Transcripción en Procariotas

RNA polimerasa

Durante la transcipción un sistema enzimático convierte la información genética de un dsDNA a una cadena de RNA.El RNA es sintetizado por la RNA polimerasa la cual requiere:

Molde de DNA Ribonucleótidos: ATP, GTP, UTP, CTP como precursores de nucleótidos Mg, Zn

La ARN polimerasa es una de las enzimas más grandes que se conoce. Consta de cinco sub-unidades: dos alfa (α), beta (β), beta prima (β’) y sigma (σ). La enzima completa es denominada Holoenzima y se divide en dos componentes principales:

La enzima central, denominada Core, formada por las sub unidades 2α, β y β’

El Factor Sigma ( el polipéptido σ)

La Holoenzima reconoce un sitio de unión específico en el ADN, este sitio es denominado Promotor . Como consecuencia de lo dicho, la ADN polimerasa puede encontrarse en dos estados:

Un estado apropiado para la unión con el Promotor: “estado de iniciación” u Holoenzima. Un estado apropiado para la elongación: Core de la enzima

El par de bases donde se inicia la transcripción es +1 que es generalmente un purina CAT. El factor 70 interacciona con dos secuencias consenso en -10 (5’ TATAAT 3’) y -35 (5’ TTGACA 3’). Existe un tercer elemento de reconocimiento rico en AT llamado elemento up (up stream promoter) al cual se une la subunidad .La frecuencia de iniciación de la transcripción por la RNA polimerasa de E. Coli depende de su afinidad por la secuencia promotora. Existen promotores fuertes que incian la transcripción con alta frecuencia, promotores débiles los cuales inician la transcipcion con baja frecuencia, esto determina el nivel de expresión de un gen. Cuando la RNA polimerasa se une a la región promotora se forma un complejo cerrado en el que las cadenas de DNA cerca del +1 tienen sus bases apareadas y para alargar la cadena, la RNA polimerasa debe separar los pares de bases unidos y formar un complejo abierto. Después de transcribir unos pares de bases, la subunidad 70 se libera actuando solo como factor de iniciación.

Iniciación de la síntesis del ARN mensajero

La iniciación se produce mediante la unión de la RNA polimerasa (Holoenzima) al ADN de doble cadena. Para que la cadena molde esté disponible para el apareamiento de bases con los ribonucleótidos, las dos cadenas de ADN deben separarse. El desenrollamiento es local y se produce cuando la Holoenzima contacta con la TATA Box. Una vez que el complejo promotor se encuentra abierto, la ARN pol comienza la síntesis. La fase de iniciación no se completa hasta que se hallan polimerizado los primeros seis ribonucleótidos.

Elongación de la cadena

Después que se han colocado los primeros seis ribonucleótidos, la ARN polimerasa sufre un cambio en su conformación, perdiendo la sub unidad σ. Se continúa la síntesis en el estado de Core anteriormente descrito. El Core se mueve a lo largo del ADN colocando los ribonucleótidos complementarios a la cadena de ADN molde, abriendo la hélice a medida que se desplaza. Los ribonucleótidos se unen al extremo 3’ de la cadena de ARN en crecimiento, formándose un Híbrido ARN-ADN en la región desenrollada, el cual se mantiene estabilizado mediante enlaces puente de Hidrógeno. El híbrido tiene una longitud aproximada de 12 pb y el nuevo ARN es liberado de estas uniones cuando el ADN recupera su estado de doble hélice por desplazamiento del Core.

Terminación y liberación del ARN sintetizado

La terminación ocurre en una secuencia determinada del ADN, denominada Secuencia Terminadora. En este punto, la enzima deja de añadir los ribonucleótidos a la cadena de ARN en crecimiento, liberando el producto terminado y disociándose del ADN. La terminación requiere que todos los enlaces Puente de Hidrógeno, que mantenían al Híbrido ARN – ADN, se rompan volviéndose a reconstituir el ADN dúplex.

Terminación Rho dependiente

Requiere la presencia de la estructura de horquilla (región rica en GC). El factor rho, es una proteína compuesta por seis sub-unidades idénticas de y tiene una alta afinidad por ARN de hebra simple. Cuando se une al ARN, el factor rho hidroliza ATP y la energía liberada es capaz de mover este complejo proteico (factor rho) a lo largo del ARN que se esta sintetizando en dirección de la burbuja de transcripción. Cuando llega a dicha burbuja, el factor rho disocia el híbrido ADN-ARN por un mecanismo desconocido, liberando el ARN al citoplasma

Rho independiente

La secuencia de terminación Rho-independiente se caracteriza por la presencia de una secuencia rica GC seguido por residuos U. las regiones complementarias se aparean al ser sintetizadas formando una horquilla seguida por la cola poli-U y al emerger la cola poli-U genera la liberación de la cadena de RNA del complejo de transcripción.

Subunidades en E.Coli y Regulación

La sustitución de los factores por otros, permiten regular la expresión en diferentes situaciones cambiando la afinidad de la RNA polimerasa. En E.Coli existen varios factores además del 70 constitutivo; los otros que son activados en condiciones especiales y reconocen otros promotores específicos.

Gen Factor () Situación de uso Secuencia -35Separación entre secuencias (pb) Secuencia -10

rpoD 70 general TTGACA 16-18 TATAAT

rpoS S estrés

rpoH 32 estrés térmico CCCTTGAA 13-15 CCCGATNT

rpo E E estrés térmico

rpoN 54 Metabolismo del N CTGGNA 6 TTGCA

Flia A 28 o F Metabolismo flagelar CTAAA 15 GCTGAATCA

sigH H AGGANPuPu 11-12 GCTGAATCA

La cuestión es cómo se cambia la expresión de manera que se exprese un factor u otro factor. Esto se da debido a señales del medio ambiente, las cuales desarrollan cascadas de señalización que terminan en cambiar la actividad celular y la expresión genética. Estos cambios desarrollados por señales pueden expresar nuevos o activar los que se encontraban en el citosol desactivados.

El cambio en la expresión también puede darse por “cascadas” dentro de la misma expresión. Un ejemplo es la de algunos bacteriófagos que infectan a E.Coli (en algunos casos también a B.Subtillis). Una cascada de factores se produce cuando se requiere de un factor para transcribir el gen que codifica para el siguiente factor.

El mecanismo sería:

Regulación de la transcripción

El modelo del operón

Tal como postularan Jacob y Monod, los grupos de genes que codifican para proteínas asociadas se encuentran en unidades

conocidas como Operones .

Composición del operón:

Los genes estructurales:  llevan información para polipéptidos. Se trata de los genes cuya expresión está regulada. Los

operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales, son poligénicos o policistrónicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo gene estructural. Los operones eucarióticos suelen contener un sólo gen estructural siendo monocistrónicos.

El promotor (P):  se trata de un elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la

ARN polimerasa para comenzar la transcripción. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra P.

El operador (O):  se trata de otro elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por

la proteína reguladora. El operador se sitúa entre la región promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra O.

El gen regulador (i):  secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora que reconoce la secuencia de la región del

operador. El gen regulador está cerca de los genes estructurales del operón pero no está inmediatamente al lado. Abreviadamente se le denomina gen i.

Proteína reguladora : proteína codificada por el gen regulador. Está proteína se une a la región del operador.

Inductor:  sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes.

Operón Lac

Genes estructurales

Lac Z codifica para la -galactosidada Lac Y codifica para la lactosa permeasa que permite la

entrada de la lactosa al interior de la célula. Lac A codifica para la transacetilasa.

Elementos de control:

Promotor: elemento de control que contiene la secuencia reconocida por la RNA polimerasa para inciar la transcripción y se encuentra antes de los genes estructurales

Operador (O): secuenca de DNA reconocida por la proteína reguladora

Gen regulador (I): secuencia que codifica para la proteína reguladora

Inductor es capaz de inducir la expresión de los genes del operón y no son hidrolizados por la -galactosidasa. Un ejemplo de inductor es el IPTG el cual es útil para estudios genéticos del operón al difundir al interior de las células manteniendo constante su concentración al no ser metabolizado.

a. Cuando la concentración de lactosa es baja o la de la

glucosa es alta , el gen regulador sintetizará una proteína, el

represor, que se unirá al operador. Al quedar el operador ocupado, la ARN polimerasa se verá imposibilitada de unirse al sitio promotor y, la transcripción de los genes estructurales se verá inhibida.

b. Cuando hay glucosa y lactosa , la frecuencia de iniciación de la

transcripción es un muy baja lo que da como resultado la síntesis de tan solo bajos niveles de mRNA lac y de las proteínas codificadas en el operón lac. Cuando la glucosa se agota del medio, se comienza a sintetizar AMPc y a medida que se incrementa su concentración, éste se une a la subunidad de la proteína dimérica CAP provocando un cambio conformacional que le permite unirse al sitio CAP de la región de control de la transcripción de lac. El complejo CAP-AMPc unido interactua con la polimerasa unida al promotor estimulando la frecuencia de iniciación. (Control positivo)

c. Cuando la concentración de Glucosa sea baja y la de la Lactosa sea alta , el regulador se unirá a una molécula inductora de la

transcripción de los genes estructurales para la síntesis de las enzimas degradativas de dicho disacárido. El represor entonces no podrá unirse al operador. Por consiguiente, al quedar este último libre, la ARN polimerasa formará el Complejo Promotor Abierto pudiéndose producir la máxima transcripción de los genes estructurales.

E. Coli puede usar glucosa u otros sacáridos como lactosa como única fuente de carbono y energía.

I. Se consume la glucosa y la lactosa se mantiene constanteII. Se consume la lactosa y ya no hay mas glucosa.

También es conveniente recordar que los tres genes estructurales del operón lactosa se transcriben juntos en un mismo ARNm, es decir que

los ARN mensajeros de bacterias suelen ser policistrónicos. Sin

embargo, en eucariontes los mensajreos suelen

sen monocistrónicos o monogénicos, es decir, corresponden a la transcripción de un solo gen estructural.

Mutaciones

Mutantes constitutivos

Los mutantes constitutivos son aquellos en los que siempre se expresan o transcriben los genes del operón lac,

independientemente de si está o no el inductor.

Mutación constitutiva I- : esta mutación altera la estructura de la proteína reguladora de manera que ya no puede unirse al

operador. Así, la región promotora queda libre para la RNA polimerasa la cual transcribe los genes estructurales en ausencia del inductor (lac)

Mutación Oc : consiste en una alteración en al secuencia de la región operadora por lo que la proteína represora producto del gen I

ya no puede unirse, la región promotora queda asequible para la ARN polimerasa y se produce la transcripción de los genes estructurales en ausencia de inductor (lactosa). El estudio de diferentes mutantes del operador ha permitido determinar que el operador es una región de 17 a 25 nucleótidos situada justo antes del gen z y después del promotor. Esta región muestra una enorme especificidad por la proteína represora.

Es importante destacar que tanto la mutación i- como la OC actúan simultáneamente sobre los tres genes estructurales del operón lactosa. En la siguiente tabla se indica la expresión de los genes del operón lactosa en los dos mutantes constitutivos estudiados, en el regulador constitutivo (i- ) y en el operador constitutivo (OC).

Mutantes constitutivos

Expresión de los genes estructurales del Operón lactosa

Ausencia de inductor (Sin lactosa) Presencia de inductor (Con lactosa)

Genotipo z+ y+ a+ z+ y+ a+

i- P OC z+y+a+ SI SI SI SI SI SI

i+P O z+y+a+ SI SI SI SI SI SI

Mutantes del Promotor (OO)

Estos mutantes presetan una alteración en la secuencia de bases nitrogenadas de la región promotora, como consecuencia la ARN-polimerasa no reconoce la secuencia promotora y, por consiguiente, no se produce la transcripción de los genes estructurales. A estos mutantes se les ha denominado "Operador cero" (OO), pero es necesario recordar que afectan a la región promotora.

Diploides parciales o merocigotos constitutivos

En estos diploides parciales, se ha comprobado que el operador

constitutivo O/OC es dominante en posición CIS, es decir, ejerce

su efecto solamente sobre los genes estructurales que están en su misma molécula de ADN que la mutación del operador, pero no actúa sobre los genes estructurales de otra molécula de ADN. Esto significa que el operador es una secuencia de bases en el ADN que no codifica para ninguna molécula difusible. En el siguiente diploide parcial i+ P O z+y+a+/ i+ P OC z+y+a+ tanto en ausencia como en presencia de lactosa se produce la expresión de los tres genes estructurales del operón. Esto se debe a que los genes estructurales que están en la misma molécula de ADN que la mutación constitutiva OC se van a expresar siempre. En el siguiente esquema se indica lo que sucede en un diploide parcial O/OC en ausencia de inductor.

Sin embargo, en los diploides parciales con un gen regulador normal y un gen regulador mutante constitutivo , es decir, en baterias

diploides parciales i+/i- el gen regulador normal i+ es dominante en posición TRANS, es decir, ejerce su efecto sobre los genes

estructurales de la misma molécula de ADN en que está la mutación del gen regulador y también sobre los genes estructurales de

otra molécula de ADN diferente. Por tanto, el gen regulador codifica para una proteína o producto difusible que puede ejercer su efecto en diferentes moléculas de ADN. En el siguiente diploide parcial i+P O z+y+a+/ i- P O z+y+a+ en ausencia de lactosa no hay expresión de los genes estructurales mientras que en presencia de lactosa si se expresan. Esto se debe a que la proteína represora normal producida por el gen i+ al ser difusible se puede unir a ambas regiones operadoras. En el siguiente esquema se indica lo que sucede en un diploide parcial i+/i- en ausencia de inductor de inductor.

En la siguiente tabla se indica la expresión de los genes del operón lactosa en los dos diplides parciales, uno con en el regulador constitutivo (i- ) y el otro con en el operador constitutivo (OC).

Diploides parciales Expresión de los genes estructurales del Operón lactosa

Ausencia de inductor (Sin lactosa) Presencia de inductor (Con lactosa)

Genotipo z+ y+ a+ z+ y+ a+

i+ P O z+y+a+/ i+ P OC z+y+a+ SI SI SI SI SI SI

i+P O z+y+a+/ i- P O z+y+a+ NO NO NO SI SI SI

Mutantes sobre el gen regulador

Mutante i-: explicado arriba en diploides parciales.

Mutante i-d: afecta al gen estructural de la proteína represora en la región que codifica para el extremo amino terminal (NH2). Esta

región es la encargada de reconocer la región operadora. La proteína represora mutante se une al inductor (al IPTG) pero no es capaz de unirse al operador. Esta mutación es dominante sobre la i+ en los diploides parciales (i+/i-d). En los diploides parciales la proteína represora mutante no se une a las regiones operadoras y se produce siempre la trasncripción de los genes estructurales.

Mutante iS : afecta al gen estructural de la proteína represora modificando la parte central de la proteína encargada de unirse al

inductor (al IPTG). La proteína represora mutante se une al operador pero no es capaz de reconocer al inductor (IPTG). Se trata de un mutante que está siempre reprimido en el que no se expresan los genes del operón lactosa ya que la proteína represora está permanentemente unida a la región operadora y no se suelta a pesar de añadir el inductor. Este mutante es dominante sobre i+ en los diploides parciales (i+/iS). En los diploides parciales el represor mutante se une a ambas regiones operadoras bloqueando la transcripción de los genes estructurales.

Operón Triptofano

Genes estructurales: existen cinco genes

estructurales en el siguiente orden trpE-trpD-trpC- trpB-trpA.

Elementos de control: promotor (P) y operador (O). El

promotor y el operador están al lado de los genes estructurales y en el siguiente orden: P O trpE-trpD- trpC-trpB-trpA. Curiosamente, las enzimas codificadas por estos cinco genes estructurales actúan en la ruta metabólica de síntesis del triptófano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en el cromosoma.

Gen regulador (trpR): codifica para la proteína

reguladora. Este gen se encuentra en otra región del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del operón.

Correpresor: triptófano.

En ausencia de triptófano , o cuando hay muy poco, la

proteína reguladora producto del gen trpR no es capaz de unirse al operador de forma que la ARN-polimerasa puede unirse a la región promtora y se transcriben los genes del operón triptófano.

En presencia de triptófano , el triptófano se une a la

proteína reguladora o represora cambiando su conformación, de manera que ahora si puede unirse a la región operadora y como consecuencia la ARN-polimerasa no puede unirse a la región promotora y no se transcriben los genes estructurales del operón trp.

Por tanto, la diferencia esencial entre el operón lac

(inducible) y el operón trp (represible) , es que en este último el

represor del triptófano solamente es capaz de unirse al operador cuando previamente está unido al trp.

Regulación por atenuación

Yanofsky aisló el ARN-m multigénico del operón trp y secuenció la región del extremo 5´ encontrando una región líder en el

extremo 5’ del mRNA que contiene 4 secuencias, las secuencias 3 y 4

forman la región atenuadora (estructura rica en GC seguida por

residuos U que actúan como terminadores de la transcripción) si se apareas las secuencias 2 y 3, la estructura atenuadora no puede formarse y continúa la transcripción.

Cuando los niveles de triptófano son altos , el ribosoma traduce la

secuencia 1 rapidamente y bloquea la secuencia 2 antes de transcribir la 3. Así se permite la formación de la estructura atenuadora que produce la terminación de la transcripcón.

Cuando los niveles de triptófano son bajos el ribosoma se detiene en la

secuencia 1 y la formación entre las secuencias 2 y 3 impide la atenuación debido a que la secuencia 3 no está disponible. Así se permite la transcripción.

Operón Arabinosa

La arabinosa es una pentosa que requiere ciertas enzimas para su metabolismo, las cuales están codificadas por los genes estructurales ara A, ara B y ara D, Este operón contiene además de los genes estructurales,

Una región reguladora con dos operadores ara O1 y ara O2

Ara I es un sitio de unión para la proteína reguladora (araC) Un promotor adyacente araI Un sitio de unión para CAP-AMPc

La proteína acaC está codificada por un gen arac en el proximidad. Esta proteína ejerce un control dual (regulador positivo y negativo)

Control dual:

Cuando no hay arabinosa y la glucosa es abundante, la proteína reguladora arac se

une tanto a araO2 como a araI por lo que se forma un lazo de DNA que no permite la transcripción de los genes estructurales.

Cuando hay arabinosa en el medio y la glucosa es escasa el complejo CAP-

AMPc es abundante y se une al sitio adyacente a araI. La arabinosa funciona como un activador, al unirse a araC altera su conformación y al unirse ésta a araI se combina con CAP- AMPc y aumenta la transcripción.

Mecanismos de censado

Activación de la RNApol conteniendo 54 en el promotor glnA por NtrC

Esta activación depende del nivel de nitrógeno en el medio y de la taza de captación del mismo. El nivel de N2 en las células se ve midiendo por la relación glutamato/glutamina. Está relación está coordinada por la acción de la enzima GlnA, la cual es clave y cuya expresión se produce utilizando el factor 54.

La GlnA es inactiva cuando no está adenilada, pero se convierte en activa cuando es adenilada. En esa forma, la glutamina es sintetizada a partir del glutamato. Su expresión depende de un promotor reconocido por σ54. Su Operón tiene un enhancer (estimulador) a unos 150nt Upstream del promotor (secuencia reguladora), que se asocia con la proteína NtrC.

NtrB es una quinasa que activa C.

El NtrC activado por NtrB forma un loop en el DNA que le permite unirse a la RNApol-54 formando el complejo cerrado, no activo. Se necesita ATP para activar el complejo y pasar a tener el complejo abierto.

A diferencia de un promotor, los enhancers activan en cualquier orientación. Los promotores si los ubico hacia un lado, van a transcribir hacia ese lado.

Muchas bacterias son controladas por dos sistemas regulatorios.

PhoR/PhoB son dos componentes del sistema regulatorio de E. coli

La expresión génica requiere en ocasiones de un mecanismo de traducción de señales que le permita censar las condiciones del entorno.

Estimulo ambiental receptor del estímulo transmisión del estímulo hacia el interior

El nivel de P se censa por una proteína transmembrana que posee:

- Dominio de unión a P (fosforo)- Dominio transmembrana- Dominio citoplasmático (H)

El fosforo no puede atravesar la membrana e ingresar a la célula, por lo cual solo puede interactuar con receptores transmembrana. Cuando hay fosforo en el medio, este está unido al receptor y el mismo no emite ninguna señal; frente a la falta de fosforo en el medio, la proteína de membrana realiza una cascada de señalización que influirá tanto a nivel metabólico como bioquímico.

El dominio citoplasmático H de la proteína receptora fosforila a phoB, activando su actividad de regulador de la expresión génica como respuesta a señales. Este factor actúa sobre diferentes genes y en diferentes lugares del cromosoma.

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