Hình 1.17. Tủ cấy vô trùng

(8). Nồi hấp (autoclave) Là thiết bị bắt buộc phải có trong PTN vi sinh cho phép tiêu diệt tất cả các dạng sống của VSV (tế bào sinh dưỡng, bào tử). Nồi hấp có cấu tạo 2 lớp vỏ nên có khả năng chịu được áp suất cao. Buồng khử trùng có gắn valve thoát khí, áp kế, nhiệt kế.

Hình 1.18. Nồi hấp khử trùng

Khi sử dụng nên dùng nước cất hay nước vô khoáng châm vào nồi, tránh bị đóng cặn. Nước phải được châm đến mức quy định. (9). pH kế (pH meter) Sử dụng máy đo pH để bàn hay pH kế di động để xác định pH của môi trường nuôi cấy VSV, dịch lên men hay dung dịch hóa chất. Giá trị pH cuối của môi trường nuôi cấy VSV thường được xác định ở 25 oC.

{ INCLUDEPICTURE "http://www.thanglonginst.com/admin/anhnho/mV.jpg" \* MERGEFORMATINET }

Hình 1.19. pH kế (9). Kính hiển vi (Microscope)

.

Trang { PAGE }

Hình 1.12. Tủ sấy (3). Tủ ấm (lab incubator) Tủ ấm được dùng cho mục đích nuôi cấy VSV. Tủ ấm duy trì được nhiệt độ ổn định. Dải nhiệt độ trong tủ ấm thường từ 0 – 50 oC. Vi khuẩn thường được nuôi cấy ở 37 oC. Đối với mỗi đối tượng VSV cần được điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp.

Hình 1.13. Tủ ấm

(4). Máy lắc (orbital shaker) Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường nuôi cấy VSV, tăng cường oxi tan trong môi truờng. được dùng để nuôi VSV hiếu khí trong môi trường lỏng.

{ INCLUDEPICTURE "http://photos.labwrench.com/equipmentPhotos/2000/2571-4614.jpg" \* MERGEFORMATINET }

Hình. 1.14. Máy lắc (5). Bể ổn nhiệt (water bath) Trong PTN VSV, bể ổn nhiệt được sử dụng để duy trì nhiệt độ nóng chảy của môi trường thạch (45oC) trước khi đổ đĩa Petri. Hiện nay, còn có loại bể điều nhiệt lắc (shaking water bath), loại này còn có tác dụng đảo đều môi trường trước khi sử dụng.

{ INCLUDEPICTURE "http://img.directindustry.com/images_di/photo-g/shaking-water-bath-375366.jpg" \* MERGEFORMATINET }

Hình 1.15. Bể ổn nhiệt lắc (6). Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Dùng để đảo trộn dịch VSV cần phân tích hay dung dịch hóa chất chứa trong ống nghiệm cho đều.

Hình 1.16. Máy lắc ống nghiệm

(7). Tủ cấy vô trùng (flow cabinet)

.

Trang { PAGE }

(1) (2) (3) (4) (5) (6) Hình 1.10. Pipetteman

(1). 2 – 20 l, (2). 20 – 100 l, (3). 20 – 200 l, (4). 200 – 1000 l, (5). 1000 – 5000 l, (6) 1000- 10000 l

Chú ý:

Khi sử dụng cần lưu ý, cần bơm micropipette có hai nấc: nấc 1 tương ứng với dung tích được chọn khi hút dịch; nấc hai ấn vượt quá nấc 1 để đuổi hết dịch còn mao quản ở đầu tip.

Không dùng micropipette để hút các loại hóa chất dễ bay hơi, như: acetic, HCl… 1.1.2.2. Thiết bị (1). Cân (lab scale) Thường sử dụng loại cân kỹ thuật (loại 2 số lẻ) có độ chính xác đế 0,01 g. Khi cần xác định một lượng chính xác, người ta dùng cân phân tích (loại 4 số lẻ) có độ chính xác đến 0,0001 g (0,1 mg).

{ INCLUDEPICTURE "http://atlanticsupply.com/pictures/%7B23A465F0-AE63-46A2-9D08-C02567CD7EC7%7D_PIONEERANALYTICALBALANCE.jpg" \*

MERGEFORMATINET } Hình 1.11. Cân kỹ thuật (trái) và cân phân tích (phải)

Chú ý: cân phải được đặt trên bề mặt phẳng, tránh gió lùa, không bị rung. (2). Tủ sấy (drying oven) Dùng để sấy khô các dụng cụ hoặc để khử trùng theo phương pháp nhiệt khô. Tủ sấy thường được đốt nóng bằng điện trở, nhiệt độ có thể có lên đến 200 oC. Khi nóng, nhiệt được đảo đều bằng quạt để tránh sai lệch nhiệt cục bộ.

.

Trang { PAGE }

thái sống, lá kính cần được rửa lại bằng nước rửa chén hay xà phòng, làm khô và ngâm trong cồn 95o.

- Các loại dụng cụ thuỷ tinh khác: các loại cốc thuỷ tinh (becher), ống đong, ống hút…

(2). Các loại que cấy - Que cấy thẳng: dùng để cấy sâu.

Hình 1.6. Que cấy thẳng - Que cấy vòng: dùng cấy ria trên mặt thạch hay phân lập VSV trên bề mặt thạch

hoặc cấy chuyền trên môi trường lỏng.

Hình 1.7. Que cấy vòng

- Que cấy móc: dùng để cấy các loại nấm mốc hay xạ khuẩn.

Hình 1.8. Que cấy móc - Que trang (trải): dùng để trải giọt sinh khối VSV trên bề mặt thạch.

Hình 1.9. Que trang

(3). Micropipette

Là loại ống hút máy, có độ chính xác đến l (tuỳ theo loại) dùng để định lượng một thể tích chính xác dung dịch VSV, môi trường nuôi cấy (lỏng) hay dung dịch hóa chất. Micropipette (pipetteman) có nhiều loại, mỗi loại đều có dải giới hạn dung tích, như: 0,1 – 10,0 l; 1 – 20 l; 20 – 200 l; 100 – 1000 l; 1000 – 5000 l và 1000 – 10.000 l (1000 l = 1 ml). Tùy theo hãng sản xuất mà quy cách dung tích có thay đổi. Trong dải dung tích cho phép, người ta có thể điều chỉnh dung tích chính xác như mong muốn. Mỗi loại micropipette đều có loại đầu tip tương ứng.

.

Trang { PAGE }

VSV, sử dụng nút bông thay cho nắp vặn. Khi phân tích VSV, sử dùng giấy nhôm hay nút silicon để hạn chế sự nhiễm VSV.

{ INCLUDEPICTURE "http://www.indigo.com/images/product/60.jpg" \* MERGEFORMATINET }

Hình 1.1. Ống nghiệm và giá đỡ ống nghiệm - Đĩa Petri (Petri dishes): Gồm nắp lớn đậy lên nắp nhỏ có hình tròn, đường kính 6, 8, 10, 12 cm. Đĩa Petri được gói lại bằng giấy trước khi đem hấp tiêt trùng bằng nhiệt ẩm hay sấy bằng nhiệt khô. Hiện nay có các loại đĩa Petri bằng nhựa vô trùng bán sẵn, rất tiện lợi và thường được sử dụng trong phòng phân tích VSV. Khác với đĩa thuỷ tinh có thể tái sử dụng nhiều lần, đĩa nhựa được chế tạo để sử dụng 1 lần.

{ INCLUDEPICTURE "http://sinhviet.com/sanpham/barloworld_files/0.jpg" \* MERGEFORMATINET }

Hình 1.2. Đĩa Petri - Bình tam giác (erlenmeyers): còn được gọi là bình nón dùng để chứa môi trường nuôi cấy (lỏng hay rắn) hay dung môi hóa chất trong pha chế môi trường.

{ INCLUDEPICTURE "http://hoahocdoisong.com/image/Articles/erlenmeyer%20flask%20three%20glassware.j

pg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.3. Bình tam giác

- Đèn cồn (Alcohol bunners): là loại đèn được được đốt bằng cồn 90o, toả nhiệt tạo ra một vùng không gian xung quanh vô trùng. Đèn cồn có thể được dùng để khử trùng các loại que cấy bằng cách hơ hay đốt trên ngọn lửa đèn cồn.

{ INCLUDEPICTURE "http://hoahocdoisong.com/image/Articles/alcohol-burner%2001.jpg" \* MERGEFORMATINET }

Hình 1.4. Đèn cồn - Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle):

Phiến kính là miếng thuỷ tinh hình chữ nhât, có độ trong suốt cao, dày 2 mm dùng để chứa giọt VSV ở trạng thái sống hay nhuộm màu khi quan sát chúng bằng kính hiển vi.

Lá kính là miếng thuỷ tinh hình vuông, có độ trong suốt cao dày 0,1 - 0,2 mm dùng để đậy lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống của tế bào VSV.

Hình 1.5. Phiến kính và lá kính

Phiến kính và lá kính khi mới mua về cần được làm sạch bằng cách đun sôi trong NaOH 10% trong 10 phút, rửa bằng nước cất, rửa bằng HCl loãng và sau cùng rửa sạch lại bằng nước cất. Phiến kính đã sử dụng để quan sát để nhuộm màu cần được sử lý bằng cách ngâm trong dung dịch sulfocromate (100 g H2SO4 đđ, 50 g K2Cr2O7 và 1000 ml nước cất) trước khi rửa sạch bằng nước và tráng lại bằng nước cất. Sau khi quan sát VSV ở trạng

.

Trang { PAGE }

BÀI 1. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ QUAN SÁT TIÊU BẢN

VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Mục tiêu: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: - Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết của một phòng thí nghiệm vi sinh vật. - Vận dụng được các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật. - Làm được các tiêu bản quan sát vi sinh vật.

1.1. Cơ sở lý thuyết 1.1.1. Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm

- Hiểu đúng nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật (VSV). - Thao tác an toàn trên đối tượng VSV ở mật độ cao. - Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm (PTN) VSV. - Mặc áo blouse trong thời gian thực hành. - Không dùng miệng hút bằng ống hút (pipette) để định lượng VSV hay hóa chất,

mà phải dùng quả bóp cao su khi thao tác hút bằng ống hút. - Hộp Petri đã đổ môi trường hoặc sau nuôi cấy VSV, không mở nắp, dùng tay để sờ

và dùng mũi để ngửi. - Khi lỡ tay làm đổ VSV ra nơi làm việc, dùng khăn hay giấy tẩm cồn 70o để lau và

lau sạch lại bằng khăn hay giấy tẩm cồn 70o khác. - Khi sử dụng que cấy để gieo cấy VSV cần phải được khử trùng bằng cách đốt trên

ngọn lửa đèn cồn tránh vương vãi ra xung quanh. - Trước và sau khi thao tác trên VSV cần lau tay kỹ bằng cồn 70o. Khi thực hiện thao

tác này cần phải tránh xa ngọn lửa đèn cồn khi tay còn ướt. - Cần ghi chú tên chủng VSV và ngày tháng thí nghiệm lên các dụng cụ chứa môi

trường nuôi cấy VSV. - Tất cả các chất thải và môi trường chứa hoặc nhiễm VSV cần được hấp khử trùng

trước khi đem đổ vào thùng rác. Các dụng cụ nhiễm VSV cần được ngâm trong dung dịch sát khuẩn trước khi rửa.

- Không đổ thạch vào bồn rửa và ống thoát nước. 1.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm vi sinh vật 1.1.2.1. Dụng cụ (1). Dụng cụ bằng thuỷ tinh: - Ống nghiệm (test tubes): được dùng để chứa môi trường nuôi cấy và nuôi cấy VSV. Môi trường có thể ở dạng lỏng hay rắn. Miệng ống nghiệm có thể được đậy bằng nút bông không thấm nước, bằng silicon, giấy nhôm hay nắp vặn. Trong trường hợp nuôi cấy

.

Trang { PAGE }

4. Đánh giá bài thực hành

Bảng. Tiêu chí đánh giá chung

STT Tiêu chí đánh giá Điểm 1 Ý thức tổ chức, kỷ luật 1 2 An toàn, vệ sinh 1 3 Thời gian 1 4 Chuẩn bị 1 5 Thao tác 2 6 Kết quả 2 7 Báo cáo 2 TỔNG 10

.

Trang { PAGE }

GIỚI THIỆU HỌC PHẦN 1. Mục tiêu học phần Sau khi học xong học phần này, sinh viên có khả năng về:

Kiến thức: Phân biệt chính xác nấm men, nấm mốc, vi khuẩn; Củng cố kiến thức về sinh lý, sinh hoá vi sinh vật mà sinh viên đã học ở học phần lí thuyết. Kĩ năng: Thực hiện được các thao tác sử dụng kính hiển vi, làm tiêu bản và quan sát vi sinh vật; Pha chế một số môi trường thông dụng và môi trường đặc hiệu để nuôi vi sinh vật; Thực hiện kỹ thuật gieo cấy, nuôi, phân lập vi sinh vật; Thực hiện các kỹ thuật phát hiện và định lượng vi sinh vật trong các chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm. Thái độ: 1. Rèn luyện tính cẩn thận, làm việc có khoa học; 2. Có quan điểm đúng về vi sinh vật trong lên men, bảo quản và vệ sinh an toàn thực phẩm.

2. Phân bố chương trình thực hành Thời gian lý thuyết: 0 tiết Thời gian thực hành: 30 tiết, chia thành 6 bài, mỗi bài 5 tiết.

Nội dung các bài thực hành về vi sinh vật bao gồm: - Chuẩn bị trang thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm, quan sát vi sinh (tiêu bản

sống, nhuộm màu); - Kỹ thuật pha chế môi trường và nuôi cấy vi sinh vật; - Kỹ thuật cơ bản phân tích vi sinh vật; - Một số quá trình lên men thực phẩm.

3. Đánh giá học phần Mỗi buổi thực hành, sinh viên phải soạn bài báo cáo trước (kết quả ghi sau) khi đến phòng thí nghiệm và được ký xác nhận của thầy cô. Sinh viên nào không soạn bài báo cáo trước xem như không đi thực hành buổi thí nghiệm đó. Sinh viên làm 6 báo cáo và đóng thành 1 cuốn, nộp vào buổi cuối. Bố cục bài báo cáo và thang điểm: viết ngắn gọn các nội dung sau trên khổ giấy A4: 1. Cơ sở lý thuyết 2. Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất và thiết bị 3. Các bước thực hiện 4. Kết quả 5. Nhận xét và thảo luận

.

Trang { PAGE }

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT & THUẬT NGỮ

Chữ viết tắt: VSV_ Vi sinh vật PTN _ Phòng thí nghiệm OD _ Optical density EMP _ Embden Meyerhof Parnas CFU _ Coloning Form Unit VKHK _ Vi khuẩn hiếu khí NM-NM _ Nấm men nếm mốc NADH _ Nicotinamide Adenine Dinucleotide Thuật ngữ: Tiêu bản: là phiến kính có chứa vi sinh vật ở trạng thái sống hoặc chết, dùng để

quan sát hình thái vi sinh vật Lame: Hay còn gọi là phiến kính, dùng tiêu bản vi sinh vật Lamelle: Hay còn gọi là lá kính, dùng làm tiêu bản giọt ép để quan sát vi sinh

vật Môi trường thạch: Môi trường dinh dưỡng rắn được đóng khối bởi thành phần agarose Canh trường: Môi trường dinh dưỡng lỏng để nuôi cấy hoặc định danh vi sinh vật Canh khuẩn: Môi trường lỏng đang có các vi sinh vật sinh trưởng Môi trường đông khô thương phẩm: Môi trường dinh dưỡng thương phẩm để nuôi cấy vi

sinh vât đã được phối chế sẵn Sinh khối: Khối lượng của các tế bào vi sinh vật trong một không gian xác định Khuẩn lạc: Một khối tế bào vi sinh vật được phát triển từ một tế bào hoặc bào tử

.

Trang { PAGE }

Hình 4.4. Mô hình kỹ thuật hộp trải ............................................................................ 44 Hình 4.5. Phương pháp phân tích vi sinh bằng kĩ thuật hộp đổ ................................... 45 Hình 5.1. Buồng đếm hồng cầu .................................................................................. 47 Hình 5.2. Cấu tạo buồng đếm Neubauer cải tiến ......................................................... 48 Hình 5.3. Buồng đếm Neubauer cải tiến ..................................................................... 49 Hình 5.4. Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và số lượng tế bào

VSV ............................................................................................................ 51 Hình 5.5. Đếm khuẩn lạc TS VKHK (Môi trường cao thịt-pepton) ............................. 54 Hình 5.6. Số lượng và dạng khuẩn lạc trên Petri sau nuôi cấy ..................................... 55 Hình 5.7. Cách cho dịch vi sinh vật vào buồng đếm ................................................... 55

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Dụng cụ và hóa chất bài 1 ........................................................................... 18 Bảng 1.2. Tiêu chí đánh giá bài 1 ................................................................................ 22 Bảng 2.1. Nhu cầu khoáng đối với một số vi sinh vật .................................................. 23 Bảng 2.2. Mối quan hệ giữa nhiệt độ và áp suất .......................................................... 27 Bảng 2.3. Thành phần của một số loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật ....................... 27 Bảng 2.4. Dụng cụ và thiết bị bài 2 ............................................................................. 27 Bảng 2.5. Tiêu chí đánh giá bài 2 ................................................................................ 31 Bảng 3.1. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 3 .............................................................. 34 Bảng 3.2. Tiêu chí đánh giá bài 3 ................................................................................ 37 Bảng 4.1. Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích .................................................. 39 Bảng 4.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 4 .............................................................. 43 Bảng 4.3. Tiêu chí đánh giá bài 4 ................................................................................ 47 Bảng 5.1. Các loại buồng đếm .................................................................................... 51 Bảng 5.2. Các giá trị tương quan giữa mật độ quang và số lượng tế bào vi sinh vật .... 52 Bảng 5.3. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị bài 5 .............................................................. 54 Bảng 5.4. Tiêu chí đánh giá bài 5 ................................................................................ 58 Bảng 6.1. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 6 ............................................................. 59 Bảng 6.2. Tiêu chí đánh giá bài 6 ................................................................................ 61

.

Trang { PAGE }

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 1.1. Ống nghiệm và giá đỡ ống nghiệm................................................................ 8 Hình 1.2. Đĩa Petri........................................................................................................ 8 Hình 1.3. Bình tam giác ............................................................................................... 8 Hình 1.4. Đèn cồn ....................................................................................................... 9 Hình 1.5. Phiến kính và lá kính..................................................................................... 9 Hình 1.6. Que cấy thẳng ............................................................................................... 9 Hình 1.7. Que cấy vòng .............................................................................................. 10 Hình 1.8. Que cấy móc ............................................................................................... 10 Hình 1.9. Que trang .................................................................................................... 10 Hình 1.10. Pipetteman .................................................................................................. 10 Hình 1.11. Cân kỹ thuật (trái) và cân phân tích (phải)................................................... 11 Hình 1.12. Tủ sấy ......................................................................................................... 11 Hình 1.13. Tủ ấm ......................................................................................................... 12 Hình. 1.14. Máy lắc ....................................................................................................... 12 Hình 1.15. Bể ổn nhiệt lắc ............................................................................................ 12 Hình 1.16. Máy lắc ống nghiệm ................................................................................... 13 Hình 1.17. Tủ cấy vô trùng ........................................................................................... 13 Hình 1.18. Nồi hấp khử trùng ....................................................................................... 13 Hình 1.19. pH kế .......................................................................................................... 14 Hình 1.20. Kính hiển vi quang học .........................................................................................15

Hình 1.21. Kính hiển vi soi nổi ..................................................................................... 15 Hình 1.22. Kính hiển vi đối pha .................................................................................... 16 Hình 1.23. Kính hiển vi huỳnh quang ........................................................................... 16 Hình 1.24. Kính hiển vi điện tử .................................................................................... 17 Hình 1.25. Cách làm tiêu bản quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống.............................. 19 Hình 1.26. Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím ............................................................. 20 Hình 1.27. Vi khuẩn Gram âm (có màu hồng đỏ) ......................................................... 20 Hình 3.1 Các kiểu ria trên môi trường thạch ........................................................... 33 Hình 3.2. Kỹ thuật cấy ria trên đĩa thạch..................................................................... 36 Hình 4.1. Kỹ thuật hộp trải ......................................................................................... 41 Hình 4.2. Kỹ thuật hộp đổ .......................................................................................... 41 Hình 4.3. Kỹ thuật pha loãng ...................................................................................... 43

.

Trang { PAGE }

MỤC LỤC

Trang Danh mục hình ................................................................................................................ 2

Danh mục bảng ................................................................................................................ 3

Danh mục chữ viết tắt và thuật ngữ .................................................................................. 4

Giới thiệu học phần ........................................................................................................ 5

Bài 1. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ QUAN SÁT TIÊU BẢN VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC ...................................................................................................... 7

Bài 2. KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG ............................................................ 22

Bài 3. KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT .................................. 32

Bài 4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT .......................................................... 38

Bài 5. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - LÊN MEN ETHANOL ....... 47

Bài 6. LÊN MEN LACTIC ........................................................................................... 58

Phụ lục .......................................................................................................................... 62

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Thí nghiệm

VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM (Dành cho hệ Đại học, Cao đẳng và Trung cấp)

Biên soạn: Trần Quốc Huy

TP. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2011

Documents

8. DRBC Thành ph S · PDF fileTrang {PAGE } 6.5. Yêu cầu viết báo cáo - Nêu cơ chế lên men ethanol - Quy trình các bước tiến hành lên men sữa chua