A BIOLOGIAA BIOLOGIA

ISABELLA MORAESMATHEUS MACHADO

NATHAN MOURATTAÍS PAIXÃO

VINICIO DE SOUZA

| A B R I L 2 0 2 0

MOLECULARMOLECULAR PELO OLHAR DO ALUNOPELO OLHAR DO ALUNO

Portfólio de Biologia Molecular realizado pelos alunos do 3º ano dahabilitação de Biotecnologia da Escola Politécnica de Saúde

Joaquim Venâncio localizada da Fiocruz.

Sumário1. Fundamentos de Biologia Molecular ........................................................... 2

2. Replicação, Transcrição e Tradução ........................................................... 6

3. Replicação, Transcrição e Tradução - continuação ..................................... 12

4. Extração de ácidos nucleicos e eletroforese ................................................ 17

5. Regulação da Expressão Gênica (Procaritos) - parte I ............................... 22

6. Regulação da Expressão Gênica (Eucariotos) - parte II.............................. 25

7. PCR – parte I ........................................................................................... 29

8. Variações da PCR – parte II .................................................................... 30

9. Clonagem Molecular – ............................................................................. 31

10. CRISPR ................................................................................................. 33

11. Tira dúvidas ........................................................................................... 35

12. Sequenciamento de DNA ........................................................................ 36

13. Referência bibliográfica .......................................................................... 43

1

A biologia molecular é a área da biologia quepesquisa a estrutura e a função do materialgenético e das proteínas. Se encontra de modointrínseco entre a bioquímica e a genética. Gregor Mendel foi o primeiro cientista aestudar a hereditariedade (transmissão dainformação genica) e os fatores hereditáriosdifundidos através dos descendentes.

Histórico

Os primeiros estudos bioquímicos referentesao núcleo celular foram realizados por FriedrichMiescher em 1868. Seu material de estudoforam os núcleos de células oriundas decurativos cirúrgicos (leucócitos de secreçãopurulenta). Em 1928, Frederick Griffith introduziu oconceito de transformação bacteriana com oseguinte experimento:

Fundamentos de Biologia MolecularFundamentos de Biologia Molecular Oswald Avery, Maclyn McCarty e Colin MunroMacLeod, apontaram o DNA como Carreador dainformação Genética. O primeiro indício de que o DNA era o materialgenético, surgiu em 1944. Era de conhecimento, portanto, no início doséculo XX, que o DNA era composto pordesoxinucleotídeos. Da mesma forma o RNA eraconhecido, uma vez que a existência doribonucleotídeos já era reconhecida. Noentanto, a estrutura da molécula de DNA aindanão havia sido descoberta. Em 1949, E. Chargaff apontou as quantidadesrelativas das quatro variedades denucleotídeos do DNA. Segundo a regra deChargaff:

T = A(C = G)3

Em 1952, Alexander Todd confirmou que osnucleotídeos estavam conectados ao DNA pormeio de ligações fosfodiéster 3’ – 5’ entre suasdesoxirriboses estruturando uma cadeiapolinucleotídica. M.H.F, Wilkins e Rosalind Franklin estudarama difração de Raio X da molécula de DNA, porém,seus resultados foram interpretados por JamesWatson e Francis Crick. Assim, em 1953 James Watson e Francis Crickapresentaram a estrutura da molécula de DNA.

2

Todos os peptídeos iniciados com a metionina(AUG) são códons iniciadores, as cadeiasproteicas sempre iniciarão com essesaminoácidos.

Em 1961, M.W.Niremberg e J.H.Matthaeiobservaram a sequência sintética dopolinucleotídeo Uracila (UUUU). Elesperceberam que essa sequência denucleotídeos produzia o aminoácidoFenilalanina, dessa forma, compreenderam queexistia uma correlação entre uma sequência eum aminoácido e logo o código genético foidescoberto.

O código genético também era conhecidocomo degenerado, pois nem sempre umaminoácido será formado por apenas umasequência, por vezes, mais de uma sequênciade códons diferentes formará o mesmoaminoácido. Existem 64 possibilidades de trípletos dasequência de nucleotídeos (códons), porém,em apenas em 61, os aminoácidos sãotraduzidos em proteínas. Os outros 3, sãocódons de parada e não formarão aminoácidos,assim, finalizam a sequência da proteína.

Mecanismos de Perpetuação e Interpretação da informação Genética

As cadeias proteicas serão finalizadas assimque encontrarem com um dos três códons deparada/ NON SENSE

UAAUAGUGA

DNA

Formado por Dupla Hélice, que ofereceestabilidade, o Dna deve ser capaz de estocargrande quantidade de informações, se replicarfielmente, garantindo a perpetuação dasespécies, e codificar o fenótipo (capacidade dedeterminar as características). A Dupla Héliceou cadeias de polinucleotídeos, sãoconstituídas por vários nucleotídeos:

3

Os nucleotídeos são formados por uma BaseNitrogenada (átomos de carbono e nitrogênio)uma Pentose (açúcar com 5 carbonos) e umGrupo Fosfato (molécula com 1 átomo de fósforocercado por 4 oxigênios de carga negativa).

A ausência de oxigênio no2º carbono, Auxilia a

identificação da moléculade DNA.

Estrutura Primária do DNA:

A Estrutura Primária do DNA se refere a ligaçãodos nucleotídeos:1 cromossomo humano 1 Molécula de DNA

Dando carganegativa a

molécula deDNA

A pentose do DNA é a Desoxirribose:

As Bases Nitrogenadas do DNA são compostaspelas purinas e pirimidinas:

As purinas possuem duplo anel aromático

*A molécula de Dna não possui uracila *

Existe uma regra que determina a direção da molécula:5’ - 3’

Composição das fitas:

A extremidade 5’ possui um grupo fosfatoem aberto, já a extremidade 3’ terá umahidroxila em aberto. A ligação que a DNApolimerase fará, está intimamente ligada aessas extremidades, onde a molécula daenzima será ligada e reconhecida.

Estrutura Secundária do DNA: Se refere à configuração tridimensional damolécula do DNA (estrutura helicoidalfundamental), favorecida pela força daspontes de hidrogênio

4

A exemplo desta matéria, publicada no início da pandemia de covid-19, podemosperceber a importância de se estudar o código genético:

O código genético, é também motivo de inspiração e curiosidade para muitos:

A descoberta do código genético:

Link de acesso ao artigo completo:

2.3 A DESCOBERTA DO CÓDIGO GENÉTICO

No final da década de 50 e início da década de 60, os cientistas dessa área estavamdiante de um enigma ainda maior. Como uma sequência linear de nucleotídeos seria capaz deproduzir proteínas que são formadas por aminoácidos? Eles sabiam que havia umalinguagem semelhante entre o DNA e o RNA, guardadas algumas pequenas diferenças, essacomunicação poderia ser entendida pelo sistema de pareamento de bases nitrogenadas porcomplementariedade. Mas o mesmo não se podia dizer sobre o RNA e as proteínas, poishavia um problema de codificação. Logo como seria possível a tradução?

Neste artigo é possível encontrar todo o seguimento do conteúdo deste capítulo:

Link de acesso ao artigo:

5

Fluxo da informação GenéticaFluxo da informação Genética

As informações que realizam todas asatividades celulares são codificadas naestrutura do DNA, porém o DNA sozinho não levaessa informação adiante, desta forma, énecessário um fluxo dessa informaçãogenética, já que o DNA não está comprometidodiretamente na realização dessas operações. É necessário, portanto, da transcrição deoutras moléculas para realizarem essaatividade: O RNA E AS PROTEINAS. Toda via, os instrumentos que serão utilizadospara realizar para as funções biológicascorrespondem principalmente em proteínas. Por exemplo, o transportador de oxigênio nashemácias é a proteína hemoglobina, e não oDNA que especifica sua estrutura.

Como ocorre esse fluxo de informação???

Dogma Central – 1ª Via de informação

Existem, porém, outras Vias de Informação:

RNA DNA: Transcrição ReversaRNA RNA: Replicação do RNA

Estão mais relacionadasaos vírus

Replicação Como acontece a replicação do DNA??

6

DNA fazendo réplicas daprópria molécula, para

que esse fluxo, e aprópria informação se

mantenha.

DNA usado como moldepara uma nova fita de

RNA

Formação da proteína,expressão genica tendo

como produto: aproteína.

Cada fita serácomplementada para aformação de mais uma

fita

Na natureza, in vivo, cada fita damolécula de DNA será molde por vez,em cada momento será uma fita,nunca as duas ao mesmo temposervirão de modelo para a síntese deDNA. In vitro, porém, em uma

pcr por exemplo, as duasfitas servirão de modelo

Esse processo, tanto in vivo quanto in vitro, é chamado

de Semiconservativo, por que cada fita nova vai carrearuma fita parental, uma fita antiga. Esse processoconserva parte da informação genética que estavapresente na molécula de DNA anterior.

Início da Replicação

A replicação de um cromossomo começaem pontos especiais chamados de origens dereplicação: curtas porções de DNA comsequências específicas de nucleotídeos.Quando as enzimas especificas para essareplicação perceberem esse trecho, elas irãoidentificar aquela região como o local dereplicação. Para os cromossomos de eucariotos,temos várias origens de replicação, diversostrechos em que o DNA pode ser replicado. Nobacteriano, existe apenas uma origem dereplicação, já que o DNA bacteriano não é umDNA retilíneo, mas sim circular. As proteínas que introduzem a replicaçãodo DNA identificam essa sequência e se ligamao DNA, separando as duas fitas e gerando a“bolha” de replicação.

Como se a dupla fitafosse inflada, separando

as fitas para que asenzinas tenham acesso

a esse materialgenético.

Assim, a replicação do DNA segue em duasdireções, até que toda a molécula seja copiada. Devido ao seu tamanho e quantidade deinformações genéticas distribuídas, umcromossomo eucarioto pode possuir centenas,até milhares, de origens de replicação.

Procarioto EucariotoÚnica origem de

replicação

É dentro deste espaço(forquilhas de

replicação) onde ocorrea replicação

Múltiplas origens de replicação

Em cada extremidade da bolha de replicaçãoestá a forquilha de replicação, região que possuiformato de Y onde as fitas de DNA parental estãosendo desenroladas. As helicases são enzimas que desenrolam adupla-hélice nas forquilhas de replicação,separando as duas fitas parentais e as tornandodisponíveis como fitas-molde. As helicases operam no ponto da bolha dereplicação e as outras regiões, onde não estáocorrendo a replicação, continuam entrelaçadas.Somente no ponto onde é necessário queenzimas tenham acesso para que aconteça areplicação ou uma transcrição, que as helicasesirão atuar na forquilha, promovendo o desenrolarda dupla hélice. Depois da separação das fitas parentais,proteínas de ligação à fita simples se juntam àscadeias de DNA não pareadas, impedindo queelas se vinculem novamente, auxiliando, assim, aestabilidade, já que naturalmente o DNA éhelicoidal. O desenrolamento da dupla-hélice causa umaumento na torção da cadeia no trecho da frenteda forquilha de replicação, como uma forçareversa. As topoisomerases auxiliam a atenuaresse aumento na tensão pela quebra, giro ereligação das fitas de DNA. Todas essas proteínas facilitam a aberturada dupla hélice, promovendo a replicação etranscrição.

7

As primases produzem os chamados primer, ele é aquele pequeno trecho que vai se ligar a essa molécula e permitirque a DNA polimerase pegue os nucleotídeos do meio e monte a nova fita. As Enzimas DNA-polimerases catalisam a síntese do novo DNA pelo acréscimo de nucleotídeos a uma cadeiapreexistente. Esse processo necessita da presença do oligonucleotídeo iniciador (primer) e de uma fita de DNA -molde, além dos nucleotídeos de DNA complementares e alinhados à fita-molde. O primer é uma pequena sequência de oligonucleotídeos de RNA. Se ligando a sequência do DNA parental, ele iráiniciar a sequência de nucleotídeos para que a DNA polimerase possa se encaixar no trecho e continuar a inserçãodos nucleotídeos do meio celular e assim, incorporá-los na fita nova de DNA.

Sintetizando uma nova fita de DNA

As enzimas DNA-polimerases, devido a sua estrutura, conseguem apenas adicionar nucleotídeos à extremidade 3’livre de um oligonucleotídeo iniciador (primer) ou de uma fita crescente de DNA, e nunca à extremidade 5’. Assim,uma nova fita de DNA somente pode ser alongada em apenas no sentido.

5’ 3’

A DNA-polimerase também possuí atividade exonucleásica (corrige erros de incorporação de nucleotídeos nodecorrer da síntese). 8

2

2

Fita-líder

Visão geral

Origem de replicação Fita descontínua

Fita-líder

Visão geral

Origem de replicação Fita descontínua

Oligonucleotídeo iniciador

Fita descontínua

Fita descontínua

Fita-líder

2 1

Fita-líder

Sentido da replicação

1 Após o oligonucleotídeo iniciador

Sentido da replicação

39 1 A primase une os nucleotídeos de

de RNA ter sido feito, a DNA-pol III inicia a síntese da fita-líder.

Origem de replicação

RNA em um oligonucleotídeo iniciador.

Origem de replicação

39 Fita-molde

59

59 39

59 39

59

59

39

DNA parental

Oligonucleotídeo

39 iniciador de RNA

“Grampo deslizante” 39

DNA pol III

59

Oligonucleotídeo

iniciador de RNA

para o fragmento 1

2 A DNA-pol III adiciona nucleotídeos de DNA ao oligonucleotídeo iniciador, formando o fragmento de Okazaki 1.

59

39 39

59

2 A fita-líder é alongada continuamente no sentido

59 1

3 Após alcançar o

próximo oligonucleotídeo iniciador de RNA à direita,

a DNA-pol III se dissocia da cadeia de DNA.

39 59 39

59

59 S 39; à medida que a

59 forquilha progride. Fragmento de Okazaki 1

59

1 39

Figura 16.15 Síntese da fita-líder durante a replicação do DNA. Este diagrama se concentra na forquilha de replicação mostrada no quadrinho com a visão geral. A DNA-polimerase III

(DNA-pol III), com o formato de mão côncava, está associada a uma proteína chamada de “grampo deslizante”, que circunda a dupla-hélice recém-sintetizada como um anel. O grampo deslizante desloca a DNA-pol III ao longo da fita-molde.

Oligonucleotídeo

iniciador de RNA

para o fragmento 2

59 Fragmento

39 de Okasaki 2

2

59

4 O fragmento 2 é iniciado. Em seguida, a DNA-pol III adiciona nucleotídeos de DNA até atingir o fragmento 1 e se dissociar da cadeia de DNA.

é alongada de maneira contínua, a fita retardada é sinteti-

zada de forma descontínua, em uma série de fragmentos.

1 39

59

Esses fragmentos da fita retardada são chamados de frag- 59

mentos de Okazaki, em homenagem ao cientista japonês 39

que os descobriu. Os fragmentos têm entre 1.000 e 2.000

nucleotídeos de extensão em E. coli e 100 a 200 nucleotí-

5 A DNA-pol I substitui o RNA por DNA, adicionando nucleotídeos à extremidade 39 do fragmento 2 (e, antes, ao fragmento 1).

2

deos de extensão em eucariotos.

A Figura 16.16 ilustra as etapas de síntese da fita re-

tardada. Enquanto apenas um oligonucleotídeo iniciador

é necessário para a síntese da fita-líder, cada fragmento de

Okazaki na fita retardada deve ser iniciado separadamente

(etapas e 4 ). Após a DNA-pol III sintetizar um frag- 39

mento de Okazaki (etapas a 4 ), outra DNA-polimera-

6 A DNA-ligase forma as ligações entre o DNA mais novo e o DNA do fragmento 1.

1 39

59

7 A fita descontínua agora está completa nesta região.

se, a DNA-polimerase I (DNA-pol I), substitui os nucleo-

tídeos de RNA dos oligonucleotídeos iniciadores por seus

equivalentes em DNA, adicionando-os um a um à extre-

midade 39 do fragmento de Okazaki adjacente (etapa 5 ).

A DNA-pol I não pode unir o nucleotídeo final desse frag-

2

1 39

59

Sentido da replicação

mento de DNA de reposição com o primeiro nucleotídeo

de DNA do fragmento de Okazaki cujo oligonucleotídeo

iniciador foi substituído (fragmento 1 na Figura 16.16).

Outra enzima, a DNA-ligase, realiza essa tarefa, unindo as

Figura 16.16 A síntese da fita descontínua.

cadeias principais açúcar-fosfato de todos os fragmentos

de Okazaki em uma fita contínua de DNA (etapa 6 ).

39

59

Como a DNA polimerase necessita de uma extremidade livre da região 3’ da fita para se ligar, ela não consegue fazerisso de forma continua na direção oposta, dessa forma, a enzima fará o processo por pequenos pedaços, fragmentos,que são chamados de fragmentos de okazaki.

Sentido da Replicação:

Para que a fita descontinua não permaneça com lacunas, as DNA ligases irão promover a ligação dos trechos,resultando em uma fita continua.

A direção 5’ 3’ é em relação a fita molde.

Na fita onde é possível ser realizada a inserção 5’ 3’ de forma continua, a síntese da nova fita será continua, porque jáobedece ao sentido de leitura da DNA polimerase. Já na fita oposta (descontinua) que possui o sentido contrário, paraque essa formação aconteça é necessário que também se mantenha o sentido 5’ 3’, mas dentro de uma outra orientação,assim, nesta indicação a construção acontece por fragmentos.

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Neste artigo, podemos entender mais detalhadamente a replicação dos plasmídeos :

• Replicação dos plasmídeos:

Os plasmídeos ligam-se a enzimas da célula hospedeira na replicação de DNApara a sua reprodução. Mas a iniciação da replicação é controlada pelos genes dosplasmídeos. Em consequência, o número de cópias do plasmídeo numa célula variaconforme o seu tipo, dependendo da regulação na iniciação da replicação. Os plasmídeos contêm uma série de genes para o estabelecimento de ligaçõesentre células e para transferir DNA do dador para o receptor. Uma cópia do plasmídeopode ser transferida na ligação da célula. A transferência é sempre acompanhada poruma replicação do plasmídeo.

Link de acesso ao artigo completo:

Animação sobre a Replicação do DNA

Replicação do novo coronavírus

11

Transcrição A Transcrição é a síntese de RNA operando as

informações presentes no DNA. Ambos os ácidosnucleicos empregam a mesma linguagem, ainformação é apenas transcrita/copiada do DNA para oRNA. Da mesma maneira que uma fita de DNA funcionacomo molde para a formação de uma nova fitacomplementar no decorrer da replicação do DNA, elatambém serve como molde para a síntese de umasequência complementar de nucleotídeos de RNA. Assim, a mesma fita que pode se replicar, fazendouma copia de si mesma, pode também servir de moldepara uma molécula de RNA. Em uma fita de DNA existem diversos genes quepossuem um promotor. Eles promovem o início dasíntese, como um sinalizador, esse trecho, nomomento em que a célula precisar de uma moléculaespecifica, estará apto a fazer a transcrição. O promotor de um gene manifesta em sua estruturao ponto de início da transcrição (o nucleotídeo onde asíntese de RNA se inicia verdadeiramente). Assim como na replicação, na transcrição a RNA-polimerase se acopla em uma posição e umaorientação específicas no promotor, definindo o inícioda transcrição, e qual das duas cadeias da hélice deDNA será empregada como molde naquele momento.

Nos procariotos:

Seguindo o dogma central, após a replicação temos a:

12Nos procariotos, ocorre

de forma direta, nocitoplasma.

Nos eucariotos:

Nos eucariotos, as etapas ocorrem de maneiradividida, porém, a replicação e transcrição ocorrem nonúcleo. O processamento do RNA é uma forma de identificara eficácia da molécula de RNAm, certificando se estáapta a sair do núcleo e fazer a tradução no citoplasma. O RNAm do eucarioto só vai até o citoplasma parafazer a tradução quando está de acordo com esseprocessamento.

Estrutura do RNA:

Estrutura secundária:

Cada anticódon só irátransportar um aminoácido

especifico.

O RNA possui fita simples;Sua pentose (ribose) possuí uma hidroxila amais em relação a pentose de DNA;A ligação, na mesma fita, entre o grupamentofosfato e uma pentose é chamada de ligaçãofosfodiéster;Purinas: Adenina e Guanina;Pirimidinas: Citosina e Uracila.

Classes de RNA encontrados nos procariotos eeucariotos:

RNA ribossômico – rRNA – Irá fazer a composição. É aestrutura onde a tradução irá acontecer.

Onde o RNA mensageiro etransportador se encontram para

formar a cadeia polipeptídica

Estrutura Primária:

Terá um aminoácido especificorelacionado ao anticódon que irá

parear com o RNA mensageiro.

Transporta os anticódons que irãose ligar com os códons do RNAmensageiro.

Formam a estruturaribossomo, que possui umaparte maior e uma menor.

RNA mensageiro – mRNA – possui códons, trincas

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Processamento do mRNA em Eucariotos

Nos eucariotos, esse processamento do RNAmensageiro, chamado de splicing:

splicing: O processamento do RNAm é a Etapa declivagem e retirada dos íntrons e de ligação dos exonscom a promoção das extremidades 5’ e 3’, formando oRNA mensageiro maduro. Os íntrons são trechos não codificantes, apenaspossuem função estrutural, mas não de síntese. Os exons são trechos codificantes, capazes deproduzir uma proteína.

É no spliceossomo que acontece todo o processode remoção dos íntrons, esse grande complexo éformado por proteínas e pequenas moléculas de RNA.Os íntrons são então dispensados e rapidamentedegradados, e o spliceossomo une os dois éxonsadjacentes a cada íntron, formando o RNAm maduro.

Tradução Neste processo, a mensagem genética é

interpretada pela célula, ela então sintetiza umpolipeptídeo correspondente. O RNA transportador (RNAt) interpreta a mensagempresente no mRNA. A informação interpretada é umasérie de códons que estão presentes ao longo dacadeia de RNA mensageiro.

A função do RNAt:

O RNAt desloca os aminoácidos contidos nocitoplasma para o polipeptídeo (cadeia de proteínas)formado no ribossomo.

Diversas proteínas são enzimas. Exemplos:amilase salivar, tripsina, pepsina;Componentes estruturais. Exemplo: queratina docabelo;Auxiliam no transporte de substâncias. Exemplo:hemoglobina, albumina;realizam funções: reguladoras, de comunicaçãoe defesa. Exemplo: hormônios, anticorpos.

No citoplasma de uma célula encontramos todos 20tipos de aminoácidos. Eles são obtidos via síntese apartir de outros compostos ou por meio da captaçãode aminoácidos contidos nas soluções que a cercam.

Função das Proteínas:

Estrutura das Proteínas:

·São constituídas por aminoácidos.

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Os aminoácidos são ligados por ligações peptídicas,construindo cadeias polipeptídicas.

Ribossomo

Estrutura primária: Sequência de aminoácidosEstrutura Secundária: folha β pregueada e a hélice αEstrutura Terciária: resultado da interação entre asestruturas secundárias – forma tridimensional.Estrutura Quaternária: Interação entre duas ou maiscadeias polipeptídicas.

RNA transportador – tRNA

Nesse caso, segundo o códigogenético, o RNAt estariatransportando uma lisina.

A enzima Amnioacil-tRNA sintetases (1 enzima paracada aminoácido) recarrega o RNAt após ele desprezaro aminoácido na formação da cadeia.

RNAt

O processo acontece até a chegada de um stopcódon que interrompe a formação da cadeia e um fatorde liberação, onde a cadeia é finalmente liberada.

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Neste artigo, podemos entender mais detalhadamente o DNA que antes eraconsiderado lixo:

Na ausência de conhecimento sobre as funções das regiões intrônicas, foi propostoinicialmente que elas seriam um “DNA-lixo” (cf. Ohno apud Keller, 2002). Isso foienfatizado pelo subsequente sequenciamento do genoma humano, no qual foi mostrado quesomente cerca de 1,2% das bases de DNA constituem éxons codificantes e, portanto, que amaior parte do genoma seria feita desse suposto “DNA-lixo” (cf. Lander et al., 2001;Venter et al., 2001).

Link de acesso ao artigo completo:

Do DNA à Proteína:

Extração de ácidos nucleicos eExtração de ácidos nucleicos eeletroforeseeletroforese

Extração de Ácidos Nucleicos

O que é?

A extração de ácidos nucleicos consiste emuma técnica primordial para a realização demuitos outros procedimentos da BiologiaMolecular. Ou seja, a partir dessa técnica, épossível obter algum tipo de ácido nucleico(DNA ou RNA) e utilizá-lo em outrasmetodologias. Baseia-se em quatro etapas primordiais,independente do protocolo; são elas: lise dasmembranas lipídicas, purificação do DNA,precipitação do DNA e reidratação do DNA.

Lise das membranas lipídicas (ou lisecelular) A lise das membranas lipídicas, ou lisecelular, é o primeiro passo para que ocorra aextração dos ácidos nucleicos; tem comoobjetivo expor o DNA/RNA, contidos no núcleoda célula, da membrana das diferentes célulasque podem ser utilizadas nessa técnica. Alémda membrana (composta por fosfolipídios +proteínas), ocorre também a lise de outroscompartimentos membranosos (organelas)indesejadas. A lise ocorre através dedetergentes que desestabilizam os lipídios dasmembranas, fazendo com que a mesma serompa e exponha seus componentes internos;um exemplo de detergente é o Dodecil Sulfatode Sódio (SDS).

(Aula Extração de ácidos nucleicos e Eletroforese – Tainah Galdino)

Essa etapa deve sempre ocorrer em um pHapropriado, de acordo com o tampão utilizadoao realizar a técnica. Ocorre também o uso deagentes quelantes, tais quais removem íonsmetálicos e formam complexos estáveis comos mesmos. Esses íons funcionam comocofatores de DNAses, inibindo-as. Um exemplodesses agentes é o ácidoetilenodiaminotetracético (EDTA).

Purificação do DNA / RNA(Desproteinização)

A purificação do DNA, ou RNA, consiste naeliminação de impurezas que podem inibir arealização das próximas etapas doprocedimento. São removidos componentescomo proteínas, lipídeos, entre outros restoscelulares. É um processo também conhecidocomo desproteinização pois, assim como otermo nos sugere, ocorre a eliminação deproteínas, que são as principais moléculascontaminantes, ressaltando as histonas porestarem diretamente ligadas aos ácidosnucleicos; para isso, fazem uso das proteases,lipases (eliminar lipídios) ou detergentes.Essas reações enzimáticas e/ou interaçõesentre macromoléculas possuem sempre ointuito de purificar ao máximo aquela mostra,favorecendo a retirada de contaminantes aoDNA/RNA e visando a extração limpa e completados ácidos nucleicos.

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Ainda nesta etapa de purificação, sãoadicionados solventes orgânicos como fenol,trizol e clorofórmio. Os mesmos funcionamcomo desnaturadores de proteína, passando asmoléculas proteicas para uma fase orgânica,enquanto o DNA/RNA continua em fase aquosa.Pode haver um aprimoramento desta etapautilizando solventes orgânicos em conjunto,como por exemplo o uso do clorofórmiojuntamente ao fenol, exercem a função dedesnaturanres porém estabilizam a junçãoentre as fases aquosa e fenólica, ou seja, autilização dessa mistura diminui a quantidadede solução aquosa retida na fase orgânica,melhorando o rendimento. Após o processo de desnaturação dasproteínas, a amostra é levada para acentrifugação com o intuito de separar porcompleto as fases aquosa e orgânica,resultando em uma fase aquosa contendo oDNA/RNA de interesse; um anel intermediárioentre as duas fases, tal qual contém asproteínas desnaturadas; e uma fase orgânicacontendo os outros restos celulares que serãoeliminados.

Precipitação do DNA/RNA

A precipitação do DNA/RNA consiste emseparar esse ácidos nucleicos do restante doscomponentes celulares. Considerando queDNA/RNA são solúveis em água, a precipitaçãodos mesmos ocorre através do uso de etanol ouisopropanol; por sua composição química, oetanol, por exemplo, induz a agregação eprecipitação dos ácidos nucleicos; tal qual,torna-se menos denso do que a solução aquosaobtida. Utilizando o etanol, ocorre também umaremoção de resíduos de fenol e de clorofórmiopresentes na amostra. Após isso, o álcool éretirado para que ocorra a formação dosedimento (pellet).

Quando o objetivo é extrair apenas o DNA, oRNA é retirado através da adição de RNAses queirão degradá-lo, permitindo a sua retirada domeio.

Reidratação do DNA/RNA

A reidratação é a última etapa do processo deextração de ácidos nucleicos, nela ocorre aressuspensão do DNA ou RNA em condiçõesespecíficas. A ressuspensão do DNA ocorre emágua ultrapura (livre de contaminantes eDNAse), ou TE ou NaOH 8mM. Já a ressuspensãodo RNA, ocorre em água ultrapura, livre decontaminante e RNAse.

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Para a molécula de RNA, a leitura deve serfeita em uma razão de 260/280nm, e aabsorbância do resultado obtido ideal deve serigual a 2, abaixo disso, o material éconsiderado contaminado, dependendo dacircunstância. Para a leitura da molécula deDNA, a mesma razão de 260/280nm deve serconsiderada, e o resultado é considerado ummaterial puro entre 1,75 e 1,80 de absorbância,quando é menor, o mesmo é considerado ummaterial contaminado. Porém, para que essas leituras ocorram, aamostra não pode obter nenhum contaminantede fenol, pois o mesmo interfere diretamentena leitura, por fluorescer em um comprimentode onda muito próximo ao dos ácidosnucleicos. Existem diferentes tipos deespectrofotômetro e de extração de ácidosnucleicos, o melhor aparelho e a melhortécnica devem ser escolhido a partir da suapergunta inicial ao experimento. A escolha dametodologia também varia de acordo com aamostra utilizada, ou seja, tudo depende dascircunstâncias da análise.

Curiosidade

Mas depois de toda essa explicação, por queestudar como funciona o processo de extraçãode ácidos nucleicos? Essa técnica nos permite conhecer muitascoisas consideradas banais ao ver dasociedade, como, por exemplo, um teste depaternidade; ou até mesmo estudos maisrebuscados como a paleonparasitologia, queestuda o DNA de microrganismos ancestrais(com milhões de anos). É uma técnica muitoutilizada em diversos tipos de pesquisa,diagnósticos e afins.

A estocagem ocorre de formas distintas paracada ácido nucleico, o DNA deve ser estocado a-20 graus Celsius, enquanto o RNA deve serestocado a -70 graus Celsius.

Quantificação do material extraído

Após a realização da extração dos ácidosnucleicos, deve haver uma quantificação domaterial extraído; com o intuito de verificar apureza e a relação entre quantidade/qualidadedo material. Essa quantificação conta com a técnica daespectrofotometria, que consiste na utilizaçãode um aparelho chamado espectrofotômetro,tal qual permite comparar a radiação absorvidapela amostra ao incidirmos radiação namesma. Essa quantidade de luz absorvida équantificada e analisada. A quantificação no aparelho ocorre através doseguinte esquema: a energia emitida eleva oselétrons das moléculas para níveis energéticosmais altos; e a energia necessária para essaelevação varia de acordo com a molécula.

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Pra obter poros grandes, deve haver umabaixa concentração de agarose, e para obterporos menores, a mistura deve possuir altaconcentração de agarose, onde ocorre umamaior retenção de moléculas. A preparação do gel ocorre através damistura do pó de agarose com a soluçãotampão escolhida, essa mistura deve seraquecida para ocorrer a fusão da agarose; apósisso, o gel deve ser levado ao molde, tambémconhecido como “caminha”. O molde contém“pentes” formadores de poços, que permitirão aadição da amostra após a solidificação do gel.Essa solidificação ocorre diretamente na cubade corrida da amostra. Após realizar a corrida em gel de agarose,coloca-se a amostra em contaro com brometode etídio, um corante capaz de se intercalarentre as bases do DNA e que fluoresce quandoexcitado com luz UV.

Eletroforese

A eletroforese é uma técnica de separaçãode moléculas; porém, também permiteidentificar e purificar, ou seja, é uma dasprincipais técnicas de análise deDNA/RNA/Proteínas/Produto amplificado (apartir da PCR). Essa técnica consiste na migração dasmacromoléculas através de um gel, aseparação acontece de acordo com a carga e opeso molecular das moléculas. Assim, em umpolo do aparelho é fornecida a carga negativa, eem outro, é fornecida a carga positiva; essamigração para os polos ocorre pela carganegativa dos grupos fosfato presentes namolécula de DNA, que correm para o polopositivo. A eletroforese em gel é a o método maisutilizado, onde as moléculas migramatravessando os poros do gel, um tipo demalha; ela pode ser empregada na separaçãode DNA/RNA/Proteínas. Porém, a composição dogel varia de acordo com a qualidade do materiala ser separado, podendo variar entrepoliacrilaminda e agarose. Através dessatécnica, ocorre a visualização dos ácidosnucleicos e/ou proteínas por cores.

Eletroforese em Gel de Agarose

A agarose é um polissacarídeo proveniente dealgas marinhas; a mesma deve ser pesada edissolvida com tampão de TBE ou TAE. Suapropriedade gelificante se deve por conta daformação de pontes de hidrogênio inter e intra-moleculares. A utilização desse gel éimportante para a separação de DNA/RNA, e ostamanhos de seus poros podem variar deacordo com a concentração de agarose namistura.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

A poliacrilamida é formada através dapolimerização de dois compostos, a acrilamidae bisacrilamida. Para preparar o gel, deve seradicionado o Temed, que atua como catalisadorda polimerização, formando assim, o gel depoliacrilamida. Dependendo da concentraçãoutilizada no gel, os poros formados no gelapresentam-se maiores ou menores, podendo

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No caso do gel de poliacrilamida, essemesmo processo pode ocorrer quando aamostra se trata de DNA ou amplicões (produtoda PCR), ocorrendo da mesma forma, com aadição do brometo de etídio, entre outrassoluções semelhantes; em outros casos, apoliacrilamida pode contar com o nitrato deprata como um corante, onde a molécula écorada por impregnação, ou seja, as partículasvão se sobrepondo às moléculas e se tornandovisíveis. Vale lembrar que os tampões de amostra,azul de bromofenol e xilenocianol, não temcomo objetivo revelar a amostra em sua fasefinal, mas sim, corar a amostra ao longo dacorrida. Esse corante entra em ação quando ogel é colocado em contato com corantes comobrometo de etídio que, em conjunto com otampão adicionado anteriormente, permite aleitura dos resultados através da luz UV.

Depois de sua formação, o gel levado aocompartimento que fará a leitura, possuindouma cuba de plástico e um pente que forma oscanais, tais quais possibilitam a adição dasamostras. Após a adição da amostra, o tampãoescolhido é adicionado ao topo docompartimento. O mesmo é ligado à eletrodos,possibilitando a utilização da técnica deseparação por carga da molécula. Uma especificidade dos géis de poliacrilamida,são as formas de corar a mostra; nestacomposição, pode ser utilizado o nitrato deprata, que é mais sensível, ou seja, há umadetecção mais fácil de pequenas quantidadesde DNA, por exemplo.

E para concluir

No gel de agarose, a “corrida” ocorre comduas moléculas denominadas monitores decorrida, são elas o azul de bromofenol e oxilenocianol. O azul de bromofenol possui corazulada e corre como um DNA pequeno, aopasso que o xilenocianol possui coresverdeada e corre como um DNA maior.

influenciar na resolução de diferentestamanhos de DNA (por isso a concentração éimportante na hora de formular o gel,dependendo da amostra em questão).

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Algumas informações relevantes sobreas bactérias...

As células bacterianas que conseguemconservar recursos e energia têm vantagemseletiva sobre as que não conseguem, ou seja,a seleção natural resultou apenas em célulasque não desperdiçam energia, sendo assim,aquelas que expressam apenas genes cujosprodutos são requeridos pela célula.

Controle da expressão gênica

Esse controle é um equilíbrio do gasto deenergia, ou seja, a expressão gênica não teráacionamento de forma a desperdiçar a energiada célula; de forma mais aprofundada, é umbalanço entre a taxa de síntese (quantidade etipo de produto sintetizado) e a taxa dedegradação (quantidade e tipo de produtogênico degradado). No caso das bactérias, a expressão gênicamantém uma flexibilidade interna onde a célulavai trabalhar de acordo com a necessidade damesma, e em resposta à mudanças ambientais(principalmente procariotos, que sãoestruturalmente mais primitivos). Mas muitas pessoas podem se perguntar...pra que regular a expressão gênica?Basicamente, todo o processo de feitura deuma proteína tem uma demanda muito grandede energia (ATP) entre outras moléculas, ouseja, o “custo” seria muito grande para produzirproteínas a todo tempo. E aí a regulação entraem ação, com o intuito de realizar apenas osprocessos necessários, otimizando o gasto deenergia da célula.

Curiosidades

Para realizar a eletroforese, não é necessárioque o ácido nucleico tenha passado peloprocedimento de extração... como é umatécnica de separação de molécula, na maioriadas vezes, é utilizada a molécula inteira!Porém, se o objetivo da técnica for avaliar aintegridade da molécula de DNA, o mesmo deveter passado por uma extração, com o intuito degarantir o melhor resultado, sempre! Por ser um procedimento simples e de baixocusto, a eletroforese é uma técnica importantede análise laboratorial. Pode ser utilizada tantoem projetos de investigação quanto nodiagnóstico, ou seja, em testes de paternidade,na identificação de mutações, sendo útil nodiagnóstico de leucemias, por exemplo, naverificação da expressão de proteínas... sãoinfinitas possibilidades!!

Regulação da expressão gênica -Procarioto (I)

O que é?

A regulação da expressão gênica nada maisé do que a etapa de transcrição entre as etapasde replicação, transcrição e tradução dosgenomas (proteínas). Neste caso, vamosabordar a expressão de procariotos, utilizandoas bactérias como representante desse grupo!

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Mas uma pergunta que pode surgir é “como aE. coli sabe a concentração de glicose no meioe como essa informação chega no operón lac?”.Primeiro ocorre a entrada da lactose (que estáem alta no meio) na célula bacteriana atravésde um poro; dentro da célula, ocorre a hidróliseda lactose através da enzima β-Galactosidase,tal qual promove, também, a formação daalolactose (isômero da lactose – estruturaparecida com a da lactose), além da glicose eda galactose. A partir disso, podemos concluir que o operónlac vai agir de diferentes formas a depender daconcentração de lactose no meio... entãovamos a análise!

Operón lac na ausência de lactose nomeio

Quando a lactose se encontra em ausênciano meio, o operón lac recebe um controlenegativo, por estar sendo guiado por umrepressor de lactose, ou seja, na ausênciadessa molécula, o repressor está ativo e ooperón está desligado. Tudo isso acontece em uma parte específicado gene (apresentada na imagem abaixo). Ogene regulador (lac I), na ausência de lactose,transcreve uma proteína repressora, tal qualvai se ligar ao sítio operador e impedir que aRNA-polimerase se ligue neste sítio e faça atranscrição dos genes estruturais.

De forma mais genérica, o estado metabólicoda célula determina o acionamento dos genesdo genoma bacteriano; e o mecanismo básicopara esse controle da expressão gênica éconhecido como modelo operón (FrançoisJacob e Jacques Monod – Instituto Pasteur –Paris 1961).

Modelo Operón

O operón é uma sequência de DNA bacterianocom locais específicos, que estãofuncionalmente relacionados, transcritosjuntos sob o controle de um único promotor; ouseja, é formado por um promotor, um operadore por seus genes estruturais. Os operóns são classificados entre reprimíveise induzíveis. Os reprimíveis normalmente têmsua transcrição ligada, mas pode ser reprimidaquando uma molécula específica se liga aproteína repressora (reguladora); já osinduzíveis normalmente estão desligados maspodem ser estimulados (induzidos) quandouma molécula específica interage com aproteína reguladora (repressora), e esse é ocaso do operón lac (lactose). Falando um pouco sobre o operón lac,devemos nos embasar no por que da utilizaçãodo mesmo. No meio, a bactéria (utilizandocomo exemplo, a E. coli) tem preferência pelautilização da glicose como fonte energia,porém, quando a glicose está em baixaquantidade e a lactose em maior quantidade, amesma serve de fonte de energia para a E. coli,e é aí onde o operón lac entra em ação.

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Em conjunto com o AMPc, a proteínaativadora de catabólito (CAP) funciona como umativador e se liga ao DNA, estimulando atranscrição do gene. Ou seja, o AMPc emconjunto com a CAP, resultam em um aumentona transcrição de genes (transcrição ativa).Essa ligação (AMPc + CAP) aumenta a afinidadeda RNA-polimerase pelo promotor e,consequentemente, aumenta o volume da taxade transcrição. Conclui-se que esse mecanismoresulta em uma regulação ativa. Porém quando se tem a presença de lactosee glicose, o nível de AMPc diminui,considerando que a glicose é a preferência defonte de energia da célula. E, nesse caso, asíntese dos genes estruturais é baixa pois nãoocorre o estímulo da RNA-polimerase (ocorre,mas é em menor quantidade). Podemos concluir que o operón lac possuium controle duplo. O negativo sendo feito pelorepressor lac, e o positivo sendo feito pela CAP.Ou seja, o estado do repressor (com ou semalolactose ligada) determina se a transcriçãodos genes desse operón irá ou não ocorrer;enquanto a CAP (com ou sem AMPc ligado)controla o volume da taxa de transcriçãoquando o operón lac estiver livre de repressor. Estes processos citados acima estãoexemplificados nas imagens abaixo.

Operón lac na presença de lactose nomeio

Agora analisando a situação contrária... napresença de lactose no meio, ocorre uma açãoda alolactose (formada pela enzima β-Galactosidase), onde a mesma se liga à enzimarepressora que foi sintetizada pelo generegulador (lac I), impedindo que ela chegue aooperador, ou seja, a alolactose inativa orepressor. Desta forma, a RNA-polimerase estálivre para fazer a transcrição dos genesestruturais do operón. Quando formados, os genes estruturais vãosintetizar na enzimas (proteínas) da β-Galactosidase (na presença de lac, a hidróliseda mesma precisa ocorrer; e ocorre atravésdessa enzima), da permease (altera amembrana da célula bacteriana e permite,ainda mais, a entrada de lactose do meio para acélula) e da transacelitase (tal qual ainda nãopossui uma ação muito bem definida). Lembrando que tudo isso ocorre com ooperón ligado e o repressor desligado. A açãoestá expressa na imagem abaixo.

Mas não acaba por aí! Além do controlenegativo citado na etapa anterior, na presençada lactose, o operón lac tem um controlepositivo, tal qual é remediado pelo AMP cíclico(AMPc); ou seja, quando a glicose está em baixaconcentração no meio, o AMPc se acumulaneste meio.

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Para resumir- Glicose presente e lactose ausente: Nãoocorre transcrição do operón lac (repressorligado, impedindo ligação da RNA-polimerase)

- Glicose presente e lactose presente: Baixonível de transcrição do operón lac (preferênciapela glicose não induz a alta nos processos detranscrição pelo operón lac)

- Glicose ausente e lactose ausente: Não ocorretranscrição do operón lac (AMPc em altosníveis; repressor ligado e impedindo ligação daRNA-polimerase)

- Glicose ausente e lactose presente: Ocorrealto nível de transcrição do operón lac (semrepressor; transcrição ativa [AMPc + CAP])

Regulação da expressão gênica -Eucarioto (II)

Ainda no assunto de regulação da expressãogênica, vamos abordar como funciona esseprocesso em organismos eucarióticos! Todos os organismos (procariotos e eucariotos/uni e pluricelulares) devem regular aexpressão gênica de forma a otimizar o gastode energia da célula, eles devem desligar eligar continuamente os genes em resposta asinais dos meios externo e interno.

Essa regulação é muito importante emorganismos pluricelulares, pois desta formaocorre uma especialização das células; semprecom o intuito de realizar apenas os processosnecessários.

Como ocorre a expressão gênica em umacélula eucariótica? Primeiramente, ocorre uma modificação dacromatina (proteínas que estão envelopando oDNA), com o intuito de estabelecer odesempacotamento do DNA. Desta forma, omesmo é exposto aos fatores de transcrição; atranscrição (expressão gênica) ocorre e resultaem um transcrito primário contendo exons eíntrons. Após isso, ocorre o processamento doDNA, onde os íntrons são retirados e os exonsligados; também ocorre a inserção de um“quepe” (guanina modificada – contém umgrupo fosfato e uma metila) na extremidade 5’.Uma cauda é ligada à extremidade 3’, tal qualse caracteriza como poliA. Lembrando que tudoisso ocorre no núcleo da célula. Após o amadurecimento do RNA mensageiro,o mesmo sai do núcleo e se desloca até ocitoplasma, onde ocorre a tradução e todo oprocessamento da proteína em questão. Valeressaltar que cada etapa da expressão gênicadessa célula, é uma potencial abertura paraque haja o controle deste processo.

Controle da expressão gênica emeucariontesPara que haja o controle da expressão gênicaem células eucarióticas, vale ressaltar que amaioria dos genes não são organizados emoperons (raramente são transcritos juntos emuma mesma molécula de RNAm). E que aestrutura da cromatina vai afetar a expressãogênica (mas isso a gente vê mais pra frente).

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Regulação da estrutura da cromatina:Modificação das proteínas histonas

A regulação da estrutura da cromatina ocorreatravés da modificação das proteínas histonase da metilação do DNA. A modificação das histonas se dá pelo N-terminal de cada histona se entendendo parafora de seu nucleossomo (unidade dacromatina); essas caudas são acessíveis àmuitas enzimas modificadoras, capazes deadicionar ou remover grupos químicos comoacetila, metila e fosfato.

Regulação da estrutura da cromatina:Metilação do DNA

A metilação do DNA ocorre em um grupodiferentes de enzimas, tais quais podemmetilar certas bases do próprio DNA(normalmente acontece na citosina). Quando o DNA é intensamente metilado, eleestá relacionado à repressão da transcrição.Como já dito, a metilação do DNA é mais comumem bases citosinas adjacentes às guaninas(CpG – na mesma fita). Ou seja, quando tem-seum excesso de metilação (inserção de umgrupamento metila CH3 na molécula) em umtrecho, neste ocorre um silenciamento gênico;portanto, antes de acontecer a transcrição, osgrupamentos metila são retirados através daação de enzimas. No caso da metilação em citosinas, oprocesso ocorre através da metiltransferase.Segue um esquema deste processo demetilação da citosina.

Cada gene estrutural tem seu própriopromotor, ou seja, já percebe-se umadiferenciação para a estrutura procariótica.Ressalto também que ativadores são maiscomuns em eucariontes e que, de novo, amembrana nuclear é importante, uma vez quesepara transcrição e tradução (em todos ossentidos). Agora, você deve saber que existem algunsprocessos importantes que afetam a regulaçãogênica neste tipo de célula. Quer saber quaissão eles? Continue lendo.

Processos que afetam a regulação gênica

Entre os processos que afetam a regulaçãoda expressão gênica, estão: o remodelamentoda cromatina, a modificação das proteínashistonas e a metilação do DNA.

Remodelamento da cromatina

Para compreender esse processo, devemosnos familiarizar com a estrutura da cromatina.

A cromatina é composta por uma dupla-hélice de DNA e por proteínas histonas, taisquais estão envoltas pela dupla-hélice e,consequentemente, oferecem uma proteção aomaterial genético; o que dificulta o acesso aomesmo. Ou seja, essa cromatina reprime aexpressão gênica, e para que os fatores detranscrição, ativadores e RNA-polimerase seliguem ao DNA, o mesmo deve ser descobertopor essa capa protetora. Sendo assim, devehaver um remodelamento da estrutura dacromatina, antes de acontecer a expressãogênica, com o intuito de tornar a molécula deDNA mais acessível aos fatores citados acima.

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Uma curiosidade é que quando há a quebrado controle da metilação das moléculas, issopode se relacionar com a formação de algunstipos de câncer. Concluindo, quando o a metila (CH3) estápresente na molécula, não ocorre a transcrição,caso contrário, esse processo pode ocorrer.

Metilação do DNA e carcinogênese

Nesta etapa vamos analisar a relação entre ametilação do DNA e a formação de tumores, ouseja, a carcinogênese. A carcinogênese pode acontecer por conta daalteração de genes críticos, através dametilação, podendo haver dois padrõesdistintos, hiper ou hipometilação generalizadado genoma. A hipometilação generalizada do genomapromove instabilidade cromossômica eativação de oncogenes (genes capazes de gerartumores). Contraditoriamente, a hipermetilaçãode ilhas CpG pode inativar genes supressorestumorais (genes que iriam inibir a formação detumores), ou também a inativação de genes dereparo. Ou seja, a célula deve encontrar umequilíbrio neste processo de metilação, pois osdois extremos podem causar danos.

Modificação das proteínas histonas

Retomando o papo sobre as proteínashistonas, vamos abordar algumascaracterísticas sobre as mesmas. As histonas possuem dois domínios, umglobular (associa-se com outras histonas ecom DNA) e um de cauda com cauda positiva,tal qual faz com que haja uma interação com osgrupos fosfato presentes no DNA. Mas quais são as modificações que podemacontecer nas histonas? São algumas... vamoslá! Pode ocorrer a adição do grupo metila (CH3)às caudas das proteínas histonas, ou seja,ocorre uma metilação na cauda da histona,ajudando no processo de repressão dacromatina. Além disso, pode ocorrer aacetilação, ou seja, a adição de grupos acetila(CH3CO) ao aminoácido lisina (situado na caudahistona), através da ação da acetiltransferase(promove relaxamento da cromatina, fazendocom que o DNA seja exposto aos fatores detranscrição); portanto, as enzimasdesacetilases retiram esse grupo das caudasda histonas e restauram a cromatina. A acetilação das histonas facilita o acessodos fatores de transcrição e da RNA-polimeraseao DNA, ou seja, relaxa a cromatina e estimula aexpressão gênica, por outro lado, adesacetilação da histona vai reprimir atranscrição, condensando a cromatina edificultando o acesso ao DNA. Para exemplificar um pouco tudo que foifalado até agora, segue um esquema que ilustraalguns processos citados anteriormente.

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Vale lembrar que as lisinas localizadas nascaudas das histonas são passíveis de ligaçõescovalentes pela ligação de grupos acetil emetil. A Histona acetiltransferase (HAT) é umaenzima capaz de adicionar o grupo acetil, ouseja, favorece o mecanismo de transcrição;enquanto as Histonas desacetilases (HDAC)promovem a retirada do grupo acetil e arepressão da expressão gênica. Conclui-se que a acetilação está relacionadaà transcrição e a metilação está relacionada àrepressão transcricional. Podendo gerar genesativos com DNA desmetilado e histonasacetiladas, ou genes inativos com DNA metiladoe histonas desacetiladas ou DNA metilado ehistonas metiladas.

Epigenética

A partir de todos os estudos feitos até agora,vamos adentrar no mundo da epigenética, queé a área da biologia que estuda as interaçõesentre os genes, podendo variar entre aexpressão e a supressão dos mesmos. É a áreaque investiga a formação do fenótipo(características visíveis no ser), a partir daformação do genótipo e sem a alteração domesmo; ou seja, ela investiga a informaçãocontida no DNA, transmitida na divisão celular,mas que não constitui parte da sequência doDNA em questão.

na biologia do organismo, definindo diferentesfenótipos” (Marcelo Fantappié, RevistaCarbono). De acordo com Marcelo Fantappié, daRevista Carbono, as modificações no genomasão vagarosas e para que um traço genético (oufenótipo) se instale numa população, isso podelevar muito tempo; por outro lado, o epigenomapode mudar rapidamente e ser transmitidopara a geração seguinte. Nesse sentido, através da herançaepigenética um organismo pode ajustar aexpressão gênica de acordo com o ambienteonde vive, sem mudanças no seu genoma.“Nesse sentido, através da herança epigenéticaum organismo pode ajustar a expressão gênicade acordo com o ambiente onde vive, semmudanças no seu genoma” (Marcelo Fantappié,Revista Carbono). Isso pode ser exemplificado a partir daexperiência de gêmeos idênticos. Já foicomprovado cientificamente que durante atransição da infância para a vida adulta, osgêmeos podem divergir significativamente emsintomas relacionados à depressão e/ouansiedade; por terem o mesmo padrão genético(exatamente a mesma sequência de bases emambos os genomas), essa divergência só podeser explicada através das diferentesexperiências individuais de cada um, que dãofrutos diferentes para cada indivíduo (etambém pelas mudanças epigenéticas).

Os processos epigenéticos ocorrem nosprocessos discutidos anteriormente, ou seja,no DNA por metilação e nas histonas pela açãoda acetilação ou metilação, sendo assim,processos pós-traducionais. E esses processosconstituem os fatores epigenéticos, tais quaispromovem a transcrição do DNA. Ou seja, “As modificações epigenéticaspodem ser herdadas no momento da divisão celular (mitose) e irão ter um profundo efeito

E para concluir “o esforço atual tem sidodepositado em cima do sequenciamento doepigenoma, ou seja, na identificação de todasas citosinas metiladas ao longo do genoma. Oepigenoma na sua totalidade irá levar a ummelhor entendimento de como a função dogenoma é regulada na saúde e na doença, etambém como a expressão genética éinfluenciada pela alimentação e pelo ambiente”(Marcelo Fantappié, Revista Carbono).

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PCRPCRO que é?

Reação cadeia da polímerase(PCR), ou eminglês "Polymerase Chain Reaction", consisteem uma técnica de biologia molecular quepermite replicação in vitro do DNA de formarápida, além de amplificação rápida desegmento específico de cDNA também.

História

Foi na década dos anos 80 que o cientistaKary Mullis quando teve a ideia de usar um parde primes para delimitar uma sequência deDNA e copiá-la usando DNA polímerase.Sendo em 1985 a 1° publicação sobre PCR narevista Science. Em 1993, Mullis ganhou oprêmio Nobel em Química.

Funcionamento

A dupla hélice é estabilizada por ligaçõeshidrogênio, duas entre as bases adenina (A) etimina (T) e três entre as bases guanina (G) ecitosina (C). Inicialmente, para que o DNA possaser replicado, a dupla hélice precisa sertotalmente desnaturada pelo aumento datemperatura, quando são desfeitas as ligaçõeshidrogênio entre as diferentes basesnitrogenadas.

1° Etapa: Desnaturação/ 94°C - 96°C

Inicialmente, para que o DNA possa serreplicado, a dupla hélice precisa ser totalmentedesnaturada pelo aumento da temperatura,quando são desfeitas as ligações hidrogênioentre as diferentes bases nitrogenadas.

2° Etapa: Anelamento/ Temperatura: 55°C- 65° C

No processo de finalização a polímeraseadiciona dNTP fazendo a extensão da nova fita.

3° Etapa: Extensão/ 72°C

No processo de finalização a polímeraseadiciona dNTP fazendo a extensão da nova fita.

Vídeo que demostra a aplicação:

.Atualidade

Hoje a teste de PCR está muito presente nocombate à pandemia causado pelo vírus Sars-cov-2, mas também utilizada no diagnóstico deinfecção de um paciente por outrosdeterminado vírus, pelo fato de técnica permitira amplificação específica de material genéticodo vírus. A especificidade da reação égarantida. Portanto, percebe-se a importânciadessa técnicas nos dias de hoje parahumidade.

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Variações da PCRVariações da PCR

Variaçõesde PCR

RT-PCR:TranscriçãoReversa seguida de PCR

Long PCR e PCR in situ(PRINS)

RACEPCR digital

TouchdownPCR e Hot start

DNA pol

PCR assimétrica eLATE- PCR

PCR inversaQC-PCR

Nested PCR

PCR quantitativa emtempo real (qPCR)

RAPD, AFLP e RFLP

Multiplex PCR e Rep-PCR

SSCP

Os diferentes tipos de PCR tem opropósito distintos para cada uma,

varia muito pelo interesse doobjetivo da pesquisa.

Clonagem MolecularClonagem Molecular

As bactérias podem incorporar DNAexógeno em um processo denominadotransformação.A transformação é um passo fundamentalna clonagem de DNA. Ocorre apósclivagem e ligação e transfere plasmídeosrecém-criados para bactérias.Após a transformação, as bactérias sãoselecionadas em lâminas antibióticas. Asbactérias com um plasmídeo sãoresistentes a antibióticos e cada umaformará uma colônia.As colônias com o plasmídeo sicertopodem ser cultivadas para formargrandes culturas de bactérias idênticas,que são usadas para produzir plasmídeoou sintetizar proteína.

Digestão com enzima(s) de restriçãoSistemas TA

Cosmídeos

Cosmídeos são moléculas de DNA circularesextracromossomais que combinam asvantagens de um plasmídeo com a de um bacteriófago. O limite de clonagem é de 35 a50 kb.

(Técnica) Transformação de E.coli

Preparação do DNA vetor e inserto

Preparação do vetor

Métodos de produção de fragmentos deDNA: insertoDigestão com enzimas de restrição Digestão parcial com DNase I Quebra mecânica controladaSíntese enzimática (cDNA, PCR) Síntese química deoligodesoxirribonucleótidos.

Digestão com enzimas de restrição Digestão parcial com DNAseQuebra mecânica controladaSíntese enzimática (cDNA, PCR) Síntese química de oligonucleotídeos

Bactérias especialmente preparadas sãomisturadas com DNA.Um choque térmico é dado nas bactérias,o que faz com que algumas delasincorporem um plasmídeo. Os plasmídeos usados na clonagemcontém um gene para resistência aantibiótico. Desta forma, todas as bactérias sãocolocadas em uma lâmina de antibióticopara selecionar aquelas queincorporaram um plasmídeo.

Preparação do inserto

Métodos de produção de fragmentos deDNA: inserto

Transformação bacteriana

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Bactérias sem um plasmídeo morrem.Cada bactéria com um plasmídeo dáorigem a um aglomerado de bactériasidênticas, contendo plasmídeo, que sãodenominadas de colônia.Várias colônias são verificadas paraidentificar uma com o plasmídeo correto.Uma colônia contendo o plasmídeocorreto cresce em volume e é usada paraa produção de plasmídeo ou proteína.

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CRISPRCRISPR A francesa Charpentier, de 51 anos, e aamericana Doudna, de 56 anos, se tornaram asexta e a sétima mulheres a serem agraciadascom o Nobel de Química, se juntando à lista queinclui Marie Curie, a primeira mulher a ganhar o prêmio nesta categoria, em 1911.

Enquanto pesquisava uma bactéria nocivacomum, Charpentier descobriu uma moléculaque era parte do antigo sistema imunológico dabactéria e que combate vírus cortando partesdo seu DNA. Depois de publicar o estudo em2011, ela trabalhou com Doudna para recriar atesoura genética da bactéria, simplificando aferramenta para usá-la em outros materiaisgenéticos. Elas reprogramaram então a tesourapara ser usada em qualquer molécula do DNA.

Crispr é a sigla para Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats, ou seja,repetições palindrômicas curtas agrupadas eregularmente interespaçadas. Essas repetiçõescorrespondem a regiões do DNA bacterianoonde se encontram sequências que contêminstruções para produzir moléculas de RNA nãocodificantes para proteínas que são capazes dereconhecer moléculas de DNA de bacteriófagosque as infectam. Normalmente, após o contatodessas bactérias com seus invasores naturais,os RNAs produzidos guiam as nucleases dosistema Crispr para o DNA do bacteriófagoinvasor para cortá-lo e inutilizá-lo, e, assim,bloquear a infecção.

O acionamento dessas áreas no genomabacteriano funciona como um mecanismo dedefesa contra infecções, neutralizando areprodução do material genético viral por umprocesso denominado RNA de interferência.

Cientistas descobriram que essa região atuacomo um sistema de defesa de bactérias, emque pedaços de DNA de vírus invasores sãoinseridos entre as repetições. São usadoscomo se fossem uma “memória” numa infecçãofutura. Quando uma nova infecção ocorre, asbactérias produzem enzimas (Cas9 é a maisconhecida) que atuam como tesourasmoleculares que carregam a “memória” dovírus. Com isso, se o novo invasor apresentarsequências idênticas a alguma dessas“memórias”, o material genético será picotadopela enzima.

Baseado nesse mecanismo de defesa dasbactérias, os cientistas descobriram comoinformar a essas enzimas, a sequência a sereditada em um genoma. A informação ocorrepor meio de uma sequência de RNA que é construída e sintetizada em laboratório.

Esse RNA é chamado de RNA-guia (sgRNA)pois, é construído de acordo com a sequênciade DNA a ser modificada, ou seja, um ou maisgenes de interesse. Dessa maneira o sgRNApode conduzir, por exemplo, a proteína Cas9até uma região do genoma do organismo queestá sendo modificado e cortar a dupla fita deDNA.

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As células possuem mecanismos naturais de reparo de sequência de DNA, que são ativados toda vez que este édanificado. Uma vez que o DNA é cortado pela proteína Cas9, o sistema de reparo dessa célula é ativado e vai“consertar” o fragmento alvo. Esse reparo pode acontecer por recombinação homóloga ou não homóloga.

Na recombinação homóloga a célula utiliza um molde de fragmento de DNA, que pode ser natural da célula ouexógeno. Neste caso é possível inserir genes. Já na recombinação não homóloga a célula apenas une as duasextremidades do fragmento de DNA. Neste caso é possível inativar genes.

Um trecho do artigo traduzido que demonstra uma possível aplicação:

Pesquisadores na universidade de Tel Aviv (TAU) demonstraram que a técnica CRISPR/Cas9 é bastante efetiva notratamento de câncer metastático (glioblstoma e óvarios), um passo significativo em direção à descoberta da curado câncer. Pesquisadores desenvolveram um novo lipídio com um sistema de entrega baseado em nanopartículasque agem especificamente nas células cancerígenas e as destroem através de manipulação genética.

Tratamento revolucionário a base da técnica de edição genética CRISPR destróicélulas cancerígenas

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Link de acesso ao artigo:

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Tira dúvidasTira dúvidas Aula se aprofundou em forense, tema solicitado por uma aluna que pretende trabalhar como perita futuramente.

A forense a partir de técnicas de biologia molecular alcança uma resposta de um crime, com o propósito de asvítimas não sejam prejudicadas e que haja justiça.

Pode ser ver a aplicação da forense neste vídeo:

A biologia molecular tem uma diversidade bem grande de oportunidades de trabalhos. BioMol não se limita a estáno laboratório sentado em uma bacanda realizando PCR.

O vídeo a baixo é bem explicativo sobre as diversas áreas de atuação de Biologia Molecular:

Baseada em hidrólise química,desenvolvida por Alan Maxam e WalterGilbert. Baseada em reação enzimática,desenvolvida por Frederick Sanger e cols.

O que é?

O sequenciamento genômico é uma técnicaque permite identificar, na ordem correta, asequência de nucleotídeos de uma molécula deDNA ou RNA, visando conhecer a informaçãogenética contida nesta estrutura.

Quais são os objetivos dosequenciamento?

- Determinar a estrutura de uma molécula deDNA, identificando a ordem dos nucleotídeoscomponentes. - Detecção de mutações - Tipagem de microrganismos - Determinação de polimorfismos

TIPOS DE SEQUENCIAMENTO:

Maxam e Gilbert:

-(1976 – 1977) – Allan Maxam e Walter Gilbertdesenvolveram um método desequenciamento de DNA baseado namodificação química do DNA e na clivagemsubsequente de bases específicas.

Preparação do DNA; Tratamento químico; Eletroforese; Autorradiografia. Análise do Resultado

Separa-se a amostra em 4 tubos. Insere-se o 32 P nas amostras de DNA,assim a extremidade 5’ do DNA ficamarcada pela radiação do 32P.

Etapas:

1.2.

Sequenciamento do DNA.Sequenciamento do DNA.

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No primeiro tubo adiciona-se Dimetil Sulfato(DMS). (guanina)

No segundo adiciona-se Dimetil Sulfato +Ácido Fórmico. (guanina + adenina)

Esses dois primeiros clivam a coluna defosfato e açúcar, no primeiro identifica-se aguanina, no segundo identifica-se a guanina +adenina.

Os dois últimos modificam as bases,identificando as pirimidinas ( citosina e timina)

No terceiro adiciona-se Hidrazina (citosina)

No quarto adiciona-se Hidrazina + Cloreto deSódio (citosina + timina)

As bandas geradas após a “corrida” destesfragmentos em gel de poliacrilamida podem servisualizadas após a impressão de um raio X. Adeterminação da sequência de nucleotídeos éobtida “lendo-se” de baixo para cima, um a um,os nucleotídeos representados pelas bandasdo gel

Sanger: A sequenciamento do Sanger também utilizaa radioatividade, porém marca os fragmentosde DNA sintetizados a partir da fita molde. Observação: A síntese de novos fragmentosde DNA a partir da fita molde só foi possívelgraças ao desenvolvimento da técnica de PCR.

DNA molde que será sequenciado separadoem 4 tubos. Enzima DNA polimerase capaz de produzircópias relativamente fiéis do DNA molde; Polimerase; Solução tampão, contendo ocofator magnésio (Mg), necessário para que aenzima DNA polimerase desempenhe suaatividade Didesoxinucleotídeos (ddATP, ddCTP, ddGTP eddTTP), que atuam como terminadores dasíntese de DNA

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A ausência do grupo OH na posição 3´ impedea entrada de um novo nucleotídeo (por issoeste método é também conhecido como“terminador de cadeia” ou “didesoxi”).

Semiautomático; Automático.

Na esquerda a dNTP, à direita ddNTP. Sem a carboxila (OH), a formação da ligaçãoentre os fosfatos é interrompida.

ddNTP

Após a adição de ddNTP ocorre a inibição dasíntese da cadeia Usa-se baixas concentrações de ddNTP e altasconcentrações de dNTP Em cada reação, um ddNTP é incorporadoaleatoriamente ao invés do dNTPcorrespondente, provocando a terminação dacadeia.

Aprimoramentos do Método de Sanger;

Modelo de sequenciadorsemiautomático;

ABI 377: Este sequenciador detecta afluorescência emitida pelosdidesoxinucleotídeos e a decodifica paradeterminar a sequência de nucleotídeos dofragmento de interesse;

Modelos de sequenciadoresautomático;

Método de Sanger semiautomático;

O princípio de Sanger se mantém o mesmo,porém a segurança do técnico que antes tinhacontato direto com a radioatividade, fica maisseguro, tendo em vista, que agora não utilizamais o composto radioativo.

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Mas qual é a diferença?

A principal modificação foi a adiçãoaos didesoxinucleotídeos, de corantescapazes de emitir fluorescência quandoexcitados em comprimento de ondaespecífico, O método aprimorado utilizafluoróforos diferentes para cada um dosquatro tipos de didesoxinucleotídeos,que ao serem excitados, emitem luzcaracterística do didesoxinucleotídeoincorporado. Como consequência da incorporaçãodos didesoxinucleotídeos marcados comfluorescência, as quatro reaçõespassaram a ocorrer num tubo único e seuconteúdo podia agora ser aplicado numaúnica canaleta do gel. Este fato fez com que o número deamostras analisadas por corrida fossequatro vezes maior. Método de Sanger automático;

Os géis (de difícil manuseio) foramsubstituídos por finíssimos capilarespreenchidos com gel onde os fragmentosde DNA são separados em altíssimavelocidade. As amostras são aplicadas, através deum sistema de eletro injeçãodiretamente nos capilares

Após a eletro injeção, os fragmentoscomeçam a migrar e encontram, numdeterminado ponto, um feixe de raioslaser que excita os fluoróforos presentesna extremidade 3´ de cada fragmentofazendo com que estes emitamfluorescência característica de um dosquatro tipos de fluoróforos. Um detector registra esta fluorescênciae a transmite para um computador quepossui um software capaz de converterfluorescência em picos coloridos, sendoutilizado uma única cor para cada um dosquatro tipos de nucleotídeos (verde paraadenina, preto para guanina, azul parasequenciando genomas 35 citosina evermelho para timina)

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Desnaturação da dupla fita, ddNTPmarcados com compostos florescentessão incorporados à cadeia nascente deDNA sintetizada pela DNA polimerase. Através de um sistema de eletroinjeção, os fragmentos de DNA recém-sintetizados começam a migrar eencontram, num determinado ponto, umfeixe de raios laser que excita osfluoróforos fazendo com que estesemitam fluorescência característica deum dos quatro tipos de nucleotídeos. Um detector registra a intensidade ecomprimento de onda destafluorescência e a transmite a umcomputador que possui um softwarecapaz de converter fluorescência empicos coloridos (cromatograma) que sãodecodificados na sequência denucleotídeos do fragmento

Sequenciamento de Nova Geração(NGS):

O projeto do genoma humano, Necessidade de obtenção deinformações genéticas para medicinapersonalizada, Avanço da tecnologia Impulsionaram o desenvolvimento denovas metodologias de sequenciamento:com melhor qualidade, menor custo,maior rapidez e maior capacidade degeração de informações (“highthroughput” / alta demanda)

Atualmente existem diversastecnologias voltadas para osequenciamento do DNA em larga escala; A Roche foi a primeira empresa adesenvolver esta estratégia que sebaseia na tecnologia depirosequenciamento (Plataforma 454):

preparo da amostra (Na primeiraetapa, o DNA é fragmentadoaleatoriamente por nebulização,sendo selecionados os fragmentoscom tamanho adequado)

(NGS):454

Esta tecnologia dispensa a clonageme tem baixo custo (comparado a outrosmétodos existentes); O sistema de sequenciamento é cercade 100 vezes mais rápido quandocomparado ao método desequenciamento padrão de Sanger.

Este método pode ser dividido emtrês etapas:

1.

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2. PCR em emulsão 3. Sequenciamento.

Plataforma 454

Ilumina

Sequenciamento de novageração (NGS)

SoliD

Não possui etapa de amplificação Maior sensibilidade na leitura Exemplo: Ion Torrent (LifeTechnologies®)

3ª e 4ª Geração de Sequenciamento:O que mudou?

Ion Torrent

Vários segmentos de DNA são dispostosem um chip contendo um sensor quedetecta variação do pH e umapolimerase. Um tipo de nucleotídeo (A, T, C ou G) éfornecido por vez ao chip. Se o segmento de DNA possuideterminado nucleotídeo em suasequência, nessa posição, ele seráincorporado e a mudança de pH serádetectada.

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Assim é possível saber qual nucleotídeofoi adicionado. Ciclos de fornecimento de A, T, C e G sãoconstantemente repetidas até que todosos segmentos tenham suas fitascomplementares formadas e a sequênciaobtida. Detecção direta - método desequenciamento bastante rápido.

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Sequenciamento do DNA

Referência bibliográfica

https://pt.wikipedia.org/wiki/Base_nitrogenada https://www.hemocentro.unicamp.br/noticias/evento-para-medicos-e-enfermeiros-abordara-as-alteracoes-mais-frequentes-no-hemograma/https://brasilescola.uol.com.br/biologia/tipos-rna.htm(https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4295692/mod_resource/content/1/Aula%206%2020%20Extra%C3%A7%C3%A3o%20de%20acidos%20nucleicos%20e%20%20Replica%C3%A7%C3%A3o.pdf)(https://www.google.com/urlsa=i&url=https%3A%2F%2Fjoneilers.github.io%2Fdnaextraction%2F&psig=AOvVaw3Wnq8TvZ9LnWOVnqAH5vzd&ust=1616793869993000&source=images&cd=vfe&ved=0CAIQjRxqFwoTCKDp_eawzO8CFQAAAAAdAAAAABAD)(https://lh3.googleusercontent.com/proxy/JJ6XeH3oAnBaEKcsA_OfETTJv1Fqk3ezKKYnXhFPb2_NPf92ghisoyssfqNYApxioggOyfyGWueJ6EhUiPUO43ZRlZAmISBdwjJ07RwQzP8x4GL0Np4YUk3wpH3zPksEm9SNKSTH0fBB0VV_ScDj-77MInXn0gvNo5pO1M)(https://kasvi.com.br/wp-content/uploads/2016/08/6-gel-agarose-cuba.jpg)(https://kasvi.com.br/wpcontent/uploads/2019/01/eletroforesesepara%C3%A7%C3%A3o-proteina.png)(Resultado eletroforese em Gel de Agarose - https://www.researchgate.net/figure/Figura-9-Eletroforese-em-gel-de-agarose-1-5-das-diferentes-etapas-de-preparacao-do-RNA_fig7_278645710)(Resultado eletroforese em Gel de Poliacrilamida -https://www.researchgate.net/profile/JoseFreire2/publication/320912098/figure/fig1/AS:558192201797633@1510094799451/Figura-01-Eletroforese-em-gel-de-poliacrilamida-12-5-p-v-em-condicoes-desnaturantes-e.png)Biologia de Campbell – 10ª Edição

Fonte imagens:

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