A humán ABCA1 membránfehérje működésének és szabályozásának vizsgálata in vitro

modellrendszerekben

Doktori értekezés

Kasza Ildikó

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Sarkadi Balázs, az MTA tagja, kutatócsoport-vezető, habilitált

egyetemi tanár Közvetlen szakmai vezető: Dr. Szabó Katalin, tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Dr. Homolya László, tudományos főmunkatárs, a biológiai tudomány kandidátusa

Hivatalos bírálók: Dr. Káldi Krisztina egyetemi docens, Ph.D. Dr. Bacsó Zsolt egyetemi adjunktus, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Enyedi Péter egyetemi tanár, az MTA tagja Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Buday László egyetemi docens, Ph.D.

Dr. Enyedi Ágnes, tudományok doktora, Ph.D.

Budapest 2010.

1

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ........................................................................................... 3

1. BEVEZETÉS ................................................................................................................ 6

1.1. Az ABC fehérjecsalád ............................................................................................... 6

1.1.1. Az ABC fehérjék szerkezete ................................................................................... 6

1.1.2. Alcsaládok, nevezéktan .......................................................................................... 7

1.1.3. A humán ABC fehérjék működése ......................................................................... 9

1.2. A humán ABCA alcsalád ........................................................................................ 11

1.3. A humán ABCA1 fehérje ........................................................................................ 14

1.3.1. Az ABCA1 membránfehérje ................................................................................ 14

1.3.2. Az ABCA1 fehérje szöveti eloszlása és sejten belüli lokalizációja ..................... 16

1.3.3. Az ABCA1 fehérje biológiai szerepe és műkődése .............................................. 16

1.3.4. Az ABCA1 fehérje működésének szabályozása .................................................. 19

2. CÉLKITŰZÉSEK ....................................................................................................... 22

3. MÓDSZEREK ............................................................................................................ 23

3.1. Az ABCA1 és HA-jelölt ABCA1 variánsokat tartalmazó retrovírus vektorok

elkészítése ....................................................................................................................... 23

3.2. Sejtvonalak és tenyésztésük ..................................................................................... 26

3.3. HA-ABCA1 variánsokat stabilan kifejező sejtvonalak létrehozása ........................ 27

3.4. RNS preparálás, reverz transzkripció és RT-PCR ................................................... 28

3.5. Sejtlizátumok és membránpreprátumok készítése ................................................... 29

3.6. Elektroforézis és immunoblot .................................................................................. 30

3.7. Sejtek immuncitokémiai jelölése konfokális mikroszkópiához .............................. 31

3.8. Foszfatidilszerin kifordulás kimutatása fluoreszcens annexin V sejtfelszíni kötődés

vizsgálattal ...................................................................................................................... 32

3.9. Sejtfelszíni kifejeződés vizsgálatok áramlási citometriával .................................... 33

3.10. Koleszterin kiáramlás mérés .................................................................................. 34

3.11. ApoA-I kötés ......................................................................................................... 34

3.12. Statisztikai módszerek ........................................................................................... 34

4. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK ................................................................ 35

2

4.1. Az ABCA1 szerepe a foszfatidilszerin Ca2+-indukálta sejtfelszíni kifordulásában 35

4.2. Az ABCA1 fehérje szerepének vizsgálata mutáns variánsok segítségével a Ca2+-

indukált foszfatidilszerin kifordulásban ......................................................................... 39

4.2.1. ABCA1 variánsok Scott EBV-transzformált B-limfocitákban ............................ 39

4.2.2. ABCA1 variánsok egészséges B-limfocitákban ................................................... 43

4.2.3. A koleszterin hatása a gyors foszfatidilszerin kifordulásra B-limfocitákban ....... 46

4.3. A humán ABCA1 fehérje sejtfelszíni megjelenésének vizsgálata in vitro

modellrendszerekben ...................................................................................................... 48

4.3.1. A HA-jelölt ABCA1 változatok stabil expressziója emlős sejtekben .................. 49

4.3.2. Az HA-jelölt ABCA1 variánsok sejten belüli lokalizációjának és működésének

vizsgálata .................................................................................................................. 51

4.3.3. A kalpain inhibitor, a BFA és az apoA-I hatása az ABCA1 variánsok sejtfelszíni

expressziójára ........................................................................................................... 58

4.3.4. Különböző anyagok hatása az ABCA1 változatok sejtfelszíni kifejeződésére .... 61

5. KÖVETKEZTETÉSEK ............................................................................................. 65

6. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................... 66

7. SUMMARY ............................................................................................................... 67

8. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................. 68

9. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ....................................................................... 83

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .................................................................................. 84

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ABC ATP Binding Cassette - ATP-kötő domén

ABL Abelson gén

ALLN Acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-L-Norleucinal

apoA-I apolipoprotein A-I

ATP adenozin-5-trifoszfát

bp bázispár

BFA Brefeldin A

BSA bovine serum albumin - marha szérum albumin

CD methyl-β-cyclodextrin

ced7 C. elegans-ban előforduló CED7 ABC fehérjét kódoló gén

C. elegans Caenorhabditis elegans, fonalféreg

CERP cholesterol efflux regulatory protein – koleszterin kiáramlást

szabályzó fehérje

CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator - cisztikus

fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

dNTP deoxy-nukleotid-5-trifoszfát

DTT ditiotreitol

EDTA etilén-diamin-tetraacetát

EGTA etilénglikol-(cisz)-2-aminoetil-tetraacetát

E. coli Escherichia coli

FCS fetal calf serum – borjú szérum

GAPDH gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz

G418 geneticin

HA hemagglutinin-epitóp (YPYDVPDY)

HDL high-density lipoprotein - nagy sűrűségű lipoprotein

HRP Horse Radish Peroxidase - torma-peroxidáz

KM K1952M Lys/Met mutáció az ABCA1 fehérje második, C-terminális

nukleotid kötő doménjének Walker A motívumában

Kol koleszterin

4

LDL low-density lipoprotein - alacsony sűrűségű lipoprotein

LTR long-terminal repeat - hosszú ismétlődő végszekvencia

MDR1 multidrug resistance protein, P-glycoprotein - multidrog rezisztencia

fehérje vagy P-glikoprotein

MHC I major histocompatibility complex - fő hisztokompatibilitási komplex

MK K939M Lys/Met mutáció az ABCA1 fehérje első, N-terminális

nukleotid kötő doménjének Walker A motívumában

MRP1 multidrug resistance associated protein 1 - multidrog rezisztenciához

társuló fehérje 1

MM K939M és K1952M dupla mutáció ABCA1 fehérje mindkét nukleotid

kötő doménjének Walker A motívumában

NBD Nucleotid Binding Domain – nukleotid kötő domén

neo neomicin

PAGE poli-akrilamid-gél-elektroforézis

PFA paraformaldehid

PBS phosphate buffered saline - foszfátpuffer

PC phosphatidylcholine - foszfatidilkolin

PCR polymerase chain reaction - polimeráz láncreakció

PE phosphatidyl-ethanolamine - foszfatidiletanolamin

PI propidium iodide - propidium-jodid

PL phospholipid - foszfolipid

PMCA plazmamembrán típusú Ca2+ATPáz

PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid

PS phosphatidylserine - foszfatidilszerin

PVDF polivinilidén-difluorid

rpm revolution per minute - fordulat / perc

RQ Scott betegben azonosított R1925Q mutációt hordozó ABCA1 variáns

RT reverz transzkriptáz enzim vagy reverz transzkripció

SA splice acceptor site

SD splice donor site

SDS nátrium-dodecil-szulfát

Sf9 sejt Spodoptera frugiperda ováriumsejtek

5

SM szfingomielin

SUR szulfonilurea receptor

SFFV spleen focus-forming vírus

TAP transporter associated with antigen processing - antigén

feldolgozásban szerepet játszó fehérje

TCA triklórecetsav

TMD transmembrane domain - transzmembrán domén

TMS transmembrane segment – transzmembrán szegmens

UP ultra pure desztillált víz

vt vad típus

WGA wheat germ agglutinin – búzacsíra agglutinin

6

1. BEVEZETÉS

1.1. Az ABC fehérjecsalád

Az ATP-Binding Cassette (ABC) fehérjék a membránfehérjék egyik legnépesebb

családját alkotják. A fehérjecsalád tagjai jelen vannak baktériumokban, gombákban,

növényekben és állatokban ugyanúgy, mint az emberi szervezetben (1). Az ABC

transzporterek széles skálájú funkciót töltenek be az őket kifejező szervezetekben.

1.1.1. Az ABC fehérjék szerkezete

Az ABC fehérjék kétféle, funkcionálisan és szerkezetileg elkülönülő egységből

állnak. Ezek egyike az ABC domén; a család tagjait ennek a doménnek a jelenléte

alapján soroljuk a családba. Ezt az intracelluláris domént három rendkívül konzervatív

szekvencia alkotja: a humán ATP-kötő fehérjére jellemző Walker A és Walker B

motívum, valamint a kizárólag erre a fehérjecsaládra jellemző ABC-signature motívum.

Az ABC domén képezi a fehérje katalitikus centrumát, itt történik a fehérje

működéséhez szükséges ATP-kötés és hasítás. Ezekben a konzervált szekvenciákban

bekövetkezett mutációk többsége a fehérje funkcióvesztését okozza.

Az ABC fehérjék másik alegysége a transzmembrán domén. Általában hat

membránt átívelő hélixből, illetve az azokat összekötő intra- vagy extracelluláris

hurkokból áll. Jelen ismereteink szerint ez a domén vesz részt a transzportált szubsztrát

felismerésében és kötésében; ebben az alegységben bekövetkezett megfelelő

aminosavcserék a fehérje szubsztrátspecifitásának változásához vezetnek.

A mai elképzelés szerint az ABC fehérjék funkcióképes formájának

kialakításához legalább két transzmembrán és két ABC domén szükséges (2). A legtöbb

humán ABC transzporternél a fenti alegységek egyetlen fehérjeláncon belül

helyezkednek el (ún. teljes transzporterek). Ilyen alapszerkezetű pl. a multidrog

transzporter MDR1, vagy a dolgozatban vizsgált ABCA1 fehérje is. Bizonyos esetekben

több fehérje együttesen alakítja ki a működőképes formát (ún. fél-transzporterek). A fél-

transzporterek homo- (pl. az ABCG2) vagy heterodimert (pl. az ABCG5 és ABCG8)

képezve alkotnak funkcionális egységet. Az ABCC alcsaládba tartozó MRP és SUR

fehérjék vagy az ABCB alcsaládba tartozó TAP1/TAP2 fél-transzporterek jelentős

7

méretű, kiegészítő membrán-, és citoplazmatikus elemeket is tartalmaznak. A humán

ABC fehérjékre általánosan jellemző membrántopológiákat az 1. ábra szemlélteti (3, 4).

1. ábra: A humán ABC fehérjék doménszerkezete

A humán ABC fehérjék többsége, az MDR1 fehérjéhez hasonlóan két ABC és két

transzmembrán doménből áll. Az MRP1 és rokon fehérjéi egy további, öt membránt

átívelő hélixet tartalmazó transzmembrán doménnel rendelkeznek. Az ún.

féltranszporter fehérjék, pl. az ABCG2 és ABCD1, csupán egyetlen ABC és

egyetlen transzmembrán doménből épülnek fel.

1.1.2. Alcsaládok, nevezéktan

Emberben 48 fehérje tartozik az ABC fehérjék családjába, melyeket

szekvenciájuk, illetve szerkezetük alapján hét alcsaládba sorolunk. A közelmúltban

8

bevezetett egységes nevezéktan alapján (http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/

guidelines.html) az alcsaládok elnevezése ABCA-tól ABCG-ig betűkóddal történik,

alcsaládon belül pedig az egyes fehérjéket egy további számmal jelölik (2. ábra).

Bizonyos fehérjék esetén továbbra is használatos a hagyományos elnevezés, ezért a

dolgozatban ezekre a fehérjékre a szélesebb körben ismert néven hivatkozunk. A

vizsgálatom tárgyát jelentő ABCA1 fehérje esetében is többféle név ismert pl. ABC1

vagy CERP, azonban a dolgozatban már az új nomenklatúra szerinti megnevezést

használom.

2. ábra: A humán ABC fehérjék családfája

A 48 humán ABC fehérjét hét alcsaládba soroljuk ABCA-tól ABCG-ig,

alcsaládokon belül az egyes fehérjék megjelölése egy további számmal történik. A

humán ABCA alcsaládot 12 fehérje alkotja. A filogenetikai fáról leolvasható, hogy

9

az ezen alcsalád rokonság alapján két alcsoportra oszlik. Az egyik csoportba a

szerkezetileg nagyon hasonló, ABCA6-szerű fehérjéket, a másikba a többi hét

ABCA fehérjét sorolják.

1.1.3. A humán ABC fehérjék működése

A humán ABC fehérjék hasonló szerkezeti felépítése sok tekintetben hasonló

működési mechanizmussal párosul. A legtöbb fehérjére igaz, hogy működése során

ABC doménje ATP-t köt, konformáció változás révén kialakul az aktív forma, majd az

ATP-t hasítva a felszabaduló energiát használja funkciója betöltéséhez. Az ABC

doménben lévő konzervatív motívumok szerepe részletesen ismert. A Walker A

motívum (G-X(4)-G-K-S/T) a foszfát csoportokkal és a Mg2+ ionnal létesít kapcsolatot,

míg a Walker B motívumban (h-h-h-h-D, ahol h hidrofób aminosavat jelöl) az erősen

konzervatív aszparaginsavnak a katalitikus magnézium-ion koordinálásában van

szerepe. Az ABC-signature motívum (L-S-G-G-Q) feltehetőleg az ATP kötése és

hidrolízise során felszabaduló energiát alakítja át konformáció változássá (2, 5). A

transzmembrán doméneknek az ABC fehérjék működésében betöltött pontos szerepéről

ma még keveset tudunk. Feltehetőleg a szubsztrát felismerésben és kötésben játszanak

szerepet (6).

A család tagjai funkciójuk szerint három nagy csoportba sorolhatók (3. ábra). Az

első, és egyben legnépesebb csoportot az aktív transzporterek alkotják; ezek a fehérjék

az ATP kötéséből és hasításából származó energiát használják szubsztrátjaik

transzmembrán transzportjára. Ilyen transzporter fehérjék pl. a multidrog transzporterek,

így MDR1, MRP1, ABCG2 fehérjék, melyek számos toxikus vegyület sejtekből való

eltávolításáért felelnek. Más aktív transzporterek lipideket (MDR3, ABCG5/ABCG8),

peptideket (TAP1/TAP2), nukleotidokat (MRP4, MRP5), stb. transzportálnak. Az ABC

fehérjék második csoportjába az ioncsatornák sorolhatók, esetükben az ATP hasítása az

ioncsatorna nyitott-zárt állapotát szabályozza. Ilyen ioncsatorna a CFTR fehérje, mely

fehérje mutációja áll a gyakori genetikai rendellenesség, a cisztikus fibrózis hátterében.

Végül az ABC fehérjék harmadik csoportját a receptorok alkotják, pl. a SUR1 és SUR2

fehérjék, melyek ligandjaik kötése után más fehérjék működését szabályozzák.

10

3. ábra: Az ABC fehérjék funkció szerinti csoportjai, illetve működésük

Az ABC fehérjék funkciójuk szerint három csoportba sorolhatók, így léteznek aktív

transzporterek, csatornák és receptorok. A fehérjék többsége működése során

intracelluláris ABC doménjével köti és hasítja az ATP-t; a fehérjék az így

felszabaduló energia révén töltik be funkciójukat. A transzmembrán domén a

transzportált szubsztrát megkötésében, illetve a membránt áthidaló csatorna

kialakításában játszik szerepet.

Az ABC fehérjék széleskörű előfordulása, valamint szubsztrátjaik tág köre

alapján sejthető általános fiziológiás szerepük. A multidrog transzporterek széles

szubsztrátfelismerő képességgel rendelkeznek és a szervezet számtalan

szövetében/szervében kifejeződve (így pl. enterocitákban, epekanalikulusok falában,

vesecsatornákban) különféle anyagok szervezeten belüli eloszlását szabályozzák.

Hasonló feladatot látnak el a különböző fiziológiai barrierekben is (pl. vér-agy gátban,

placentában). Más transzporterek szubsztrátspecifitása sokkal szűkebb, pl. az MDR3

fehérje a májsejtekből az epekanalikulusokba való foszfatidilkolin transzportját

szabályozza. A már említett TAP1 és TAP2 fehérjék intracellulárisan, az

endoplazmatikus retikulum membránjában helyezkednek el és az antigén prezentálás

folyamatában vesznek részt; peptideket transzportálnak az endoplazmatikus retikulum

lumenébe, ahol azok az MHC I molekulával komplexet képeznek (Abele és Tampe

11

1999). Más fehérjék pl. az ABCB6, ABCB7, ABCB8 a vas- és hem-homeosztázisban

vesznek részt.

A dolgozatban vizsgált ABCA1 több ABC fehérjével együtt a szervezet lipid-

anyagcseréjében tölt be fontos szerepet. Ide tartozik a már korábban említett

foszfatidilkolin transzporter MDR3, a peroxiszóma zsírsavtartalmáért felelős ABCD

alcsaládba tartozó fél-transzporterek, az epesav transzporter ABCB11, és a növényi

szitoszterinek a bélbe történő reszekréciójáért felelős ABCG5/ABCG8 fehérjék.

Továbbá az ABCA alcsaládból ide sorolják a retinában retinaldehidet és foszfatidil-

etanolamint szállító ABCA4 fehérjét, valamint a koleszterin és foszfolipidek

szállításáért is felelős ABCA7 fehérjét.

Mindezek mellett az ABC fehérjék patológiás szerepe is jelentős. A multidrog

transzporterek tumor sejtekben kifejeződve azok kemoterápiás szerekkel szembeni

rezisztenciáját, a kezelés sikertelenségét okozzák. A májsejtekből epekanalikulusokba

organikus anionokat transzportáló MRP2 fehérje mutációja okozza a konjugált bilirubin

májbeli exkréciójának zavarával járó Dubin-Johnson szindrómát. Amint az már fentebb

említésre került, a CFTR fehérjét kódoló gén mutációja áll a kaukázusi populáció

gyakori, súlyos örökletes betegsége, a cisztikus fibrózis hátterében. A SUR1 a

hasnyálmirigy β -sejtjeiben a K+

1.2. A humán ABCA alcsalád

csatornák egyik alegysége, a csatorna permeabilitását

befolyásolva szabályozza az inzulin szekréciót. Mutációi inzulin független diabéteszhez

vezethetnek.

Az ABC fehérjék mutációi állnak számos, a szervezet és a sejtek lipid-háztartását

befolyásoló öröklődő betegség hátterében is. Ilyen pl. a látászavarral járó ún. Stargardt

betegség, amelyet a fentebb említett, retinában expresszálódó ABCA4 mutációi miatt a

fotoreceptorok működéséhez szükséges A-vitamin származékok transzportjának hiánya

okoz. A toxikus növényi szteroidok felszívódási zavarát, az ún. szitoszterolémiát pedig

az ABCG5/ABCG8 mutációi okozzák. A dolgozatban vizsgált ABCA1 fehérje az egyik

kulcsszerepet játszó ABC transzporter a lipidanyagcserében. A fehérje mutációi a

lipidanyagcsere defektusát, hiperkoleszterinémiával, érelmeszesedéssel, korai

szívinfarktussal járó Tangier betegséget eredményezik (7-10).

A dolgozat tárgyát képező fehérje a humán ABCA alcsaládba tartozik, melybe 12

fehérjét sorolunk. Elnevezésük az egységes ABC nevezéktan szerint alakul, az egyes

12

fehérjék számozása a más fajokban fellelhető fehérjékkel mutatott homológiájuk alapján

történik. Filogenetikailag két további csoportra osztják az alcsaládot. Az egyik csoport,

melybe az ABCA1 is tartozik, hét fehérjét tartalmaz (A1, A2, A3, A4, A7, A12, A13),

hat különböző kromoszómán kódolva. A másik csoport tagjai az ABCA6-szerű fehérjék

(A5, A6, A8, A9 és A10), szerkezetileg hasonlóak, valamint ugyanazon a kromoszómán

csoportosulva helyezkednek el. A humán ABCA fehérjék főbb jellemzőit az 1. táblázat

foglalja össze. Szerkezetileg az alcsalád tagjai teljes-transzporterek, 1543 és 5058

aminosav közötti mérettartományban. A jellegzetes szerkezeti elemek mellett jellemző

az alcsaládra az első és második transzmembrán szegmens (TMS1 és TMS2, illetve a

TMS5 és TMS6) közötti két nagy extracelluláris hurok.

Az ABCA1 fehérje mellett, melynek patológiás szerepéről a későbbiekben

részletesen lesz szó, a család legtöbbet vizsgált tagja az ABCA4 fehérje. Az érett fehérje

a retinában, a csapokban és a pálcikákban fejeződik ki és működése elősegíti a trasz-

retinálok körforgását. Az ABCA alcsaládból az ABCA4 volt az első transzporter,

melyet egyértelműen összekapcsoltak egy genetikai betegséggel. Jelenleg több száz

szekvencia variációt dokumentáltak már, melyeket négyféle retina betegségben

azonosítottak (11-13).

Az alcsalád harmadik tagját, az ABCA3 fehérjét a tüdőben lévő alveoláris

sejtekben mutatták ki. Több módon is bizonyították, hogy a fehérje elsősorban a tüdő

sejtjeiben lévő speciális sejtorganellumokba, az ún. lamelláris testekbe való foszfolipid-

transzport szabályozásáért felelős. Mutációi a surfactant (egyedi összetételű felületaktív

anyag) metabolizmus hibáját okozzák és újszülött vagy felnőttkori tüdőbetegségekhez

vezetnek (14, 15).

Az ABCA7 fehérjét emberi makrofágokban azonosították, azonban a mai napig is

többféle működést rendelnek hozzá pl. koleszterin vagy többféle foszfolipid szállítását.

Továbbá felmerült, hogy egy autoimmun betegség a Sjögren szindróma kialakulásában

is szerepe lehet. Azonban mind a lipid metabolizmusban, mind a gyulladásos

folyamatokban betöltött szerepének igazolása további erőfeszítéseket igényel (16-20).

Az ABCA12 gén mutációit nemrég azonosították, mint több örökletes

bőrbetegség okozóját pl. Harlequin ichtiózis, vagy a lamelláris ichtiózis. A fehérje

keratinocitákban kifejeződve szfingolipidek sejten belüli áthelyeződésében játszik igen

fontos szerepet, hiányában a bőrben lévő lamelláris granulumok nem alakulnak ki, nincs

13

teljes keratinizáció (21-23). A kiemelt fehérjéket és az alcsalád további tagjainak

patológiás szerepét a 2. táblázat foglalja össze.

1. táblázat: A humán ABCA fehérjék főbb jellemzői

A táblázatban az ABCA alcsalád tagjai, korábban használt elnevezéseik, a gének

kromoszómán való elhelyezkedése, a fehérjék szöveti eloszlása és az eddig felismert

funkciók vannak feltüntetve. Kol: koleszterin, PL: foszfolipid, PC: foszfatidilkolin

PE: foszfatidil-etanolamin.

fehérje alternatív

nevek

gén

lókusz szöveti eloszlás funkció

ABCA1 ABC1,

CERP 9q31.1 ubikviter Kol és PL kiáramlás

ABCA2 - 9q34 agy, vese, tüdő, szív neurális lipid

transzport

ABCA3 ABC-C 16p13.3 tüdő, egyéb szövetek PC-szerű anyagok

szállítása a tüdőben

ABCA4 ABCR 1p22 retina fotoreceptor

sejtjei

N-retinilidén-PE

kiáramlás

ABCA5 - 17q24 izom, szív, here nem ismert

ABCA6 - 17q24 máj nem ismert

ABCA7 ABCX 19p13.3

lép, tímusz, makrofág,

csontvelő,

keratinociták

Kol és PL felvétel és

leadás?

ABCA8 - 17q24 petefészek nem ismert

ABCA9 - 17q24 szív nem ismert

ABCA10 - 17q24 izom, szív nem ismert

ABCA12 - 2q32 keratinociták nem ismert

ABCA13 - 17q24 légcső, here, csontvelő nem ismert

14

2. táblázat: Az ABCA alcsaládból az ismert patológiás szereppel rendelkező

ABC fehérjék és a hozzájuk kapcsolt betegségek

fehérje patológiás szerep

monogénes betegség összetett betegség

ABCA1 Tangier betegség, familiáris

HDL deficiencia

ateroszklerózis, Alzheimer

betegség

ABCA2 nem ismert Alzheimer betegség

ABCA3 újszülött kori tüdőbetegségek gyerekkori intersticiális

tüdőbetegségek

ABCA4

Stargardt betegség, makula

degeneráció, Retinitis

pigmentosa, csapsejtek

dystrophiája

kor-függő macula

degeneráció

ABCA7 nem ismert Sjögren szindróma?

ABCA12 Harlequin ichtiózis nem ismert

1.3. A humán ABCA1 fehérje

1.3.1. Az ABCA1 membránfehérje

Az ABCA1 fehérjét kódoló gént már 1994-ben azonosították makrofágokból,

azonban ekkor még néhány nyomravezető megfigyelés ellenére sem tudták

meghatározni a fehérje funkcióját (24). Az ABCA1 génje a 9. kromoszóma hosszú

karján a 31.1 régióban helyezkedik el. A fehérje 2261 aminosavból épül fel és

szerkezete megegyezik a teljes-transzporterek felépítésével (TMD1-NBD1-TMD2-

NBD2), kiegészülve az ABCA alcsaládra jellemző két nagy extracelluláris hurokkal

(4. ábra). A fehérje szerkezeti sajátosságai alapján javasolták az új alcsalád létrehozását.

15

4. ábra: A humán ABCA1 feltételezett membrán-topológiája

A humán ABCA1 fehérje két transzmembrán doménből (a 12 TMS-t kék téglalapok

jelölik), valamint két intracelluláris ABC-egységből vagy más néven nukleotid kötő

doménből épül fel (NBD1 és NBD2). Az utóbbi alegységek tartalmazzák az ABC

transzportereket meghatározó három rendkívül konzervált szekvenciát, a Walker A,

Walker B (piros téglalapok) és az ABC-signature régiót (sárga kör). Az

extracelluláris hurkokon a lehetséges N-glikozilációs helyek láthatók (zöld).

Az ABCA1 fehérje 1999-ben került ismét a figyelem középpontjába, amikor

három független csoport is kimutatta, hogy az ABCA1 génjének mutációi állnak a

Tangier betegség hátterében (8, 9, 25). E ritka genetikai elváltozásban szenvedő betegek

vérében a HDL-szintje kóros értékeket mutat, a különböző szövetekben koleszterin

szaporodik fel és változatos kórformák alakulnak ki (26). Az elmúlt években megjelent

eredmények, elsősorban a Tangier betegek, és az ABCA1-hiányos egerek vizsgálata

bizonyította, hogy a fehérje mutációi a reverz koleszterin transzportban kulcsszerepet

játszó éretlen, emberben elsősorban ApoAI-tartalmú HDL formák képződésének zavarát

okozzák. In vivo egérkísérletekkel nemcsak azt bizonyították, hogy a máj a plazma HDL

elsődleges forrása hanem, hogy az ABCA1 kiemelt szerepet játszik a hepatikus HDL

előállításában (27-29). Jelenleg több mint 90 mutációt azonosítottak az emberi ABCA1

génjében. A legújabb adatok az emberi gén mutációs adatbázisból érhetők el (The

Human Gene Mutation Database: http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac).

16

1.3.2. Az ABCA1 fehérje szöveti eloszlása és sejten belüli lokalizációja

Az ABCA1 fehérje szöveti eloszlását megfelelő antitest hiányában először csak in

situ RNS hibridizációval mutatták ki, később azonban mind mRNS, mind fehérje

szinten részletesen meghatározták az expressziós mintázatát (30). A fehérje expressziója

alapvetően ubikviter, számos szövetben pl. máj, méh, méhlepény, mellékvese, here

fejeződik ki magas szinten, sejtes szinten pedig a szöveti makrofágokban és makrofág-

szerű sejttípusokban mutat magas expressziót.

Az ABCA1 fehérje sejtszinten túlnyomórészt a plazmamembránban található

(31). Az ABCA1 bélben való szerepét és szabályozását vizsgálva megállapították, hogy

polarizáltan növesztett sejtekben bazolaterális plazmamembránban lokalizálódik (32).

Jelenleg azt feltételezik, hogy a fehérje lipid kiáramlásban betöltött szerepéhez ez a

sejtfelszíni megjelenés feltétlenül szükséges. Másrészt az ABCA1 megtalálható a Golgi

hálózatban és a lizoszómákban is (33-35). Mindezek alapján felmerült az az elképzelés,

hogy az ABCA1 retroendocitózist végezve, nem csak a sejtfelszínen szabályozza a lipid

kiáramlást, hanem mint egy mozgó molekula, ingázik a plazmamembrán, a Golgi

hálózat és a lizoszómális sejtorganellumok között lipideket pumpálva a vezikulák

lumenébe (36).

1.3.3. Az ABCA1 fehérje biológiai szerepe és műkődése

Az elmúlt évek eredményei bizonyították, hogy az ABCA1 bizonyos

apolipoproteinekkel (apoA-I, II, IV; apoC-I, II, III; apoE; emberben elsősorban apoA-I)

közvetlen kölcsönhatásba lépve az ún. éretlen, pre-β-HDL kialakítására képes. Ez a

HDL forma az első lépése a koleszterin eltávolítási útvonalak működésének és a többi

lipoprotein kialakulásának (37, 38). Az ABCA1-függő HDL-képződés során elsősorban

foszfatidilkolin és koleszterin, majd egyéb foszfolipid kiáramlás indul meg a sejtekből.

Ehhez a folyamathoz szükséges egy meghatározott amfipatikus helikális szerkezettel

rendelkező apolipoprotein, elsősorban apoA-I közvetlen kölcsönhatása az ABCA1

fehérjével. Az apoA-I és az ABCA1 kölcsönhatását a plazmamembrán felszínén több

megközelítésben, keresztkötés kísérletekkel (37, 39), immunprecipitációval (40),

biotinilálással (41) és radioaktív jelöléssel is bizonyították (39). Mindazok ellenére,

hogy a közvetlen apoA-I-ABCA1 kapcsolatot részletesen bizonyították, később

kimutatták, hogy a sejtekhez kötődött apoA-I-nek csak 10%-a keresztköthető az

17

ABCA1 fehérjével (42). Mások szerkezeti vizsgálatokkal bemutatták, hogy az apoA-I

kötés és a koleszterin kiáramlás folyamata szétválasztható (43), és az ABCA1 jelentősen

csökkentette a membrán rigiditását az apolipoproteinek jelenléte nélkül is (44). Ezen

eredmények tükrében elképzelhető, hogy az ABCA1 önmaga nem receptora az apoA-I-

nek, azonban nagy affinitású apoA-I kötőhely létrehozását teszi lehetővé. Működésével

a koleszterint és a foszfolipideket feldúsítja a külső membránrétegben, így a lipid

környezet megváltozása lehetővé teszi az apoA-I kikötődését és az ABCA1 fehérjével

való közvetlen kapcsolat nélkül is a koleszterin kiáramlását (45).

Az ABCA1 működésével kapcsolatban alternatív modellek is születtek. Bizonyos

eredmények szerint az apoA-I receptor-szabályozott endocitózissal kerül a sejtekbe,

ahol az, a kiválasztódást megelőzően koleszterinnel és foszfolipidekkel töltődik fel

endoszómákon belüli lipid cseppekből (46); azonban későbbi eredmények ezt a modellt

cáfolták. Kimutatták, hogy retroendocitózissal a HDL-nek kevesebb, mint 2%-a

lipidálódik, valamint megerősítették, hogy az apoA-I lipidálódásnak és az ABCA1-

függő koleszterin kiáramlásnak a plazmamembrán a fő helyszíne (47).

Újabb kísérletek szerint az ABCA1 a koleszterinen és foszfatidilkolinon kívül

más, apoptózis során szerepet játszó lipideket is szállíthat. Kimutatták, hogy a

citotoxikus 25-hidroxi-koleszterint igen nagy affinitással transzportálja (48). Kérdéses

azonban, hogy ez a folyamat mennyire ABCA1-függő, mivel ezen oxiszterolok

könnyen kijutnak a sejtekből passzív diffúzióval.

Az ABCA1 vizsgálatainak korai szakaszában felmerült, hogy a fehérje

működésének hiánya nemcsak a koleszterin anyagcsere zavarait, hanem a fagocitózist

és a trombocita funkciók csökkenését is okozza, feltételezhetően a sejtfelszíni

foszfatidilszerin kifordulásának befolyásolása révén (49, 50). Az eukarióta sejtek

jellemzője a foszfolipidek jellegzetes asszimetrikus megoszlása a plazmamembrán két

rétegében, ahol a külső rétegben foszfatidilkolin és szfingomielin, a belső rétegben

pedig foszfatidilszerin és foszfatidil-etanolamin található. A lipidasszimetria felbomlása

és a hibás sejtfelszíni foszfatidilszerin megjelenés bizonyított számos betegség

patomechanizmusában (51, 52). A jelátviteli folyamatok által aktivált foszfatidilszerin

kifordulás alapvető fontosságú pl. a vérlemezke aggregációban, illetve az apoptotikus

sejtek eltávolításában. A megemelkedett intracelluláris Ca2+-szint hatására egyes sejtek

pár perc alatt bekövetkező, “gyors” foszfatidilszerin expozícióval reagálnak, míg

18

apoptotikus hatások eredményeként ez lassabban következik be. A foszfatidilszerin

asszimetrikus eloszlásának fenntartásában és ennek megváltozásában többféle fehérje

játszik fontos szerepet. Az P-típusú ATP-áz flippázok közül az amino-foszfolipid

transzlokázok aktív transzporttal specifikusan foszfatidilszerint és foszfatidil-

etanolamint fordítanak a belső rétegbe. A két membrán réteg foszfolipidjeit Ca2+-függő

membránfehérjék, a „scramblase”-ek specificitás és irányultság nélkül keverik össze. A

fenti folyamat mechanizmusa és az ABCA1 szerepe sem a trombociták aktiválódásakor

bekövetkező gyors, sem az apoptózis során bekövetkező lassabb foszfatidilszerin

kifordulásban eddig még nem tisztázott (51-54).

Nemrég Prof. C. Higgins munkacsoportja egy igen ritka, öröklődő vérzékenység,

a Scott betegség tanulmányozásakor egy betegben jelentősen csökkent ABCA1 mRNS

expressziót és mutáns (R1925Q) ABCA1 jelenlétét mutatta ki (55). A betegségre

jellemző a normális lipid profil mellett a Ca2+-aktivált foszfatidilszerin kifordulás hibás

működése, amely a véralvadáshoz szükséges trombocita aktiváció során kiemelkedő

fontosságú lépés (54). A mutációt okozó 1925–ös pozícióban lévő arginin N-

terminálisan 20 aminosavra helyezkedik el az NBD2-ben lévő Walker A motívumtól és

az eddig feltérképezett, más fajokból származó ABCA1 fehérjékben konzervált (5.

ábra). Ezen felül az 1925-ös arginin glutaminra cserélődése egy öt, erősen bázikus

aminosavból (RRKRK) álló szakaszt bont meg, amely szinten minden ABCA

alcsaládba tartozó fehérjénél konzervált. Ugyanakkor eredményeik szerint ez az

R1925Q mutáns fehérje HEK293 sejtekben kifejezve lokalizációs mutánsnak bizonyult,

a vad típusú fehérjével szemben nem jutott ki a sejtek plazmamembránjába (55).

A legtöbb ABC fehérje katalitikus centrumában, a Walker A régióban található

egy konzervált lizin aminosav (GXXGXGK), melynek központi szerepe van az ATP

megkötésében, ezen keresztül a fehérje aktivitásában. Amint arról számos publikáció

beszámol (56-60), a lizin metioninra történő cseréje több ABC fehérje esetén az ATP-

kötő képesség megszűnéséhez, teljes funkciókieséshez vezetett. Az ABCA1 fehérje

esetében is több csoport kimutatta, hogy az előbbi konzervatív szekvenciákban mutációt

hordozó variánsoknál a megfelelő fehérje feltekeredés (folding) és intracelluláris

irányítás (routing) mellett sincs apoA-I kötés és az ABCA1 fehérjére jellemző apoA-I

függő koleszterin kiáramlás (49, 61, 62). Ezen inaktív mutánsok használata ma már

széles körben elfogadott kontroll a fehérje funkcionális vizsgálataihoz.

19

5. ábra: Különböző gerinces fajokból származó ABCA1 fehérjék és a C. elegans

ortológ fehérje aminosav szekvenciáinak összehasonlítása

Az ábrán az ABCA1, A2, A3, A4, A7 és a C. elegans ced7 aminosav szekvenciáinak

összehasonlítása látható azon szakaszon, amely lefedi a Scott betegben mutáns

régiót. A színskála a konzerváltság mértékét jelzi.

1.3.4. Az ABCA1 fehérje működésének szabályozása

Az ABCA1 fehérje kifejeződése és működése erősen szabályozott transzkripciós

és poszttranszkripciós szinten, magába foglalva szabályozó molekulák sokaságát. A

transzkripciós szabályozó anyagokat az egyszerűség kedvéért három csoportba sorolják.

Az első csoportba a másodlagos hírvivő, cAMP tartozik, amely egy specifikus válasz

elem segítségével serkenti az ABCA1 gén expresszióját (63). A második csoportba a

nukleáris receptorok pl. az LXR, RXR, vagy PPAR-ok tartoznak. A magi receptorok

aktivációja fiziológiás körülmények között oxiszterolokkal, retinoidokkal és

agonistákkal történik és megnövekedett ABCA1-függő koleszterin és foszfolipid

kiáramláshoz vezet (64-67). A harmadik csoportba a pleiotrópikus hatású citokineket

sorolják. Az LXR szabályozott útvonalon keresztül a gyulladásos citokinek, a tumor

nekrózis faktor-α, az interleukin-1-β és az interferon -γ csökkenti az ABCA1

20

transzkripciót és a fehérje expressziót. A transzformáló növekedési faktor-β ellentétes

hatást kiváltva indukálja az ABCA1 kifejeződését (68-70).

Az ABCA1 fehérje stabilitásának és életciklusának szabályozásában

poszttranszkripciós folyamatok is fontos szerepet játszanak. A fehérje lebomlását egy

cisztein proteáz, a kalpain szabályozza (71-73), aktivitását pedig többféle protein kináz

befolyásolja. Az intracelluláris cAMP változásra válaszoló protein kináz A (PKA)

foszforilálja az ABCA1 fehérjét, közvetlenül módosítva a fehérje működését (74).

Kimutatták továbbá, hogy az ABCA1 PKA-általi foszforilációjának kialakulásában az

apoA-I kötésének is jelentős szerepe van (75). A többi kináz közül a protein kináz C2

révén történő foszforiláció fordítva hat, csökkenti az ABCA1 aktivitását (76). Egyéb

szabályzó kinázok közül a JAK2, Janus arcú tirozin kináz hatását tanulmányozták még

részletesen. A JAK2 célpontja nem az ABCA1, azonban gátlása befolyásolja az apoA-I

kötést. Bizonyítottak ezen felül egy új mechanizmust, amivel az apoA-I JAK2

autofoszforiláción keresztül szabályozza a saját eltávolítását a sejtekből (77).

Több ABC fehérjéről ismert, hogy a plazmamembrán összetétele és lipideloszlása

szabályozza működésüket. Többségük, pl. az MDR1, MRP1 vagy az ABCG2 fehérjék,

a plazmamembrán mikrodoménekben, lipid raftokban csoportosulnak, ahol a speciális

membránösszetétel miatt létre tudják hozni összetett kapcsolataikat membránlipidekkel

és fehérjékkel. Az ABCA1 fehérjéről is először azt feltételezték, hogy lipid raftban

található (26), később azonban számos kísérlet bizonyította, hogy mégsem a klasszikus

koleszterin/szingolmielin raftban helyezkedik el (78, 79). Bizonyították, hogy az

ABCA1 működése révén tönkreteszi a lipid raftok szerkezetét, csökkentve azok

koleszterin és szfingomielin tartalmát (80). Ezen a mechanizmuson keresztül az ABCA1

jelátviteli utakra is hatást gyakorol. Mivel az Akt kináz működését a mikrodomének

összetétele és szerkezete szabályozza, ezért a fehérje jelenléte befolyásolja a kináz

jelátviteli folyamatait (79).

Számos esetben kimutatták, hogy a membránlipidek a fehérjék expressziójának

befolyásolásán keresztül képesek szabályozni azok működését. Erre jó példa az ABCA1

esetében a szfingolipidek közül a ceramid és egyéb glikoszfingolipidek. Az előbbi

növeli az ABCA1 sejtfelszíni kifejeződését, ezáltal a koleszterin kiáramlást (81), míg az

utóbbiak az ABCA1 mRNS szint csökkentésével gátolják azt (82).

21

Az ABCA1 plazmamembrán jelenléte bizonyítottan szükséges a fehérje

megfelelő működéséhez, ezért terápiás célból az elmúlt években megindult a fehérje

sejtfelszíni megjelenését szabályzó anyagok keresése. Mivel az ABCA1 sejtfelszíni

megjelenésének folyamata összetett, a gyógyszerfejlesztések célpontja igen sokrétű. A

magi receptorokon keresztül a fehérje transzkripciójának szabályozása a célmolekulák

széles körét érinti, ami sok mellékhatáshoz vezethet. Ezért a fehérje poszttranszkripciós

folyamatainak szabályozása pl. internalizációjának, lebomlásának gátlása, fontos eszköz

lehet újabb célmolekulák keresésekor. Jelenleg azonban még nincs olyan elfogadott

tesztrendszer, mellyel megbízhatóan, a transzkripciós szabályozástól függetlenül,

követhető a fehérje plazmamembrán megjelenése.

A legújabb klinikai tanulmányok szerint bizonyos gyógyszerek, pl. a sztatinok, a

niacin és az ezetimib önmagukban vagy kombinációban lehetőséget nyújtanak a HDL-

szint növelésre, vagy az LDL-szint csökkentésre (83, 84). Ezen gyógyszerek hármas

kombinációja bizonyult eddig in vivo a leghatékonyabbnak. Azonban in vitro kísérleti

rendszerekben ezen anyagok a lipid effluxra és az ABCA1 expressziójának

szabályozására vonatkozó hatásáról ellentétes eredményeket publikáltak (85-89).

Egy régebbi klinikai megfigyelés szerint egyes kálcium-csatorna blokkolók

antiaterogén hatásúak (90), azonban a későbbi in vitro ABCA1 expressziós

hatásvizsgálatok eredményei itt is ellentmondóak voltak. A csoport megfigyelései

szerint ezek a gyógyszerek egyes esetekben növelték az ABCA1 mRNS szintjét, más

esetekben mRNS szint változása nélkül a fehérje expresszió növekedését okozták, attól

függően, hogy milyen kísérleti modellrendszerben tanulmányozták azt (91, 92). Az

ellentmondások hátterében a különböző sejtkörnyezet és vizsgálati rendszerek eltérő

szabályozása is állhat, ezért a HDL-szintet növelő anyagok keresése még további

kísérleti rendszerek fejlesztését teszi szükségessé.

22

2. CÉLKITŰZÉSEK

Kutatómunkánk során célul tűztük ki a humán ABCA1 membránfehérje emlős

expressziós rendszerekben való kifejezését, normális és kóros működésének vizsgálatát.

Céljaink között szerepelt a fehérje expressziójának, intracelluláris lokalizációjának és a

működésének vizsgálatára alkalmas technikák kidolgozása. Olyan modellrendszereket

kívántunk létrehozni, ahol a fehérje funkcionális jellemzése mellett intracelluláris

szállításának és sejtfelszíni megjelenésének szabályozását is feltérképezhetjük.

Ennek érdekében a következő konkrét célokat fogalmaztuk meg:

1. Az ABCA1 szerepének vizsgálata a foszfatidilszerin Ca2+-indukálta sejtfelszíni

kifordulásában.

A funkcionális mérésekhez az ABCA1 fehérje termelését biztosító, különféle

sejttípusra alkalmazható retrovirális expressziós rendszerek előállítását és stabilan

expresszáló sejtvonalak létrehozását terveztük.

2. Mutáns ABCA1 variánsok segítségével az ABCA1 fehérje Ca2+

-indukált

foszfatidilszerin kifordulásban játszott szerepének részletes vizsgálata.

Ehhez inaktív mutáns variánsok illetve a Scott betegben azonosított mutáns

ABCA1 létrehozását és azokat stabilan expresszáló sejtvonalak előállítását terveztük. A

fehérje specifikus és érzékeny kimutatásához monoklonális antitest által specifikusan

felismert hemagglutinin (HA) epitópot terveztünk beilleszteni a vad típusú és a

különböző mutáns variánsokba.

3. Az ABCA1 fehérje sejtfelszíni megjelenésének követésére alkalmas kvantitatív

tesztrendszer létrehozása.

4. Koleszterinszint-csökkentő vagy HDL-szint növelő gyógyszerek, illetve ismerten az

ABCA1 fehérje expressziójára vagy funkciójára ható anyagok hatásának vizsgálata a

fehérje sejtfelszíni megjelenésére.

23

3. MÓDSZEREK

3.1. Az ABCA1 és HA-jelölt ABCA1 variánsokat tartalmazó retrovírus vektorok

elkészítése

A retrovirális vektorok létrehozásához a vad típusú (vt), teljes hosszúságú

ABCA1 cDNS-ét (93) az SpeI/XhoI hasítóhely használatával a neomicin rezisztenica

gén (neo) beépítésével módosított bicisztronikus SPsLdS (94, 95) retrovírus vektorba

klónoztuk. Az ABCA1 cDNS-ét a spleen focus-forming vírus (SFFV) LTR

szekvenciája és a splice donor (SD) hely mögé illesztettük. A neo cDNS-e a Moloney

murine leukémia vírus genomjából származó splice akceptor (SA) hely mögé volt

illesztve. A HA-ABCA1 konstrukció előállításához a vt ABCA1 cDNS-nek 207.

pozíciójába a HA-epitóp (YPYDVPDY) kódoló szekvenciáját tartalmazó kazettát

illesztettük (96). Ehhez a következő oligonukleotidokat használtuk:

`5-GTGACCAATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCCCGGGCAG-3`

3`-GTCACCTGCCCGGGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATTG-3`

A létrehozott DNS konstrukció bázissorrendjét a beillesztett régió

szekvenálásával ellenőriztük. Kontrollként a csak neo gént tartalmazó retrovírus

konstrukciót (vektor) használtuk fel (95). Vizsgálatainkhoz a HA-jelölt ABCA1

többféle mutáns változatát tartalmazó retrovírus vektorokat is létrehoztuk. Ezek között

szerepel a bevezetőben is említett Walker A mutáns K939M (MK) és K1952M (KM),

valamint a K939M/K1952M (MM) duplamutáns, illetve a Scott betegben azonosított

R1925Q (RQ) mutáns variáns. A retrovírus vektorok a 6. ábrán láthatóak.

Ezek során az MK, KM mutánsokat PCR mutagenezis technikával hoztuk létre.

Elsőként a HA-ABCA1 retrovírus vektorból az XhoI/NotI kazettát áttettük a pBlscrSK-

vektorba. Az MK mutációt hordozó DNS szakasz elkészítésekor először két PCR

reakció segítségével előállítottuk az egymással átfedő N-, illetve C-terminális DNS

fragmenseket. Mindkét reakció során a kívánt DNS fragmenseket egy külső, és egy

ellentétes irányultságú belső primer-pár segítségével állítottuk elő.

Külső primer-pár: 5’-TGGCTGTGATCATCAAGGGC-3’ és

5’-CCAGGACGTCCGCTTCATCCAT-3’

Belső primer-pár: 5’-ATTGACATGGTGGTCGTCATCC-3’ és

5’-GGATGACGACCACCATGTCAAT-3’

24

6. ábra: A bicisztronikus retrovirális vektorok sematikus ábrázolása

VT: vad típusú ABCA1 konstrukció; HA-VT: vad típusú HA-jelölt ABCA1

konstrukció; HA-MK: HA-jelölt NBD1-ben K939M lizin-metionin cserét tartalmazó

HA-ABCA1 konstrukció; HA-KM: HA-jelölt NBD2-ben K1952M lizin-metionin

cserét tartalmazó HA-ABCA1 konstrukció; HA-MM: mindkét Walker A

motívumban lizin-metionin cserét tartalmazó dupla mutáns HA-ABCA1 konstrukció

(K939M/K1952M); HA-RQ: R1925Q mutációt tartalmazó HA-ABCA1

konstrukció.

A pirossal jelölt nukleotidok aminosav cserét és új FokI hasító helyet

eredményeznek a vad típushoz képest. A továbbiakban egy PCR reakció keretén belül

létrehoztuk a teljes hosszúságú, már mutáns cDNS kópiákat. Ezen reakcióban mind

templátként, mind láncindító szekvenciaként az előző lépés egymással átfedő termékei

25

szolgáltak, azonban itt is szükség volt a külső primerekre a későbbi ciklusok során

keletkezett teljes hosszúságú cDNS amplifikálásához. A KM mutáns cDNS

konstrukciót egy PCR reakció segítségével hoztuk létre a következő oligonukleotidok

felhasználásával:

5’-AGCCAAAAGCTTAAAGAACAAGATCTGGGTG-3’ és

5’-CTCCTGTTAACATCTTGAAAGTTGATGACATCCCAGCC-3’.

A pirossal jelölt nukleotidok az előzőekhez hasonlóan aminosav cserét

eredményeznek, melyek a kékkel jelölt nukleotiddal együtt új FokI hasító helyet hoznak

létre a vt ABCA1 cDNS-hez képest. Az új FokI hasító helyek lehetővé tették mindkét

mutáció kimutatását egy egyszerű restrikciós emésztéssel. A dupla MM mutáns

létrehozásához HindIII/HpaI emésztéssel kazettacserét végeztünk a pBlscrSK-

vektorban. Az XhoI/BamHI enzimekkel való részleges emésztés után a megfelelő

fragmenseket izoláltuk és klónoztuk a szintén XhoI/BamHI hasított HA-ABCA1-et

tartalmazó retrovírus vektor megfelelő helyére. A mutáns cDNS konstrukció

elkészítéséhez a PCR reakciót 50 µl térfogatban Vent Taq puffert (NEB), 0,25 mM

dNTP-t, 1-1µM reverz és forward primert és 0,5 µl Vent Taq polimerázt tartalmazó

reakció elegyben végeztük.

A PCR reakció körülményei az Eppendorf készüléken:

Hot start 3 perces 95°C-os denaturáció után 35 ciklus zajlott, majd 6 perces 72°C-os

termináció után 10 perc alatt 4°C-ra hűtöttük a mintákat. Egy ciklus 1 perces 95°C-os

denaturációs, 1 perces 55°C-os anellációs és 1 perces 72°C-os elongációs fázisból állt.

Az RQ HA-ABCA1 konstrukció létrehozásához a megfelelő DNS fragmenseket

pciDNA R1925Q-ABCA1-GFP vektorból (55) NotI/HpaI kazettacserével klónoztuk a

vt HA-ABCA1-et tartalmazó retrovírus vektorba.

Minden létrehozott DNS konstrukció bázissorrendjét a beillesztett régió

szekvenálásával ellenőriztettük (festék terminációs szekvenáló eljárás, MTA SzBK,

Szeged).

A preparatív célra szánt PCR termékeket gélen való futtatás és izolálás után

QIAquick Gel Extraction Kit-tel (Qiagen) oszlopon tisztítottuk. A DNS fragmenseket

túlnyúló véggel ligáltuk a vektorokba a T4 DNS ligáz segítségével.

Munkánk során használt restrikciós emésztés körülményei: a PCR termékeket és

a BlueScript vektorban elkészített plazmidokat BclI, AatII, HpaI, XhoI, BamHI, NotI és

26

HindIII enzimekkel emésztettük 20-100 µl térfogatban a gyártó által javasolt

körülmények között. A retrovírus vektorban készült konstrukciókat NdeI, SpeI és XhoI

enzimekkel emésztettük 20µl térfogatban szintén a gyártó által javasolt körülmények

között. A vt HA-ABCA1 retrovírus vektor részleges emésztését XhoI/BamHI

enzimekkel 30 percig, 37°C-on végeztük. A kész retrovírus konstrukciókból az emlős

sejtek transzdukciójához megfelelő tisztaságú és mennyiségű plazmidot preparáltunk

Endofree Plasmid Maxi kit (Quiagen) segítségével.

3.2. Sejtvonalak és tenyésztésük

A retrovírus termeléshez használt pakolósejtvonalak közül a Phoenix Eco sejteket

G. Nolan (Department of Pharmacology, Stanford University, USA) bocsátotta

rendelkezésünkre, a PG13 (94) sejteket pedig az ATCC-től (American Type Culture

Collection) vásároltuk. Mindkét pakolósejtvonalat 10% v/v Fetal Calf Serum (FCS), 1%

v/v L-glutamin és Penicillin/Streptomicin tartalmú DMEM (Gibco) médiumban

tenyésztettük.

Az MDCKII és a HeLa sejtvonalakat ATCC-től (Manassas, VA) vásároltuk, a

HEK293H sejtvonalat az Invitrogen-től szereztük be. Ezen sejtvonalakat is a fenti

médiumban tenyésztettük.

Az egészséges emberekből és a Scott betegből izolált, majd Epstein-Barr vírussal

immortalizált B-sejtvonalakat C. Albrecht bocsátotta a rendelkezésünkre (55). A B-

sejteket 10% v/v FCS, 1% v/v L-glutamin és Penicillin/Streptomicin tartalmú RPMI

(Gibco) médiumban tenyésztettük.

A Thp-1 humán eredetű monocita sejtvonalat 10% v/v FCS, 1% v/v L-glutamin

és Penicillin/Streptomicin tartalmú RPMI (Gibco) médiumban tartottuk fenn. A sejtek

indukálása 24 órás 2 nM PMA előkezeléssel történt. A humán monocitákat egészséges

emberek véréből izoláltuk Ficollos szeparációval, majd izoláltuk és szelektáltuk CD14

MicroBeads és MiniMACS Separator (Miltenyi Biotech) segítségével (97). A szeparált

sejteket 10% v/v FCS tartalmú DMEM-ben növesztettük 5 napig. Az ABCA1

expressziót mind a PMA előkezelt Thp-1 sejtekben, mind a monocita-eredetű

makrofágokban 8 órás 1 μM T0901317 (Alexis Biochemicals) szintetikus LXR agonista

kezeléssel indukáltuk.

27

Az immunlokalizációs kísérletekhez a MDCKII sejteket 5×105 sejt/cm2

sűrűséggel előzetesen 0,03 mg/ml Vitrogen-nel (Cohesion Technologies) bevont

6,5 mm-es, 0,4 µm pórusátmérőjű Transwell Col filtereken (Corning Costar)

növesztettük. A sejtkultúrából rendszeres sejttenyésztő médiumos mosással

eltávolítottuk az elpusztult sejteket és a sejttörmeléket. A lokalizációs vizsgálatokat 8

napig növesztett konfluens sejtkultúrákkal végeztük. A HEK293H sejteket 8 well

Lab-Tek II Chambered Coverglass kamrára (Nalge Nunc) szélesztettük, 5×104 sejt/lyuk

sűrűséggel, és a kísérlet előtt 2 napig tenyésztettük. Minden sejtkultúrát 5% CO2

3.3. HA-ABCA1 variánsokat stabilan kifejező sejtvonalak létrehozása

koncentráció mellett, 37°C-on tartottuk fenn sejttenyésztő termosztátban.

Az emlős sejtek fertőzéséhez a korábban leírt módon (98) a vírust két lépésben

termeltettük. Először a Phoenix eco pakolósejteket transzfektáltuk a retrovírus

vektorokkal kálcium-foszfátos kicsapással (Invitrogen). A pakolósejtekről 48 és 72

órával a transzfekció után gyűjtöttük a vírusfelülúszót, amit 0,45 μm pórusméretű

szűrőn való szűrés után használtunk fel a PG13 pakolósejtek transzdukciójához. A

PG13 transzdukciót egymást követő két napon megismételve, majd azt követően

1mg/ml G418 szelekciót alkalmazva stabil, hosszú távú vírustermelést értünk el. A vírus

felülúszót leszűrve a retrovírusokat -20°C-on tároltuk felhasználásig.

Az ABCA1 variánsokat kifejező EBV-transzformált B-sejtvonalak előállítása

során a B-limfocitákat retrovírus partikulumokkal egymást követő két napon

transzdukáltuk. Mivel a B-sejtek növekedése erősen denzitásfüggő, ezért szekvenciális

szelekciót alkalmaztunk (99). A sejteket 0,7 mg/ml G418 mellett szelektáltuk 103

Hasonlóan a B-sejtekhez, a HEK293H, az MDKCII és a HeLa sejteket is egymást

követő két napon transzdukáltuk a retrovírus partikulumokkal. A G418 szelekciót a

transzdukció utáni harmadik napon kezdtük el és a transzdukció kontrolljaként használt,

vírus nélkül transzdukált sejtek elpusztulásáig folytattuk. A transzdukció után az MDKII

db

sejt/ml sűrűségig. Amikor a sejtszám ez alá esett, felfüggesztettük a szelekciót, majd a

sejtszám növekedésétől függően újra kezdtük. A szelekciót a transzdukció

kontrolljaként használt, vírus nélkül transzdukált sejtek elpusztulásáig folytattuk. A

szelektált sejteket folyamatosan 0,7 mg/ml G418 mellett tartottuk fenn a

tenyészmédiumban.

28

sejteket 0,8 mg/ml, az HEK293H sejteket 0,7 mg/ml, a HeLa sejteket pedig 0,5 mg/ml

G418-cal kiegészített szelekciós médiumban tenyésztettük. MDCKII és HeLa sejtekből a

stabilan expresszáló sejtpopulációkat összekeverő (pooling) módszerrel hoztuk létre.

Ennek során a transzdukciót és szelekciót követően végpont hígítással 96 lyukú plate-en

egy-egy sejtből létrehozott klónokat készítettünk. A klonális sejtvonalakat is szelekciós

médiumban növesztettük. Vizsgálatainkhoz négy-hat hasonló expressziós szintet mutató

klón összekeverésével hoztuk létre a sejtpopulációkat. HEK293H sejtek esetén

transzdukció és szelekció után a sejtpoplációkat szétválogató (sorting) módszerrel hoztuk

létre. 106

3.4. RNS preparálás, reverz transzkripció és RT-PCR

sejtet jelöltünk direkt HA-antitesttel (1:100, Babco), majd a hasonló sejtfelszíni

HA-ABCA1 expresszió alapján áramlási citométer használatával válogattuk szét a

populációkat (BD FACS AriaI). Az így létrehozott sejtvonalak homogenitása érdekében

dupla szétválogatást alkalmaztunk. A második szétválogatás után a HA-ABCA1

variánsok sejtfelszíni expressziója már egységes volt.

RNS-t egy lépéses módszerrel, TriZol (Invitrogen) használatával izoláltunk. A

reverz transzkripcióra 1 µg RNS-t használtunk fel. A reverz transzkripciót 20μl

végtérfogatban 1µl RNS és 9μl RTmix (Promega) összekeverésével 25 °C-on 10 percig,

majd 37°C-on 45 percig, végül 95°C-on 5 percig tartó inkubálással végeztük. A

keletkezett cDNS-t -20°C-on tároltuk. Minden kísérletnél készültek a reverz

transzkriptáz enzimet nem tartalmazó (-RT kontroll) és RNS templátot nem tartalmazó

kontroll minták.

A humán ABCA1 transzkriptumáról előállított cDNS kimutatásához a következő

láncindító szekvenciákat használtuk:

ABCA1: 5’-ACAAGATGCTGAGGGCTGAT-3’ és

5’-CCCAAGACTATGCAGCAATG-3’.

Ezen primerek használatával a genomiális abca1-et el tudjuk különíteni az exogén

ABCA1 cDNS-től. Az RNS preparálás és a reverz transzkripció kontolljaként B-sejtek

esetében a houskeeping Abelson (ABL) gén, MDCKII és HEK293H sejtek esetében a

gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) gén transzkriptumát használtuk. Ezeket

a következő oligonukleotidok használatával mutattuk ki:

ABL: 5’-GGGCTCATCACCACGCTCCA-3’ és

5’- CTGCCGGTTGCACTCCCTCA-3’

29

GAPDH: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’ és

5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’.

B-sejtek esetében a HA-jelölt ABCA1 variánsok transzkripciójának kimutatását

hagyományos RT-PCR technika segítségével is végeztük. A PCR reakció körülményei

az Eppendorf készüléken a következők voltak: hot start 95°C 4 percig, 35 cikluson át

denaturáció 95°C 1 percig, anelláció 60°C 1 percig, elongáció 72°C 1 percig, termináció

72°C 6 percig, majd 10 perc alatt 4°C-ra hűtöttük a mintákat. A reakció 20 µl

térfogatban zajlott.

B-sejtekben az ABCA1 mRNS szintjét reverz transzkripció után Lightcycler-el

(Roche) is meghatároztuk. Az előállított cDNS-ből 1-1 µl-t használtunk a PCR

reakciókhoz. A PCR reakció körülményei a Lightcycler készüléken: denaturáció: 95°C

5 percig, amplifikáció: 95°C 10 másodpercig, 60°C 5 másodpercig, 72°C 20

másodpercig, kvantifikáció: 82 single, 40 ciklus, olvadás: 65-99°C, mérték: 0.1°C

/másodperc (100).

Az MDCKII és HEK293H sejtek esetében a kvantitatív RT-PCR-t a Light Cycler

480 II (Roche) készüléken végeztük. A PCR körülményei: amplifikáció előtt a FastStart

DNA polymer aktiválása és a cDNS teljes denaturációja miatt 95°C-on 1 percig

előinkubáltunk, majd 45 cikluson keresztül 95°C 30 másodpercig, 58°C 1 másodpercig

és 72°C 1 másodpercig zajlott a reakció. A reakcióelegy 3 mM MgCl2

3.5. Sejtlizátumok és membránpreprátumok készítése

-ot, 0,25 μM

ABCA1 illetve 0,5 μM GAPDH primereket, és 5 μl LightCycler DNA Master SYBR

Green I-t tartalmazott (2x, Roche). Az utolsó ciklus után elvégeztük az amplikonok

olvadáspont analízisét. Az amplifikációs profilt a LightCycler Relative Quantification

Software segítségével a második derivált maximum számításával értékeltük. Az mRNS

szintek relatív változását a GAPDH expressziójára normálva állapítottuk meg.

A sejtvonalakból teljes sejtlizátumot vagy differenciál centrifugálással

membránpreparátumot készítettünk a laboratóriumunkban már használt metodika több

módosításával (101).

Teljes sejtlizátum készítéséhez a sejteket tripszines (Sigma) emésztéssel szedtük

fel a tenyésztőedény faláról, majd mostuk PBS oldattal. Ezután a Laemmli mintafelvevő

pufferben (50 mM pH 6,8 Tris-PO4, 2% SDS, 2% β-merkaptoetanol, 2 mM EDTA,

30

20% glicerin, 0,008% brómfenolkék) feloldott sejteket 5 másodpercig, 4°C-on

szonikáltuk (MSE Sonicator).

A membránpreparátumok készítéséhez a sejteket először proteáz inhibitorral

kiegészített PBS oldattal mostuk. Nem letapadó B-sejtek esetén további mosóoldattal

(50 mM pH 7,0 Tris, 300 mM mannitol, 8 µg/ml aprotinin, 10 µg/ml leupeptin,

85 µg/ml PMSF, 2 mM DTT) való leöblítés után kezdtük el a sejtek feltárását. Letapadó

sejtkultúrák esetén, mint MDCKII, HEK293H és HeLa sejtvonalak, a sejteket a

mosóoldatban steril kaparóval kapartuk le a tenyésztőedény faláról. Centrifugálás után a

sejteket feltártuk TMEP-ben (50 mM pH 7,0 Tris-HCl, 50 mM mannitol, 2 mM EGTA,

8 µg/ml aprotinin, 10 µg/ml leupeptin, 4 mM DTT, 85 µg/ml PMSF) és 5 percig

homogenizáltuk üveg-teflon szövet homogenizátorban (Wheaton). A sejtmagfrakciót és

a fel nem tárt sejteket 500 g mellett 10 percen át végzett centrifugálással (ROTIXA/RP,

Hettich) távolítottuk el. Az egyesített felülúszót 60 percig, 100000 g-vel centrifugáltuk

(LJ-55, Beckman), majd a membránt tartalmazó csapadékot TMEP-ben oldottuk fel

úgy, hogy az legalább 6 mg/ml fehérjekoncentrációjú legyen. Az így elkészített

membránpreparátumokat a felhasználásukig -80°C-on tároltuk.

A membránpreparátumok össz-fehérjetartalmát módosított Lowry módszerrel

határoztuk meg: 5 μl mintához 1,5 ml Lowry oldatot (0,01 M NaOH - 2% Na-tartarát-

0,5% CuSO4 100:1:1 arányban), majd 150 ml Folin-Ciocalteu (Sigma) reagenst adtunk

és 45 perc elteltével 660 nm-en spektrofotométerben (Perkin Elmer Lambda12)

leolvastuk az oldat fényelnyelését. Sejtlizátumok esetén a mintákat először 4,5% TCA-

val kicsaptuk, majd a csapadékot Lowry oldatban felvéve a membránpreparátumok

fehérje-koncentrációjának meghatározásához hasonlóan folytattuk a módszert. A minták

fehérjetartalmát a mért optikai abszorbanica értékek kalibrációs görbével való

összevetése alapján határoztuk meg.

3.6. Elektroforézis és immunoblot

A minták HA-ABCA1 tartalmának ellenőrzéséhez a teljes sejtlizátumokkal és a

Laemmli mintafelvevő pufferben hígított membránpreparátumokkal gélelektroforézist

végeztünk. A minták fehérjéit 6%-os SDS-poliakrilamid gélen választottuk el

Mini-Protean elektroforézis készüléket (Bio-Rad) használva. EBV-transzformált ¬B-

sejtek membránpreparátumaiból 75 µg, HEK293H sejtek lizátumából 15 µg, MDCKII

sejtek lizátumából pedig 40 µg fehérjetartalom került minden gélre. Molekulatömeg

31

standardként a Full Range Rainbow markert (Amersham) használtuk. A fésűgélben

állandó 25 mA-es, míg a lapgélben 35 mA-es áramerősség mellett, futtató pufferben (25

mM pH 7,7 Tris-OH, 192 mM glicin, 0,2% SDS) 2,5 óra alatt szeparáltuk a mintákat.

Ezután a fehérjéket 0,2 pm pórusméretű PVDF (Bio-Rad) membránra blottoltuk át a

Mini-Trans-Blot (Bio-Rad) készülék segítségével transzfer pufferben (25 mM pH 8,3

Tris-OH, 192 mM glicin, 4% metanol), 250 mA áramerősségen 2 órán át a blottoló-

kádat állandóan hűtve. A PVDF membránt ezután 5% (g/v) tejport (Carnation nonfat

dry milk) tartalmazó TBS-TWEEN pufferben (50 mM pH 7,4 Tris-OH, 200 mM NaCl,

0,1% Tween 20) blokkoltuk egy órán át.

Az ABCA1 variánsok detektálásához a PVDF membránokat 16 órán át

inkubáltuk az anti-HA (1:3000, egér monoklonális, HA.11, Babco) vagy anti-ABCA1

(1:250, nyúl poliklonális, Abcam) elsődleges antitestben. A megfelelő mosási (5% tej,

1% TBS-TWEEN, kétszer 15 perc) lépések után 1 órát inkubáltuk tormaperoxidáz-

konjugált, anti-egér IgG másodlagos antitesttel (1:10.000, Jackson Immunoresearch). A

mintafelvitel kontrolljaként a Na+-K+ ATPáz fehérjét használtuk. Kimutatására az

anti-Na+-K+

3.7. Sejtek immuncitokémiai jelölése konfokális mikroszkópiához

ATPáz antitestet (1:1000, egér monoklonális, BioMol) alkalmaztuk.

Háromszori mosás után (háromszor 20 perc, 5% tej, 1% TBS-TWEEN) a blotot

„enhanced chemiluminescence” technikával (ECL, Amersham) tettük láthatóvá.

Immunlokalizációs kísérletekhez a HEK293H sejteket 8 well kamrán

növesztettük. A sejteket Dulbecco módosított PBS (DPBS) mosás után óvatosan

fixáltuk 1% paraformaldehid tartalmú PBS oldattal (PFA/PBS) 5 percig,

szobahőmérsékleten. A plazmamembrán festéshez 5 μg/ml Alex aFluor633-konjugált

búzacsíra agglutininnel (WGA, Invitrogen) inkubáltuk a mintákat 10 percig,

szobahőmérsékleten. Az aspecifikus kötőhelyeket blokkoló oldatban (DPBS oldatban

2mg/ml BSA, 1% halzselatin, 0,1 % Triton X-100, 5% kecske szérum) 1 órán át

blokkoltuk. A lizoszóma festéshez az élő sejteket 100 µM LysoTracker Red

(Invitrogen) festékkel festettük 37°C-on 30 percig. A festés után a sejteket fixáltuk és

permeabilizáltuk 8% PFA/PBS oldattal 15 percig, szobahőmérsékleten, majd jelöltük

anti-HA antitesttel (1:500, egér monoklonális, HA.11, Babco). A Golgi-apparátust és az

endoszómákat indirekt immunfestéssel tettük láthatóvá anti-Giantin (1:500, nyúl

poliklonális, Abcam) és anti-EEA1 (1:250, egér, monoklonális, Abcam) antitesttel.

32

Másodlagos antitestként AlexaFluor-488 konjugált anti-egér IgG és AlexaFluor-594

konjugált anti-nyúl IgG (1:250, Invitrogen) antitesteket használtunk. Az immunjelölés

után a mintákban a sejtmagokat 1 μM DAPI festékkel, 10 percig szobahőmérsékleten

festve, tettük láthatóvá.

A transzdukált MDCKII sejteket az immunfluoreszcens festéshez Transwell Col

filteren növesztettük. DPBS mosást követően a sejteket 5 percig fixáltuk 4% PFA/PBS

oldattal, majd mosás után előhűtött metanollal tovább fixáltuk és permeabilizáltuk

(5 perc). Az ellenanyag hígításokat az előbbi blokkoló oldatban végeztük. 1 óra

blokkolás után a sejteket anti-HA (1:500, egér monoklonális, HA.11, Babco) és anti-

Na+-K+

3.8. Foszfatidilszerin kifordulás kimutatása fluoreszcens annexin V sejtfelszíni

kötődés vizsgálattal

ATPáz (1:250, csirke monoklonális, Abcam) antitesttel jelöltük és 1 órát

inkubáltuk. Másodlagos antitestként AlexaFluor-488 konjugált anti-egér IgG és

AlexaFluor-647 konjugált anti-csirke IgG (1:250, Invitrogen) antitesteket használtunk.

A minták festődését Olympus FV500-IX konfokális mikroszkóppal PLAPO 60× (1.4)

olaj immerziós objektívvel (Olympus) vizsgáltuk. A minták kék, zöld, piros és távoli

piros fluoreszcenciáját 405, 488, 543, és 633nm-es lézerekkel gerjesztettük. Az

emissziót a megfelelő filterek használatával specifikusan detektáltuk.

A sejtfelszínen megjelenő PS mennyiségét fluoreszcensen-jelölt annexin V

kötődés mérésével áramlási citométerrel követtük (Becton Dickinson FACS Calibur). A

jelölés során a B-sejteket PBS-sel történő mosás után annexin-kötő pufferben (10 mM

pH 7,4 HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) vettük fel. A mérés előtt közvetlenül

20 µg/mL propídium jodidot és Alexa Fluor 488-konjugált annexin V-t (1:80,

Molecular Probes) adtunk a mintákhoz. Az A23187 kálcium ionofór (1 µM, Boehringer

Mannheim) hozzáadása után időben követtük a sejtfelszíni PS megjelenést 1, 2, 3, 5, 10,

15 vagy 30 perces időtartamon keresztül. A PS kifordulásra különböző ABC

transzproter inhibitorok hatását vizsgáltuk a következő koncentrációkban: 0,05; 0,1; 0,2;

0,5 és 1 mM gliburid, 10 µM ciklosporin A, 30 µM verapamil, 1 µM KO143, 1 µM

PSC833. Minden inhibitor és az A23187 DMSO-ban volt oldva. Az A23187 aktiválás

előtt 10 percig inkubáltuk a sejteket a vizsgált anyagokkal, majd az indukció után az

annexin V jelölődést követtük időben. A méréseket Cell Quest szoftverrel értékeltük.

Az ábrázolt adatok élő sejtekre vonatkoznak, mivel a teljes sejtpopulációból kivontuk az

33

elpusztult, propídium jodiddal festődött sejteket. A Ca2+

3.9. Sejtfelszíni kifejeződés vizsgálatok áramlási citometriával

-függő annexin V kötődést úgy

számoltuk, hogy az A23187 jelenlétében mért fluoreszcencia átlag értékekből kivontuk

a DMSO oldószer jelenlétében mért fluoreszcencia átlag értékeket. Minden ábrázolt

mérési pontunk legalább három független kísérlet eredményét átlagolja. A KO143 Dr. J.

Allen és G. Koomen (Division of Experimental Therapy, The Netherlands Cancer

Institute, and Laboratory of Organic Chemistry, University of Amsterdam, Amsterdam,

The Netherlands) csoportjától kaptuk. A PSC833 a Novartis Pharmatól (Basel,

Switzerland) származott. A többi anyagot a Sigma-Aldrich-től vásároltuk.

A sejtfelszíni expressziós vizsgálatokhoz a sejteket tripszinnel felszedtük, majd

mosási lépések után 2 mg/ml borjú szérum albumint (BSA) tartalmazó PBS oldatban

10 percig blokkoltuk. Ezután a mintákat anti-HA antitesttel (1:250, egér monoklonális,

HA.11, Babco), majd ezt követő mosási lépések után az AlexaFluor-488 konjugált anti-

egér IgG másodlagos antitesttel (1:500, Invitrogen) inkubáltuk 30-30 percig

szobahőmérsékleten. Izotípus kontrollnak az egér IgG1 (1:10, Sigma-Aldrich) antitestet

használtuk. A HA-ABCA1 variánsok sejtfelszíni expresszióját áramlási citométerrel

detektáltuk (Becton Dickinson FACS Calibur). A különböző anyagok hatásának

vizsgálatakor a sejteket tenyészedényben növesztettük, majd az immunfestés előtt 4 órát

inkubáltuk a következő anyagokkal: 50 μM ALLN, 1 0 μg/ml ap oA -I (Calbiochem),

10-50 μM atorvasztatin (Pfizer), 5 μg/ml BFA, 10-50 μM ezetimib (Schering-Plough),

0,1-1 mM niacin, 10-50 μM verapamil, 30-100 μM nifedipin, 50-500 μM gliburid,

10-50 μM ciklosporin A, 100 μg/ml cikloheximid, 0,1-2,5 mM metil-β-ciklodextrin

(CycloLab), 0,1-2,5 mM 4,4 % koleszterinnel töltött metil-β- (CycloLab). Azok az

anyagok, ahol nem tüntettük fel a forrást, azok a Sigma-Aldrich cégtől származnak. Az

ALLN, atorvasztatin, BFA, ezetimib, niacin, verapamil, nifedipin, gliburid,

ciklosporin A és a cikloheximid oldószere a DMSO volt. Az apoA-I és a metil-β-

ciklodextrin szérummentes DMEM tápfolyadékban volt hígítva. A kezelés után a

sejteket tipszineztük, festettük 2 percig 10 mg/ml propídium jodiddal, majd kiméletesen

fixáltuk 10 percig 1% PFA/PBS oldattal. A további lépéseket 4 ºC-on végeztük. Az

ábrázolt relatív sejtfelszíni expresszió a drog kezelt és az oldószer kezelt minták mértani

átlag fluoreszcencia értékeinek a hányadosa.

34

3.10. Koleszterin kiáramlás mérés

A koleszterin kiáramlás mérés során 6 lyukú plate-en növesztett, közel konfluens

HEK293H és MDCKII kultúrákat 100 nM (4 μCi/ml) 3H-koleszterinnel töltöttünk

(PerkinElmer) 37°C-on 24 órán keresztül. A koleszterintöltést 2 mg/ml zsírsavmentes

BSA-t tartalmazó DMEM (BSA/DMEM) oldatban végeztük. Ezt követően a médiumot

friss BSA/DMEM-re cseréltük, majd 15 μg/ml apoA -I jelenlétében vagy hiányában

37°C-on, 24 órán keresztül inkubáltuk a sejteket. A felülúszót összegyűjtöttük, majd

centrifugáltuk, hogy megszabaduljunk az esetleges felúszott sejtektől. Az üledéket és a

sejtek rétegét 2% SDS és 1 M NaOH oldatában lizáltuk. Minden minta radioaktivitását

liquid szcintillációs módszerrel mértük meg. A koleszterin kiáramlás mértékét a teljes 3

3.11. ApoA-I kötés

H-koleszterin tartalom (felülúszó+sejtek) százalékában fejeztük ki. Az apoA-I-függő

koleszterin kiáramlást az apoA-I jelenlétében és hiányában mért efflux mérések

különbségéből határoztuk meg.

Az ApoA-I konjugációját és a kötési kísérleteket a korábban leírt módon végeztük

kisebb módosításokkal (61). Az ApoA-I fehérjét konjugáltuk a cianin 5 (Cy5,

Amersham Pharmacia Biotech) fluorokrómmal a gyártó javaslata szerint. Minden

kísérlethez a Cy5-jelölt ApoA-I-et kötő pufferben hígítottuk (1,8 mM CaCl2, 1 mM

MgCl2, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4), majd ultracentrifugálással

(30 perc, 100000 g) eltávolítottuk az aggregátumokat. A kötési kísérletek során 5×105

3.12. Statisztikai módszerek

sejtet 1 órán keresztül 4 °C-on inkubáltunk 20 μg/ml apoA -I-Cy5-al. Némely

kísérletben az apoA-I kötésvizsgálat előtt a sejteket előkezeltük 50 µM ALLN-nel vagy

10 µM ciklosporin A-val 4 órán át 37 °C-on. Az apoA-I kötés után, gyors mosási lépést

követően a felszíni apoA-I-Cy5 kötődést áramlási citométerrel) detektáltuk. Az apoA-I-

Cy5 fluoreszcencia értékeket a mért fluoreszcencia mértani középértékekből átlagoltuk.

Statisztikai analízis során a kétmintás t-próbát használtuk. Minden mérési pontnál

a mintaszám több volt, mint 3. Az ábrázolt hibazászlók jelentését minden

ábramagyarázatban feltüntettük, melyek a méréstől függően standard hiba értékeket,

standard devianciát, vagy szórást mutathatnak.

35

4. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK

4.1. Az ABCA1 szerepe a foszfatidilszerin Ca2+

Az ABCA1 foszfatidilszerin (PS) kifordulásban betöltött szerepének

vizsgálatához Prof. C. Higgins munkacsoportja által diagnosztizált Scott betegből

származó, Epstein-Barr vírussal immortalizált B-sejteket kaptunk. Az ABCA1 fehérje

expressziójához a laboratóriumukban már sikeresen alkalmazott retrovirális expressziós

rendszert használtuk több módosítással (98). Mivel a B-sejtvonalak nehezen

transzdukálhatóak és nem klónozhatóak (a sejtnövekedés erősen denzitásfüggő),

valamint nagyméretű fehérjék általában rosszabb hatékonysággal fejeződnek ki

sejtekben, ezért több lépésből álló transzdukciós protokollt dolgoztunk ki.

A vad típusú (vt) ABCA1 cDNS-ét egy neomicin rezisztencia gént is tartalmazó

bicisztronikus retrovirális vektorba klónoztuk. Phoenix eco és PG13 pakolósejtvonalak

használatával retrovírus partikulumokat termeltettünk. A célsejteket duplán fertőzve,

sejtvonal-függő szekvenciális neomicin szelekciós módszert használtunk. Ezen lépések

segítségével a nehezen transzdukálható B-sejtvonalakból a vt ABCA1 fehérjét

expresszáló stabil sejtvonalakat hoztunk létre.

RT-PCR analízissel kimutattuk, hogy a G418 szelektált, Scott betegből izolált

EBV-transzformált B-sejtvonalban (Scott B-sejt + ABCA1) megnövekedett az ABCA1

mRNS szintje (7/A ábra). Mivel nem állt rendelkezésre megfelelően érzékeny antitest, a

vt ABCA1 expressziója EBV-transzformált B-sejtekben nem volt kimutatható sem

immunoblottal, sem egyéb immunfluoreszcens módszerrel. A kész sejtvonalakon az

ABCA1 működésének vizsgálatára beállítottunk egy olyan módszert, mely a sejtek

plazmamembránjának külső rétegében megjelenő PS detektálására alkalmas. Ennek

során intakt sejtekben, fluoreszcens annexin V sejtfelszíni kötődést mértünk áramlási

citométer vagy konfokális mikroszkóp segítségével. Ezzel a módszerrel a

megemelkedett intracelluláris Ca

-indukálta sejtfelszíni

kifordulásában

2+-szint hatására bekövetkező “gyors” (1-5 perc) PS

kifordulást időben tudtuk követni. Összehasonlítva a nyugalmi és a Ca2+-indukált PS

transzlokációt a sejtvonalakban megállapítottuk, hogy a vt ABCA1 alacsony

expressziója is elegendő volt, hogy helyreállítsa a hibás, csökkent mértékű Ca2+-aktivált

PS kifordulást a Scott betegből származó sejtekben (7/B ábra).

36

7. ábra: A vt ABCA1 expressziójának hatása a Scott betegből származó

B-sejtek Ca2+-stimulált sejtfelszíni PS kifordulására

(A) Az ábrán az előállított sejtvonalak RT-PCR analízisének eredménye gél-

elektroforézis képen látható. A cDNS minták totál RNS preparátumból RT enzim

jelenlétében készültek. A –RT-kontroll esetében a vt ABCA1-et expresszáló Scott

B-sejtek totál RNS preparátumából RT enzim hiányában készült a minta. (B) Az

ábrán egészséges B-sejtek, Scott betegből származó B-sejtek és a vt ABCA1 fehérjét

expresszáló Scott B-sejtek annexin V kötésének áramlási citometriás analízise

látható. Az annexin V kötődést először A23187 ionofór nélkül, majd az ionofór

hozzáadását követően több időpontban mértük.

37

Megfigyeltük továbbá, hogy egészséges B-sejtekben a PS kifordulás

koncentrációfüggő módon gátolható egy ABCA1 gátlószerrel, a gliburiddal (8/A ábra)

(62, 102, 103). Mivel a gliburid egyéb ABC fehérjék működését is gátolja (104) pl.

MDR1, ABCG2, MRP1, MRP2 és MRP3, ezért utóbbi fehérjékre specifikus inhibitorok

(ciklosporin A, verapamil, PSC833, és KO143 (60, 105-108)) hatását is vizsgáltuk, és

kizártuk az említett transzporterek részvételét a PS transzlokációban. Ezen

eredményeink megerősítik mások megfigyeléseit is, miszerint inkább az ABCA1 (49,

102) és nem az MDR1 (109) vagy az ABCG2 (110) fehérjék szabályozhatják a

lipidasszimetria megszűnését. Megvizsgálva a gliburid hatását a vt ABCA1-et kifejező

Scott B-sejtvonalon azt tapasztaltuk, hogy a gliburid teljes mértékben gátolja a

megnövekedett Ca2+-ionofór-stimulálta PS transzlokációt (8/B ábra). Mindez

alátámasztja azt, hogy az vt ABCA1 expresszió változtatta meg a Scott beteg sejtjeinek

hibás PS transzlokációs képességét.

Az előzőekben ismertetett eredményeink alapján kijelenthető, hogy az ABCA1

fehérjét sikeresen kifejeztük Scott betegből származó B-limfocitákban. Kimutattuk,

hogy a vt ABCA1 expressziója helyreállította a hibás Ca2+-indukált PS transzlokációt,

valamint ezt a helyreállított PS kifordulást egy ABCA1 inhibitor gátolta.

Eredményeinket együttműködő partnereinkkel közös cikkben jelentettük meg

(1.¬közlemény). Az együttműködésben munkánk segítségével tudtuk igazolni a fehérje

szerepét a gyors PS kifordulásban, így elsőként mutattunk ki funkcionális összefüggést

egy vérzékenységi betegség és az ABCA1 működése között.

38

8. ábra: B-limfociták Ca2+-stimulálta PS transzlokációjának gátlása gliburiddal

(A) Az ábrán a kontroll B-sejtek A23187 ionofór jelenlétében mért Ca2+-aktivált PS

kifordulása látható gliburid (GLIB), ciklosporin A (CsA), verapamil (VRP), KO143

és PSC833 kezelést követően. (B) Scott parentális és a vt ABCA1 fehérjét kifejező

Scott sejtek Ca2+-aktivált PS kifordulás mérései láthatók gliburid kezelés hatására. A

hibazászlók standard deviancia értékeket mutatnak. *p<0.01.

39

4.2. Az ABCA1 fehérje szerepének vizsgálata mutáns variánsok segítségével a

Ca2+

A előző alfejezetben az ABCA1 működésének vizsgálata során a vad típusú

ABCA1 expresszióját csak mRNS szinten, illetve a megváltozott funkció alapján tudtuk

bizonyítani. Annak érdekében, hogy az ABCA1 expressziót fehérje szinten is ki tudjuk

mutatni, először olyan ABCA1 variáns cDNS-t állítottunk elő, amely egy

immundetektálásra alkalmas hemagglutinin (HA)-epitópot tartalmaz. Az ABCA1

fehérje 207-208. aminosava közé beékelt, a fehérje első extracelluláris hurkában levő

HA-epitóp nem befolyásolja a fehérje funkcióját (96). A 4.3.2. fejezetben ismertetésre

kerülő módon mi is igazoltuk, hogy a HA-jelölt ABCA1 fehérje mind lokalizációjában,

mind működésében a jelöletlen vad típusú ABCA1 fehérjével megegyezően viselkedik.

A HA-epitóppal ellátott ABCA1 használata lehetőséget nyújt a bevitt és az endogén

ABCA1 fehérje egyértelmű megkülönböztetésére.

A HA-jelölt vt ABCA1 fehérjén kívül elkészítettük egyik illetve másik NBD

régióban mutáns változatokat (MK: K939M és KM: K1952M). Később bemutatásra

kerülő eredményeikkel mi is igazoltuk, hogy a magasabb expressziós szinteket mutató

MDCKII és HEK293H modellrendszerekben (4.3.2. alfejezet) ezek a funkcióvesztéssel

járó mutánsok, azaz NBD mutánsok, a plazmamembránban lokalizálódnak. Kimutattuk,

hogy expressziójuk nem okoz a működőképes ABCA1-re jellemző apoA-I-függő

koleszterin kiáramlást. Ezen inaktív variánsok megfelelő kontrollt jelentenek a fehérje

funkcionális jellemzése során.

A Scott betegben azonosított ABCA1 mutáció hatásmechanizmusának

vizsgálatához előállítottuk az R1925Q mutáns HA-ABCA1 (HA-RQ) cDNS-ét is.

-indukált foszfatidilszerin kifordulásban

4.2.1. ABCA1 variánsok Scott EBV-transzformált B-limfocitákban

Előállítottuk a HA-jelölt vt ABCA1, valamint az NBD és az RQ Scott mutáns

variánsokat stabilan kifejező Scott B-sejtvonalakat a 4.1 fejezetben leírt módon.

Kvantitatív mRNS expressziós vizsgálatokkal ellenőriztük sejtvonalainkban a HA-jelölt

variánsok expressziós szintjét és megállapítottuk, hogy mind a vt ABCA1, mind a

mutáns variánsok expressziója hasonló mRNS szinteket eredményezett a Scott

B-sejtekben (ezen eredményeket ábrán nem mutatjuk be).

40

Az ABCA1 fehérje HA-jelzéssel ellátott formáját használva nemcsak az mRNS,

hanem a Scott B-sejtekben tapasztalt igen alacsony szintű fehérje expresszió is

kimutatható volt Western blot technikával. A vt HA-ABCA1 valamint az HA-RQ, HA-

KM és HA-MK fehérje variánsok expressziója Scott B-limfocitákban az 9/A ábrán

látható. A mért hasonló mRNS szintek ellenére, a HA-jelölt MK és KM variáns fehérjék

expressziója több független sejtvonalban vizsgálva mindig jelentősen magasabb volt az

RQ és a vt ABCA1 fehérjék szintjéhez képest.

Ezt a különbséget immunfluoreszcens vizsgálataink is igazolták. Az RQ és a vt

HA-ABCA1 variánsokat nem, csak a két inaktív mutáns variánst tudtuk detektálni

immunfluoreszcens jelöléssel, konfokális mikroszkóp segítségével. Az 9/B ábra a

HA-jelölt ABCA1 variánsok sejten belüli lokalizációját mutatja. Látható, hogy

permeabilizált Scott B-sejtekben az HA-MK és a HA-KM mutáns variánsok főleg a

sejtek plazmamembránjában lokalizálódnak.

A továbbiakban a HA-jelölt ABCA1 variánsok expressziójának hatását

tanulmányoztuk a Ca2+-indukálta PS kifordulásra. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a

HA-jelölt vt ABCA1 a nem jelölt vt ABCA1 fehérjéhez hasonlóan (4.1. fejezet 7/B

ábra), helyreállította a PS kifordulást a Scott B-sejtekben, míg az RQ és az MK mutáns

variánsok nem hatottak erre a folyamatra. Eredményeinket a 10/A és B ábra foglalja

össze. Mivel a Walker A motívum mutáns variánsok lokalizációja megfelelő és

expressziójuk jelentősen magasabb, mint a vt ABCA1 fehérjéé, az MK mutáns

hatástalansága azzal magyarázható, hogy a Scott sejtekben csak a működőképes

ABCA1 jelenléte okozza a Ca2+-függő gyors PS kifordulás kijavítását.

Ugyanakkor a másik NBD mutáns, a KM ABCA1 variáns expressziója részlegesen

helyreállította a Scott B-sejtek PS transzlokációs képességét (10/A és B ábra). Az

irodalomból ismert, hogy számos ABC fehérje működésében a két nukleotid kötő

domén eltérő módon vehet részt (111-113), így elképzelhető, hogy az MK és a KM

mutáció különböző korrigáló hatása is erre a funkcionális különbségre vezethető vissza.

41

9. ábra: A HA-jelölt ABCA1 variánsok expressziója és sejten belüli

lokalizációja Scott betegből származó EBV-transzformált B-sejtekben

(A) A HA-jelölt ABCA1 variánsok expresszióját membránpreparátumokból anti-HA

antitestet használva Western blot analízissel követtük. Minden minta esetében 75 µg

fehérjetartalom került a gélre. VT/a és VT/b: két függetlenül készült, a vt HA-

ABCA1 variánst különböző mértékben kifejező Scott B-sejtvonalak. (B) A HA-

jelölt MK és KM variánsok lokalizációját permeabilizált Scott B-sejtekben anti-HA

antitestet használva konfokális mikroszkóppal mutattuk ki (zöld). A

plazmamembrán jelölésére búzacsíra agglutinint (WGA) használtunk (piros).

42

10. ábra A HA-jelölt ABCA1 változatok expressziójának hatása a Ca2+

(A) Az ábrán a különböző ABCA1 variánsokat expresszáló Scott betegből származó

B-limfociták Ca

-

stimulált sejtfelszíni PS kifordulásra Scott betegből származó B-sejtekben

2+-aktivált annexin V kötésének áramlási citometriás analízise

látható A23817 ionofór hozzáadása után. (B) A diagram a különböző variánsokat

43

expresszáló sejtek PS kifordulásának időfüggését mutatja be. A teli szimbólumok az

ionofór mellett, míg az üres szimbólumok a DMSO kontroll jelenlétében mért

kifordulás kinetikáját mutatják. A hibazászlók standard deviancia értékeket

mutatnak, n>3.

A 4.1. fejezetben bemutattuk, hogy a PS transzlokáció egészséges B-sejtekben

koncentrációfüggő módon gátolható egy ABCA1 gátlószerrel, a gliburiddal. Ugyanezt a

gátló hatást tapasztaltuk a Scott B-sejtekben, miután a vt ABCA1 expressziójával

korrigáltuk a hibás PS transzlokációt (lásd 7/B ábra). Megvizsgáltuk az inhibitor hatását

a HA-jelölt vt ABCA1-et expresszáló Scott B-sejteken is. Az előzőekhez hasonlóan azt

tapasztaltuk, hogy a gliburid itt is jelentős mértékben gátolta a Ca2+

4.2.2. ABCA1 variánsok egészséges B-limfocitákban

-aktivált PS

kifordulást a HA-ABCA1-et kifejező Scott B-sejtekben (ezeket az adatokat ábrán nem

mutatjuk be).

Amint a bevezetőben részletesen ismertettük, a vizsgált Scott beteg heterozigóta

volt az RQ ABCA1 mutációra. Ez a mutáció egy konzervatív RRKRK szekvenciát

módosított, amely hasonlít a más fehérjékben endoplazmás retikulum retenciós

szignálként azonosított RXXR motívumra (114). Mindezen felül azt is ismertük, hogy

az RQ ABCA1 mutáns HEK293 sejtekben kifejezve lokalizációs mutánsnak bizonyult

és nem jutott ki a sejtek plazmamembránjába (55). Ezek alapján felmerült a kérdés,

hogy vajon a mutáció domináns negatív módon okozza-e a beteg sejtjeiben

tapasztalható hibás Ca2+-aktivált PS transzlokációt.

Az ABCA1 fehérje működésének módja és annak molekuláris mechanizmusa

sem a sejtekből való koleszterin eltávolításban, sem a gyors Ca2+-indukált PS

transzlokációban részletesen még nem ismert. Irodalmi adatok azonban valószínűsítik,

hogy az ABCA1 fehérje nukleotid-kötő régiói alapvető fontossággal bírnak mindkét

folyamatban (49, 50, 62, 103). Ezért kísérleti rendszerünkben megvizsgáltuk, hogy a

fenti Scott mutáció (RQ), valamint NBD mutánsok (KM, MK és MM) befolyásolják-e a

gyors Ca2+

Tanulmányoztuk az ABCA1 variánsok expresszióját mRNS szinten RT-PCR

módszerrel, fehérje szinten Western blot analízissel, majd összehasonlítottuk a

nyugalmi és a Ca

-indukált PS transzlokáció működését egészséges B-limfocitákban.

2+-indukált PS transzlokációt a sejtvonalakban. Megvizsgálva az

44

egészséges B-sejtekben a fehérjék kifejeződését, közel hasonló fehérje expressziós

mintázatot figyelhetünk meg, mint a Scott B-sejtek esetén kapott eredményeknél. A vt

alacsony, az RQ mutáns alig a kimutathatósági határ feletti, míg az MK, KM és MM

variánsok jelentősen magasabb expressziós szinteket mutattak (11. ábra A és B panel).

Összehasonlítva a blotokon az RQ ABCA1 variánst kifejező mintákat a vt HA-ABCA1-

et expresszálókal észrevettük, hogy az RQ mutáns néhány esetben eltérő magasságban

fut a geleken. Ennek egyik elképzelhető magyarázata a fehérje nem megfelelő

glikozilációja lehet.

11. ábra: A HA-jelölt ABCA1 variánsok expressziója egészséges emberből

származó EBV-transzformált B-sejtekben

45

A HA-jelölt ABCA1 variánsok expresszióját membránpreparátumokból anti-HA

antitestet használva Western blot analízissel mutattuk ki. Minden minta esetében

75 µg fehérjetartalom került a gélre. (A) Az ábrán a különböző inaktív és a Scott

mutációt hordozó HA-ABCA1 variánsok expressziójának reprezentatív

összehasonlító blotja látszik. (B) Az ábra három függetlenül készült, Scott mutációt

hordozó HA-ABCA1 variánst különböző mértékben kifejező B-sejtvonalat mutat be

a vt HA-ABCA1 mellett.

12. ábra: A HA-jelölt ABCA1 variánsok expressziójának hatása egészséges

B-sejtek Ca2+

Az ábrán különböző variánsokat expresszáló B-sejtek PS kifordulásának időfüggését

mutatjuk be. A teli szimbólumok az A23187 ionofór mellett, míg az üres

szimbólumok a DMSO kontroll jelenlétében mért kifordulás kinetikáját mutatják. A

hibazászlók standard deviancia értékeket mutatnak, n>3.

-stimulált sejtfelszíni PS kifordulására

46

A sejtfelszíni lokalizációt, hasonlóan a Scott B-sejtekben való fehérje

expresszióhoz, az egészséges B-sejtek esetében is csak a Walker A motívum

mutánsoknál tudtuk detektálni (ezeket az adatokat ábrán nem mutatjuk be).

A gyors Ca2+

4.2.3. A koleszterin hatása a gyors foszfatidilszerin kifordulásra B-limfocitákban

-indukált PS transzlokációt vizsgálva megállapítottuk, hogy sem a

Scott mutáció, sem az NBD mutánsok nem befolyásolták egészséges B-sejtekben ezt a

folyamatot (12. ábra). Függetlenül attól, hogy melyik mutáns variánst és milyen

mértékben fejeztük ki, mindig hasonló kinetikájú PS transzlokációt figyeltünk meg.

Eredményeink, tekintettel az inaktív NBD mutánsok magas expressziós szintjére, azt

sugallják, hogy ezek a variánsok nincsenek domináns negatív hatással a PS kifordulás

folyamatára.

Ezek alapján a Scott beteg sejtjeinek hibás PS kifordulására elképzelhető egy

másik magyarázat. Korábban kimutatták, hogy a Scott beteg heterozigóta az RQ

mutációra és kórosan alacsony mennyiségű ABCA1 transzkriptum keletkezik mindkét

allélról (55). Mivel eredményeink szerint az RQ mutáció nem domináns negatív hatású

a PS transzlokációra, lehetséges, hogy a beteg fenotípust a működőképes, megfelelően

lokalizálódó ABCA1 erősen csökkent mennyisége okozza.

A bevezetőben ismertetett egyik, az ABCA1 működésére vonatkozó modell

szerint elképzelhető, hogy a fehérje működése az apoA-I-től függetlenül szabályozza a

plazmamembrán koleszterin szintjét. Az ABCA1 ugyanis a lipoproteinek kötését

megelőzve már elősegíti a koleszterin kiáramlást (42, 47, 80, 115). Többen

bizonyították ezen kívül, hogy expressziója módosítja az anionos foszfolipidek

elhelyezkedését a membrán két rétege kötött (43, 49, 61, 103), valamint hogy működése

destabilizálja a lipid raftokat, ami PS kifordulás kíséretében a membrán belső oldalán

erős töltésváltozást okoz (116). Azonban az előbbi folyamatok fizikai és kémiai

mechanizmusai még nem tisztázottak. Ezért kísérleti rendszerünkben tanulmányoztuk a

plazmamembrán koleszterinszint változás hatását a Ca2+-indukált PS kifordulásra

egészséges, Scott és az ABCA1 által helyreállított funkciójú Scott B-sejtekben. A

plazmamembrán koleszterinszint növelésére koleszterinnel töltött metil-β-ciklodextrin

(CD-Koleszterin) komplexet, a membrán koleszterin tartalmának csökkentésére pedig

üres metil-β-ciklodextrint (CD) használtunk (117). Kísérleteink során az alkalmazott

CD kezelés nem változtatta meg a sejtek életképességét.

47

A CD kezelésnek nem volt hatása a Ca2+-indukált gyors PS kifordulásra sem

normális, sem a HA-jelölt ABCA1 által kijavított működésű Scott B-sejtekben. Ezzel

szemben CD-Koleszterin kezelés hatására, a membrán koleszterin töltése jelentősen

csökkentette a gyors PS kifordulást. Ezt a jelenséget mind egészséges, mind a vt HA-

ABCA1-et expresszáló Scott sejtekben megfigyeltük (13. ábra). Ez utóbbi hatás a

koleszterinnel töltött sejtek CD kezelésével teljesen visszafordítható volt (ezeket az

adatokat ábrán nem mutatjuk be). Eredményeink szerint, a plazmamembrán koleszterin

szintjének változása erőteljes hatással van a Ca2+-függő PS kifordulásra limfocitákban.

Mivel ez a jelenség nem volt megfigyelhető a Scott betegből származó B-sejtekben,

feltételezhető, hogy a működőképes ABCA1 jelenléte fontos a PS kifordulás

mechanizmusának kedvező, alacsony koleszterin tartalmú mikrokörnyezet

biztosításában.

13. ábra A plazmamembrán koleszterinszint változásának hatása a Ca2+

Az ábrán egészséges B-sejtek, vt HA-ABCA1 fehérjét expresszáló Scott B-sejtek

és Scott B-sejtek Ca

-

indukált PS kifordulásra B-sejtekben

2+-aktivált annexin V kötésének áramlási citometriás analízise

látható.

48

Ezen alfejezetben a HA-jelölt mutáns ABCA1 variánsok segítségével tovább

vizsgáltuk az ABCA1 fehérje szerepét a Ca2+

4.3. A humán ABCA1 fehérje sejtfelszíni megjelenésének vizsgálata in vitro

modellrendszerekben

-indukált foszfatidilszerin kifordulásban.

Megállapítottuk, hogy a Scott beteg sejtjeire jellemző hibás PS kifordulást csak a vt

HA-ABCA1 jelenléte hozza helyre, a működésképtelen NBD mutánsok nem javítják ki

ezt a hibás működést. Vizsgáltuk egészséges B-sejtekben a Scott betegből azonosított

ABCA1 mutáció és az NBD mutánsok hatását. Eredményeink szerint egyik mutáció

sincs domináns negatív hatással a PS kifordulás folyamatára. Azonban ez a jelenség

mind normális, mind az ABCA1 fehérje által kijavított Scott B-sejtekben gátolható volt

egy már ismert ABCA1 gátlószerrel, a gliburiddal, illetve a sejtek koleszterin

feltöltésével. Habár a Scott beteg heterozigóta volt az RQ mutációra és az alacsony

endogén ABCA1 mRNS szintek miatt feltételezhető egy másik szabályzó elem

mutációja, eredményeink megerősítik azt a feltételezést, hogy az ABCA1 jelenléte -

még ismeretlen mechanizmussal - szerepet játszik a PS kifordulásban és így a

lipidasszimetria megszüntetésében.

Az elmúlt évek eredményei, elsősorban a Tangier és más familiáris HDL-hiányos

betegek, és az ABCA1 hiányos egerek vizsgálatai bizonyították, hogy a fehérje

működési zavara a reverz koleszterin transzportban kulcsszerepet játszó HDL formák

képződésének hiányához vezet. Ez a makrofágokban koleszterin felhalmozódást okoz és

megnöveli az érelmeszesedésre való hajlamot (118-120). Világszerte széleskörű

kísérleti munkát indítottak olyan HDL-szint növelő vegyületek felfedezésére, melyek

fokozzák az ABCA1 fehérje közvetítette, sejtből kifelé irányuló koleszterin

transzportot. Az ABCA1 sejtfelszíni megjelenésének tanulmányozása azonban eltérő

eredményekhez vezethet a fehérje különböző sejttípusokban való eltérő szabályozása

miatt. Létrehoztunk ezért egy olyan kvantitatív in vitro sejtes modellrendszert, amely

független a közvetlen transzkripciós szabályozástól és megfelelő az ABCA1

plazmamembrán szintjének vizsgálatára. Ezen kísérleti rendszerünkben megvizsgáltuk

számos koleszterinszint-csökkentő anyag hatását.

49

4.3.1. A HA-jelölt ABCA1 változatok stabil expressziója emlős sejtekben

Az ABCA1 sejtfelszíni vizsgálatára alkalmas modellrendszer létrehozására a B-

sejteknél sikerrel alkalmazott, extracelluláris HA-epitópot tartalmazó ABCA1 variánst

stabilan expresszáltuk különböző emlős sejtvonalakban (MDCKII, HEK293, HeLa)

retrovirális expressziós rendszer segítségével. A 6. ábrán bemutatott retrovirális

konstrukciók közül a vt ABCA1-et, a vt HA-ABCA1-et és az összes HA-jelölt Walker

A mutáns variáns (MK, KM és MM) konstrukciókat fejeztettük ki. Phoenix és PG13

pakolósejtek segítségével retrovírus partikulumokat termeltettünk és különböző szintű

ABCA1 expressziót mutató sejtvonalakat hoztunk létre. Egy korábbi tanulmányban azt

mutatták ki, hogy transzfektált sejtekben néhány passzázs elteltével az ABCA1

expresszió rohamosan csökkent (103). A transzgént stabilan kifejező, homogén

expressziós szintet mutató sejtvonalak létrehozására kétféle stratégiát alkalmaztunk:

i) Összekeverő (pooling) módszer: klónozást követően négy-hat, hasonló expressziós

szintet mutató klón összekeverésével hoztunk létre sejtpopulációkat.

ii) Szétválogató (sorting) módszer: direkt HA-antitest jelöléssel, hasonló sejtfelszíni

HA-ABCA1 expresszió alapján sejtszorterrel szétválogatva hoztunk létre

sejtpopulációkat.

Az első módszert MDCKII és HeLa sejtek esetében, a másodikat HEK293H

sejtek esetén alkalmaztuk.

Az így előállított sejtvonalakban kvantitatív RT-PCR segítségével meghatároztuk

az ABCA1 mRNS expressziós szinteket, melyeket HepG2 sejtekkel és különböző

makrofág modellrendszerekkel hasonlítottunk össze pl.: PMA-kezelt Thp-1 sejtekkel és

emberi monocita-eredetű makrofágokkal (MDM). Azt tapasztaltuk, hogy az ABCA1

csak mérsékelt overexpressziót mutat a sejtvonalainkban (HepG2 sejtekhez viszonyítva

hozzávetőlegesen 10-40-szeres túltermelést). Mindemellett az expressziós szintek

hasonlónak mutatkoztak a T0901317, egy LXR agonista által indukált makrofág

sejtekben lévő endogén ABCA1 expresszióval (14/A ábra). A HA-jelölt ABCA1

variánsok fehérje expresszióját több passzázson keresztül követtük sejtvonalainkban,

teljes sejtlizátumból vagy izolált membránpreparátumokból, Western-blot technikával

(14/B ábra). Az figyeltük meg, hogy az MDCKII sejtek 50, míg a HEK293H sejtek 20

passzázson keresztül stabilan fejezik ki a transzgént. Mivel a HeLa sejtvonalak esetében

50

az ABCA1 variánsok kifejeződésének mértéke alacsonyabb lett, ezért a további

kísérletekhez elsősorban a HEK293H és az MDCKII sejtvonalakat használtuk.

14. ábra: A vt és mutáns HA-jelölt ABCA1 variánsok expressziója HEK293H és

MDCKII sejtekben

(A) Az ABCA1 variánsok mRNS szintjét kvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg

HEK293H és MDCKII sejtekben. Az ABCA1 mRNS expressziót minden esetben

HepG2 sejtek endogén ABCA1 expressziójához viszonyítottunk. Az endogén

ABCA1 expresszós szintjének bemutatásához Thp-1 sejteket és humán MDM

51

sejteket használtunk. Az ABCA1 expresszió indukciójára ez utóbbi két sejttípust

kezeltük a T0901317 LXR agonistával (n.d.: nem detektálható).

(B) A HA-jelölt ABCA1 variánsok fehérje expressziós szintjét teljes sejtlizátumból

anti-HA antitestet használva Western blot analízissel mutattuk ki. Az ábrán látható

reprezentatív blotok HEK293H és MDCKII sejtekben kifejeződő variánsokat

mutatnak be 5 passzázs után. HEK293H sejtek esetén 15 µg, MDCKII sejtek esetén

40 µg fehérjetartalom került a gélre. Mintafelviteli kontrollként a Na+-K+

4.3.2. Az HA-jelölt ABCA1 variánsok sejten belüli lokalizációjának és

működésének vizsgálata

ATPázt

használtuk.

A létrehozott sejtvonalakban a teljes fehérje expresszió elemzése mellett

tanulmányoztuk az ABCA1 variánsok sejtfelszíni megjelenését is. Ép sejteket közvetve,

immunfluoreszcens módszerrel jelöltünk anti-HA antitestet használva. A sejtfelszíni

festődést áramlási citométerrel mutattuk ki. Mind MDCKII, mind HEK293H sejtekben

az összes ABCA1 változat esetén közel azonos plazmamembrán expressziós szinteket

figyeltünk meg (15. ábra). Hasonlóan az ABCA1 variánsok teljes fehérje

expressziójához, a sejtfelszíni kifejeződés változatlan maradt MDCKII sejtekben 50,

HEK293H sejtekben 20 passzázsig.

15. ábra A vt és mutáns HA-jelölt ABCA1 variánsok sejtfelszíni

expressziójának áramlási citometriás vizsgálata

52

A különböző HA-jelölt ABCA1 variánsokat kifejező ép HEK293H és MDCKII

sejteket immunfluoreszcensen jelöltük anti-HA, majd anti-egér IgG-Alexa 488

antitesttel. Az ábrán az ABCA1 variánsok sejtfelszíni megjelenéséről reprezentatív

hisztogramok láthatók.

16. ábra A HA-jelölt ABCA1 variánsok sejten belüli lokalizációja HEK293H

sejtekben

53

A permeabilizált HEK293H sejtekben a vt (B, E, H, K, N) és a dupla mutáns variáns

HA-ABCA1 (C, F, I, L, O) fehérjéket anti-HA antitesttel való immunfluoreszcens

festést követően konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá (zöld szín). Negatív

kontrollként a neo-tartalmú vektorral transzdukált sejteket használtunk (A, D, G, J,

M). A különféle sejtorganellumok vizsgálatára a következő markereket használtuk:

wheat germ agglutinin (plazmamembrán marker, D-F), anti-Giantin (Golgi marker,

G-I) és anti-EEA1 (endoszóma marker, J-I) antitest, valamint LysoTracker

(lizoszóma, M-O) festék (vörös). A sejtmagot DAPI festéssel tettük láthatóvá (kék).

A fehér nyilak a kolokalizáció helyét jelzik. A skála 10 μm-t jelöl.

A HA-jelölt ABCA1 variánsok sejten belüli lokalizációját anti-HA antitesttel való

immunfluoreszcens jelölést követően konfokális mikroszkóppal is vizsgáltuk.

HEK293H sejtekben részletesen jellemezve az intracelluláris lokalizációt azt

tapasztaltuk, hogy a HA-jelölt ABCA1 variánsok főként a plazmamembránban

expresszálódnak (16. ábra E, F). Kis mértékben a Golgi apparátusban is látható HA-

ABCA1 kifejeződés és bizonyos fokú kolokalizáció figyelhető meg az endoszóma

markerrel (16. ábra K, L).

Polarizáltan növesztett MDCKII sejtekben szintén vizsgáltuk a HA-ABCA1

variánsok sejten belüli lokalizációját. A bazolaterális plazmamembrán jelölésére a Na+-

K+ ATPáz fehérje festést használtuk. Hasonlóan mások korábbi, nem jelölt fehérjéhez

kapcsolódó megfigyeléseihez (32), a HA-jelölt vt ABCA1 szintén bazolaterális

membránban helyezkedett el (17. ábra F panel). Ezen felül az összes inaktív HA-jelölt

ABCA1 variáns szintén bazolaterális expressziót mutatott (17. ábra I, L, O panelok).

54

17. ábra A HA-ABCA1 változatok sejten belüli lokalizációja polarizált

MDCKII sejtekben

55

A vt HA-ABCA1 fehérjét (D-F), a mutáns variánsokat (G-O) és a negatív

kontrollként használt neo-tartalmú vektort (A-C) kifejező MDCKII sejteket áteresztő

membránon növesztettük polarizált kultúra létrehozásáig. A permeabilizált sejtekben

a HA-ABCA1 variánsokat immunfluoreszcens festést követően konfokális

mikroszkóppal tettük láthatóvá. Az ABCA1 fehérjét anti-HA antitesttel (zöld szín)

mutattuk ki; a Na+-K+ ATPáz fehérje festést (vörös szín) bazolaterális

plazmamembrán jelölésére használtuk.

A HA-jelölt ABCA1 változatok működőképességét az ABCA1 működésére

jellemző apoA-I-függő koleszterin kiáramlás mérésekkel és apoA-I kötésvizsgálatokkal

ellenőriztük. Korábbi, nem jelölt fehérjével való megfigyelésekhez hasonlóan (39, 121)

a vt ABCA1 kifejeződése, HEK293H és MDCKII sejtekben is megemelkedett

koleszterin kiáramlást okozott a kontroll, nem expresszáló sejtekhez viszonyítva (18.

ábra). Ez a mérésünk azt mutatta, hogy a HA-jelölt és a nem jelölt ABCA1 működése

hasonló volt; tehát azt a fontos megállapítást támasztja alá, hogy a HA-jelölés nem

okozott funkcionális változást a fehérje működésében. Az apoA-I-függő koleszterin

kiáramlás az MK, KM és MM ABCA1 variánsokat expresszáló sejtekben nem

különbözött a kontroll sejteken mért értéktől (eredményeinket ábrán nem mutatjuk be).

Mivel a három inaktív mutáns variáns között nem figyeltünk meg különbséget sem

expressziójukban és sejten belüli lokalizációjukban, sem a koleszterin kiáramlás

mérésekben, ezért a további kísérleteinkben a dupla mutáns (MM) ABCA1 változatot

használtuk kontrollként. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy kísérleti rendszerünkben a

megfigyelt apoA-I-függő koleszterin efflux kisebb mértékű volt, mint mások korábbi

méréseiben. Ennek a legvalószínűbb oka, hogy a mi rendszerünkben lévő mérsékelt

expressziós szintekhez képest mások sejtes rendszerei, tranziens expresszión alapulva,

igen magas expressziós szinteket érnek el. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy korábbi,

endogén ABCA1 fehérjét vizsgáló makrofág rendszerekben, indukció hatására mért

koleszterin efflux változások hasonló mértékűek voltak, mint az általunk előállított

sejtvonalakon mért kiáramlások (122).

56

18. ábra ApoA-I függő koleszterin kiáramlás az ABCA1 fehérjét kifejező

HEK293H és MDCKII sejtekből

Az ábrán az ABCA1 működésére jellemző apoA-I-függő koleszterin kiáramlás

mérés eredménye látható a jelöletlen és a HA-jelölt vt ABCA1 fehérjét expresszáló,

valamint a parentális sejteken. A hibazászlók standard hiba értékeket mutatnak, n>6

(n.d.: nem detektálható). A vizsgált sejtvonalakban az ABCA1 expressziós szintjeit

anti-ABCA1 antitestet használva, Western-blot technikával mutattuk ki.

Az apoA-I kötés vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy mind a jelöletlen, mind a

HA-jelölt vt ABCA1 jelenléte megnövelte az apoA-I sejtfelszíni kötődését HEK293H

sejteken a kontroll sejtekhez viszonyítva (19/A ábra). Az inaktív MM mutáns

expressziója nem befolyásolta az ApoA-I kötődését. Az apoA-I kötés vizsgálat

eredményei összhangban a koleszterin kiáramlás mérésekkel azt mutatják, hogy a HA-

jelölés nem befolyásolja a fehérje funkcióját, viszont a Walker A mutánsok

funkcionálisan inaktívnak bizonyulnak.

57

19. ábra ApoA-I-kötés mérése az ABCA1 variánsokat kifejező HEK293H

sejteken

(A) A reprezentatív hisztogramokon a fluoreszcensen jelölt ApoA-I (ApoA-I-Cy5)

sejtfelszíni kötődésének áramlási citometriás analízise látható a vt, a HA-vt és a HA-

MM ABCA1 variánsokat expresszáló HEK293H sejteken apoA-I hozzáadása után

(piros, kék, zöld görbék). (B) Az oszlopdiagramokon a különféle variánsokat

expresszáló HEK293H sejteken mért ApoA-I-Cy5 sejtfelszíni kötődés vizsgálat

eredménye látható. Kontroll kezelés esetén oldószerrel (fehér oszlopok), ALLN

esetén kalpain inhibitorral (szürke oszlopok), CsA kezelés esetén ciklosporin A-val

(fekete oszlopok) kezeltük a sejteket. A hibazászlók standard deviancia értékeket

mutatnak, n>3.

58

Későbbi kísérletekben (4.3.3. és 4.3.4 alfejezetekben) használt, ABCA1

sejtfelszíni megjelenését is befolyásoló anyagok közül a kalpain inhibitor, Acetyl-L-

Leucyl-L-Leucyl-L-Norleucinal (ALLN) és a ciklosporin A hatását is vizsgáltuk a

sejtek apoA-I kötésére. ALLN esetében ismert, hogy az, gátolva az ABCA1

degradációjáért felelő kalpain proteázt, növeli a fehérje szintjét a sejtfelszínen, fokozva

a koleszterin kiáramlást a sejtekből (71-73). A ciklosporin A szintén növeli az ABCA1

jelenlétét a plazmamembránban, azonban még ismeretlen mechanizmussal, a

megnövekedett expresszió ellenére, gátolja a koleszterin kiáramlást (123). Kísérleteink

során azt tapasztaltuk, hogy míg az ALLN jelentősen megnövelte az apoA-I kötődését

mind a vt, mind a HA-vt ABCA1-et expresszáló sejtekhez, addig a ciklosporin A

előkezelés jelentősen csökkentette azt (19/B ábra). Ez a megfigyelés összhangban áll

mások jelöletlen ABCA1 fehérjén végzett kísérleteivel (71-73, 123). Az ALLN és a

ciklosporin A nem volt hatással a parentális és az MM ABCA1 variánst kifejező

sejtvonalak apoA-I kötésére, alátámasztva azt, hogy az MM inaktív mutáns valóban

nem működik modellrendszerünkben.

4.3.3. A kalpain inhibitor, a BFA és az apoA-I hatása az ABCA1 variánsok

sejtfelszíni expressziójára

A HA-ABCA1 fehérjét expresszáló sejtvonalak létrehozásának a célja az volt,

hogy az ABCA1 sejtfelszíni expressziójának követésére alkalmas modellrendszert

hozzunk létre. Annak érdekében, hogy rendszerünk használhatóságát igazoljuk, először

már ismert, az ABCA1 sejten belüli szállítását és lebomlását befolyásoló anyagok

hatását tanulmányoztunk. Korábban leírták, hogy egy kálcium-aktivált intracelluláris

cisztein proteáz, a kalpain közreműködik az ABCA1 lebontásában (71-73). Ezért egy

kalpain gátlószerrel (ALLN) kezeltük a HA-jelölt ABCA1 fehérjét kifejező sejtjeinket.

Előbbi anyag hatására gátlódik az ABCA1 lebomlási útvonala, ezért várhatóan

növekszik a fehérje sejtfelszíni expressziója. Az ABCA1 sejtfelszíni megjelenésének

csökkentésére a Brefeldin A-t (BFA) használtuk, amely a fehérje transz-Golgiból való

továbbjutását gátolja (35). 4 órás ALLN és BFA kezelés után ép sejteket

immunfluoreszcensen jelöltünk anti-HA antitesttel, majd követtük a sejtfelszíni ABCA1

kifejeződést áramlási citométer segítségével.

A 20/A és B ábrák a vt és MM HA-ABCA1 variánsokat kifejező HEK293H

sejtekre jellemző sejtfelszíni jelölődést mutatják. A 20/C és D ábrákon több mérésből

59

átlagolt, a kontroll sejtekhez viszonyított relatív sejtfelszíni expresszió látható. Mindkét

variáns sejtfelszíni megjelenésében lényeges változást figyeltünk meg a nem kezelt

sejtekhez képest. Az ALLN 60%-os növekedést, míg a BFA kezelés hozzávetőlegesen

60%-os csökkenést okozott a vt HA-ABCA1 sejtfelszíni megjelenésében (20/C ábra).

MM HA-ABCA1 esetében az ALLN 30%-kal növelte, míg a BFA 40%-kal

csökkentette a variáns plazmamembrán megjelenését (20/D ábra). A ábrán bemutatott

anyagok mellett egy ismert fehérje-szintézist gátló vegyület, a cikloheximid hatását is

vizsgáltuk, ami szintén csökkentette az ABCA1 változatok sejtfelszíni megjelenését.

Azonban ez az anyag jelentősen csökkentette a sejtek életképességét is.

Az apoA-I-ről már korábban kimutatták, hogy jelenléte növeli az ABCA1 fehérje

expresszióját, a sejtfelszínen a fehérjéhez kötődve megvédi azt a lebomlástól (72, 73).

Kísérleti rendszerünkben apoA-I hozzáadására mi is ezt a hatást figyeltük meg. A

kezelés jelentősen megnövelte a vt HA-jelölt ABCA1 fehérje mennyiségét a

sejtfelszínen (20/C ábra). Az MM HA-ABCA1 fehérje esetén, melyről korábban mások

(62) és mi is kimutattuk (4.3.2. fejezet), hogy nem képes kötni az apoA-I-et, nem

tapasztaltuk a sejtfelszíni megjelenés változását az apoA-I kezelést követően (20/D).

Ezek az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy modellrendszerünk megbízhatóan

használható a különféle anyagok ABCA1 fehérje sejtfelszíni expressziójára gyakorolt

hatásának kimutatására.

Érdemes megjegyezni, hogy hasonló kísérletekben MDCKII sejteken is

vizsgáltuk az ALLN és BFA kezelés hatását a HA-jelölt ABCA1 sejtfelszíni

kifejeződésére. Habár széles koncentráció tartományban tanulmányoztuk az anyagok

hatását, nem tapasztaltunk jelentős változást az ABCA1 sejtfelszíni megjelenésében. A

két sejttípusban tapasztalt különbség legkézenfekvőbb magyarázata az ABCA1 fehérje e

sejtvonalakban eltérő féléletideje lehet. Korábban kimutatták, hogy az ABCA1 fehérje

életciklusa HEK293 sejtekben igen gyors (féléletidő = 1-2 óra) (72, 124), így ez a

sejtkörnyezet alkalmas lehet a fehérje sejten belüli sorsának tanulmányozására. Az

epitél eredetű MDCKII sejtek - úgy tűnik - nem megfelelőek ilyen vizsgálatokra, vagy

legalábbis nem a mi általunk használt időtartományban. Ezek alapján a további

kísérleteinket a HEK293H sejtes rendszeren végeztük.

60

20. ábra. Különböző anyagok hatása a HA-jelölt ABCA1 változatok sejtfelszíni

megjelenésére HEK293H sejtekben

Az ábrán a vt és az MM HA-ABCA1 variánsokat expresszáló HEK293H sejtek anti-

HA antitesttel való immunfluoreszcens jelölése látható áramlási citométerrel

követve. (A, B) A reprezentatív hisztogramok ALLN és BFA kezelés után ép sejtek

immunfluoreszcens festését mutatják a kontroll (kezeletlen) sejtekhez viszonyítva.

(C, D) Az oszlopdiagramokon a különböző anyagokkal kezelt vt és az MM

variánsokat expresszáló sejtek relatív sejtfelszíni expresszióját ábrázoltuk a kontroll

sejtekhez viszonyítva. A hibazászlók standard hiba értékeket mutatnak, n>3, *p<

0,005.

61

4.3.4. Különböző anyagok hatása az ABCA1 változatok sejtfelszíni kifejeződésére

Miután bizonyítottuk, hogy kísérleti rendszerünk megfelelő a további

vizsgálatokra, különböző anyagok az ABCA1 variánsok sejtfelszíni megjelenésére

gyakorolt hatását tanulmányoztuk. Elsősorban olyan vegyületeket vizsgáltunk, amelyek

forgalomban lévő gyógyszerkészítmények hatóanyagai és ismerten koleszterinszint

csökkentő hatásúak. A használt szerek a következők: atorvasztatin, ezetimib, niacin (83,

125-130), a kálcium-csatorna blokkoló nifedipin és verapamil (91, 92). Emellett

tanulmányoztunk olyan anyagokat is, mint például a ciklosporin A és a gliburid,

amelyekről korábban kimutatták, hogy befolyásolják az ABCA1 fehérje

plazmamembrán szintjét és működését (62, 123).

Előzetes vizsgálataink során azt figyeltük meg, hogy egyes tanulmányozott

anyagok hatására a sejtek érzékennyé válnak az immunfluoreszcens jelölési protokollra

és erőteljesen csökken az életképességük a festési eljárás során. Ezért az

immunfluoreszcens jelölési protokollt kiegészítettük egy propidíum jodidos előfestéssel,

ami lehetővé tette az elpusztult sejtek elkülönítését és a vizsgált anyagok érzékenyítő

hatásának kiküszöbölését. Az anyagokat széles koncentráció és inkubációs idő

tartományban használtuk. Minden kísérletben az ABCA1 sejtfelszíni szintjének

emelésére és csökkentésére, pozitív kontrollként az ALLN és BFA anyagokat

használtuk.

Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy az atorvasztatin (10-50 µM), a niacin

(0,1-1 mM), a verapamil (10-50 µM) és a nifedipin (30-100 µM) anyagoknak nem volt

kimutatható hatásuk az ABCA1 plazmamembrán szintjére. Azonban a ciklosporin A

(10 µM) számottevően megnövelte a vt HA-ABCA1 sejtfelszíni megjelenését. Ez a

megfigyelés összhangban áll egy másik csoport korábbi eredményével, hogy a

ciklosporin A megnöveli a fehérje szintjét a plazmamembránban, mintegy ott fogva,

csapdázva azt a sejtfelszínen (123). Azt azonban még nem mutatták ki, hogy van-e

összefüggés e hatás és a fehérje funkciója között. Ezért elvégeztük ugyanezt a kísérletet

az inaktív MM ABCA1 variánssal, és azt tapasztaltuk, hogy a ciklosporin A egyformán

növelte az ABCA1 sejtfelszíni expressziót mind a vt, mind az MM HA-ABCA1-t

kifejező sejtekben, vagyis a csapdázó hatás független az ABCA1 fehérje funkciójától.

Meglepő módon az ezetimib, amely a koleszterin bélből való felszívódását gátló

gyógyszer, hozzávetőlegesen 20%-kal csökkentette a vt HA-ABCA1 sejtfelszíni

62

megjelenését. Méréseink azt is megmutatták, hogy ez a hatás összefüggésben van az

ABCA1 működésével, mivel ezetimib kezelés hatására az MM HA-ABCA1 sejtfelszíni

megjelenésében semmilyen változást nem tapasztaltunk (20. ábra C és D panel).

Korábbi irodalmi adatok szerint a gliburid gátolja az ABCA1-függő koleszterin

kiáramlást és az apoA-I kötést anélkül, hogy megváltoztatná az ABCA1 fehérje szintjét

és a sejtfelszíni megjelenését (62, 131). Ezzel összhangban a gliburidnak a mi kísérleti

rendszerünkben sem volt hatása az ABCA1 plazmamembrán szintjére. Habár magasabb

koncentrációkkal való kezelés esetén enyhe csökkenést figyeltünk meg az ABCA1

sejtfelszíni megjelenésében, azonban párhuzamosan a sejtek életképességének erőteljes

csökkenését tapasztaltuk mind a vt, mind az MM HA-ABCA1 változatot kifejező

sejtekben. (4 órás 200-500 µM gliburid kezelés hatására mindkét sejtvonalban a sejtek

50%-a elpusztult, meghiúsítva az anyag hatásának értékelését.)

A fenti anyagok mellett a plazmamembrán koleszterinszint változásának hatását

is vizsgálni kívántuk az ABCA1 variánsok sejtfelszíni megjelenésére. Amint a 4.2.3.

fejezetben is leírtuk, koleszterinszint növelésére CD-Koleszterin komplexet, a membrán

koleszterin tartalmának csökkentésére pedig üres CD-t használtunk (117). A CD kezelés

széles koncentráció tartományban (0,1-2,5 mM) és sokféle inkubációs időtartam (20

perc - 4 óra) mellett sem volt hatással az ABCA1 variánsok sejtfelszíni megjelenésére,

habár a jelentős csökkenést figyeltünk meg a sejtek életképességében. A

plazmamembrán koleszterinnel való töltése (CD-Koleszterin kezelés) sem okozott

változást az ABCA1 expresszióban egyik sejttípusban sem. Az élő sejtek arányában

azonban hozzávetőlegesen 20%-os növekedést figyeltünk meg. A vizsgált anyagok az

ABCA1 variánsok sejtfelszíni expressziójára gyakorolt hatását a 3. táblázat foglalja

össze.

63

3. táblázat: Különböző anyagok hatása a vt és az MM mutáns HA-ABCA1

variánsok sejtfelszíni expressziójára

anyagok ismert hatások ABCA1 sejtfelszíni kifejeződés

vt HA-ABCA1 MM HA-ABCA1

ALLN kalpain gátlószer (+ 60%) (+ 30%)

ApoA-I koleszterin akceptor (+ 30%) nincs hatás

Atorvasztatin koleszterinszint-

csökkentő nincs hatás nincs hatás

Brefeldin A transz-Golgi

transzport gátló (- 60%) (- 40%)

Cikloheximid fehérje szintézis gáltó (- 30%)

(életképesség )

(- 30%)

(életképesség )

Ciklosporin A immunszupresszáns (+ 60%) (+ 60%)

Ezetimib bélből koleszterin

felszívódást gátló (- 20%) nincs hatás

Gliburid

antihiperglikémiás

szulfanilurea

származék, ABCA1

gátlószer

nincs hatás nincs hatás

Niacin koleszterinszint-

csökkentő nincs hatás nincs hatás

Nifedipin Ca2+ nincs hatás -csatorna gátló nincs hatás

Metil-β-

ciklodextrin

membránból

koleszterin és

foszfolipidek

kivonása

nincs hatás

(életképesség )

nincs hatás

(életképesség )

Koleszterin-

metil-β-

ciklodextrin

membrán

koleszterinnel való

töltése

nincs hatás

(életképesség)

nincs hatás

(életképesség)

Verapamil Ca2+ nincs hatás -csatorna gátló nincs hatás

64

Ezen alfejezetben ismertetett eredményeinket összefoglalva kijelenthetjük, hogy

sikeresen létrehoztunk és jellemeztünk egy olyan modellrendszert, amely alkalmas az

ABCA1 plazmamembrán szintjének kimutatására. Létrehoztunk olyan sejtvonalakat,

amelyek stabilan expresszálják a működőképes és az inaktív ABCA1 variánsokat. A

beépített extracelluláris HA-epitóp segítségével követtük az ABCA1 sejtfelszíni

expresszióját áramlási citométerrel és konfokális mikroszkóppal is. Az ABCA1

szállítását és degradációját ismerten szabályzó anyagok használatával (BFA és ALLN)

bizonyítottuk, hogy a létrehozott kísérleti rendszer megbízhatóan alkalmazható

különféle anyagok a fehérje sejtfelszíni megjelenésére való hatásának vizsgálatára.

Tanulmányozva több ismerten koleszterinszint csökkentő vegyület, pl. az atorvasztatin

és a niacin, továbbá néhány kálcium-csatorna blokkoló hatóanyag, pl. a nifedipin és a

verapamil hatását azt tapasztaltuk, hogy nem befolyásolják az ABCA1 plazmamembrán

expresszióját. Vizsgáltunk olyan anyagokat is, amelyekről korábban kimutatták, hogy

befolyásolják az ABCA1 fehérje plazmamembrán szintjét és működését, pl. a

ciklosporin A és a gliburid. Eredményeink szerint, mely alátámasztja mások

vizsgálatait, az előbbi növeli, az utóbbi pedig nem befolyásolja a fehérje

plazmamembrán megjelenését. Az ezetimibnek, egy koleszterin bélből történő

felszívódását gátló gyógyszernek, az ABCA1-re gyakorolt új hatását sikerült

azonosítanunk. Modellsejtjeinkben ez a vegyület csökkentette a működőképes ABCA1

sejtfelszíni expresszióját, míg az inaktív fehérje sejtfelszíni megjelenésében semmilyen

változást nem okozott.

A többféle koleszterinszint-csökkentő vagy HDL-szint növelő gyógyszerek és

egyéb vegyületek hatását megvizsgálva ezen eredményeinket cikkben közöltük (2.

közlemény). Mindezek alapján kijelenthetjük, hogy rendszerünk újszerű eszköz az

ABCA1 sejten belüli sorsának tanulmányozására, lehetőséget adva az ABCA1

működését szabályzó új vegyületek felfedezésére.

65

5. KÖVETKEZTETÉSEK

Munkánk során a humán ABCA1 fehérje működésének többrétű vizsgálatát

végeztük. Elsőként közöltünk olyan eredményeket, amelyek összekapcsolnak egy

vérzékenységi betegséget az ABCA1 fehérje működésével. Ezen kívül egy kvantitatív

in vitro sejtes modellrendszerrel újszerű módon vizsgáltuk ismert gyógyszer-

hatóanyagok hatásmechanizmusát az ABCA1 sejtfelszíni megjelenésére.

1. Az ABCA1 fehérje a Ca2+

4. Modellsejtjeinkben koleszterinszint csökkentő és HDL-szint növelő anyagok és

egyéb vegyületek hatását vizsgáltuk az ABCA1 sejtfelszíni megjelenésére. Sikerrel

azonosítottuk az ezetimib, egy ismert bélből való koleszterin felszívódást gátló

gyógyszer, hatását az ABCA1 fehérjére. Ezek alapján arra következtetünk, hogy

tesztrendszerünk alkalmazásával új és részletes ismereteket szerezhetünk már ismert

gyógyszerekről, vagy lehetőségünk nyílhat az ABCA1 működését szabályzó új anyagok

felfedezésére.

-indukált PS sejtfelszíni kifordulásában betöltött

szerepét vizsgálva megállapítottuk, hogy az ABCA1 expressziója helyreállította Scott

B-sejtekben a hibás PS kifordulást. Ezen eredményeinkkel a fehérje normális és kóros

működéséről új és jelentős ismereteket szereztünk.

2. HA-jelölt mutáns ABCA1 variánsok segítségével tovább vizsgáltuk az ABCA1

fehérje szerepét a gyors PS kifordulásban. Megállapítottuk, hogy a Scott beteg sejtjeire

jellemző hibás PS transzlokációt csak a vt HA-ABCA1 jelenléte hozza helyre, az

inaktív mutánsok nem javítják ki ezt a hibás működést. Egészséges B-sejtekben a

mutáns variánsok nem voltak domináns negatív hatással erre a folyamatra. Kísérleteink,

melyekkel a koleszterin töltés hatását vizsgáltuk a PS kifordulásra azt mutatták, hogy a

PS transzlokáció jelenségét valamilyen módon befolyásolja a plazmamembrán

koleszterin összetétele. Azonban e folyamat és a PS transzlokáció kapcsolatának

tisztázása még további vizsgálatokat igényel.

3. Az ABCA1 plazmamembrán expressziójának követésére létrehoztunk egy

modellrendszert. Az ABCA1 sejten belüli szállítását és lebomlását befolyásoló anyagok

felhasználásával bemutattuk, hogy a létrehozott tesztrendszer alkalmas az ABCA1

sejtfelszíni megjelenésének kvantitatív vizsgálatára.

66

6. ÖSSZEFOGLALÁS

Az ABCA1 membránfehérje a lipidanyagcsere egyik kulcsfontosságú szereplője.

A reverz koleszterin transzportfolyamatok első lépéseként az ABCA1 részt vesz a

koleszterin és a foszfolipidek apolipoproteinekkel való kölcsönhatásában, a HDL

részecskék létrehozásában és a felesleges koleszterin sejtekből történő eltávolításban.

Mutációi által okozott Tangier betegségben kimutatták, hogy a fehérje hiánya vagy

működésképtelensége HDL hiánybetegséget, hiperkoleszterinémiát, makrofágokban

koleszterin felhalmozódást és rendszerint érelmeszesedést okoz. A fehérje működésének

hiánya nemcsak a koleszterin anyagcsere zavarait, hanem csökkent fagocitózist és

trombocita funkciókat is okoz, feltételezhetően a sejtfelszíni foszfatidilszerin

kifordulásának befolyásolása révén. Munkám elsődleges célja az ABCA1

működésének, sejtfelszíni megjelenésének és szabályozásának vizsgálata volt in vitro

modellrendszerekben.

Munkánk során tanulmányoztuk az ABCA1 fehérje szerepét a foszfatidilszerin

sejtfelszíni kifordulásában. Vizsgáltuk a vad típusú és az inaktív fehérje variánsok

valamint egy ritka vérzékenységi rendellenségben, Scott betegségben szenvedő

páciensben azonosított ABCA1 mutáció hatását e folyamatokra. Kísérleteink

megmutatták, hogy a Scott betegre jellemző fenotípust, a hibás foszfatidilszerin

transzlokációt a működőképes ABCA1 helyreállítja. Ezen eredményünkkel elsőként

igazoltuk az ABCA1 fehérje szerepét a gyors foszfatidilszerin kifordulásban és

összefüggést mutattunk ki egy vérzékenységi betegség és az ABCA1 működése között.

Ezen felül tanulmányoztuk az ABCA1 fehérje szállításának és sejtfelszíni

expressziójának szabályozását, mely során a fehérje sejtfelszíni megjelenésének

követésére alkalmas tesztrendszert hoztunk létre. Modellsejtjeinkben koleszterinszint

csökkentő és HDL-szint növelő anyagok hatását vizsgáltuk. Ismert gyógyszerek, pl. az

ezetimib ABCA1-re gyakorolt új hatását sikerült így azonosítanunk. Ezen

eredményeink azt mutatják, hogy a létrehozott modellrendszer újszerű és megbízható

eszköz az ABCA1 sejten belüli sorsának tanulmányozására, lehetőséget adva az

ABCA1 működését szabályzó új vegyületek felfedezésére.

67

7. SUMMARY

The ABCA1 membrane protein plays a pivotal role in cellular lipid homeostasis.

As an initial step of the reverse cholesterol transport pathway ABCA1 participates in the

interactions of amphiphilic apolipoproteins with cholesterol and phospholipids to

generate nascent HDL particles, thus removing excess cellular cholesterol. Mutations in

ABCA1 cause Tangier disease, a disorder characterized by HDL deficiency,

hypercholesterolemia, cholesterol deposition in macrophages, and premature

atherosclerosis. The dysfunction of ABCA1 leads not only to disturbed cholesterol

homeostasis but also to impaired phagocytosis and platelet functions presumably

through mediating exofacial exposure of phosphatidylserine. The major goal of my

study was to acquire new insight into the function, cell surface expression and

regulation of ABCA1 by using variuos in vitro model systems.

Investigating the role of ABCA1 in cell surface translocation of

phosphatidylserine, we examined the effect of the wild type ABCA1 and a mutant

variant carrying a missens mutation indentified in a patient with Scott syndrome, a rare

bleeding disorder. Our results revealed that expression of wild type ABCA1 restored the

defective phosphatidylserine translocation, a phenotype observed in the particular Scott

syndrome patient. This is the first demonstration of the contribution of ABCA1 in the

cell surface exposure of phosphatidylserine. Our results confirm the association between

ABCA1 dysfunction and a bleeding disorder. To investigate the regulation of trafficking

and cell surface expression of ABCA1 we developed a model system which is suitable

for monitoring the plasma membrane level of the protein. By using these model cells the

effects of several pharmaceuticals with known cholesterol-lowering or HDL level-

raising effects were tested. This approach revealed unknown effect of several drugs,

including ezetimibe, on ABCA1. Our findings demonstrate the applicability of a novel

and reliable model system for studying cellular routing of ABCA1, opening up new

opportunities to identify unknown interaction of drugs with this key transporter of

cholesterol metabolism.

68

8. IRODALOMJEGYZÉK

1. Higgins, C.F., Abc transporters: From microorganisms to man. Annu Rev Cell

Biol, 1992. 8: p. 67-113.

2. Hyde, S.C., P. Emsley, M.J. Hartshorn, M.M. Mimmack, U. Gileadi, S.R.

Pearce, M.P. Gallagher, D.R. Gill, R.E. Hubbard,C.F. Higgins, Structural model

of atp-binding proteins associated with cystic fibrosis, multidrug resistance and

bacterial transport. Nature, 1990. 346(6282): p. 362-5.

3. Dean, M., A. Rzhetsky,R. Allikmets, The human atp-binding cassette (abc)

transporter superfamily. Genome Res, 2001. 11(7): p. 1156-66.

4. Tusnady, G.E., B. Sarkadi, I. Simon,A. Varadi, Membrane topology of human

abc proteins. FEBS Lett, 2006. 580(4): p. 1017-22.

5. Takahashi, K., Y. Kimura, K. Nagata, A. Yamamoto, M. Matsuo,K. Ueda, Abc

proteins: Key molecules for lipid homeostasis. Med Mol Morphol, 2005. 38(1):

p. 2-12.

6. Stefkova, J., R. Poledne,J.A. Hubacek, Atp-binding cassette (abc) transporters in

human metabolism and diseases. Physiol Res, 2004. 53(3): p. 235-43.

7. Brooks-Wilson, A., M. Marcil, S.M. Clee, L.H. Zhang, K. Roomp, M. van Dam,

L. Yu, C. Brewer, J.A. Collins, H.O. Molhuizen, O. Loubser, B.F. Ouelette, K.

Fichter, K.J. Ashbourne-Excoffon, C.W. Sensen, S. Scherer, S. Mott, M. Denis,

D. Martindale, J. Frohlich, K. Morgan, B. Koop, S. Pimstone, J.J. Kastelein, J.

Genest, Jr.,M.R. Hayden, Mutations in abc1 in tangier disease and familial high-

density lipoprotein deficiency. Nat Genet, 1999. 22(4): p. 336-45.

8. Lawn, R.M., D.P. Wade, M.R. Garvin, X. Wang, K. Schwartz, J.G. Porter, J.J.

Seilhamer, A.M. Vaughan,J.F. Oram, The tangier disease gene product abc1

controls the cellular apolipoprotein-mediated lipid removal pathway. J Clin

Invest, 1999. 104(8): p. R25-31.

9. Rust, S., M. Rosier, H. Funke, J. Real, Z. Amoura, J.C. Piette, J.F. Deleuze, H.B.

Brewer, N. Duverger, P. Denefle,G. Assmann, Tangier disease is caused by

mutations in the gene encoding atp-binding cassette transporter 1. Nat Genet,

1999. 22(4): p. 352-5.

69

10. Rust, S., M. Walter, H. Funke, A. von Eckardstein, P. Cullen, H.Y. Kroes, R.

Hordijk, J. Geisel, J. Kastelein, H.O. Molhuizen, M. Schreiner, A. Mischke,

H.W. Hahmann,G. Assmann, Assignment of tangier disease to chromosome

9q31 by a graphical linkage exclusion strategy. Nat Genet, 1998. 20(1): p. 96-8.

11. Mata, N.L., J. Weng,G.H. Travis, Biosynthesis of a major lipofuscin fluorophore

in mice and humans with abcr-mediated retinal and macular degeneration. Proc

Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(13): p. 7154-9.

12. Sun, H., R.S. Molday,J. Nathans, Retinal stimulates atp hydrolysis by purified

and reconstituted abcr, the photoreceptor-specific atp-binding cassette

transporter responsible for stargardt disease. J Biol Chem, 1999. 274(12): p.

8269-81.

13. Weng, J., N.L. Mata, S.M. Azarian, R.T. Tzekov, D.G. Birch,G.H. Travis,

Insights into the function of rim protein in photoreceptors and etiology of

stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell, 1999. 98(1):

p. 13-23.

14. Yamano, G., H. Funahashi, O. Kawanami, L.X. Zhao, N. Ban, Y. Uchida, T.

Morohoshi, J. Ogawa, S. Shioda,N. Inagaki, Abca3 is a lamellar body membrane

protein in human lung alveolar type ii cells. FEBS Lett, 2001. 508(2): p. 221-5.

15. Nagata, K., A. Yamamoto, N. Ban, A.R. Tanaka, M. Matsuo, N. Kioka, N.

Inagaki,K. Ueda, Human abca3, a product of a responsible gene for abca3 for

fatal surfactant deficiency in newborns, exhibits unique atp hydrolysis activity

and generates intracellular multilamellar vesicles. Biochem Biophys Res

Commun, 2004. 324(1): p. 262-8.

16. Toda, Y., R. Aoki, Y. Ikeda, Y. Azuma, N. Kioka, M. Matsuo, M. Sakamoto, S.

Mori, M. Fukumoto,K. Ueda, Detection of abca7-positive cells in salivary

glands from patients with sjogren's syndrome. Pathol Int, 2005. 55(10): p. 639-

43.

17. Wang, N., D. Lan, M. Gerbod-Giannone, P. Linsel-Nitschke, A.W. Jehle, W.

Chen, L.O. Martinez,A.R. Tall, Atp-binding cassette transporter a7 (abca7)

binds apolipoprotein a-i and mediates cellular phospholipid but not cholesterol

efflux. J Biol Chem, 2003. 278(44): p. 42906-12.

70

18. Linsel-Nitschke, P., A.W. Jehle, J. Shan, G. Cao, D. Bacic, D. Lan, N.

Wang,A.R. Tall, Potential role of abca7 in cellular lipid efflux to apoa-i. J Lipid

Res, 2005. 46(1): p. 86-92.

19. Harangi, M., W.E. Kaminski, M. Fleck, E. Orso, M. Zeher, E. Kiss, Z.

Szekanecz, E. Zilahi, J. Marienhagen, C. Aslanidis, G. Paragh, A.I. Bolstad, R.

Jonsson,G. Schmitz, Homozygosity for the 168his variant of the minor

histocompatibility antigen ha-1 is associated with reduced risk of primary

sjogren's syndrome. Eur J Immunol, 2005. 35(1): p. 305-17.

20. Abe-Dohmae, S., Y. Ikeda, M. Matsuo, M. Hayashi, K. Okuhira, K. Ueda,S.

Yokoyama, Human abca7 supports apolipoprotein-mediated release of cellular

cholesterol and phospholipid to generate high density lipoprotein. J Biol Chem,

2004. 279(1): p. 604-11.

21. Akiyama, M., Y. Sugiyama-Nakagiri, K. Sakai, J.R. McMillan, M. Goto, K.

Arita, Y. Tsuji-Abe, N. Tabata, K. Matsuoka, R. Sasaki, D. Sawamura,H.

Shimizu, Mutations in lipid transporter abca12 in harlequin ichthyosis and

functional recovery by corrective gene transfer. J Clin Invest, 2005. 115(7): p.

1777-84.

22. Kelsell, D.P., E.E. Norgett, H. Unsworth, M.T. Teh, T. Cullup, C.A. Mein, P.J.

Dopping-Hepenstal, B.A. Dale, G. Tadini, P. Fleckman, K.G. Stephens, V.P.

Sybert, S.B. Mallory, B.V. North, D.R. Witt, E. Sprecher, A.E. Taylor, A.

Ilchyshyn, C.T. Kennedy, H. Goodyear, C. Moss, D. Paige, J.I. Harper, B.D.

Young, I.M. Leigh, R.A. Eady,E.A. O'Toole, Mutations in abca12 underlie the

severe congenital skin disease harlequin ichthyosis. Am J Hum Genet, 2005.

76(5): p. 794-803.

23. Lefevre, C., S. Audebert, F. Jobard, B. Bouadjar, H. Lakhdar, O. Boughdene-

Stambouli, C. Blanchet-Bardon, R. Heilig, M. Foglio, J. Weissenbach, M.

Lathrop, J.F. Prud'homme,J. Fischer, Mutations in the transporter abca12 are

associated with lamellar ichthyosis type 2. Hum Mol Genet, 2003. 12(18): p.

2369-78.

24. Luciani, M.F., F. Denizot, S. Savary, M.G. Mattei,G. Chimini, Cloning of two

novel abc transporters mapping on human chromosome 9. Genomics, 1994.

21(1): p. 150-9.

71

25. Bodzioch, M., E. Orso, J. Klucken, T. Langmann, A. Bottcher, W. Diederich,

W. Drobnik, S. Barlage, C. Buchler, M. Porsch-Ozcurumez, W.E. Kaminski,

H.W. Hahmann, K. Oette, G. Rothe, C. Aslanidis, K.J. Lackner,G. Schmitz, The

gene encoding atp-binding cassette transporter 1 is mutated in tangier disease.

Nat Genet, 1999. 22(4): p. 347-51.

26. Schmitz, G., W.E. Kaminski,E. Orso, Abc transporters in cellular lipid

trafficking. Curr Opin Lipidol, 2000. 11(5): p. 493-501.

27. Timmins, J.M., J.Y. Lee, E. Boudyguina, K.D. Kluckman, L.R. Brunham, A.

Mulya, A.K. Gebre, J.M. Coutinho, P.L. Colvin, T.L. Smith, M.R. Hayden, N.

Maeda,J.S. Parks, Targeted inactivation of hepatic abca1 causes profound

hypoalphalipoproteinemia and kidney hypercatabolism of apoa-i. J Clin Invest,

2005. 115(5): p. 1333-42.

28. Wellington, C.L., L.R. Brunham, S. Zhou, R.R. Singaraja, H. Visscher, A.

Gelfer, C. Ross, E. James, G. Liu, M.T. Huber, Y.Z. Yang, R.J. Parks, A. Groen,

J. Fruchart-Najib,M.R. Hayden, Alterations of plasma lipids in mice via

adenoviral-mediated hepatic overexpression of human abca1. J Lipid Res, 2003.

44(8): p. 1470-80.

29. Basso, F., L. Freeman, C.L. Knapper, A. Remaley, J. Stonik, E.B. Neufeld, T.

Tansey, M.J. Amar, J. Fruchart-Najib, N. Duverger, S. Santamarina-Fojo,H.B.

Brewer, Jr., Role of the hepatic abca1 transporter in modulating intrahepatic

cholesterol and plasma hdl cholesterol concentrations. J Lipid Res, 2003. 44(2):

p. 296-302.

30. Wellington, C.L., E.K. Walker, A. Suarez, A. Kwok, N. Bissada, R. Singaraja,

Y.Z. Yang, L.H. Zhang, E. James, J.E. Wilson, O. Francone, B.M.

McManus,M.R. Hayden, Abca1 mrna and protein distribution patterns predict

multiple different roles and levels of regulation. Lab Invest, 2002. 82(3): p. 273-

83.

31. Orso, E., C. Broccardo, W.E. Kaminski, A. Bottcher, G. Liebisch, W. Drobnik,

A. Gotz, O. Chambenoit, W. Diederich, T. Langmann, T. Spruss, M.F. Luciani,

G. Rothe, K.J. Lackner, G. Chimini,G. Schmitz, Transport of lipids from golgi

to plasma membrane is defective in tangier disease patients and abc1-deficient

mice. Nat Genet, 2000. 24(2): p. 192-6.

72

32. Ohama, T., K. Hirano, Z. Zhang, R. Aoki, K. Tsujii, Y. Nakagawa-Toyama, K.

Tsukamoto, C. Ikegami, A. Matsuyama, M. Ishigami, N. Sakai, H. Hiraoka, K.

Ueda, S. Yamashita,Y. Matsuzawa, Dominant expression of atp-binding cassette

transporter-1 on basolateral surface of caco-2 cells stimulated by lxr/rxr ligands.

Biochem Biophys Res Commun, 2002. 296(3): p. 625-30.

33. Tanaka, A.R., S. Abe-Dohmae, T. Ohnishi, R. Aoki, G. Morinaga, K. Okuhira,

Y. Ikeda, F. Kano, M. Matsuo, N. Kioka, T. Amachi, M. Murata, S.

Yokoyama,K. Ueda, Effects of mutations of abca1 in the first extracellular

domain on subcellular trafficking and atp binding/hydrolysis. J Biol Chem,

2003. 278(10): p. 8815-9.

34. Santamarina-Fojo, S., A.T. Remaley, E.B. Neufeld,H.B. Brewer, Jr., Regulation

and intracellular trafficking of the abca1 transporter. J Lipid Res, 2001. 42(9): p.

1339-45.

35. Neufeld, E.B., A.T. Remaley, S.J. Demosky, J.A. Stonik, A.M. Cooney, M.

Comly, N.K. Dwyer, M. Zhang, J. Blanchette-Mackie, S. Santamarina-

Fojo,H.B. Brewer, Jr., Cellular localization and trafficking of the human abca1

transporter. J Biol Chem, 2001. 276(29): p. 27584-90.

36. Takahashi, Y.,J.D. Smith, Cholesterol efflux to apolipoprotein ai involves

endocytosis and resecretion in a calcium-dependent pathway. Proc Natl Acad

Sci U S A, 1999. 96(20): p. 11358-63.

37. Denis, M., B. Haidar, M. Marcil, M. Bouvier, L. Krimbou,J. Genest, Jr.,

Molecular and cellular physiology of apolipoprotein a-i lipidation by the atp-

binding cassette transporter a1 (abca1). J Biol Chem, 2004. 279(9): p. 7384-94.

38. Liu, L., A.E. Bortnick, M. Nickel, P. Dhanasekaran, P.V. Subbaiah, S. Lund-

Katz, G.H. Rothblat,M.C. Phillips, Effects of apolipoprotein a-i on atp-binding

cassette transporter a1-mediated efflux of macrophage phospholipid and

cholesterol: Formation of nascent high density lipoprotein particles. J Biol

Chem, 2003. 278(44): p. 42976-84.

39. Wang, N., D.L. Silver, P. Costet,A.R. Tall, Specific binding of apoa-i, enhanced

cholesterol efflux, and altered plasma membrane morphology in cells expressing

abc1. J Biol Chem, 2000. 275(42): p. 33053-8.

73

40. Fitzgerald, M.L., A.L. Morris, A. Chroni, A.J. Mendez, V.I. Zannis,M.W.

Freeman, Abca1 and amphipathic apolipoproteins form high-affinity molecular

complexes required for cholesterol efflux. J Lipid Res, 2004. 45(2): p. 287-94.

41. Oram, J.F., R.M. Lawn, M.R. Garvin,D.P. Wade, Abca1 is the camp-inducible

apolipoprotein receptor that mediates cholesterol secretion from macrophages. J

Biol Chem, 2000. 275(44): p. 34508-11.

42. Vedhachalam, C., A.B. Ghering, W.S. Davidson, S. Lund-Katz, G.H.

Rothblat,M.C. Phillips, Abca1-induced cell surface binding sites for apoa-i.

Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007. 27(7): p. 1603-9.

43. Rigot, V., Y. Hamon, O. Chambenoit, M. Alibert, N. Duverger,G. Chimini,

Distinct sites on abca1 control distinct steps required for cellular release of

phospholipids. J Lipid Res, 2002. 43(12): p. 2077-86.

44. Vaughan, A.M.,J.F. Oram, Abca1 redistributes membrane cholesterol

independent of apolipoprotein interactions. J Lipid Res, 2003. 44(7): p. 1373-80.

45. Cavelier, C., I. Lorenzi, L. Rohrer,A. von Eckardstein, Lipid efflux by the atp-

binding cassette transporters abca1 and abcg1. Biochim Biophys Acta, 2006.

1761(7): p. 655-66.

46. Neufeld, E.B., J.A. Stonik, S.J. Demosky, Jr., C.L. Knapper, C.A. Combs, A.

Cooney, M. Comly, N. Dwyer, J. Blanchette-Mackie, A.T. Remaley, S.

Santamarina-Fojo,H.B. Brewer, Jr., The abca1 transporter modulates late

endocytic trafficking: Insights from the correction of the genetic defect in

tangier disease. J Biol Chem, 2004. 279(15): p. 15571-8.

47. Denis, M., Y.D. Landry,X. Zha, Atp-binding cassette a1-mediated lipidation of

apolipoprotein a-i occurs at the plasma membrane and not in the endocytic

compartments. J Biol Chem, 2008. 283(23): p. 16178-86.

48. Tam, S.P., L. Mok, G. Chimini, M. Vasa,R.G. Deeley, Abca1 mediates high-

affinity uptake of 25-hydroxycholesterol by membrane vesicles and rapid efflux

of oxysterol by intact cells. Am J Physiol Cell Physiol, 2006. 291(3): p. C490-

502.

49. Hamon, Y., C. Broccardo, O. Chambenoit, M.F. Luciani, F. Toti, S. Chaslin,

J.M. Freyssinet, P.F. Devaux, J. McNeish, D. Marguet,G. Chimini, Abc1

74

promotes engulfment of apoptotic cells and transbilayer redistribution of

phosphatidylserine. Nat Cell Biol, 2000. 2(7): p. 399-406.

50. Hamon, Y., O. Chambenoit,G. Chimini, Abca1 and the engulfment of apoptotic

cells. Biochim Biophys Acta, 2002. 1585(2-3): p. 64-71.

51. Zwaal, R.F., P. Comfurius,E.M. Bevers, Surface exposure of phosphatidylserine

in pathological cells. Cell Mol Life Sci, 2005. 62(9): p. 971-88.

52. Savill, J., I. Dransfield, C. Gregory,C. Haslett, A blast from the past: Clearance

of apoptotic cells regulates immune responses. Nat Rev Immunol, 2002. 2(12):

p. 965-75.

53. Pohl, A., P.F. Devaux,A. Herrmann, Function of prokaryotic and eukaryotic abc

proteins in lipid transport. Biochim Biophys Acta, 2005. 1733(1): p. 29-52.

54. Zwaal, R.F., P. Comfurius,E.M. Bevers, Scott syndrome, a bleeding disorder

caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys

Acta, 2004. 1636(2-3): p. 119-28.

55. Albrecht, C., J.H. McVey, J.I. Elliott, A. Sardini, I. Kasza, A.D. Mumford, R.P.

Naoumova, E.G. Tuddenham, K. Szabo,C.F. Higgins, A novel missense

mutation in abca1 results in altered protein trafficking and reduced

phosphatidylserine translocation in a patient with scott syndrome. Blood, 2005.

106(2): p. 542-9.

56. Azzaria, M., E. Schurr,P. Gros, Discrete mutations introduced in the predicted

nucleotide-binding sites of the mdr1 gene abolish its ability to confer multidrug

resistance. Mol Cell Biol, 1989. 9(12): p. 5289-97.

57. Hou, Y., L. Cui, J.R. Riordan,X. Chang, Allosteric interactions between the two

non-equivalent nucleotide binding domains of multidrug resistance protein

mrp1. J Biol Chem, 2000. 275(27): p. 20280-7.

58. Mechetner, E.B., B. Schott, B.S. Morse, W.D. Stein, T. Druley, K.A. Davis, T.

Tsuruo,I.B. Roninson, P-glycoprotein function involves conformational

transitions detectable by differential immunoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S

A, 1997. 94(24): p. 12908-13.

59. Muller, M., E. Bakos, E. Welker, A. Varadi, U.A. Germann, M.M. Gottesman,

B.S. Morse, I.B. Roninson,B. Sarkadi, Altered drug-stimulated atpase activity in

75

mutants of the human multidrug resistance protein. J Biol Chem, 1996. 271(4):

p. 1877-83.

60. Ozvegy, C., A. Varadi,B. Sarkadi, Characterization of drug transport, atp

hydrolysis, and nucleotide trapping by the human abcg2 multidrug transporter.

Modulation of substrate specificity by a point mutation. J Biol Chem, 2002.

277(50): p. 47980-90.

61. Chambenoit, O., Y. Hamon, D. Marguet, H. Rigneault, M. Rosseneu,G.

Chimini, Specific docking of apolipoprotein a-i at the cell surface requires a

functional abca1 transporter. J Biol Chem, 2001. 276(13): p. 9955-60.

62. Wang, N., D.L. Silver, C. Thiele,A.R. Tall, Atp-binding cassette transporter a1

(abca1) functions as a cholesterol efflux regulatory protein. J Biol Chem, 2001.

276(26): p. 23742-7.

63. Le Goff, W., P. Zheng, G. Brubaker,J.D. Smith, Identification of the camp-

responsive enhancer of the murine abca1 gene: Requirement for creb1 and

stat3/4 elements. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006. 26(3): p. 527-33.

64. Venkateswaran, A., B.A. Laffitte, S.B. Joseph, P.A. Mak, D.C. Wilpitz, P.A.

Edwards,P. Tontonoz, Control of cellular cholesterol efflux by the nuclear

oxysterol receptor lxr alpha. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(22): p. 12097-

102.

65. Murthy, S., E. Born, S.N. Mathur,F.J. Field, Lxr/rxr activation enhances

basolateral efflux of cholesterol in caco-2 cells. J Lipid Res, 2002. 43(7): p.

1054-64.

66. Langmann, T., M. Porsch-Ozcurumez, S. Heimerl, M. Probst, C. Moehle, M.

Taher, H. Borsukova, D. Kielar, W.E. Kaminski, E. Dittrich-Wengenroth,G.

Schmitz, Identification of sterol-independent regulatory elements in the human

atp-binding cassette transporter a1 promoter: Role of sp1/3, e-box binding

factors, and an oncostatin m-responsive element. J Biol Chem, 2002. 277(17): p.

14443-50.

67. Costet, P., F. Lalanne, M.C. Gerbod-Giannone, J.R. Molina, X. Fu, E.G. Lund,

L.J. Gudas,A.R. Tall, Retinoic acid receptor-mediated induction of abca1 in

macrophages. Mol Cell Biol, 2003. 23(21): p. 7756-66.

76

68. Panousis, C.G.,S.H. Zuckerman, Interferon-gamma induces downregulation of

tangier disease gene (atp-binding-cassette transporter 1) in macrophage-derived

foam cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000. 20(6): p. 1565-71.

69. Panousis, C.G., G. Evans,S.H. Zuckerman, Tgf-beta increases cholesterol efflux

and abc-1 expression in macrophage-derived foam cells: Opposing the effects of

ifn-gamma. J Lipid Res, 2001. 42(5): p. 856-63.

70. Lusis, A.J., Atherosclerosis. Nature, 2000. 407(6801): p. 233-41.

71. Martinez, L.O., B. Agerholm-Larsen, N. Wang, W. Chen,A.R. Tall,

Phosphorylation of a pest sequence in abca1 promotes calpain degradation and is

reversed by apoa-i. J Biol Chem, 2003. 278(39): p. 37368-74.

72. Wang, N., W. Chen, P. Linsel-Nitschke, L.O. Martinez, B. Agerholm-Larsen,

D.L. Silver,A.R. Tall, A pest sequence in abca1 regulates degradation by calpain

protease and stabilization of abca1 by apoa-i. J Clin Invest, 2003. 111(1): p. 99-

107.

73. Arakawa, R.,S. Yokoyama, Helical apolipoproteins stabilize atp-binding cassette

transporter a1 by protecting it from thiol protease-mediated degradation. J Biol

Chem, 2002. 277(25): p. 22426-9.

74. See, R.H., R.A. Caday-Malcolm, R.R. Singaraja, S. Zhou, A. Silverston, M.T.

Huber, J. Moran, E.R. James, R. Janoo, J.M. Savill, V. Rigot, L.H. Zhang, M.

Wang, G. Chimini, C.L. Wellington, S.R. Tafuri,M.R. Hayden, Protein kinase a

site-specific phosphorylation regulates atp-binding cassette a1 (abca1)-mediated

phospholipid efflux. J Biol Chem, 2002. 277(44): p. 41835-42.

75. Haidar, B., M. Denis, M. Marcil, L. Krimbou,J. Genest, Jr., Apolipoprotein a-i

activates cellular camp signaling through the abca1 transporter. J Biol Chem,

2004. 279(11): p. 9963-9.

76. Roosbeek, S., F. Peelman, A. Verhee, C. Labeur, H. Caster, M.F. Lensink, C.

Cirulli, J. Grooten, C. Cochet, J. Vandekerckhove, A. Amoresano, G. Chimini, J.

Tavernier,M. Rosseneu, Phosphorylation by protein kinase ck2 modulates the

activity of the atp binding cassette a1 transporter. J Biol Chem, 2004. 279(36): p.

37779-88.

77

77. Tang, C., A.M. Vaughan,J.F. Oram, Janus kinase 2 modulates the apolipoprotein

interactions with abca1 required for removing cellular cholesterol. J Biol Chem,

2004. 279(9): p. 7622-8.

78. Drobnik, W., H. Borsukova, A. Bottcher, A. Pfeiffer, G. Liebisch, G.J. Schutz,

H. Schindler,G. Schmitz, Apo ai/abca1-dependent and hdl3-mediated lipid

efflux from compositionally distinct cholesterol-based microdomains. Traffic,

2002. 3(4): p. 268-78.

79. Mendez, A.J., G. Lin, D.P. Wade, R.M. Lawn,J.F. Oram, Membrane lipid

domains distinct from cholesterol/sphingomyelin-rich rafts are involved in the

abca1-mediated lipid secretory pathway. J Biol Chem, 2001. 276(5): p. 3158-66.

80. Landry, Y.D., M. Denis, S. Nandi, S. Bell, A.M. Vaughan,X. Zha, Atp-binding

cassette transporter a1 expression disrupts raft membrane microdomains through

its atpase-related functions. J Biol Chem, 2006. 281(47): p. 36091-101.

81. Witting, S.R., J.N. Maiorano,W.S. Davidson, Ceramide enhances cholesterol

efflux to apolipoprotein a-i by increasing the cell surface presence of atp-binding

cassette transporter a1. J Biol Chem, 2003. 278(41): p. 40121-7.

82. Glaros, E.N., W.S. Kim, C.M. Quinn, J. Wong, I. Gelissen, W. Jessup,B.

Garner, Glycosphingolipid accumulation inhibits cholesterol efflux via the

abca1/apolipoprotein a-i pathway: 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-

propanol is a novel cholesterol efflux accelerator. J Biol Chem, 2005. 280(26):

p. 24515-23.

83. Schachter, M., Strategies for modifying high-density lipoprotein cholesterol: A

role for nicotinic acid. Cardiovasc Drugs Ther, 2005. 19(6): p. 415-22.

84. Sviridov, D., P. Nestel,G. Watts, Statins and metabolism of high density

lipoprotein. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem, 2007. 5(3): p. 215-21.

85. Argmann, C.A., J.Y. Edwards, C.G. Sawyez, C.H. O'Neil, R.A. Hegele, J.G.

Pickering,M.W. Huff, Regulation of macrophage cholesterol efflux through

hydroxymethylglutaryl-coa reductase inhibition: A role for rhoa in abca1-

mediated cholesterol efflux. J Biol Chem, 2005. 280(23): p. 22212-21.

86. Sone, H., H. Shimano, M. Shu, M. Nakakuki, A. Takahashi, M. Sakai, Y.

Sakamoto, T. Yokoo, K. Matsuzaka, H. Okazaki, Y. Nakagawa, K.T. Iida, H.

Suzuki, H. Toyoshima, S. Horiuchi,N. Yamada, Statins downregulate atp-

78

binding-cassette transporter a1 gene expression in macrophages. Biochem

Biophys Res Commun, 2004. 316(3): p. 790-4.

87. Wong, J., C.M. Quinn,A.J. Brown, Statins inhibit synthesis of an oxysterol

ligand for the liver x receptor in human macrophages with consequences for

cholesterol flux. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004. 24(12): p. 2365-71.

88. Wong, J., C.M. Quinn, I.C. Gelissen, W. Jessup,A.J. Brown, The effect of

statins on abca1 and abcg1 expression in human macrophages is influenced by

cellular cholesterol levels and extent of differentiation. Atherosclerosis, 2008.

196(1): p. 180-9.

89. Martin, G., H. Duez, C. Blanquart, V. Berezowski, P. Poulain, J.C. Fruchart, J.

Najib-Fruchart, C. Glineur,B. Staels, Statin-induced inhibition of the rho-

signaling pathway activates pparalpha and induces hdl apoa-i. J Clin Invest,

2001. 107(11): p. 1423-32.

90. Waters, D., J. Lesperance, M. Francetich, D. Causey, P. Theroux, Y.K. Chiang,

G. Hudon, L. Lemarbre, M. Reitman, M. Joyal,et al., A controlled clinical trial

to assess the effect of a calcium channel blocker on the progression of coronary

atherosclerosis. Circulation, 1990. 82(6): p. 1940-53.

91. Suzuki, S., T. Nishimaki-Mogami, N. Tamehiro, K. Inoue, R. Arakawa, S. Abe-

Dohmae, A.R. Tanaka, K. Ueda,S. Yokoyama, Verapamil increases the

apolipoprotein-mediated release of cellular cholesterol by induction of abca1

expression via liver x receptor-independent mechanism. Arterioscler Thromb

Vasc Biol, 2004. 24(3): p. 519-25.

92. Hasegawa, K., S. Wakino, T. Kanda, K. Yoshioka, S. Tatematsu, K. Homma, I.

Takamatsu, N. Sugano,K. Hayashi, Divergent action of calcium channel

blockers on atp-binding cassette protein expression. J Cardiovasc Pharmacol,

2005. 46(6): p. 787-93.

93. Szakacs, G., T. Langmann, C. Ozvegy, E. Orso, G. Schmitz, A. Varadi,B.

Sarkadi, Characterization of the atpase cycle of human abca1: Implications for

its function as a regulator rather than an active transporter. Biochem Biophys

Res Commun, 2001. 288(5): p. 1258-64.

94. Becker, S., S. Wasser, M. Hauses, J.P. Hossle, M.G. Ott, M.C. Dinauer, A.

Ganser, D. Hoelzer, R. Seger,M. Grez, Correction of respiratory burst activity in

79

x-linked chronic granulomatous cells to therapeutically relevant levels after gene

transfer into bone marrow cd34+ cells. Hum Gene Ther, 1998. 9(11): p. 1561-

70.

95. Paszty, K., G. Antalffy, A.R. Penheiter, L. Homolya, R. Padanyi, A. Ilias, A.G.

Filoteo, J.T. Penniston,A. Enyedi, The caspase-3 cleavage product of the plasma

membrane ca2+-atpase 4b is activated and appropriately targeted. Biochem J,

2005. 391(Pt 3): p. 687-92.

96. Tanaka, A.R., Y. Ikeda, S. Abe-Dohmae, R. Arakawa, K. Sadanami, A. Kidera,

S. Nakagawa, T. Nagase, R. Aoki, N. Kioka, T. Amachi, S. Yokoyama,K. Ueda,

Human abca1 contains a large amino-terminal extracellular domain homologous

to an epitope of sjogren's syndrome. Biochem Biophys Res Commun, 2001.

283(5): p. 1019-25.

97. Seres, L., J. Cserepes, N.B. Elkind, D. Torocsik, L. Nagy, B. Sarkadi,L.

Homolya, Functional abcg1 expression induces apoptosis in macrophages and

other cell types. Biochim Biophys Acta, 2008. 1778(10): p. 2378-87.

98. Ujhelly, O., C. Ozvegy, G. Varady, J. Cervenak, L. Homolya, M. Grez, G.

Scheffer, D. Roos, S.E. Bates, A. Varadi, B. Sarkadi,K. Nemet, Application of a

human multidrug transporter (abcg2) variant as selectable marker in gene

transfer to progenitor cells. Hum Gene Ther, 2003. 14(4): p. 403-12.

99. Kiffmeyer, W.R., P.J. Stambrook,M.A. Lieberman, Retroviral mediated gene

transfer in megakaryocytic cell lines. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1994.

30A(11): p. 803-9.

100. Bors, A., P. Ribiczey, G. Koblos, A. Brozik, Z. Ujfaludi, M. Magocsi, A.

Varadi, A. Tordai, T. Kovacs,T. Aranyi, External cell control polymerase chain

reaction: Replacing internal standards with an unbiased strategy for quantitative

polymerase chain reaction normalization. Anal Biochem, 2008. 372(2): p. 261-3.

101. Sarkadi, B., E.M. Price, R.C. Boucher, U.A. Germann,G.A. Scarborough,

Expression of the human multidrug resistance cdna in insect cells generates a

high activity drug-stimulated membrane atpase. J Biol Chem, 1992. 267(7): p.

4854-8.

80

102. Marguet, D., M.F. Luciani, A. Moynault, P. Williamson,G. Chimini, Engulfment

of apoptotic cells involves the redistribution of membrane phosphatidylserine on

phagocyte and prey. Nat Cell Biol, 1999. 1(7): p. 454-6.

103. Alder-Baerens, N., P. Muller, A. Pohl, T. Korte, Y. Hamon, G. Chimini, T.

Pomorski,A. Herrmann, Headgroup-specific exposure of phospholipids in

abca1-expressing cells. J Biol Chem, 2005. 280(28): p. 26321-9.

104. Gedeon, C., J. Behravan, G. Koren,M. Piquette-Miller, Transport of glyburide

by placental abc transporters: Implications in fetal drug exposure. Placenta,

2006. 27(11-12): p. 1096-102.

105. Smith, A.J., A. van Helvoort, G. van Meer, K. Szabo, E. Welker, G. Szakacs, A.

Varadi, B. Sarkadi,P. Borst, Mdr3 p-glycoprotein, a phosphatidylcholine

translocase, transports several cytotoxic drugs and directly interacts with drugs

as judged by interference with nucleotide trapping. J Biol Chem, 2000. 275(31):

p. 23530-9.

106. Hollo, Z., L. Homolya, C.W. Davis,B. Sarkadi, Calcein accumulation as a

fluorometric functional assay of the multidrug transporter. Biochim Biophys

Acta, 1994. 1191(2): p. 384-8.

107. Homolya, L., Z. Hollo, U.A. Germann, I. Pastan, M.M. Gottesman,B. Sarkadi,

Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J

Biol Chem, 1993. 268(29): p. 21493-6.

108. Ozvegy, C., T. Litman, G. Szakacs, Z. Nagy, S. Bates, A. Varadi,B. Sarkadi,

Functional characterization of the human multidrug transporter, abcg2,

expressed in insect cells. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 285(1): p. 111-

7.

109. Zhou, Q., P.J. Sims,T. Wiedmer, Expression of proteins controlling transbilayer

movement of plasma membrane phospholipids in the b lymphocytes from a

patient with scott syndrome. Blood, 1998. 92(5): p. 1707-12.

110. Woehlecke, H., A. Pohl, N. Alder-Baerens, H. Lage,A. Herrmann, Enhanced

exposure of phosphatidylserine in human gastric carcinoma cells overexpressing

the half-size abc transporter bcrp (abcg2). Biochem J, 2003. 376(Pt 2): p. 489-

95.

81

111. Biemans-Oldehinkel, E., M.K. Doeven,B. Poolman, Abc transporter architecture

and regulatory roles of accessory domains. FEBS Lett, 2006. 580(4): p. 1023-35.

112. Bakos, E.,L. Homolya, Portrait of multifaceted transporter, the multidrug

resistance-associated protein 1 (mrp1/abcc1). Pflugers Arch, 2007. 453(5): p.

621-41.

113. Linsdell, P., Mechanism of chloride permeation in the cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator chloride channel. Exp Physiol, 2006.

91(1): p. 123-9.

114. Michelsen, K., H. Yuan,B. Schwappach, Hide and run. Arginine-based

endoplasmic-reticulum-sorting motifs in the assembly of heteromultimeric

membrane proteins. EMBO Rep, 2005. 6(8): p. 717-22.

115. van Meer, G., D. Halter, H. Sprong, P. Somerharju,M.R. Egmond, Abc lipid

transporters: Extruders, flippases, or flopless activators? FEBS Lett, 2006.

580(4): p. 1171-7.

116. Zarubica, A., A.P. Plazzo, M. Stockl, T. Trombik, Y. Hamon, P. Muller, T.

Pomorski, A. Herrmann,G. Chimini, Functional implications of the influence of

abca1 on lipid microenvironment at the plasma membrane: A biophysical study.

Faseb J, 2009. 23(6): p. 1775-85.

117. Telbisz, A., M. Muller, C. Ozvegy-Laczka, L. Homolya, L. Szente, A. Varadi,B.

Sarkadi, Membrane cholesterol selectively modulates the activity of the human

abcg2 multidrug transporter. Biochim Biophys Acta, 2007. 1768(11): p. 2698-

713.

118. Oram, J.F., Atp-binding cassette transporter a1 and cholesterol trafficking. Curr

Opin Lipidol, 2002. 13(4): p. 373-81.

119. Oram, J.F., Molecular basis of cholesterol homeostasis: Lessons from tangier

disease and abca1. Trends Mol Med, 2002. 8(4): p. 168-73.

120. Schmitz, G.,T. Langmann, Structure, function and regulation of the abc1 gene

product. Curr Opin Lipidol, 2001. 12(2): p. 129-40.

121. Bortnick, A.E., G.H. Rothblat, G. Stoudt, K.L. Hoppe, L.J. Royer, J.

McNeish,O.L. Francone, The correlation of atp-binding cassette 1 mrna levels

with cholesterol efflux from various cell lines. J Biol Chem, 2000. 275(37): p.

28634-40.

82

122. Larrede, S., C.M. Quinn, W. Jessup, E. Frisdal, M. Olivier, V. Hsieh, M.J. Kim,

M. Van Eck, P. Couvert, A. Carrie, P. Giral, M.J. Chapman, M. Guerin,W. Le

Goff, Stimulation of cholesterol efflux by lxr agonists in cholesterol-loaded

human macrophages is abca1-dependent but abcg1-independent. Arterioscler

Thromb Vasc Biol, 2009. 29(11): p. 1930-6.

123. Le Goff, W., D.Q. Peng, M. Settle, G. Brubaker, R.E. Morton,J.D. Smith,

Cyclosporin a traps abca1 at the plasma membrane and inhibits abca1-mediated

lipid efflux to apolipoprotein a-i. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004. 24(11):

p. 2155-61.

124. Wang, Y.,J.F. Oram, Unsaturated fatty acids inhibit cholesterol efflux from

macrophages by increasing degradation of atp-binding cassette transporter a1. J

Biol Chem, 2002. 277(7): p. 5692-7.

125. Schwartz, G.G., A.G. Olsson, M.D. Ezekowitz, P. Ganz, M.F. Oliver, D.

Waters, A. Zeiher, B.R. Chaitman, S. Leslie,T. Stern, Effects of atorvastatin on

early recurrent ischemic events in acute coronary syndromes: The miracl study:

A randomized controlled trial. Jama, 2001. 285(13): p. 1711-8.

126. Pedersen, T.R., O. Faergeman, J.J. Kastelein, A.G. Olsson, M.J. Tikkanen, I.

Holme, M.L. Larsen, F.S. Bendiksen, C. Lindahl, M. Szarek,J. Tsai, High-dose

atorvastatin vs usual-dose simvastatin for secondary prevention after myocardial

infarction: The ideal study: A randomized controlled trial. Jama, 2005. 294(19):

p. 2437-45.

127. Davidson, M.H., T. McGarry, R. Bettis, L. Melani, L.J. Lipka, A.P. LeBeaut, R.

Suresh, S. Sun,E.P. Veltri, Ezetimibe coadministered with simvastatin in

patients with primary hypercholesterolemia. J Am Coll Cardiol, 2002. 40(12): p.

2125-34.

128. Guyton, J.R., B.G. Brown, S. Fazio, A. Polis, J.E. Tomassini,A.M. Tershakovec,

Lipid-altering efficacy and safety of ezetimibe/simvastatin coadministered with

extended-release niacin in patients with type iia or type iib hyperlipidemia. J Am

Coll Cardiol, 2008. 51(16): p. 1564-72.

129. Kerzner, B., J. Corbelli, S. Sharp, L.J. Lipka, L. Melani, A. LeBeaut, R. Suresh,

P. Mukhopadhyay,E.P. Veltri, Efficacy and safety of ezetimibe coadministered

83

with lovastatin in primary hypercholesterolemia. Am J Cardiol, 2003. 91(4): p.

418-24.

130. Sudhop, T., D. Lutjohann, A. Kodal, M. Igel, D.L. Tribble, S. Shah, I.

Perevozskaya,K. von Bergmann, Inhibition of intestinal cholesterol absorption

by ezetimibe in humans. Circulation, 2002. 106(15): p. 1943-8.

131. Nieland, T.J., A. Chroni, M.L. Fitzgerald, Z. Maliga, V.I. Zannis, T.

Kirchhausen,M. Krieger, Cross-inhibition of sr-bi- and abca1-mediated

cholesterol transport by the small molecules blt-4 and glyburide. J Lipid Res,

2004. 45(7): p. 1256-65.

9. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

Kasza I, Hegyi Z, Szabó K, Andrikovics H, Német K, Váradi A, Sarkadi B, Homolya L.

Model system for the analysis of cell surface expression of human ABCA1.

BMC Cell Biol. 2009 Dec 21;10:93.

Albrecht C, McVey JH, Elliott JI, Sardini A, Kasza I, Mumford AD, Naoumova RP,

Tuddenham EG, Szabo K, Higgins CF.

A novel missense mutation in ABCA1 results in altered protein trafficking and reduced

phosphatidylserine translocation in a patient with Scott syndrome.

Blood. 2005 Jul 15;106(2):542-9. Epub 2005 Mar 24.

84

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Mindenekelőtt szeretnék köszönetet mondani Szabó Katalinnak a közvetlen szakmai

irányításért, a mindennapi problémák megoldásában nyújtott mérhetetlen és fáradhatatlan

segítségéért. Vezetése alatt tanultam meg szakmánk szeretetét és ismertem meg módszereink

nagy részét. Hálás köszönet barátáságáért.

Szeretnék köszönetet mondani Sarkadi Balázsnak, hogy csoportjában dolgozhatok,

hogy mindig igényes és támogató segítséget jelentett munkám során.

Köszönettel tartozom Homolya Lászlónak a további szakmai irányításért, hogy

tapasztalt és önzetlen türelemmel támogatta munkámat.

Hálás köszönet Hegyi Zoltánnak, aki PhD hallgatóként a legnagyobb arányban vett

részt az itt bemutatott munkák elvégzésében.

Köszönet Váradi Andrásnak figyelmes támogatásáért. Csoportjából hálával tartozom

Bakos Évának és Iliás Attilának a praktikus tanácsokért és a szakmai segítségért. Köszönet

illeti az alapos asszisztensi segítségért Bézsenyi Gyöngyit, Kis Juditot, Andrási Zsuzsit,

Zombori Ilonát és Demeter Györgyit. Köszönetet szeretnék mondani Német Katalinnak, hogy

munkám egy részét a laboratóriumában végezhettem, Újhelly Olgának az alapos és kiváló

tanácsokért, illetve asszisztensüknek Bátkai Mónikának a szakmai segítségért. Köszönet illeti

Tordai Attilát és laboratóriumából Bors Andrást, akik munkámhoz sok ötletet, illetve az

asszisztenseket, akik segítő kezet nyújtottak.

Külön szeretném megköszönni az együtt eltöltött sok-sok órát Cserepes Juditnak és

Brózik Annának. Támogatásuk és jelenlétük nélkül nem lett volna ilyen tartalmas és kedves

ez a pár év.

Végül köszönet egész Családomnak, akik elvárás nélkül támogattak munkám során és

Páromnak, akinek szeretete szárnyakat adott.