A kalciumpermeábilis humán P2X4 és TRPV6

ioncsatornák működése és gátlása

Doktori értekezés

Balázs Bernadett Éva

Semmelweis Egyetem

Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Zsembery Ákos egyetemi docens, Ph.D.

Hivatalos bírálók: Dr. Zelles Tibor egyetemi docens, Ph.D.

Dr. Szentesi Péter tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Tretter László egyetemi tanár, az MTA

doktora

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Riba Pál egyetemi docens, Ph.D.

Dr. Fodor János, Ph.D.

Budapest

2014

1

Tartalomjegyzék

I. Rövidítések jegyzéke………………………………………………………….. 5

II. Bevezetés……………………………………………………………………… 8

II. 1. Az ioncsatornák…………………....................................................... 8

II. 2. Az ATP mint extracelluláris szignálmolekula……………………… 10

II. 3. Az intracelluláris kalcium-homeosztázis…………………………… 11

II. 4. A purinoceptorok…………………………………………………….13

II. 4. 1. P2Y metabotróp receptorok……………………………… 15

II. 4. 2. P2X ionotróp receptorok…………………………………. 15

II. 4. 2. 1. A P2X4 purinerg receptor……………………… 16

II. 5. A TRP fehérjék……………………………………………….……...18

II. 5. 1. TRPV6 csatornák………………………………………… 18

III. Célkitűzések……………………………….………………………….……... 21

IV. Módszerek…………………………………………………………………… 22

IV. 1. Sejttenyésztés……………………………………………………… 22

IV. 2. Konstrukt-készítés…………………………………………………. 22

IV. 2. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 készítése………………………. 22

IV. 2. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 készítése…………………….. 22

IV. 3. Tranziens transzfekció………………………………………..…… 23

IV. 3. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 transzfekciója…………………. 23

IV. 3. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 transzfekciója……………….. 23

IV. 4. Sejtklónok létrehozása…………………………………………….. 23

2

IV. 5. Sejtfelszíni biotiniláció és western blot…………………………… 24

IV. 6. Immunofluoreszcencia……………………………………………... 25

IV. 7. Intracelluláris [Ca2+] mérés..….………………………………........ 25

IV. 7. 1. Az egyes sejtek szintjén történő kalciummérés………… 25

IV. 7. 2. Fluoreszcens intracelluláris [Ca2+] mérés……….............. 26

IV. 7. 3. FLIPR Tetra módszer……………………………………. 27

IV. 8. A Ca2+-belépés vizsgálata mangán „quench” módszer

alkalmazásával…………………………………………………………….. 27

IV. 9. Elektrofiziológia……………………………………………………. 28

IV. 10. Statisztika…………………………………………………………. 28

V. Eredmények………………………………………………………..…………. 30

V. 1. A transzfektált hP2X4 receptorok lokalizációja HEK-293

sejtekben………………………………………………………………….. 30

V. 2. A hP2X4 fehérjék plazmamembránon expresszálódnak……………. 31

V. 3. A hP2X4 receptorok kationpermeábilis ioncsatornaként működnek. 31

V. 4. Az ATP-indukált intracelluláris Ca2+ koncentráció mérése a hP2X4

receptorokat stabilan expresszáló sejtekben……………………………… 33

V. 5. Az 5-BDBD gátolja az ATP-által indukált Ca2+ jeleket a hP2X4

receptorokat stabilan expresszáló sejtekben ……………………………... 37

V. 6. Egyes sejtek szintjén történő [Ca2+] mérés a tranziensen

expresszált hP2X4 receptorokon…………………………………………... 38

V. 6. 1. Az [Ca2+]i -ban bekövetkező ATP-indukált

koncentrációfüggő változás a humán P2X4 receptort expresszáló

és nem-expresszáló sejtekben………..…………………..……….. 38

3

V. 6. 2. Az ATP indukált [Ca2+]i változás vizsgálata kalciumot

tartalmazó és kalcium mentes oldatban, valamint ivermektin

jelenlétében……………………………………………………….. 40

V. 6. 3. Az 5-BDBD és a TNP-ATP dózis-függő gátlása a hP2X4

receptorokat tranziensen expresszáló sejtekben…………………... 42

V. 7. Az 5-BDBD koncentráció-függő gátlásának vizsgálata a hP2X4

receptorokon elektrofiziológiai módszerekkel……………………………. 43

V. 8. Az 5-BDBD kompetitíven gátolja a hP2X4 receptor csatornákat…... 44

V. 9. A hTRPV6 plazmamembrán expressziója HEK-293 sejtekben……. 45

V. 10. A hTRPV6 működése és gátlása…………………………………... 46

V. 10. 1. A hTRPV6 kalciumpermeábilis ioncsatorna…………... 46

V. 10. 2. A 2-APB gátolja a hTRPV6 csatornákon keresztüli

Ca2+ beáramlást …………………………………………………... 47

V. 10. 3. A 2-APB gátolja a hTRPV6 csatornán keresztüli Mn2+

transzportot …….…………….…………………………………… 49

V.11. A hTRPV6 fehérjék citoszól és membrán frakciójának elkülönítése

HEK-293 sejtekben……………………………………………………..... 51

VI. Megbeszélés……………………………………………………….…………. 53

VI.1. P2X4 ioncsatorna…………………………………………………… 53

VI.2. TRPV6 ioncsatorna…………………………………………………. 56

VII. Következtetések……………………………………………………………. 58

VIII. Összefoglalás………………………………………………………………. 59

VIII. 1. Magyar nyelvű összefoglaló……………………………………... 59

VIII. 2. Angol nyelvű összefoglaló……………………………………….. 60

4

IX. Irodalomjegyzék………………………………………….……………….… 61

X. Saját publikációk jegyzéke…………………………………………………... 73

X.1. Az értekezés alapját képező publikációk……………………………. 73

X.2. Egyéb publikációk……………………………………………………73

XI. Köszönetnyilvánítás………………………………………………………… 74

5

I. Rövidítések jegyzéke

ADP: adenozin-difoszfát

AM: acetoxi-metilészter

AMP: adenozin-monofoszfát

AP: alkalikus foszfatáz

ATP: adenozin-trifoszfát

AUC: görbe alatti terület (area under the curve)

5-BDBD: 5-(3-Bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofuro [3,2-e]-1,4

diazepin-2one

BSA: borjú szérumalbumin

calbindin-D28K: az emlős vesében expresszálódó kalcium-kötő fehérje altípus

cAMP: ciklikus adenozin monofoszfát

cGMP: ciklikus guanozin monofoszfát

CaV: feszültségfüggő kalcium csatorna

[Ca2+]: kalciumkoncentráció

[Ca2+]i: intracelluláris Ca2+- koncentráció

CF: cisztás fibrózis

CNT: összekötő csatorna

CRAC: kalcium felszabadulás által aktivált kalcium csatorna

DAG: diacilglicerin

DCT: disztális kanyarulatos csatorna

DMEM: Dulbecco által módosított Eagle médium

DMSO: dimetil-szulfoxid

EC50: félmaximális aktivitáshoz szükséges koncentráció

ECL: erősített kemilumineszcencia (enhanced chemiluminescence)

Ecto-5’-NT: ekto-5’-nukleotidáz

EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav

EGTA: etilénglikol-diaminoetiléter-tetraecetsav

E-NPP: ektonukleotid pirofoszfatáz/foszfodiészteráz

E-NTPD: ektonukleozid trifoszfát difoszfohidroláz

ER: endoplazmás retikulum

6

FBS: fötális borjúszérum

GPCR: G-protein kapcsolt receptor

GTP: guanozin-trifoszfát

GDP: guanozin-difoszfát

HRP: tormaperoxidáz (horseradish-peroxidase)

I: áramerősség

IC50: félhatásos gátló koncentráció

IP3: inozitol 1,4,5-triszfoszfát

IVM: ivermektin

NCKX: Na+-Ca2+-K+-cserélő fehérje

NCX: Na+-Ca2+-cserélő fehérje

nH: Hill-koefficiens

Orai1: kalcium felszabadulás által aktivált kalcium csatorna fehérje 1

pA: pikoamper

PFA: paraformaldehid

PBS: foszfátpuffer

PBST: foszfátpuffer Tween 20-al

PIP: foszfatidilinozitol-4 foszfát

PIP2: foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát

PLC: foszfolipáz C

PMCA: plazmamembrán kalcium ATP-áz

PVDF: polivinilidén-fluorid

P2X4: ionotróp purinerg receptor X4-es típus

RyR: rianodin receptor

ROI: vizsgált terület (region of interest)

RTK: tirozin kináz receptor

SD: szórás (standard deviation)

SDS-PAGE: nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis

SEM: az átlag standard hibája (standard error of the mean)

SERCA: szarko(endo)plazmatikus retikulum Ca2+ ATP-áz

SOC: raktár által vezérelt kalcium csatorna

STIM1: stromal interaction molecule 1

7

TM: transzmembrán

TNP-ATP: 2'-(vagy-3')-O-trinitrofenil ATP

TRPC: tranziens receptor potenciál kanonikus alcsalád

TRPV5: tranziens receptor potenciál vanilloid 5-ös típus

TRPV6: tranziens receptor potenciál vanilloid 6-os típus

UDP: uridin-difoszfát

UTP: uridin-trifoszfát

UTR: nem kódoló szakasz (untranslated region)

8

II. Bevezetés

II. 1. Az ioncsatornák

Az ioncsatornák a sejtmembránt átérő ún. transzmembrán fehérjék, amelyek az ionok

számára átjárható hidrofil bélésű pórusokat képeznek. Az ioncsatornák több alegységből

felépülő ún. multimer fehérjék. A csatornák pórust alkotó alegységei hozzák létre az

ionszelektív pórust, a hozzájuk kapcsolódó járulékos alegységek pedig a csatornák

működését módosítják. A pórusokon keresztül az ionok passzív transzporttal jutnak át a

sejtmembránon. Mivel a transzport sebessége meglehetősen nagy, így másodpercenként

akár 108 ion is átjuthat a csatornán (1). A sejtmembrán egy négyzet mikrométernyi

területén 1-1000 ioncsatorna található, a sejt, valamint a csatorna típusától függően (2).

Az ioncsatornáknak funkcionális szempontból vezető és nem-vezető szerkezeti állapotát

különböztethetjük meg. Vezető állapotban a nyitott csatornán ionok jutnak át a

membránon. A nem-vezető állapotot a csatorna zárt, ill. inaktivált szerkezeti állapota

jelenti. Az ioncsatornák egyes szerkezeti állapotai közötti átmenetet kapuzásnak

nevezzük. A csatornáknak alapvető tulajdonsága a szelektív permeabilitás, ez esetben

egy meghatározott csatorna csak egy, vagy néhány ion számára átjárható. Az

ioncsatornák működése elengedhetetlen a sejtek életének fenntartásában. Sejttípustól

függetlenül alapvető szerepet töltenek be például a nyugalmi membránpotenciál

fenntartásában, az ingerlékeny sejtekben az akciós potenciál kialakításában, valamint a

hámsejtek szekréciós és reabszorpciós folyamataiban. Számos betegség oka egy

meghatározott ioncsatorna csökkent vagy fokozott működése, aminek következtében e

betegségek elnevezésére egy új orvosi szakszó is létrejött: „channelopathies”

(ioncsatorna-betegségek). A kóros működés oka lehet például a csatornát kódoló gén

mutációja, vagy a csatornafehérjék elleni autoantitestek megjelenése (1).

A plazmamembránban található, kation permeábilis ioncsatornákat és azok legfontosabb

élettani szerepét az 1. táblázat foglalja össze (2).

9

1. táblázat. A plazmamembránban található kation csatornák és főbb élettani funkcióik.

Plazmamembrán kation permeábilis

ioncsatornák

Főbb élettani funkciók

K+ csatornák Elektromos jelátvitel

Akciós potenciál repolarizációja

Hiperpolarizáció-által aktivált ciklikus

nukleotid-függő kation csatornák

cAMP- és cGMP- aktivált

„funny áram” a szívben

Ciklikus nukleotid-függő kation csatornák Érző transzdukciós mechanizmusok a

látásban és a szaglásban

Tranziens receptor potenciál (TRP) kation

csatornák

Polimodális szenzoros transzdukciós

folyamatok (fájdalom, viszketés,

hőmérsékletérzékelés, valamint a kémiai,

mechanikai és ozmotikus stressz)

Feszültség-függő Na+ csatornák Akciós potenciál gyors depolarizációjának

kialakítása ideg és izomsejtekben

Feszültség-függő Ca2+ csatornák Transzmitter- és hormonszekréció

stimulálása, valamint az akciós potenciál

depolarizációs fázisának meghosszabbítása

szívizomsejtekben

Ligand-függő kation csatornák Excitatórikus posztszinaptikus potenciál

(EPSP) kialakítása

Glutamát-által aktivált kation csatornák Excitatórikus posztszinaptikus potenciál

(EPSP) és hosszú távú potenciálódás

kialakítása

Purinerg ligand-függő kation csatornák Excitatórikus szinaptikus transzmisszióban

való részvétel, valamint a véralvadás és a

hámsejtek szekréciójának szabályozása

Epiteliális Na+ csatornák Hámsejteken keresztüli Na+ transzport

Raktár-által vezérelt Ca2+ csatornák (Orai) Az intracelluláris Ca2+ raktárak ürülését

követő extracelluláris Ca2+ beáramlás

10

II. 2. Az ATP mint extracelluláris szignálmolekula

Az ATP minden metabolikusan aktív sejtben jelen van. Legnagyobb mennyiségben a

mitokondriális oxidatív foszforiláció során szintetizálódik, ezt követően pedig a

citoplazmában található meg. Az ATP fiziológiás és patológiás körülmények között is

kikerülhet a sejtekből az extracelluláris térbe (3). Az első leírás arról, hogy az

extracelluláris adeninszármazékok biológiai hatással bírnak, még a huszadik század első

felében jelent meg (4). Harminc évvel később azt feltételezték, hogy az ATP

transzmitterként működik a szenzoros neuronokban (5). Ezt követően azonban még több

mint tíz évnek kellett eltelnie ahhoz, hogy Geoffrey Burnstock egyértelműen igazolja,

hogy az ATP részt veszt a sejtek közötti szignalizációban (6). Később a motoros

idegekben (6, 7), majd egyes központi idegrendszeri neuronokban is leírták az ATP-t

mint extracelluláris szignálmolekulát (8). Az intracelluláris ATP koncentráció ([ATP]i ~

3-10 mM) lényegesen meghaladja az extracelluláris ATP koncentrációt. Ennek legfőbb

oka az, hogy amint az ATP elhagyja a sejtet, az ektonukleotidázok gyorsan lebontják.

Az enzimatikus hidrolízis során az ATP foszfátcsoportjai lehasadnak és előbb ADP,

majd AMP és adenozin keletkezik belőle. Az extracelluláris ATP metabolizmusa

különböző ektonukleotidázok révén szabályozódik, melyek az ektonukleozid trifoszfát

difoszfohidroláz (E-NTPD-áz) család és az ektonukleotid pirofoszfatáz/foszfodiészteráz

(E-NPP) család tagjai. Először a nagyenergiájú foszfát csoportot vágja le az

ektonukleotidáz, majd az ekto-5’-nukleotidáz (ecto-5’-NT) és az alkalikus foszfatáz

(AP) katalizálják a nukleotidok adenozinná alakulását (1. ábra). Az extracelluláris ATP

és származékai a purinerg receptorok stimulálása révén számos sejtfunkció

szabályozásában vesznek részt (9).

11

1. ábra. A purinoceptorok extracelluláris ATP-kötése és a reakciótermékek, melyek

ektonukleotidázok által enzimatikus hidrolízis során keletkeznek. (ATP: adenozin-

trifoszfát, ADP: adenozin-difoszfát, AMP: adenozin-monofoszfát, Ecto-5’-NT: ekto-5’-

nukleotidáz, AP: alkalikus foszfatáz, E-NPP: ektonukleotid pirofoszfatáz/foszfodiészteráz, E-

NTPD: ektonukleozid trifoszfát difoszfohidroláz (10). Részleteket ld. a szövegben.

II. 3. Az intracelluláris kalcium-homeosztázis

A kalcium-homeosztázis fenntartása nagyon fontos, hiszen a kalcium számos élettani

folyamatban elengedhetetlen szerepet tölt be. Ezek közé tartozik például az

immunválasz, az izomkontrakció, vagy a hormonszekréció szabályozása. Felnőtt

emberben a kalcium összmennyisége hozzávetőlegesen 1 kg. A teljes kalcium kb. 99%-

a a csontokban található, a test kalciumtartalmának kevesebb mint egy százaléka pedig

az extra- és az intracelluláris térben van jelen (11). A kalcium az egyik legfőbb

másodlagos hírvivő. A kalciumkoncentráció [Ca2+] mintegy tízezerszer magasabb az

endoplazmás retikulumban vagy az extracelluláris térben, mint a citoszólban. A legtöbb

12

sejtben a citoszólikus [Ca2+] 50-100 nM között van, míg az ER-ban és az extracelluláris

folyadékban hozzávetőleg 1,2 mM (12) (2. ábra). Az ER-hoz hasonlóan a

mitokondriumok is millimólos koncentrációban raktároznak Ca2+-ot (13). Az

endoszómák, a Golgi vezikulák (akroszómák), a lizoszómák, a szekretoros granulumok

és a melanoszómák membrán-kapcsolt kompartmentek, melyekből szintén történhet

kalciumkiáramlás (14). A citoplazmatikus [Ca2+] emelkedhet a plazmamembránon át

történő kalciumbelépés révén, valamint az intracelluláris raktárakból történő

kalciumfelszabadulás által, amelynek forrása többnyire az endoplazmás retikulum.

2. ábra. A Ca2+-gradiens fenntartása. A panel: alacsony citoplazmatikus Ca2+-szint

nyugalmi körülmények között. B panel: az alapvető kalciumszabályozási útvonalak.

(NCKX: Na+-Ca2+-K+-cserélő fehérje, NCX: Na+-Ca2+-cserélő fehérje, PMCA: plazmamembrán

kalcium ATP-áz, SERCA: szarko(endo)plazmatikus retikulum Ca2+-ATP-áz, IP3: inozitol

(1,4,5) triszfoszfát, IP3R: inozitol triszfoszfát receptor, RyR: rianodinreceptor, RTK: tirozin

kináz receptor, DAG: 1,2-diacil-glicerol, PLC: foszfolipáz C, Ptdlns: foszfatidilinozitol, PIP:

foszfatidilinozitol-4 foszfát, PIP2: foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát, GPCR: G-fehérje kapcsolt

receptor, GTP: guanozin-trifoszfát, GDP: guanozin-difoszfát, CaV: feszültség-függő kalcium

csatorna, TRP: tranziens receptor potenciál, CRAC: kalciumfelszabadulás által aktivált kalcium

csatorna (15). Részleteket ld. a szövegben.

A plazmamembránon keresztüli kalciumbelépés történhet feszültségfüggő, vagy attól

független ioncsatornákon keresztül. Ez utóbbiak közé tartoznak az ATP-függő P2X

ionotróp receptor csatornák (16), valamint a tranziens receptor potenciál csatornák (17).

Ingerlékeny sejtekben a kalciumbeáramlás főként a feszültségfüggő Ca2+-csatornákon

13

keresztül történik (12). Az extracelluláris térből történő kalciumbeáramlás mellett az

intracelluláris raktárakból történő kalcium felszabadulás is növelheti a citoplazma

[Ca2+]-ját, amely többnyire heterotrimer G-fehérjékhez kapcsolt plazmamembrán

receptorok, valamint a tirozin kináz receptorok stimulációján keresztül valósulhat meg.

E szignalizációban fontos szerepet kapnak a foszfolipáz C (PLC) enzim különböző

izoformái. A foszfolipáz C enzim a sejtmembrán inozitol-biszfoszfát molekulájának

hasításával inozitol 1,4,5-triszfoszfátot (IP3) és diacilglicerint (DAG) hoz létre. A DAG

a protein kináz C (PKC) aktivátora, míg az IP3 az ER membránján található IP3 receptor

csatornákhoz kötődve kalcium kiáramlást okoz az ER-ból a citoplazmába (18). Az ER

membránján helyezkedik el az ún. „stromal interaction molecule 1” (STIM1), amely az

ER kalciumszintjének csökkenését követően áthelyeződik a plazmamembrán irányába,

ahol interakcióba lép és aktiválja az Orai 1 csatornát, mely kalciumbelépést indukál az

extracelluláris térből (17). A kalcium indukált kalcium felszabadulás (CICR) is

hozzájárulhat az ER-ből történő kalcium-kiáramlás fokozódásához (19). A

citoplazmatikus kalcium eltávolítása több transzportrendszer működésének köszönhető.

A plazmamembrán kalcium ATP-áz (PMCA) az elektrokémiai grádienssel szemben az

extracelluláris térbe juttatja ki a Ca2+-okat. Ez az ionpumpa elektroneutrálisan cserél 1

Ca2+-t két protonra, ATP hidrolíziséből származó energia felhasználásával. A transzport

kis kapacitással és nagy affinitással működik. A kalcium-kalmodulin komplex és/vagy

az intracelluláris kalciumkoncentráció emelkedése a pumpa aktiválódásához vezet (15,

20). A Na+/Ca2+ (NCX) egy Ca2+-t cserél 3 Na+-ra, vagy a Na+/Ca2+-K+ (NCKX) egy

Ca2+-t és egy K+-ot cserél négy Na+-ra (21, 22). Szintén az elektrokémiai gradienssel

szemben a szarko-endoplazmatikus retikulum Ca2+-ATP-áz (SERCA) az intracelluláris

raktárakba pumpálja vissza a kalciumot a citoszólból (23).

II. 4. A purinoceptorok

A sejt felszínén található nukleotid receptorokat purinoceptoroknak nevezték el (24). A

ʼPʼ jelölés arra utal, hogy e receptorok purin és pirimidin nukleotid vegyületek által

aktiválódnak (25). A purinoceptoroknak két fő csoportját különböztetjük meg; a P1 és a

P2 receptorokat (3. ábra). A hét transzmembrán domént tartalmazó P1 receptor család

endogén ligandja az adenozin. A P1 receptorok négy altípusba sorolhatóak (A1, A2A,

14

A2B és A3), Gs vagy Gi heterotrimer G fehérjéhez kapcsolódnak és kompetitív

gátlószereik a metilxantinok. A P2 receptorok alapvetően ATP, ADP, UTP és UDP által

aktiválhatóak és két csoportra oszthatóak. A P2X ionotróp receptorok ATP-függő

ioncsatornaként funkcionálnak és két transzmembrán domént tartalmaznak. Ezzel

szemben a P2Y receptorok hét transzmembrán doménnel rendelkeznek, és heterotrimer

G-fehérjék közvetítik az őket stimuláló agonisták hatásait (26). Az ionotróp P2X

receptor csatornákat hét, a metabotróp P2Y receptorokat pedig nyolc altípusra

oszthatjuk (27). A purinerg receptorok már az evolúció korai szakaszában megjelentek,

és számos gerinctelen fajban is megtalálhatóak (28, 29). Működésüket tekintve a

purinerg receptorok az ATP preszinaptikus és posztszinaptikus hatásaiban egyaránt

részt vesznek (30-32), beleértve az ízérzést (33), a hallást (34) valamint a kemorecepciót

(35).

3. ábra. Az extracelluláris ATP és az adenozin plazmamembrán receptorai. A panel:

Adenozin receptorok szerkezete. B panel: P2X ionotróp receptorok szerkezete. C panel: P2Y

metabotróp receptorok szerkezete (10). Részleteket ld. a szövegben.

15

II. 4. 1. P2Y metabotróp receptorok

A P2Y receptorok G-proteinhez kapcsolt metabotróp receptorok. A P2Y receptorok

aktiválása a heterotrimer G-fehérjéken keresztül intracelluláris másodlagos hírvivő

molekulák képződéséhez vezet (36). Ez idáig nyolc emlős P2Y receptor altípust

klónoztak (P2Y1,2,4,6,11,12,13,14). A P2Y1,2,4,6 altípusok Gq/G11 receptorhoz kapcsoltak,

mely a foszfolipáz C aktivációján keresztül IP3 képződéséhez vezet. Ezzel szemben a

P2Y12,13,14 receptor altípusok a Gi/Go feherjék által az adenilát-cikláz gátlásához

vezetnek, ami a cAMP képződését csökkenti. A P2Y11 a Gs/Go fehérjék

közreműködésével fokozza a cAMP szintézisét (37, 38). Ezek a receptorok lassúbb

választ közvetítenek, mint a P2X receptorok, mivel másodlagos hírvivő rendszer is részt

vesz a jelátviteli folyamatban. A metabotróp P2Y receptorok megtalálhatóak többek

között a vérerekben (39), a csontokban (40), a gasztrointesztinális traktus sejtjeiben (41)

és az epidermiszben (42). A P2Y metabotróp receptorok szinte minden emlős hámsejt

apikális és/vagy bazolaterális membránjában jelen vannak. Az emberi hámsejtekben

főként P2Y1, P2Y2, P2Y4 és P2Y6 altípusok expresszálódnak (37, 38). Fontos

megemlíteni, hogy a különböző P2Y receptor altípusok extracelluláris nukleotidokkal

való stimulálása Cl- szekréciót indukálhat olyan hámsejtekben, ahol a Ca2+-függő Cl- és

K+ csatornák egyszerre vannak jelen (43). Következésképpen a P2Y receptorok

stimulálása terápiás jelentőséggel bírhat olyan kórképekben, mint például a cisztás

fibrózis (CF), amelyben a cAMP-függő Cl- szekréció károsodik (44).

II. 4. 2. P2X ionotróp receptorok

A P2X receptoroknak hét altípusát különböztetjük meg (P2X1-P2X7) (16). Az ATP-által

vezérelt P2X ionotróp receptorok két transzmembrán doménből állnak, egy N- és C-

terminális régiót tartalmaznak a citoplazmában és nagy extracelluláris hurokkal

rendelkeznek (45). Az extracelluláris hurok ciszteinben gazdag diszulfidkötéseket (16)

és ATP kötőhelyeket tartalmaz (46, 47). Az ATP kötődése az extracelluláris domén

megfelelő helyére konformációváltozást indukál, amely egy nem-szelektív kation-

csatorna nyitásához vezet, melyen keresztül Na+, K+ és Ca2+ ionok szabadon

áramolhatnak (48, 49). Minden P2X receptor permeábilis a Ca2+-okra nézve, azonban a

16

Na+ -hoz viszonyított Ca2+ permeabilitás (PCa/PNa) eltérő az egyes altípusok között (50).

A Na+ és Ca2+ beáramlás depolarizálja a membránt, illetve a szabad citoszólikus Ca2+

koncentráció ([Ca2+]i) is megemelkedik. Ez befolyásolja az akciós potenciál terjedését

és hatással van számos Ca2+- függő folyamatra, beleértve a szekréciót (51, 52), az izom

kontrakciót (53, 54) és a sejtek túlélését (55, 56). A P2X ionotróp receptorok alegységei

homo- vagy heterotrimer formába rendeződhetnek. A heteromerizáció képes

megváltoztatni az egyes P2X receptor altípusok funkcionális és farmakológiai

tulajdonságait (27). A P2X ioncsatornák altípusai közül a P2X1 és a P2X3 homomer

csatornák gyors deszenzitizációt mutatnak, ezzel szemben a P2X2 és P2X4 altípusok

lassan deszenzitizálódnak, míg a P2X7 altípus nem mutat deszenzitizációt (16). A P2X

receptorok szükségesek az immunrendszer megfelelő működéséhez is (57). A

kardiovaszkuláris rendszerben, a légző-, az urogenitális, valamint a gyomor-bél

rendszerben egyaránt megtalálhatóak P2X receptor altípusok, melyek fontos szerepet

játszanak az élettani működések fenntartásában (58). Farmakológiai vizsgálatok és

génkiütött állatokon végzett kísérletek során nyilvánvalóvá vált, hogy a P2X receptorok

számos kórtani folyamatban is részt vesznek. Ezek közé tartoznak a krónikus és

gyulladásos fájdalomérzékelés (59-64), az arthritis (65), a férfi meddőség (66), a magas

vérnyomás (67, 68), a csontbetegségek és a rákos megbetegedések (56, 69).

II. 4. 2. 1. A P2X4 purinerg receptor

A P2X4 receptor csatornák nagyfokú kalciumpermeabilitással rendelkeznek, mely a

sejtmembrán depolarizációja mellett emeli az [Ca2+]i-t is, mely aktiválja a kalcium-

szenzitív intracelluláris folyamatokat (16, 70, 71). A P2X4 receptor csatornák

megtalálhatóak a lizoszómákban is és az extracelluláris szignál hatására kihelyeződnek

a sejt felszínére (72). A P2X4 fehérje altípust kódoló gént eredetileg patkányagyból

klónozták (73). A P2X4 receptorok fontos szerepet töltenek be a neuropátiás

fájdalomérzékelésben (63, 74), a gyulladásos folyamatokban (75), az endotélsejtek NO-

termelésében (67), a légúti hámsejtek működésének szabályozásban (76), a légutak Cl-

szekréciójának indukálásában (77, 78), valamint az epekiválasztás mechanizmusában

(79). Ezen felül a receptorok fontos szerepet játszanak a neuronális, a zsigeri és a

gyulladásos fájdalom folyamataiban (80). Nagy előrelépést jelentett, hogy nemrégiben a

17

zebrahal P2X4 receptort sikeresen kristályosították mind zárt (81), mind nyitott

állapotban (48). A cink alacsony mikromoláris koncentrációban (82, 83), valamint a

makrociklikus lakton antibiotikum ivermektin potencírozzák az ATP hatását a P2X4

receptorokon (84). Mindazonáltal a P2X4 receptorok vizsgálatát megnehezíti a

specifikus inhibitorok hiánya. Valójában a P2X4 receptorok inszenzitívek a nem-

szelektív P2X receptor gátlószerek iránt mint amilyen például a suramin és a PPADS

(85). Irodalmi adatok azt mutatják, hogy a P2X4 receptorok gátlása esetén mind a

suramin, mind a PPADS IC50 értéke >500 µM (86). A TNP-ATP nem specifikus módon

gátolja a P2X4 receptorokat (87). Ráadásul a TNP-ATP a P2X4 csatornák gyenge

gátlószerének bizonyult (IC50=15 µM; 10 µM ATP jelenlétében), szemben a P2X1 (IC50

= 0,006 µM) és a P2X3 (IC50 = 0,001 µM) receptorokon kifejtett potens gátló hatással

(88). A benzodiazepin-származék, 5-(3-Bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofuro [3,2-

e]-1,4-diazepin-2-one (5-BDBD) P2X4 receptorokat gátló hatását vizsgálták korábban,

és egy 2005-ben közzétett szabadalomban az IC50 érték közel 0,5 µM-nak adódott (89)

(4. ábra). Mindazonáltal ezek az eredmények szabadalmi védelem alatt állnak, így nem

hozzáférhetőek. Valószínűleg ennek köszönhetően a kutatók széles

koncentrációtartományban alkalmazzák az 5-BDBD-t a P2X4 receptorok gátlására.

Néhány közleményben alacsony mikromoláris (5-10 µM) koncentrációban használták

(90, 91), míg mások szignifikánsan magasabb dózisban (30-100 µM) alkalmazták (92,

93) az 5-BDBD-t. Jelen munkánkban megvizsgáltuk az 5-BDBD hatását a heterológ

módon expresszált humán P2X4 receptorokon HEK-293 sejtekben.

4. ábra. Az 5-BDBD szerkezeti képlete

18

II. 5. TRP csatornák

Több mint negyven évvel ezelőtt Cosens és Manning megfigyelték, hogy a mutáns

ecetmuslica (Drosophila melanogaster) retinájában hosszú ideig tartó fénymegvilágítás

hatására Ca2+ permeábilis ioncsatornák aktiválódnak, mely fenntartott receptorpotenciált

eredményez. Innen ered a két évtizeddel később leírt tranziens receptor potenciál (TRP)

csatornák elnevezése (94). A TRP fehérjék kationpermeábilis csatornák, melyek az

élesztőtől az emlősökig számos sejttípusban megtalálhatóak (95, 96). A TRP

szupercsaládnak hét fő alcsaládját különböztetjük meg: TRPC (canonical), TRPV

(vanilloid), TRPM (melastatin), TRPP (polycystin), TRPML (mucolipin), TRPA

(ankyrin) és a TRPN (nem mechanoreceptor) (95, 97, 98). A TRPV családon belül a

gerincesekben hat altípust azonosítottak. A TRPV1 a fájdalomérzékelésben, valamint a

kémiai és hőmérsékleti stimulusok közvetítésében játszik szerepet (99, 100). A TRPV2

és TRPV3 receptorok a hőmérséklet emelés hatására nyílnak, melegben és ártalmas

hőmérsékleti tartományban aktiválódnak (101, 102). A TRPV4 receptorok az ozmotikus

viszonyok változásának érzékelésében, a nocicepcióban és a meleg érzékelésben

vesznek részt (103, 104). A vesetubulusok hámsejtjeiben és a bélhámsejtekben a

TRPV5 és a TRPV6 csatornák kulcsfontosságú szerepet töltenek be a Ca2+

reabszorpcióban (105, 106). Nem meglepő módon a TRP csatornák közül a TRPV5 és a

TRPV6 rendelkezik a legnagyobb Ca2+-szelektivitással, (PCa/PNa értékük meghaladja a

100-at). Következésképpen, egyedülállóak a TRP szupercsaládban az intracelluláris

kalciumszabályozásban betöltött szerepük révén (107).

II. 5. 1. TRPV6 csatorna

A TRPV6 (régebbi nevén „calcium transporter 1” - CaT1) csatornát több mint egy

évtizeddel ezelőtt azonosították és klónozták (108, 109). A humán TRPV6 gén a 7q34

kromoszómán található (109). A humán TRPV6 promóter régiója számos D-vitamin

receptor kötőhelyet tartalmaz, melyek a 1,25-dihydroxivitamin D3 által részt vesznek a

TRPV6 expressziójának a szabályozásában (110, 111). A TRPV6 receptor 725

aminosavból épül fel, hat transzmembrán doménből áll, és intracellulárisan N- és C

terminális régióval rendelkezik (5. ábra). A pórus régió feltehetőleg az ötös és a hatos

19

transzmembrán doménok között található. A TRPV6 aktivitását a PKC és a kalmodulin

szabályozzák. A fehérje N-terminális része három ankirin kötőhelyet tartalmaz. A

TRPV6 receptor aminosav-szekvenciája legjobban a TRPV5 fehérjével mutat

egyezőséget (112, 113).

5. ábra. A TRPV6 csatornák szerkezete (11). A panel: A TRPV6 receptor hat transzmembrán

doménből épül fel. Intracellulárisan N- és C terminális régiót tartalmaz. Három ankirin kötőhely

foglal helyet a fehérje N-terminális régióján. B panel: A tetramer pórus régió vélhetően az ötös

és a hatos transzmembrán doménok között figyelhető meg.

A TRPV6 fehérjéről azt feltételezték, hogy része a kalcium által aktivált

plazmamembrán kalciumcsatornának (114, 115). Ezt a feltételezést azonban nem

sikerült egyértelműen igazolni, hiszen az endogén ICRAC tulajdonságai eltérnek a

heterológ módon expresszált TRPV6 tulajdonságaitól (116). Természetesen a különbség

az expressziós rendszerben lévő kifejeződés szintjétől függ (117).

A TRPV5, valamint a TRPV6 csatornák homo- vagy heterotetramer formába

rendeződhetnek (118). A duodenumban és a placentában főként TRPV6 csatornákon

keresztül zajlik a Ca2+ reabszorpció. A hasnyálmirigy, a prosztata és a nyálmirigyek

hámszöveteiben a TRPV6 csatorna funkciója máig tisztázatlan (108, 117). A vese-

tubulusok hámsejtjeiben történő Ca2+ reabszorpció a TRPV5 és TRPV6 csatornákon

keresztül történik (6. ábra). A disztális kanyarulatos csatornában (DCT) és az összekötő

csatornában (CNT) a transzcelluláris kalciumreabszorpció három lépésben zajlik.

Elsőként Ca2+ áramlik a hámsejtekbe az apikális membránban lévő TRPV5 és TRPV6

20

csatornákon keresztül. Ezt követően a Ca2+ kalcium-kötő fehérjéhez kötődik (Calbindin-

D28K) és átdiffundál a citoplazmán anélkül, hogy az [Ca2+]i szignifikánsan emelkedne.

Végül a Ca2+ a bazolaterális membránon át távozik a PMCA vagy a Na+/Ca2+cserélő

(NCX) segítségével (11).

6. ábra. A Ca2+ abszorpció mechanizmusa a vese epitheliumában. TRPV5: transiens

receptor potenciál vanilloid 5-ös típus, TRPV6: transiens receptor potenciál vanilloid 6-os típus,

PMCA1b: plazmamembrán kalcium ATP-áz 1b típus, NCX1: Na+-Ca2+-cserélő fehérje 1-es

típus, DCT: disztális kanyarulatos csatorna, CNT: összekötő csatorna, calbindin-D28K: az emlős

vesében expresszálódó kalcium-kötő fehérje altípus (11).

A TRPV6 fehérje működésének vizsgálatát nehezíti az a körülmény, hogy jelenleg a

csatornának nincs specifikus és hatékony gátlószere. A Zn2+ és a Cd2+ gátolja a TRPV6-

ot magas mikromoláris (200-2000 µM) koncentrációban (117). Jelen munkánkban

megvizsgáltuk az IP3 receptor és a raktár vezérelt Ca2+ csatornák gátlószereként ismert

2-APB hatását a TRPV6 csatornákon (119).

21

III. Célkitűzések

1. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a heterológ módon expresszált humán P2X4

purinerg receptor csatornák működését HEK-293 sejtekben. Tanulmányozni kívántuk

továbbá a benzodiazepin származék, 5-BDBD gátló hatását a humán P2X4 receptorokon

az intracelluláris kalciumkoncentráció változásának nyomon követésével és a teljes-sejt

ionáramok detektálásával.

2. További célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a heterológ módon expresszált humán

TRPV6 csatornák működését HEK-293 sejtekben. Arra is kerestük a választ, hogy a

belső raktár vezérelt Ca2+ csatorna gátlószereként ismert 2-APB hogyan befolyásolja a

hTRPV6 csatornák működését.

22

IV. Módszerek

IV. 1. Sejttenyésztés

Kísérleteinkhez humán embrionális vese (HEK)-293 hámsejtvonalat használtunk. A

HEK-293 sejteket már több mint harminc éve alkalmazzák rekombináns fehérjék

tanulmányozására. Azért esett a választásunk e sejtvonalra, mert ezek a sejtek gyorsan

osztódnak, könnyen fenntarthatóak, és ideálisak tranziens és stabil expressziós rendszer

létrehozására, ugyanakkor magas hatásfokkal transzfektálhatóak. A HEK-293 sejtek

kiválóan alkalmasak elektrofiziológiai módszerekkel történő funkcionális vizsgálatokra

(120). A kísérleteinkhez használt HEK-293 sejteket műanyag szövettenyésztő edényben

5% borjúsavót (FBS), 100 U/ml penicillint és 100 µg/ml streptomycint tartalmazó

DMEM/Ham’s F-12 (1:1 v/v) médiumban tenyésztettük. A sejteket 5% CO2

jelenlétében, 37ºC-os sejttenyésztő inkubátorban tartottuk fenn. A passzálás 90-95%-os

konfluencia elérésénél történt.

IV. 2. Konstrukt készítés

IV. 2. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 készítése

A humán P2X4R-t (ImaGenes GmbH, Berlin, Németország) humán cDNS-ből

amplifikáltuk az alábbi primer párral: 5’-TAT AAG ATC TCG CGG CCA TGG CGG

GC-3’, 5’-TAT AGA ATT CCC TGG TCC AGC TCA CTA GCA AGA CCC TGC-3’

Az amplifikált terméket a pmCherry-N1 (Clontech Laboratories Inc.) vektor BglII és

EcoRI resrikciós helyeire szubklónoztuk. A humán P2X4 receptorok izoformája 3-as

típusú.

IV. 2. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 készítése

A humán TRPV6-ot cDNS-ből amplifikáltuk PCR-al a következő primerekkel: 5’-UTR

TCT GCA GTC GAC GGT ACC GCG GGC CCG GCC CTA CAC CCC ATG UTR-

3’, 3’-UTR AAA AAA CTC GAG CAT GCA TCT AGA TAA CTG ATCA UTR-5’ A

primerek UTR (nem kódoló) szekvenciát is tartalmaztak. A pEYFP-C1-hTRPV6

23

vektort Prof. Christoph Romanin-tól kaptuk (Johannes Kepler Egyetem, Biofizikai

Intézet, Linz, Ausztria), ahonnan az amplifikált terméket SacII és XhoI segítségével

tettük át a pTagRFP-C1 vektorba.

IV. 3. Tranziens transzfekció

IV. 3. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 transzfekciója

A transzfekció előtti napon, a sejteket 40 mm-es műanyag Petri-csészékben lévő, poli-

D-lizin bevonatú, kerek, üveg tárgylemezekre (25 mm átmérő) szélesztettük,

tárgylemezenként 500.000 sejtszámmal. A sejtek transzfekcióját 16-24 óra elteltével 3

µg pmCherry-N1-hP2X4 DNS-el és 5 µl TurboFectTM transzfekciós reagenssel végeztük

el 200 µl szérum-mentes médiumban. A méréseket a sejteken a transzfektálást követő

16-48 óra elteltével végeztük. A transzfekció hatásfoka 60-70% volt.

IV. 3. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 transzfekciója

A HEK-293 sejteket a transzfektálást megelőző 24 órával poli-D-lizinnel előkezelt

tárgylemezekre szélesztettük, melyeket 35 mm-es Petri-csészékben helyeztünk el. A

transzfekciót 2 µg pTagRFP-C1-TRPV6 és 5 µl Lipofectamine 2000 nevű transzfekciós

reagenssel végeztük el a gyártó cég által ajánlott protokoll alapján. A transzfekciós

médiumot 4 óra múlva antibiotikum-mentes médiumra cseréltük le. A transzfekció után

24 óra múlva használtuk fel a sejteket.

IV. 4. A pmCherry-N1-hP2X4-et és a pTagRFP-C1-hTRPV6 expresszáló HEK-293

sejtklónok létrehozása

A pmCherry-N1-hP2X4-et, valamint a pTagRFP-C1-hTRPV6-ot expresszáló HEK-293

sejtklónok létrehozásához a sejteket 35 mm átmérőjű Petri csészében lévő, poli-D-

lizinnel előkezelt, steril tárgylemezekre szélesztettük. A transzfektáláshoz 2 µg

pmCherry-N1-hP2X4-et, illetve pTagRFP-C1-hTRPV6-ot és 5 µl Lipofectamine 2000-t

használtunk lemezenként, a gyártó cég által leírt protokoll szerint. A transzfekciós

tápoldatot 4 óra múlva antibiotikum-mentes médiumra cseréltük le. A következő napon

a médiumot szelekciós antibiotikumot tartalmazó (G418) tápoldatra cseréltük, és ebben

a szelekciós médiumban tartottuk őket. A nem transzfektálódott sejtek pusztulását

követően, a túlélő sejteket tripszineztük, és újraszélesztettük 96-lyukú lemezre. A

24

hígítást úgy készítettük el, hogy 1 lyukba 1 darab sejt kerüljön. Az ezt követő napokon a

pirosan fluoreszkáló sejtkolóniák, mint a hP2X4-et és a hTRPV6-ot expresszáló pozitív

klónok, fluoreszcens mikroszkóppal kerültek kiválasztásra.

IV. 5. Sejtfelszíni biotiniláció és western blot

A P2X4-et és TRPV6-ot kifejező HEK-293 sejtklónokat poli-D-lizinnel előkezelt,

1.000.000 sejt/tárgylemez sűrűségben tettük ki 60 mm átmérőjű tenyésztőedényekbe. A

sejteket, 24 órával a kitapadás után, jéghideg PBS-Ca-Mg (0,1 mM CaCl2 és 1 mM

MgCl2) oldatban mostuk, ezt követte a plazmamembrán-fehérjék biotinilációja 1,5

mg/ml sulfo-NHS-LC-biotin-al 10 mM trietanolaminban (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 2 mM

CaCl2 és 150 mM NaCl jelenlétében 90 percen keresztül, horizontális rázatás mellett,

4ºC-os hőmérsékleten. A felesleges biotint 1mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2 és 100 mM

glicin-t tartalmazó PBS-el távolítottuk el, 20 percen keresztül 4ºC-on, majd háromszor

mostuk PBS-ben. Végül a sejteket lízis pufferben lizáltuk 30 percen át és a lizátumot

centrifugálással tisztítottuk meg. A fehérje koncentrációját DC Protein Assay

módszerrel határoztuk meg. A sejt lizátum azonos mennyiségű fehérjét tartalmazott

(1,33 mg/ml), amelyhez streptavidin-agaróz gyöngyöket kevertünk egy éjszakán át,

4ºC-on. A gyöngyöket egymás után háromszor mostuk A oldattal [50 mM Tris-HCl (pH

7,4), 100 mM NaCl és 5 mM EDTA], kettőször B oldattal [50 mM Tris-HCl (pH 7,4) és

500 mM NaCl] és egyszer C oldattal (50 mM Tris-HCl, pH 7,4). A biotinilált felszíni

fehérjéket 95ºC-on főztük 4x Laemmli pufferben. Az intracelluláris frakcióból kapott

fehérjéket 95ºC-on 5 percen át főztük 4x Laemmli pufferben.

A P2X4-et expresszáló mintáinkat 10%-os SDS-PAGE gélen futattuk, amelyre 40 µl

fehérjét vittünk fel a citoszólikus fehérjéből (1 mg/ml) és a plazmamembrán-fehérjéből

egyaránt. Towbin pufferben transzferáltuk a mintákat PVDF membránra, ehhez

félszáraz transzfert használtunk. A membránok blokkolását szobahőmérsékleten

végeztük el egy órán keresztül PBS-ben oldott 5%-os tejporoldattal, mely 0,5% BSA-t

és 0,02% NaN3-t tartalmazott. Ezt követően a mintákat a megfelelő primer antitestet

tartalmazó (1:1000 egér anti-mCherry (Clontech, 632543)) blokkoló oldatban

inkubáltuk egy éjszakán át 4ºC-on, majd háromszor mostuk foszfátpuffer Tween 20

(PBST) oldatban. A szekunder antitest tormaperoxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-

egér (1:4000, BioRad) antitest volt. Folyamatosan PBST-ben történő háromszori mosást

25

végül PBS-es mosás követte, a detektálásra kemilumineszcens (ECL) módszert

használtunk. Kontrollként az anti-mCherry antitesttel jelölt membránt sztrippeltük és

avidin-HRP (1:1000, BioRad)-al blottoltuk.

A TRPV6-ot tartalmazó mintánkat 8%-os SDS-PAGE gélen futattuk, amelyre 20 µg

proteint adagoltunk a teljes és a citoszólikus fehérjéből egyaránt. Ebben az esetben is

félszáraz transzfert alkalmaztunk, azonban a mintákat Dunn puffer segítségével

transzferáltuk át PVDF membránra. A membránokat egy éjszakán át blokkoltuk PBS-

ben oldott 5%-os tejporoldattal, mely 0,5% BSA-t és 0,02% NaN3-t tartalmazott. Ezután

a mintákat a megfelelő primer antitestet tartalmazó (1:2000 nyúl anti-tRFP (Evrogen

AB233)) blokkoló oldatban inkubáltuk szobahőmérsékleten 1,5 órán keresztül, majd

háromszor mostuk PBST oldatban. A másodlagos antitest tormaperoxidázzal (HRP)

konjugált kecske anti-nyúl (1:20,000, Santa Cruz SC1616) volt. Folyamatosan PBST-

ben történő háromszori mosást végül PBS-es mosás követte, a detektálásra

kemilumineszcens (ECL) módszert használtunk.

IV. 6. Immunofluoreszcencia

A 35 mm-es tenyésztő edényben lévő, 400.000 darab P2X4-et kifejező HEK-293 sejt

klónok kitapadását követő 24 órával a sejteket PBS-ben mostuk. Az inkubálást 0.1

mg/ml LC-sulfo-NHS(+)-biotin (Molbio)-val végeztük el szobahőmérsékleten 1 órán át,

ezt PBS-el történő mosás követte háromszor egymás után. A fixálás 4% PFA-val történt

37ºC-on 15 percig. Majd, a háromszori PBS-es mosást követően, a sejteket sztreptavidin

konjugált Alexa 488 (1:4000 hígítás, Invitrogen)-al jelöltük 1 órán át szobahőn. Végül

négyszeri PBS-es mosás után, a mintákat CitiFluor AF2 (EMS)-vel jelöltük. A képeket

Nikon C1 konfokális lézer szkenning mikroszkóppal tettük láthatóvá, ehhez Multiline

Argon és HeNe lézereket használtunk 40x nagyítással.

IV. 7. Intracelluláris [Ca2+] mérése

IV. 7. 1. Az egyes sejtek szintjén történő kalciummérés

A tranziensen transzfektált HEK-293 sejteket Fluo-3 AM (acetoxi-metilészter) (4 µl)

festékkel töltöttük fel standard extracelluláris oldatban, 45 percen át,

szobahőmérsékleten. A fluoreszcens festéket dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk,

26

mely 20% Pluronic-F127-et (a festék bejutását megkönnyítő enyhe detergens)

tartalmazott. Emellett a feltöltő oldatba 1 mM probenicidet is tettünk, a festék

szivárgásának megelőzése érdekében. A feltöltés után a sejteket standard extracelluláris

oldattal mostuk. Az oldat összetétele (mM-ban): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10

D-glükóz és 10 HEPES, pH 7,4 (NaOH-dal). A nominálisan Ca2+-mentes oldatokat

CaCl2 hozzáadása nélkül készítettük.

A méréseket Axiovert 200 M Zeiss LSM 510 Meta konfokális lézer szkenning

mikroszkóp segítségével végeztük (Carl Zeiss, Jena, Németország) 20x nagyításon

(NA=0,80) DIC objektívvel. Az excitációhoz 488 nm hullámhosszúságú argon-ion

lézert használtunk. A kibocsátott fény szűrését az emissziós oldalon BP 505-570 filter

segítségével értük el. Az adatok regisztrálása 0,5 Hz-en történt. Az [Ca2+]i változásait a

kísérlet kezdetén detektálható relatív fluoreszcencia érték %-ában mutattuk be. A

sejteket standard extracelluláris oldatban tartva határoztuk meg az alapfluoreszcencia

értéket (100%) a ROI-k (region of interests) által kapott átlagfluoreszcencia értékből. A

háttérfluoreszcenciát, mely a tárgylemez sejtmentes területén mérhető, kivontuk az alap

fluoreszcens intenzitásból. Az agonistákat és az antagonistákat közvetlenül adagoltuk az

oldatba a kívánt koncentrációban. A kísérleteket szobahőmérsékleten (22-24ºC)

végeztük.

IV. 7. 2. Fluoreszcens intracelluláris [Ca2+] mérés

A sejttenyészet intracelluláris kalcium koncentrációjában bekövetkező változást Fura-2-

acetoxi-metilészterrel (Fura-2 AM) mértük. A mérés elve, hogy a kalciumot kötött és

nem kötött fluoreszcens festék abszorpciós spektruma eltérő 380 nm-en, illetve 340 nm-

en történt excitációt követően. Amennyiben a festéket tartalmazó mintát két váltakozó

hullámhosszon gerjesztjük, az emittált fénysugarak intenzitásának hányadosából

meghatározható a minta intracelluláris kalcium koncentrációja (121). A módszer előnye,

hogy eltekinthetünk a megvilágító fény intenzitásától, és a sejt által felvett festék

koncentrációjától.

Az azonos tárgylemezen található transzfektált és nem-transzfektált sejteket

szérummentes médiumban oldott 5 µg/ml Fura-2 AM (a törzsoldat 5 µg/µl) festékkel

töltöttük fel 1 órán keresztül, 37°C-os sejtkultúra inkubátorban. A festéket DMSO-ban

27

oldottuk fel, mely 20% Pluronic-F127-et és 1 mM probenicidet tartalmazott. Ezt

követően a sejteket módosított, nominális kalcium-mentes Krebs-Ringer HEPES (KRH)

(118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM D-glükóz, és 10 mM HEPES, pH

7,4) oldatba helyeztük 20 percre. Ez idő alatt a sejtek felvették a festéket, amely az

acetoxi-metilészter által membránpermeabilissá vált. A sejt észteráz enzime eltávolította

a citoplazmába került festékmolekuláról az AM-csoportokat, ezáltal a festék a sejtekben

halmozódik fel.

A méréseket Nikon Eclipse TiU inverz mikroszkóppal végeztük. A sejteket Nikon 40x

S Fluor objektívvel vizsgáltuk. A képeket hűtött Hamamatsu Orca-EG monokróm CCD

kamera segítségével készítettük. A képalkotást és az analízist SimplePCI 6.2 CImaging-

gel végeztük.

IV. 7. 3. FLIPR Tetra módszer

Az endogénen jelen lévő P2Y receptorok vizsgálatára natív HEK-293 sejteket

használtunk. A P2X4 receptorok vizsgálatához P2X4 fehérjéket kifejező HEK-293 sejt

klónokat alkalmaztunk. A kísérlet kezdete előtt 36 órával a lemezeket 100 µg/ml poli-

D-lizinnel vontuk be, majd a sejteket tripszineztük és 100 µl térfogatban 40.000

sejt/lyuk sűrűségben 96-lyukú lemezre szélesztettük. Az oldatot 36 órával később 100

µl módosított Krebs oldatra cseréltük (117 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1 mM CaCl, 1 mM

MgCl, 5 mM D-glükóz, 10 mM HEPES és Calcium-5 fluoreszcens festék), a sejteket

ebben az oldatban 1 órán át inkubáltuk 37ºC-on. A fluoreszcens [Ca2+] méréseket nagy

teljesítményű FLIPR Tetra fluoreszcens mikroplate olvasóval végeztük. A sejteket 470-

495 nm hullámhosszúságú LED modullal gerjesztettük, az emisszióhoz 515-575 nm-es

filtereket használtunk. Az alapvonal felvétele után a sejteket 5 percen át előkezeltük a

különböző vegyületekkel, majd ezt követte a tesztelni kívánt anyagok hatásának

vizsgálata ATP jelenlétében és ATP hozzáadása nélkül.

IV. 8. A Ca2+-belépés vizsgálata mangán „quench” módszer alkalmazásával

A sejteket Fura-2 AM festékkel töltöttük fel. A Fura-2 festék gerjesztésére az ún.

izobesztikus pontnak megfelelő 359 nm hullámhosszúságú fényt használtuk, így a

festék Ca2+-független fluoreszcenciaváltozásait tudtuk detektálni. MnCl2 (250 µM)

hozzáadása után a Mn2+ belépéstől függően csökken az emittált fény intenzitása. A

28

csökkenés mértékét a görbékhez húzott érintő meredekségéből határoztuk meg. A

kísérletek során a MnCl2-ot az EGTA-mentes oldathoz adtuk.

IV. 9. Elektrofiziológia

A „voltage clamp” méréseket a standard teljes sejt (whole-cell) konfigurációban

végeztük, melyekhez egy Axopatch 200B erősítőt használtunk (Axon Instruments).

(122). A humán P2X4-et expresszáló sejteket Diaphot 300 invert patch clamp

mikroszkóp (Nikon) alatt válogattuk ki, mely egy epifluoreszcens egységet is

tartalmazott (Elektro-Optika, Érd, Magyarország). A mikropipettákat egy P-97 Flaming-

Brown típusú készülék segítségével (Sutter Instrument) boroszilikát üvegkapillárisokból

(Harvard Apparatus) készítettük el. A pipettahegyek ellenállása 3-6 MΩ között volt,

miután pipettaoldattal töltöttük fel azokat. A pipettaoldat összetétele (mM-ban): 135

KCl, 5 NaCl, 1 MgCl2, 1 EGTA, 10 HEPES és annyi CaCl2, hogy a szabad [Ca2+]i = 0,1

µM volt. A szabad [Ca2+]i-t MaxChelator szoftverrel (Stanford University, Palo Alto,

USA) becsültük meg. A pH-t 7,2 értékre állítottuk be KOH-dal. A standard

extracelluláris oldat összetétele (mM-ban): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-

glükóz, 10 HEPES, pH 7,4 (NaOH-dal). Az oldatokat folyamatos perfúzióval

áramoltattuk a sejtekre, egy gravitáció által működtetett rendszer segítségével. Az

antagonisták oldatba juttatása 3-5 perccel az agonista adása előtt történt. A kísérletekben

a membrán potenciált -60 mV-os értékre állítottuk be. A feszültség lépcsők létrehozását

és az adatgyűjtést pClamp 6.03 szoftver (Axon Instrument) segítségével végeztük. A

kapacitatív áramokat analóg módon kompenzáltuk. A bemeneti soros ellenállás érték

abban az esetben került elfogadásra, ha ez az érték nem haladta meg a pipettahegy

ellenállás 5-szörösét. Az analóg adatokat Bessel szűrő segítségével szűrtük és Digidata

1200 analóg digitális konverterrel digitalizáltuk. Az adatfeldolgozáshoz Clampfit 6.03

és Microsoft Excel szoftvereket használtunk. Minden kísérletet szobahőmérsékleten

(20-22°C) végeztünk.

IV. 10. Statisztika

A görbe alatti terület kiszámítása trapéz szabály alapján történt az agonista adását

követő 4 perc után, melyhez SigmaPlot 12.0 szoftvert használtunk. A P2X receptor

funkció meghatározásához a nem expresszáló sejtek válaszát kivontuk a P2X4 receptort

29

kifejező sejtek görbe alatti területének értékéből minden egyes tárgylemezen. Az

antagonista koncentráció gátlás görbe meghatározásához fokozatosan emeltük a

vegyület koncentrációját, miközben az agonista koncentrációját az EC50 (fél maximális

aktiváláshoz szükséges koncentráció) érték közelébe állítottuk be. Az IC50 értéket (fél

hatásos gátló koncentráció) a legkisebb négyzetek elve alapján számítottuk ki

I=I0/[1+(IC50/[Ant])-nH], ahol I és I0 a maximális válaszokat mutatják az antagonista

[Ant] jelenlétében és hiányában. Az eredményeket átlag ± SEM formájában adtuk meg.

A megfigyelés számát az „n” jelöli. A statisztikai feldolgozás során a parametrikus

adatokat páros Student’s t-próbával, míg a nem parametrikus adatokat egy változós

varianciaanalízissel és Mann-Whitney U teszttel elemeztük. Az eltéréseket akkor

tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha a p˂0,05. A nem lineáris görbe

meghatározásához SigmaPlot 12.0 programot használtunk.

30

V. Eredmények

V. 1. A transzfektált hP2X4 receptorok lokalizációja HEK-293 sejtekben

A HEK-293 sejtek endogén módon nem expresszálnak P2X receptorokat, és jól

használhatók az elektrofiziológiai mérésekhez is. Következésképpen, hP2X4 fehérjét

kódoló cDNS-t juttattunk a HEK-293 sejtekbe, és vizsgáltuk a fehérje expresszió

lokalizációját. A transzfektált hP2X4 receptorok HEK-293 sejtekben való

elhelyezkedésének vizsgálata céljából immunofluoreszcencia technikát alkalmaztunk. A

biotinilált sejtfelszíni fehérjék kolokalizációja, valamint az mCherry fluoreszcens

protein mutatja a P2X4 receptorok plazmamembránban való elhelyezkedését (7. ábra).

7. ábra. A P2X4 receptorok celluláris lokalizációjának bemutatása immunofluoreszcencia

módszerrel. A sejtfelszíni proteinek LC-sulfo-NHS(+)-biotin és sztreptavidin-Alexa488-al

történt jelölése (A panel). Az mCherry-vel ellátott P2X4 receptorok fluoreszcens képe HEK-293

sejtekben (B panel). A P2X4 receptorok és a biotinilált sejtfelszíni fehérjék kolokalizációjának

egyesített képe (C panel). A P2X4 receptort expresszáló sejtek átmenő fénnyel megvilágított

képe (D panel). Nagyítási lépték 50 µM.

31

V. 2. A hP2X4 fehérjék a plazmamembránon expresszálódnak

Az immunofluoreszcencia technika alkalmazása nem tisztázta azt a kérdést, hogy a

P2X4 receptorok főként a plazmamembránban vagy a citoszólban helyezkednek-e el.

Sejtfelszíni biotiniláció és western blot módszereket használtunk a HEK-293 sejtekben

található fehérjék citoszól- és membránfrakciójának elkülönítésére. Az mCherry-vel

jelölt P2X4 fehérjék a plazmamembránon helyezkednek el, és expressziójukat az

ivermektin jelenléte nem befolyásolta (8. ábra A panel). A kontroll kísérletekben avidin-

HRP-jelölt antitestet használtunk a membránfrakcióban található fehérjék

elhelyezkedésének igazolására (8. ábra B panel).

8. ábra. A transzfektált hP2X4 receptorok plazmamembrán-expressziójának kimutatása

biotinilációval és western blot technikákkal. A citoszólikus és a sejtfelszíni fehérjék

elválasztása. A humán P2X4 receptorok citoszólikus (1-4 oszlop) és plazmamembrán (5-8

oszlop) régiókban való elhelyezkedése. Az 1 és 5 sávok a kezeletlen sejteket jelölik. A 2 és a 6

sávok a DMSO-val előkezelt (1:1000) fehérjét tartalmazzák. A 3-as és a 7-es szám 10 µM

ivermektinnel előkezelt mintákat mutatják, a 20 µM ivermektinnel történt előkezelést a 4-es és a

8-as számok jelzik (A panel). A B panel 5-8 számú oszlopai avidin-HRP-vel jelölt fehérjék

plazmamembrán-expresszióját mutatják.

V. 3. A hP2X4 receptorok kationpermeábilis ioncsatornaként működnek

A plazmamembránban található humán P2X4 receptorok funkcionális jellemzésére

ʺpatch clampʺ technikát használtunk. Méréseink során az ionáramokat teljes-sejt

konfigurációban detektáltuk a transzfektált HEK-293 sejtekben. Az ATP koncentráció-

függő módon (0,1-300 µM) emelkedő maximális áram amplitúdót eredményezett a

P2X4 receptorokat expresszáló sejtekben (9. ábra A és B panel). Az agonista dózis-

32

válasz görbét a Hill-egyenlettel határoztuk meg; E= Emax[1+(EC50/[ATP])nH]. Az

egyenletben az E érték az agonistakoncentráció [ATP] által kiváltott áram csúcsértéket

jelöli, az Emax a maximális agonistakoncentrációval kapott csúcsáramot mutatja. Az

EC50 a félmaximális áramot kiváltó koncentráció-értéket adja meg, az nH a Hill

koefficienst jelöli. Eredményeink azt mutatták, hogy az ATP EC50 értéke 2,1 µM volt

(9. ábra B panel). A P2X4 receptort nem expresszáló sejtekben az ATP (100 µM) nem

váltott ki választ. Annak érdekében, hogy a P2X4 receptorok szerepét megerősítsük az

ATP által kiváltott befelé irányuló áramokban, a sejteket 3 és 10 µM ivermektinnel

kezeltük elő. Várakozásainknak megfelelően, az ivermektin koncentrációfüggő módon

potencírozta a 0,5 µM ATP által kiváltott ionáramokat (9. ábra C panel). Ezután

megvizsgáltuk a TNP-ATP hatását 1 µM ATP által indukált ionáram-változásokra. Ezen

körülmények között azt találtuk, hogy a TNP-ATP félmaximális gátlókoncentráció-

értéke (IC50) 1,5 µM volt (9. ábra D panel). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a

plazmamembránban található humán P2X4 receptorok teljesen funkcionálisak a

transzfektált HEK-293 sejtekben.

9. ábra. A hP2X4 receptorok kationpermeábilis ioncsatornaként működnek. Reprezentatív

képek mutatják az ATP által kapott befelé irányuló áramokat ivermektin nélkül (A panel) és

ivermektin jelenlétében (C panel). A B panel az ATP-re (0,1-300 µM) adott koncentráció-

válaszokat mutatja. A D panel a TNP-ATP (0,05-50 µM) koncentráció adatait jelöli 1 µM ATP

stimulálásakor. Az értékeket átlag ± SEM formában adtuk meg. A hibasávok nem mindig

láthatóak az alacsony SEM értékek következtében. A méréseket minden koncentrációban

legalább háromszor megismételtük.

250 250

33

V. 4. Az ATP-indukált intracelluláris Ca2+ koncentráció mérése a hP2X4

receptorokat stabilan expresszáló sejtekben

A natív HEK-293 sejtekben az ATP (0,5-100 µM) egy tranziens emelkedést váltott ki az

intracelluláris kalciumkoncentrációban, míg alacsonyabb dózisban az agonista (0,1-0,25

µM) nem okozott változást az intracelluláris kalciumszintben (10. ábra). Nominálisan

kalcium-mentes oldatban az ATP (0,1-100 µM) a fent leírtakhoz hasonló választ

indukált (11. ábra). Ebből arra következtettünk, hogy a kalciumfelszabadulás az

intracelluláris raktárakból történt, az így kapott kalciumjel a P2Y receptorok

jelenlétének köszönhető. Bár az extracelluláris kalcium jelenlétében az ATP-indukált

kalciumjel nagyobb volt, mint a nominálisan kalcium-mentes oldatban, azonban egyik

esetben sem láttunk fenntartott választ (10. ábra).

Ezt követően megvizsgáltuk az ATP által kiváltott Ca2+ jelet olyan HEK-293

sejtklónokban, melyek stabilan expresszálják a P2X4 receptorokat. Ezekben a sejtekben

a 0,1-0,25 µM ATP alkalmazása intracelluláris kalciumkoncentráció-változást

eredményezett (12. ábra). Ezt a választ azonban nem tapasztaltuk nominálisan kalcium-

mentes oldatban (13. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az extracelluláris

térből történt a kalcium belépés a sejtekbe (12. és 13. ábra). Magasabb ATP

koncentráció (≥ 1 µM) alkalmazása során azonban fenntartott kalciumjelet láttunk (12.

ábra). A P2X4 receptor specifikus pozitív allosztérikus modulátor ivermektin (20 µM)

potencírozta a 0,25 µM ATP által kiváltott kalcium belépést (AUCATP = 852 ± 47; n=5,

illetve AUCATP+IVM =1026 ± 46; n=5; p <0,05). Ezek az eredmények azt bizonyítják,

hogy az alacsony koncentrációjú ATP (≤ 0,25 µM) hatására létrejött kalciumjel a P2X4

receptorok jelenlétéhez köthető, és a P2Y receptorok nem vesznek részt ennek

kialakításában.

34

10. ábra. ATP-indukált intracelluláris kalciumkoncentráció-változások detektálása FLIPR

Tetra módszerrel. Az extracelluláris ATP által kiváltott dózisfüggő tranziens intracelluláris

Ca2+ koncentráció-változás a natív HEK-293 sejtekben extracelluláris kalcium jelenlétében. A

mérés 6 kísérlet átlagából készült.

35

11. ábra. ATP által kiváltott intracelluláris kalciumkoncentráció-változások detektálása

nominálisan kalcium-mentes oldatban. Natív HEK-293 sejtek vizsgálata extracelluláris

kalcium hiányában. Az extracelluláris ATP koncentrációfüggő módon tranziens citoszólikus

Ca2+ koncentráció-változást eredményezett. Az eredmény 6 mérés átlagát mutatja.

36

12. ábra. Az intracelluláris kalcium koncentrációjának meghatározása extracelluláris

kalcium jelenlétében. A hP2X4 receptort stabilan expresszáló HEK-293 sejtekben az ATP

adását követően fenntartott a kalciumválasz extracelluláris kalcium jelenlétében. A felvétel 6

mérés átlagát mutatja.

37

13. ábra. Az intracelluláris kalcium koncentrációjának meghatározása nominálisan

kalcium-mentes oldatban. A P2X4 receptort kifejező HEK-293 sejtek tranziens válasza

kalcium-mentes közegben, mely hasonló a nem-transzfektált sejtek válaszával. Az eredmény 6

egyedi mérés átlagából készült.

V. 5. Az 5-BDBD gátolja az ATP-által indukált Ca2+ jeleket a hP2X4 receptorokat

stabilan expresszáló sejtekben

A humán P2X4 receptorokat stabilan expresszáló HEK-293 sejteken tanulmányoztuk a

benzodiazepin-származék 5-BDBD hatását 0,25 µM ATP jelenlétében. Eredményeink

azt mutatják, hogy az 5-BDBD (2-20 µM) szignifikánsan gátolta a P2X4 receptor-

mediált kalcium választ (14. ábra A panel). Az 5-BDBD hasonló gátlást mutatott abban

az esetben is, amikor a sejteket 0,5 µM ATP-vel stimuláltuk (14. ábra B panel). Az 5-

BDBD (1-20 µM) az ATP koncentrációtól függetlenül nem volt hatással a natív HEK-

293 sejtekre. Ebből arra következtettünk, hogy az 5-BDBD nem gátolja az endogénen

jelen levő P2Y receptorokat.

38

14. ábra. Az 5-BDBD gátolja az ATP-által indukált Ca2+ jeleket a humán P2X4

receptorokat stabilan expresszáló HEK-293 sejtekben. Az A és a B paneleken a kalcium

válaszok 5-BDBD általi koncentráció-függő gátlása látható 0,25 µM és 0,5 µM ATP

jelenlétében. Az értékeket átlag ± SD formában adtuk meg. Minden mérést legalább négyszer

megismételtünk. Az A. U. mérési egységet jelent. *p <0,05 és **p <0,005 szemben az ATP

pozitív kontrollokkal (ANOVA).

V. 6. Egyes sejtek szintjén történő kalciummérés a tranziensen expresszált hP2X4

receptorokon

V. 6. 1. Az [Ca2+]i -ban bekövetkező ATP-indukált koncentrációfüggő változás a humán

P2X4 receptort expresszáló és nem-expresszáló sejtekben

Az egyedi sejteken történő kalcium mérés egy alternatív módszer a P2X receptor

csatornák aktivitásának vizsgálatára (123). Ezért, az ATP-indukált intracelluláris Ca2+

szignált az egyes sejtek szintjén is tanulmányoztuk. Annak érdekében, hogy a P2X4

receptorokat expresszáló és nem expresszáló sejtek intracelluláris kalciumszintjének

változásait egyszerre detektálhassuk, tranziensen transzfektált sejteket használtunk.

Elsőként azt az ATP-koncentráció értéket határoztuk meg, ahol a P2X és a P2Y

receptorok által indukált Ca2+ válasz aránya a legnagyobb. A P2Y receptor-indukált

válasz nagyságát a citoszólikus kalciumcsúcs amplitúdójával becsültük meg. A P2X

39

receptor-mediált kalciumválasz mértékét a görbe alatti terület (AUC) nagyságának

meghatározásával becsültük meg, amely a fenntartott kalciumválasz mértékét tükrözi. A

P2X4 receptorokat nem expresszáló sejtekben 0,1 µM és 0,5 µM ATP alkalmazása során

kis amplitúdójú tranziens kalciumválaszt tapasztaltunk (15. ábra A panel). A P2X4

receptorokat expresszáló sejtekben a kalciumcsúcs 0,1 µM és 0,5 µM ATP hatására

szignifikánsan magasabbnak bizonyult a P2X4 receptorokat nem expresszáló sejtekhez

képest. Fontos azonban megjegyezni, hogy jelentős kalciumjel csak 0,5 µM ATP

adásakor volt megfigyelhető (15. ábra A panel). Az ATP koncentrációjának további

emelése (1 µM) esetén jelentős emelkedést láttunk az intracelluláris kalciumcsúcs

amplitúdójában, ami a P2X4 receptorokat nem expresszáló sejtekben is megfigyelhető

volt. A P2X4 receptorokat expresszáló sejtekben azonban az 1 µM ATP stimulálásakor

keletkezett fenntartott kalciumjel nem különbözött szignifikánsan a 0,5 µM ATP által

kapott fenntartott kalcium válasz nagyságától (15. ábra A panel). Mivel a P2X, valamint

a P2Y receptormediált kalciumválasz aránya 0,5 µM ATP alkalmazásánál volt a

legnagyobb (15. ábra B Panel), a további kísérleteinkben ezt az agonistakoncentrációt

választottuk az egyedi sejtek kalciumjeleinek vizsgálatára.

40

15. ábra. Az [Ca2+]i -ban bekövetkező ATP-indukált koncentrációfüggő változás a humán

P2X4 receptort expresszáló és nem-expresszáló HEK-293 sejtekben. Reprezentatív

felvételek mutatják a különböző ATP koncentrációk (0,1-1 µM) hatását az [Ca2+]i -ban. Minden

mérést legalább ötször megismételtünk (A panel). A B panelen a P2X, valamint a P2Y receptor

által keletkezett kalcium válaszok arányai láthatóak különböző ATP koncentrációk adásakor. A

P2Y receptorhoz köthető válaszokat az intracelluláris kalciumcsúcs amplitúdójával becsültük

meg. A P2X receptorhoz kapcsolt válaszokat a görbe alatti terület (AUC) értékkel számítottuk

ki, mivel a kalciumjel fenntartott volt. A SEM értékeket nem mutattuk a reprezentatív

felvételeken, mert az átlag 10%-on belül volt. Az A. U. mérési egységet jelent.

V. 6. 2. Az ATP indukált [Ca2+]i változás vizsgálata kalciumot tartalmazó és kalcium-

mentes oldatban, valamint ivermektin jelenlétében

Annak igazolására, hogy a P2X4 receptorokat expresszáló sejtekben az ATP indukált

fenntartott kalciumjel az extracelluláris térből történő kalciumbeáramlás eredménye,

elvégeztük a kísérleteket nominálisan kalcium-mentes oldatban is. Ilyen körülmények

között csak egy tranziens kalciumjelet láttunk, ami azt bizonyítja, hogy a kalcium

41

beáramlás a funkcionális P2X4 receptorok jelenlétének köszönhető (16. ábra). Az

extracelluláris kalcium jelenléte nem változtatta meg az ATP-indukált intracelluláris

kalcium jel tranziens jellegét a P2X4 receptorokat nem expresszáló sejtekben (16. ábra).

Ezek az eredmények kizárták annak a lehetőségét, hogy a belső raktárak által vezérelt

kalciumcsatornák szignifikáns szerepet játszanak a kalciumbeáramlásban, 0,5 µM ATP-

vel történt stimuláció során. A fenntartott kalciumjel további vizsgálata céljából a

sejteket öt percig előkezeltük 10 µM ivermektinnel. Ezen körülmények között az ATP-

indukálta fenntartott kalcium jel szignifikánsan megemelkedett a P2X4 receptorokat

kifejező sejtekben, azonban P2X4 receptorokat nem expresszáló sejtekben ez a változás

nem volt megfigyelhető (16. ábra).

16. ábra. Egyes sejteken történő intracelluláris [Ca2+] mérés a P2X4 receptorokat

expresszáló és nem expresszáló sejtekben. A felső panel kalcium jelenlétében és kalcium-

mentes körülmények között mutatja be az intracelluláris [Ca2+] változást. Az alsó panel azt

mutatja, hogy az ivermektin a humán P2X4 receptorokat expresszáló sejtekben potencírozza az

ATP-indukált kalcium jelet.

42

V. 6. 3. Az 5-BDBD és a TNP-ATP dózis-függő gátlása a hP2X4 receptorokat

tranziensen expresszáló sejtekben

Kísérleteink folytatásaként megvizsgáltuk, hogy az 5-BDBD milyen hatással van a

P2X4 receptor-mediált kalciumbeáramlásra 0,5 µM ATP jelenlétében. Amikor a sejteket

5-BDBD-vel (0,5-20 µM) kezeltük elő azt tapasztaltuk, hogy a fenntartott kalciumjel

szignifikánsan lecsökkent. Az AUC értékek 50%-os csökkenését hozzávetőlegesen 2

µM 5-BDBD jelenléte váltotta ki (17. ábra A panel). Tekintettel arra, hogy korábbi

irodalmi adatok szerint a TNP-ATP a P2X4 receptorok antagonistája (87), méréseinket a

TNP-ATP gátló hatásának tanulmányozásával folytattuk. A TNP-ATP (0,5-50 µM) 0,5

µM ATP jelenlétében koncentrációfüggő módon gátolta a fenntartott kalciumjelet (17.

ábra B panel). Ezekből az eredményekből azt a következtetést vontuk le, hogy mind az

5-BDBD, mind a TNP-ATP gátolják az ATP indukált kalciumjelet a hP2X4

receptorokat tranziensen expresszáló sejtekben.

17. ábra. Az 5-BDBD és a TNP-ATP dózis-függő módon gátolják az ATP-által indukált

kalcium jeleket a humán P2X4 receptorokkal tranziensen transzfektált HEK-293

sejtekben. Az A és a B paneleken az 5-BDBD (0,5-20 µM), valamint a TNP-ATP (0,5-50 µM)

koncentráció-függő gátlása látható az ATP-indukált kalciumválaszon. A kísérletek számát

zárójelben mutatjuk az oszlopok alatt.

43

V. 7. Az 5-BDBD koncentráció-függő gátlásának vizsgálata a hP2X4 receptorokon

elektrofiziológiai módszerekkel

A fentiekben bemutatott kísérletek eredményei azt mutatták, hogy az 5-BDBD gátolta a

P2X4 receptor-mediált Ca2+ beáramlást a stabilan és a tranziensen transzfektált HEK-

293 sejtekben. Ugyanakkor az intracelluláris kalcium koncentrációk mérése során

számolni kell azzal, hogy az endogén P2Y receptorok aktiválódhatnak és/vagy az ion

transzporterek eltávolítják a kalciumot a citoszólból (pl. plazma membrán kalcium

ATP-áz, szarkoplazmás retikulum kalcium ATP-áz), melyek az 5-BDBD

hatékonyságának megítélését befolyásolhatják. Ezért megvizsgáltuk az 5-BDBD gátló

hatását HEK-293 sejtekben, a patch clamp technika teljes sejt konfigurációjában. A

sejteket 1 µM ATP-vel stimuláltuk (ez az érték közel volt az ATP EC30 értékéhez), mert

az agonista magasabb koncentrációja a mérések során gyakran a sejtek idő előtti

pusztulását okozta. Ezen kísérleti körülmények között azt találtuk, hogy az 5-BDBD

(0,1-50 µM) koncentrációfüggő módon gátolta a P2X4 receptor-mediált befelé irányuló

ionáramokat (18. ábra).

44

18. ábra. Az 5-BDBD koncentrációfüggő gátlásának vizsgálata a humán P2X4

receptorokat tranziensen expresszáló HEK-293 sejtekben. Az eredeti reprezentatív

felvételek mutatják az 5-BDBD gátlását különböző koncentrációk alkalmazásakor (A panel). Az

5-BDBD (0,1-50 µM) koncentráció-függő gátlása 1 µM ATP jelenlétében (B panel). Az

értékeket átlag ± SEM formában adtuk meg. A hibasávok nem mindig láthatóak az alacsony

SEM értékek következtében. A méréseket minden koncentrációban legalább háromszor

megismételtük.

V. 8. Az 5-BDBD kompetitíven gátolja a hP2X4 receptor csatornákat

Az 5-BDBD koncentrációfüggő gátló hatásának vizsgálatát követően célul tűztük ki

annak kiderítését, hogy az 5-BDBD kompetitív vagy allosztérikus módon gátolja-e a

P2X4 receptorokat. Az 5-BDBD 2 µM és 20 µM-os koncentrációban az ATP dózis-

hatás görbét jobbra tolta. Tekintettel arra, hogy a maximális áram nagysága nem

változott, arra következtettünk, hogy az 5-BDBD kompetitív módon gátolta a P2X4

receptorokat (19. ábra).

45

19. ábra. Az 5-BDBD kompetitív módon gátolta az ATP-által indukált befelé irányuló

áramokat a humán P2X4 receptorokat tranziensen expresszáló HEK-293 sejtekben. Az

ATP-t 0,1-300 µM-os koncentrációban adtuk, illetve 2 µM és 20 µM 5-BDBD-vel előkezeltük.

Az ATP válasz-görbe jobbra tolódott, miközben a maximális stimuláció nem változott. Ezek az

eredmények azt mutatták, hogy az 5-BDBD kompetitíven gátolja a P2X4 receptor csatornákat.

Az értékeket átlag ± SEM formában adtuk meg. A SEM értékek nem mindig láthatóak, mert

értékük alacsony volt. A méréseket minden koncentrációban legalább háromszor

megismételtük.

V. 9. A hTRPV6 plazmamembrán expressziója HEK-293 sejtekben

Az RFP-hTRPV6-ot expresszáló HEK-293 klónok létrehozását követően, a TRPV6

expressziójának kimutatására western blot technikát és biotinilációs eljárást

használtunk. Eredményeink azt mutatták, hogy a hTRPV6 fehérje csak a transzfektált

HEK-293 klónokban van jelen, natív HEK-293 sejtekben nem expresszálódik a fehérje

(20. ábra). Biotinilációval végzett kísérletek igazolják, hogy a hTRPV6 fehérje a

plazmamembránban expresszálódik (117) (20. ábra).

46

20. ábra. A hTRPV6 expressziója a pTagRFP-C1-hTRPV6-al stabilan transzfektált HEK-

293 sejtekben. Western blot kép mutatja az anti-tRFP antitesttel jelölt RFP-hTRPV6

megjelenését a teljes sejt lizátumban, a citoszól és a membrán frakcióban. Az 1. és a 2. nyilak a

hTRPV6 glikozilált és nem-glikozilált formáját mutatják. A 3. nyíl vélhetően az RFP-vel jelölt

hTRPV6 degradációs terméke. Az alsó ábrán az aktin mint belső kontroll látható.

V. 10. A hTRPV6 működése és gátlása

V. 10. 1. A hTRPV6 kalciumpermeábilis ioncsatorna

A következőkben a hTRPV6 csatornán keresztüli kalcium transzportot vizsgáltuk.

Nominálisan kalcium-mentes oldatban nem találtunk különbséget a kiindulási

intracelluláris kalcium koncentrációban a kontroll és hTRPV6 fehérjével tranziensen

transzfektált HEK-293 sejtek között (0,662 ± 0,038, n = 168 vs. 0,722 ± 0,085, n =

250). Abban az esetben azonban, ha 1 mM kalciumot adtunk az extracelluláris oldathoz,

egy jelentős tranziens emelkedést követően az intracelluláris kalciumkoncentráció

magasabb szinten stabilizálódott a transzfektált sejtekben, mint a kontroll sejtekben (21.

47

ábra). Korábban már igazoltuk, hogy a HEK-293 sejtek üres vektorral (pEYFP-C1)

történt transzfekcióját követően nem történt változás sem a kiindulási intracelluláris

kalciumkoncentrációban, sem a plazmamembránon keresztül folyó ionáramban (117).

21. ábra. A hTRPV6 kalciumpermeábilis ioncsatorna. A reprezentatív felvétel azt mutatja,

hogy nominálisan kalcium-mentes oldatban az intracelluláris kalciumkoncentráció azonos a

transzfektált és a nem-transzfektált HEK-293 sejtekben. Amikor 1 mM kalciumot adtunk az

extracelluláris oldathoz, jelentős tranziens intracelluláris kalciumkoncentráció-emelkedés volt

tapasztalható, melyet egy fenntartott Ca2+ jel követett a hTRPV6 fehérjét expresszáló sejtekben.

Ugyanezen körülmények között a kontroll sejtekben nem volt szignifikáns intracelluláris

kalciumkoncentráció-emelkedés.

V. 10. 2. A 2-APB gátolja a hTRPV6 csatornákon keresztüli Ca2+ beáramlást

Munkánk folytatásaként a belső kalciumraktárak által vezérelt plazmamembrán Ca2+

csatornák gátlószerének, a 2-APB-nek a hatását vizsgáltuk a hTRPV6 csatornákon.

Nominális kalcium-mentes oldatban a 2-APB (100 µM) nem befolyásolta az

intracelluláris kalciumszintet sem a kontroll, sem a hTRPV6 fehérjét expresszáló

sejtekben. Extracelluláris kalcium (1 mM) jelenlétében a 2-APB (100 µM) mindkét

sejtcsoportban szignifikánsan gátolta a kalcium beáramlást (22. és 23. ábra).

48

22. ábra. A 2-APB gátló hatása. A 2-APB 1 mM extracelluláris kalcium jelenlétében

szignifikánsan csökkentette az intracelluláris kalciumválaszt a transzfektált HEK-293 sejtekben.

23. ábra. A 2-APB gátlás összesített adatai. Az oszlopdiagramok a Fura-2 arány

emelkedésének kezdeti sebességét mutatja 1 mM extracelluláris kalcium hozzáadását követően.

Minden mérést legalább hatszor megismételtünk, egy mérés alkalmával ötven sejtet mértünk le.

*p <0,05; #p <0,001.

49

V. 10. 3. A 2-APB gátolja a hTRPV6 csatornán keresztüli Mn2+ transzportot

A humán TRPV6 aktivitását mangán „quench” módszer alkalmazásával

tanulmányoztuk. A 2-APB gátló hatását a Fura-2 emissziójának csillapításával MnCl2

jelenlétében vizsgáltuk. A mangánbeáramlás a transzfektált sejtekben szignifikánsan

intenzívebb volt, mint a kontroll sejtekben. Következésképpen, ez a módszer alkalmas a

2-APB hTRPV6 fehérjére gyakorolt hatásának vizsgálatára (24. ábra). A sejtek 2-APB-

vel (100 µM) történt előkezelését követően szignifikánsan csökkent a Mn2+ beáramlás

mértéke, amely a hTRPV6 fehérje gátlására utal. Az extracelluláris kalcium jelenléte kis

mértékben befolyásolta a 2-APB gátló hatását a hTRPV6 ioncsatornán (65,9%-os gátlás

volt kalcium jelenlétében és 88,7%-os volt a gátlás kalcium-mentes közegben) (25. és

26. ábra).

24. ábra. Reprezentatív, normalizált Fura-2 által emittált fényintenzitás-mérés, mely a

Mn2+ beáramlás mértékét mutatja. A Fura-2 által emittált fény intenzitást 359 nm-en

(kalciumra nem érzékeny hullámhossz) történt gerjesztést követően mértük. A mangán-

beáramlás mértéke szignifikánsan magasabb volt a hTRPV6 fehérjét expresszáló sejtekben a

kontroll sejtekhez viszonyítva.

50

25. ábra. A 2-APB gátolja a hTRPV6 csatornákon keresztüli Mn2+ beáramlást a

tranziensen transzfektált HEK-293 sejtekben. Az előkezelésben adott 2-APB szignifikánsan

csökkentette a hTRPV6-on keresztüli Mn2+ beáramlás mértékét.

51

26. ábra. Az adatok a Fura-2 által emittált fényintenzitás csökkenés rátáját mutatják 250

µM Mn2+ jelenlétében. Csoportonként 80 sejtet vizsgáltunk, a méréseket hatszor ismételtük

meg. #p <0,001.

V.11. A hTRPV6 fehérjék citoszól és membrán frakciójának elkülönítése HEK-293

sejtekben

A továbbiakban arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a 2-APB hatással van-e a

hTRPV6 fehérje expressziójára a teljes és a plazmamembrán frakcióban.

Következésképpen membránfelszíni biotinilációs kísérleteket végeztünk 2-APB (100

µM) jelenlétében. Eredményeink azt mutatják, hogy sem a teljes hTRPV6 fehérje

szintjében, sem pedig a plazmamembrán-szintjében nem volt változás a 2-APB

előkezelés hatására (27. ábra).

52

27. ábra. A hTRPV6 fehérje expressziója a HEK-293 sejtekben 2-APB (100 µM) kezelés

után. Az A panelen a citoplazma, a B panelen a plazmamembrán frakció látható. A hTRPV6

kimutatására anti-tRFP antitestet használtunk, ez a membrán felső részén látható. A belső

kontroll aktin volt, amit anti-aktin antitesttel mutattuk ki, ezt a membrán alsó része mutatja. A

hTRPV6 fehérjénél három specifikus csíkot kaptunk. Biotinilációs kísérletek biotin nélkül

negatív kontrollként vannak jelen. A hTRPV6 fehérje membrán vagy plazmamembrán

expressziójára az öt percen át tartó 2-APB előkezelés nem volt hatással.

53

VI. Megbeszélés

VI.1. A P2X4 receptor ioncsatornák működése és gátlása

A P2X4 receptorok számos élettani és kórélettani folyamatban játszanak fontos szerepet.

Ezek közé tartoznak például az endotélsejtek és a hámsejtek közötti autokrin és parakrin

jelátvitel, a krónikus fájdalomérzékelés, valamint a központi idegrendszerbe érkező

afferens szignalizáció (124). A P2X4 receptorok szerepének vizsgálatát nehezíti a

szelektív gátlószerek hiánya. Néhány éve ismert, hogy a benzodiazepin származék 5-

BDBD szelektíven gátolja a P2X4 receptorokat (89). Tekintettel arra azonban, hogy az

5-BDBD gátló tulajdonságaira vonatkozó adatok szabadalmi védelem alatt állnak,

használatával kapcsolatban eltérő adatok jelentek meg az irodalomban. Az 5-BDBD

gyenge gátlószernek bizonyult a rekombináns humán P2X4 receptorokon HEK-293

sejtekben (90) és a natív P2X4 receptorokon a vaszkuláris endotélsejtekben (IC50≈30

µM) (92). Ezzel szemben a prechondrogén sejteken már 10 µM 5-BDBD szignifikánsan

gátolta a P2X4 receptorokat (91). Legjobb tudomásunk szerint ez idáig nem végeztek

párhuzamos elektrofiziológiai és citoszolikus kalciumkoncentráció-méréseket az 5-

BDBD gátló hatásának vizsgálatára. Következésképpen, megvizsgáltuk az 5-BDBD

gátló hatását az ATP-függő P2X4 receptor-mediált ionáramokra, valamint az

extracelluláris Ca2+ belépésre. Eredményeink azt mutatták, hogy az 5-BDBD kompetitív

gátló hatással bír, de a kísérleti körülményektől függően a gátlás mértéke szignifikáns

eltéréseket mutathat. A „patch clamp” technika teljes sejt konfigurációjában az 5-BDBD

hatását közvetlenül a P2X4 fehérjén vizsgáltuk. Ilyen körülmények között tapasztaltuk a

leghatékonyabb gátlást. A citoszólikus kalciumkoncentráció-mérések során az 5-BDBD

sokkal markánsabban gátolta a P2X4 receptorokat abban az esetben, ha a fehérjét kódoló

cDNS-t tranziensen transzfektáltuk a HEK-293 sejtekbe. Ennek valószínűleg az az oka,

hogy a P2X4 receptorok száma magasabb a tranziensen transzfektált sejtekben, mint a

fehérjét stabilan expresszáló sejtekben. Ezen túlmenően a tranziensen transzfektált

sejtekben az [Ca2+]i-t egyedi szinten vizsgáltuk.

A HEK-293 sejtekben legalább három különböző P2Y receptor altípus expresszálódik

endogénen (89, 125). Ennek ellenére gyakran használják a HEK-293 sejteket a P2X

receptorok tanulmányozására (125, 126). Mindazonáltal, számos munkacsoport használt

P2Y receptorokat nem expresszáló sejtvonalakat a P2X receptor csatornák

54

tanulmányozása céljából (pl. excitábilis egér immortalizált gonadotropin-releasing

hormon szekretáló sejteket (GT1) és humán asztrocitóma sejteket (1321N1) (123, 127).

Magas ATP koncentráció alkalmazása során (>10 µM) a P2Y receptor-indukálta

kalcium felszabadulás interferálhat a P2X receptor-mediálta extracelluláris kalcium

beáramlással a HEK-293 sejtekben. Kísérleti eredményeink igazolták, hogy amennyiben

alacsony koncentrációban alkalmazzuk az ATP-t az endogénen expresszálódó P2Y

receptorok nem aktiválódnak. Ez a körülmény lehetővé teszi a HEK-293 sejtekbe

transzfektált P2X receptorok tulajdonságainak vizsgálatát. A szubmikromoláris (≤ 0.25

µm) koncentrációban alkalmazott ATP kizárólag azokban a sejtekben okozott

citoszólikus kalciumkoncentráció-emelkedést, melyek expresszálnak P2X4 receptorokat.

A P2X4 receptorok szerepét a Ca2+ jel kiváltásában ivermektin alkalmazásával

igazoltuk. Az ivermektin csak extracelluláris Ca2+ jelenlétében potencírozta az ATP

hatását.

A magasabb koncentrációban alkalmazott ATP (≥1 µM) bifázisos kalcium jelet indukált

a natív HEK-293 sejteken, amely egy tranziens és egy fenntartott komponensből állt.

Extracelluláris kalcium hiányában a jel fenntartott komponense eltűnt, ami arra utal,

hogy ebben a fázisban Ca2+ belépés történik. Ezek az eredmények arra engedtek

következtetni, hogy a magas koncentrációjú ATP (≥1 µM) a P2X4 receptor

aktiválódástól független kalcium beáramlást okoz a natív HEK-293 sejtekben. A

kalcium válasz kezdeti szakasza szignifikánsabb meredekebb volt a P2X4 receptorokat

expresszáló sejtekben, mint a natív sejtekben. Fontos megjegyezni, hogy kísérleteink

során nominálisan kalcium-mentes oldatot használtunk. Nem alkalmazhattunk kalcium

kelátort (pl: EGTA-t), ugyanis a HEK-293 sejtek tárgylemezhez tapadásához az

extracelluláris kalcium nélkülözhetetlen. Méréseinkből arra következtettünk, hogy a

magasabb koncentrációjú ATP-indukálta (>1 µM) kalciumjel magába foglalja a P2Y

receptorfüggő kalciumfelszabadulást, melyet az intracelluláris raktárak ürülése

eredményez. Eredményeink azt bizonyítják, hogy alacsony koncentrációjú ATP-vel

történő stimulációt követően az intracelluláris kalciumkoncentráció-mérések alkalmasak

a HEK-293 sejtekbe transzfektált P2X receptorok tulajdonságainak tanulmányozására.

A stabilan transzfektált HEK-293 sejteken történő kalcium-mérés során nem lehetett

elkülöníteni a P2X4 receptorokat expresszáló és nem-expresszáló sejteket.

55

Következésképpen, az egyes sejtek szintjén történő kalciumkoncentráció-mérési

módszert használtuk a P2X4 receptorokat expresszáló és nem expresszáló sejtek

összehasonlítására egy adott tárgylemezen. Eredményeink azt mutatták, hogy a P2X4

receptort nem-expresszáló sejtekben a 0,5 µM és ennél kisebb koncentrációban használt

ATP csupán egy kis, tranziens-változást eredményezett az intracelluláris Ca2+

koncentrációban, míg az 1 µM ATP szignifikánsan emelte a kalciumjel amplitúdóját. Ez

a jelenség valószínűleg az endogén módon expresszálódó P2Y receptor altípusok

fokozatos aktiválódásának köszönhető (128).

Figyelemreméltó, hogy nominálisan kalcium-mentes oldatban az ATP-által kiváltott

kalciumjel amplitúdója szignifikánsabb magasabb volt a P2X4 receptorokat tranziensen

expresszáló sejtekben, mint a nem-expresszáló sejtekben. Hasonló eredményt kaptunk a

P2X4 fehérjével stabilan transzfektált HEK-293 sejtekben is. A fentiekből arra

következtethetünk, hogy a különbség sokkal inkább a P2X4 receptoron keresztül történő

Ca2+ beáramlásnak, mint sem az intracelluláris raktárakból származó Ca2+

felszabadulásnak tulajdonítható. A transzfektált sejtek magas P2X4 expressziója,

valamint a kalcium kelátorok hiányában a mikromoláris koncentrációban jelen levő

Ca2+ együttesen eredményezik a kalcium beáramlást. Az eredményeink azt is igazolták,

hogy az ivermektin a P2X4 receptorokat tartalmazó sejtekben potencírozta az ATP-által

indukált kalcium beáramlást. Fontos azonban megjegyezni, hogy az ivermektin csak a

kalcium beáramlásra volt stimuláló hatással, a P2X4 receptorok sejtfelszíni expresszióját

nem befolyásolta (84) (129).

Az elektrofiziológiai mérések adatai megerősítették a funkcionális P2X4 receptorok

jelenlétét a tranziensen transzfektált HEK-293 sejtekben. A P2X4 receptorokat

expresszáló sejtekben az ATP, ivermektinnel potencírozható befelé irányuló áramot

indukált. Az ATP általunk meghatározott EC50 értéke megfelel a korábban közölt

adatoknak (88). Fontos hangsúlyozni azt is, hogy 1 µM-nál magasabb ATP

koncentráció alkalmazása gyakran irreverzibilis sejtkárosodást okozott. Ez a

megfigyelés magyarázható a P2X4 receptorok magas szintű expressziójával és a jelentős

kationbeáramlással, melyek a sejtek károsodásához vezethetnek. Következésképpen, az

5-BDBD és a TNP-ATP gátló tulajdonságát 1 µM ATP jelenlétében teszteltük.

56

A P2X4 receptorok kulcsszerepet töltenek be a neuropátiás fájdalom patogenezisében

(63). Fájdalomcsillapítás céljából Nagata és munkatársai megvizsgáltak néhány

antidepresszáns készítmény hatását a P2X4 receptorokra (127). Azt találták, hogy a

paroxetin dózis-függő módon gátolta a P2X4 receptorokat. A paroxetin nem-kompetitív

antagonistaként viselkedett, IC50 értéke 2,5 µM volt a patkány és 1,9 µM volt a humán

P2X4 receptorokon. A TNP-ATP-vel összevetve a paroxetin hatása szignifikánsan

erősebbnek bizonyult a patkány P2X4 receptorokon (127). Irodalmi adatok szerint a

TNP-ATP ezerszer potensebb gátlószere a P2X1 és P2X3 receptoroknak, mint a P2X4-

nek (85). Ugyanakkor a TNP-ATP-t mint P2X4 receptor antagonistát számos

tanulmányban használták (124, 130). Az eredményeink azt mutatják, hogy a TNP-ATP

gátolja az intracelluláris Ca2+ jeleket, és az ATP-által stimulált befelé irányuló

ionáramokat is. ATP (1 µM) alkalmazása során a TNP-ATP IC50 értéke 1,5 µM volt,

mely összevethető korábbi tanulmányok eredményeivel (87). A TNP-ATP nem-

kompetitív antagonistája a P2X3 receptornak és hasonló hatás fejt ki a P2X4

receptorokon is (87).

Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy a TNP-ATP és az 5-BDBD hasonló gátlást

eredményeztek a rekombináns humán P2X4 receptorokat expresszáló HEK-293

sejteken. A TNP-ATP-vel ellentétben az 5-BDBD kompetitív módon gátolta a P2X4

receptorokat. Az 5-BDBD az ATP dózishatás görbét jobbra tolta, miközben a maximális

stimuláció nagysága nem változott. Nem zárhatjuk ki azonban annak a lehetőségét sem,

hogy az 5-BDBD csökkenti a csatorna ligandkötő affinitását. Ez annál is inkább igaz

lehet, mivel az ATP kötődés ilyesfajta alloszterikus változatait korábban már leírták a

P2X receptorokon (131, 132).

VI.2. TRPV6 ioncsatorna működése és gátlása

A TRPV6 ioncsatornákat mélyrehatóan vizsgálták az utóbbi évtizedekben. Ennek

ellenére a TRPV6 fehérjéknek máig sincs specifikus, potens gátlószere, illetve

aktivátora. A lantanidák közül a gadolínium és a lantán gátolják a humán TRPV6-ot

(109, 117). Bizonyos divalens kationok, mint például a cink, a kadmium, a mangán

gátolják a TRPV6-mediálta kalcium áramot (108, 109, 117). Egyes divalens kationok

57

(Ba2+, Sr2+, Hg2+) permeábilisak, mások (Ni2+) viszont nem a TRPV6 csatornákra.

Érdekes, hogy a cink alacsony mikromoláris koncentrációban stimulálta a humán

TRPV6 aktivitását (117). A ruténiumvörös gátolja a TRPV6 csatornákat, az IC50 értéke

9±1 µM (133). A gombaellenes szerek közül az ekonazol gátolta a TRPV6 által generált

kalciumáramot és a sejtproliferációt a humán TRPV6 fehérjét expresszáló HEK-293

sejtekben (134). Saját eredményeink azt mutatják, hogy a transzfektált hTRPV6

ioncsatornaként viselkedik a HEK-293 sejtekben. Az extracelluláris kalciumszint

megemelése szignifikánsan növeli az intracelluláris Ca2+ szintet a hTRPV6 fehérjét

expresszáló sejtekben. Sokáig vitatott volt, hogy a TRPV6 részét képezi-e a raktár által

vezérelt Ca2+ csatorna-rendszernek. A kérdés tisztázására kísérleteinkben 2-APB-t

alkalmaztuk, mely széles körben használt raktár által vezérelt Ca2+ csatorna-blokkoló.

Irodalmi adatok azt mutatják, hogy a 2-APB aktiválja a TRPV1, a TRPV2, a TRPV3, a

TRPA1 és a TRPM6, míg gátolja a TRPC4, a TRPC5, a TRPC6, a TRPM2 és a TRPM7

csatornákat (15, 135). Saját adataink arra utalnak, hogy a 2-APB szignifikánsan gátolja

a humán TRPV6 csatornákat. A 2-APB gátló hatása csak kis mértékben függ az

extracelluláris Ca2+ koncentrációtól. Az 1 vagy 2 mM-os extracelluláris Ca2+ jelenléte

minimálisan csökkentette a 2-APB hatását. Megvizsgáltuk továbbá, hogy a TRPV6

expressziót gátolja-e a 2-APB-vel történt előkezelés. Azt tapasztaltuk, hogy öt percen át

történő előkezelés nem okozott semmilyen változást a TRPV6 csatorna plazmamembrán

expressziójában. A 2-APB gátló hatását a Fura-2 emissziójának csillapításával MnCl2

jelenlétében vizsgáltuk. A mangán-beáramlás szignifikánsan nagyobb volt a

transzfektált sejtekben, a kontroll sejtekhez viszonyítva. A sejtek 2-APB-vel (100 µM)

történt előkezelését követően szignifikánsan csökkent a Mn2+ beáramlás mértéke, amely

a hTRPV6 fehérje gátlására utal.

Összefoglalásképpen elmondhatjuk, hogy a hTRPV6 divalens kationokra permeábilis

ioncsatornaként működik. A 2-APB azonos koncentrációtartományban gátolja a humán

TRPV6 fehérjét, mint a raktár által vezérelt kalciumcsatornákat. Ugyanakkor az

eredményeinkből arra nem kaptunk választ, hogy a TRPV6 ioncsatorna tagja-e a raktár

által vezérelt kalcium-csatorna rendszernek.

58

VII. Következtetések

Szubmikromoláris ATP koncentráció alkalmazása esetén, a citoszólikus kalcium

koncentráció mérése megbízható módszernek bizonyult a P2X receptor agonisták és

antagonisták farmakológiai tulajdonságainak vizsgálatára. Az 5-BDBD és a TNP-ATP

hasonló mértékben gátolják a humán rekombináns P2X4 receptorokat, azonban a

hatásmechanizmusuk különböző. Az 5-BDBD az ATP dózishatás görbét jobbra tolta,

miközben a maximális stimuláció nagysága nem változott. Ezek az eredmények arra

utalnak, hogy az 5-BDBD valószínűleg kompetitív gátlószere a humán P2X4

receptoroknak.

A humán TRPV6 fehérjék konstitutívan nyitott, divalens kationokra permeábilis

ioncsatornaként viselkednek. A hTRPV6 ioncsatornák megbízható, de nem specifikus

gátlószere a 2-APB. A 2-APB ugyanabban a koncentrációtartományban gátolja a raktár

által vezérelt kalcium csatornákat és a hTRPV6 ioncsatornákat. Mindazonáltal

eredményeink nem teszik lehetővé annak a kérdésnek a megválaszolását, hogy a

hTRPV6 ioncsatornák részét képezik-e a belső raktár vezérelt Ca2+ csatornának. A 2-

APB és hasonló struktúrájú vegyületek fontos szerepet tölthetnek be a hTRPV6

csatornák farmakológiai gátlásában.

59

VIII. Összefoglalás

VIII. 1. Magyar nyelvű összefoglaló

Az ATP által stimulálható P2X4 purinerg receptorok nem szelektív kation csatornaként

működnek és fontos szerepet töltenek be mind az ingerlékeny, mind a nem-ingerlékeny

sejtekben. A P2X4 receptor csatornák vizsgálatát nehezíti az a körülmény, hogy nincs

ismert specifikus gátlószerük. A benzodiazepin származék, 5-BDBD gátolja a P2X4

receptorokat, de a gátlás hatásossága nem tisztázott. Munkánk célja az volt, hogy

jellemezzük az 5-BDBD gátló hatását a humán rekombináns P2X4 receptorokon.

Vizsgálatainkban tranziensen és stabilan transzfektált HEK-293 sejteket használtunk. A

P2X4 receptor csatorna funkciót intracelluláris [Ca2+] mérésével és elektrofiziológiai

módszerek segítségével vizsgáltuk. Eredményeink azt mutatták, hogy az ATP

szubmikromoláris koncentrációban stimulálja a P2X4 receptorokon keresztüli kalcium

beáramlást, de nem aktiválja az endogénen jelen levő P2Y receptorokat. Az 5-BDBD és

a TNP-ATP koncentráció-függő módon gátolják mind a kalciumbeáramlást, mind az

ionáramokat. Az 5-BDBD az ATP dózishatás görbét jobbra tolta, ugyanakkor nem

befolyásolta az ATP-indukálta maximális áram amplitúdóját. Ezek az adatok arra

utalnak, hogy az 5-BDBD valószínűleg kompetitív gátlószere a humán P2X4

receptoroknak.

A TRPV6 fehérjék nagymértékben Ca2+ szelektív ioncsatornák, melyek fontos szerepet

töltenek be a kalciumfelszívódásban. A humán TRPV6 leginkább a duodenumban, a

placentában és az exokrin szövetekben expresszálódik. A humán TRPV6-ot kódoló gén

cDNS-ének tranziens és stabil transzfekcióját követően vizsgáltuk a fehérje működését

és 2-APB általi gátlását HEK-293 sejtekben. Eredményeink azt mutatták, hogy a

TRPV6 konstitutívan aktív, Ca2+ permeábilis csatornaként működik, melyet

szignifikánsan gátolt a 2-APB. Ez utóbbi megfigyelés megerősíti azt a korábbi

feltételezést, hogy a TRPV6 fehérjék részét képezhetik a belső raktár által vezérelt

kalcium csatorna komplexnek.

60

VIII. 2. Angol nyelvű összefoglaló

The ATP-gated P2X4 purinergic receptors function as non-selective cation channels and

play important roles in both excitable and non-excitable cells. Lack of known specific

inhibitors makes the investigation of P2X4 receptor channels difficult. The

benzodiazepine derivative, 5-BDBD inhibits the P2X4 receptors but details of its

inhibitory effects are largely unknown. Thus, we aimed to characterize the inhibitory

effects of 5-BDBD on recombinant human P2X4 receptors. In our experiments, we used

transiently and stably transfected HEK-293 cells. Function of P2X4 receptors was

assessed by measuring intracellular Ca2+ concentrations and recording of whole cell ion

currents. Our data show that administration of submicromolar concentrations of ATP

stimulates P2X4 receptor-mediated calcium influx, while endogenously expressed P2Y

receptors are not activated. TNP-ATP and 5-BDBD inhibit ATP-induced calcium

signals and inward ion currents in a concentration-dependent manner. 5-BDBD causes a

rightward shift in ATP dose-response curve. Since the magnitude of maximal

stimulation does not change, these data suggest that 5-BDBD may competitively inhibit

the P2X4 receptors.

TRPV6 proteins are highly calcium-selective ion channels and play important role in

calcium reabsorption. The human TRPV6 is expressed abundantly in the duodenum, the

placenta and exocrine tissues. Following transient or stable transfection of hTRPV6

proteins into HEK-293 cells, we tested the effects of 2-APB on hTRPV6 activity. Our

data show that TRPV6 proteins function as constitutively active, Ca2+ permeable

channels which are inhibited by 2-APB. This latter observation suggests that TRPV6

might be part of the store operated calcium channel complex.

61

IX. Irodalomjegyzék

1. Panyi G, Gáspár R. A membránpotenciál eredete és sejtbiológiai szerepe.

Ioncsatornák és farmakológiai vonatkozásaik. Szabó G (szerk.). Sejtbiológia,

Medicina, Budapest, 2009: 106-127

2. Boron WF, Boulpaep EL. Medical Physiology, Saunders, Philadelphia, 2009:

166-171

3. Burnstock G. (2006) Purinergic signalling. Br J Pharmacol, 147 Suppl 1: S172-

181

4. Drury AN, Szent-Gyorgyi A. (1929) The physiological activity of adenine

compounds with especial reference to their action upon the mammalian heart. J

Physiol, 68: 213-237

5. Holton P. (1959) The liberation of adenosine triphosphate on antidromic

stimulation of sensory nerves. J Physiol, 145: 494-504

6. Burnstock G, Campbell G, Satchell D, Smythe A. (1970) Evidence that

adenosine triphosphate or a related nucleotide is the transmitter substance

released by non-adrenergic inhibitory nerves in the gut. Br J Pharmacol, 40:

668-688

7. Burnstock G. (1976) Do some nerve cells release more than one transmitter?

Neuroscience, 1: 239-248

8. Edwards FA, Gibb AJ, Colquhoun D. (1992) ATP receptor-mediated synaptic

currents in the central nervous system. Nature, 359: 144-147

9. Schwiebert EM, Zsembery A. (2003) Extracellular ATP as a signaling molecule

for epithelial cells. Biochim Biophys Acta, 1615: 7-32

10. Fields RD, Burnstock G. (2006) Purinergic signalling in neuron-glia

interactions. Nat Rev Neurosci, 7: 423-436

11. Jeon US. (2008) Kidney and Calcium Homeostasis. Electrolyte Blood Press, 6:

68-76

12. Clapham DE. (1995) Calcium signaling. Cell, 80: 259-268

13. Kirichok Y, Krapivinsky G, Clapham DE. (2004) The mitochondrial calcium

uniporter is a highly selective ion channel. Nature, 427: 360-364

62

14. Rizzuto R, Pozzan T. (2006) Microdomains of intracellular Ca2+: molecular

determinants and functional consequences. Physiol Rev, 86: 369-408

15. Clapham DE. (2007) Calcium signaling. Cell, 131: 1047-1058

16. North RA. (2002) Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev, 82:

1013-1067

17. Mercer JC, Dehaven WI, Smyth JT, Wedel B, Boyles RR, Bird GS, Putney JW,

Jr. (2006) Large store-operated calcium selective currents due to co-expression

of Orai1 or Orai2 with the intracellular calcium sensor, Stim1. J Biol Chem,

281: 24979-24990

18. Berridge MJ. (1993) Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature, 361:

315-325

19. Csernoch L, Hunyadi J, Kovacs L. (2000) Calcium release activated calcium

entry in a human skin derived cell line (HaCaT). Exp Dermatol, 9: 200-205

20. Nayak L, De RK. (2007) Modularized study of human calcium signalling

pathway. J Biosci, 32: 1009-1017

21. Hilgemann DW, Yaradanakul A, Wang Y, Fuster D. (2006) Molecular control

of cardiac sodium homeostasis in health and disease. J Cardiovasc

Electrophysiol, 17 Suppl 1: S47-S56

22. Gomez-Villafuertes R, Mellstrom B, Naranjo JR. (2007) Searching for a role of

NCX/NCKX exchangers in neurodegeneration. Mol Neurobiol, 35: 195-202

23. Rossi AE, Dirksen RT. (2006) Sarcoplasmic reticulum: the dynamic calcium

governor of muscle. Muscle Nerve, 33: 715-731

24. Fredholm BB, AP IJ, Jacobson KA, Klotz KN, Linden J. (2001) International

Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of adenosine

receptors. Pharmacol Rev, 53: 527-552

25. Khakh BS, North RA. (2006) P2X receptors as cell-surface ATP sensors in

health and disease. Nature, 442: 527-532

26. Burnstock G, Kennedy C. (1985) Is there a basis for distinguishing two types of

P2-purinoceptor? Gen Pharmacol, 16: 433-440

27. Burnstock G, Fredholm BB, North RA, Verkhratsky A. (2010) The birth and

postnatal development of purinergic signalling. Acta Physiol, 199: 93-147

63

28. Abbracchio MP, Burnstock G, Verkhratsky A, Zimmermann H. (2009)

Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends Neurosci, 32:

19-29

29. Burnstock G, Verkhratsky A. (2009) Evolutionary origins of the purinergic

signalling system. Acta Physiol, 195: 415-447

30. Jo YH, Role LW. (2002) Coordinate release of ATP and GABA at in vitro

synapses of lateral hypothalamic neurons. J Neurosci, 22: 4794-4804

31. Sim JA, Chaumont S, Jo J, Ulmann L, Young MT, Cho K, Buell G, North RA.

Rassendren F. (2006) Altered hippocampal synaptic potentiation in P2X4

knock-out mice. J Neurosci, 26: 9006-9009

32. Khakh BS, Kennedy C. (1998) Adenosine and ATP: progress in their receptors'

structures and functions. Trends Pharmacol Sci, 19: 39-41

33. Roper SD. (2007) Signal transduction and information processing in mammalian

taste buds. Pflugers Arch, 454: 759-776

34. Housley GD, Marcotti W, Navaratnam D, Yamoah EN. (2006) Hair cells--

beyond the transducer. J Membr Biol, 209: 89-118

35. Rong W, Gourine AV, Cockayne DA, Xiang Z, Ford AP, Spyer KM, Burnstock

G. (2003) Pivotal role of nucleotide P2X2 receptor subunit of the ATP-gated ion

channel mediating ventilatory responses to hypoxia. J Neurosci, 23: 11315-

11321

36. von Kugelgen I, Wetter A. (2000) Molecular pharmacology of P2Y-receptors.

Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 362: 310-323

37. Burnstock G, Brouns I, Adriaensen D, Timmermans JP. (2012) Purinergic

signaling in the airways. Pharmacol Rev, 64: 834-868

38. Magni G, Ceruti S. (2013) P2Y purinergic receptors: new targets for analgesic

and antimigraine drugs. Biochem Pharmacol, 85: 466-477

39. Burnstock G. (2002) Purinergic signaling and vascular cell proliferation and

death. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 22: 364-373

40. Hoebertz A, Arnett TR, Burnstock G. (2003) Regulation of bone resorption and

formation by purines and pyrimidines. Trends Pharmacol Sci, 24: 290-297

64

41. Roman RM, Fitz JG. (1999) Emerging roles of purinergic signaling in

gastrointestinal epithelial secretion and hepatobiliary function.

Gastroenterology, 116: 964-979

42. Greig AV, Linge C, Terenghi G, McGrouther DA, Burnstock G. (2003)

Purinergic receptors are part of a functional signaling system for proliferation

and differentiation of human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol, 120:

1007-1015

43. Hao Y, Ko WH. (2014) Purinergic P2Y receptors in airway epithelia: from ion

transport to immune functions. Sheng Li Xue Bao, 66: 16-22

44. Flume PA, Van Devanter DR. (2012) State of progress in treating cystic fibrosis

respiratory disease. BMC Med, 10: 88

45. Coddou C, Yan Z, Obsil T, Huidobro-Toro JP, Stojilkovic SS. (2011) Activation

and regulation of purinergic P2X receptor channels. Pharmacol Rev, 63: 641-

683

46. Ennion S, Hagan S, Evans RJ. (2000) The role of positively charged amino acids

in ATP recognition by human P2X1 receptors. J Biol Chem, 275: 35656

47. Jiang LH, Rassendren F, Surprenant A, North RA. (2000) Identification of

amino acid residues contributing to the ATP-binding site of a purinergic P2X

receptor. J Biol Chem, 275: 34190-34196

48. Hattori M, Gouaux E. (2012) Molecular mechanism of ATP binding and ion

channel activation in P2X receptors. Nature, 485: 207-212

49. Baconguis I, Gouaux E. (2012) Structural plasticity and dynamic selectivity of

acid-sensing ion channel-spider toxin complexes. Nature, 489: 400-405

50. Egan TM, Khakh BS. (2004) Contribution of calcium ions to P2X channel

responses. J Neurosci, 24: 3413-3420

51. Khakh BS, Henderson G. (2000) Modulation of fast synaptic transmission by

presynaptic ligand-gated cation channels. J Auton Nerv Syst, 81: 110-121

52. Norenberg W, Gobel I, Meyer A, Cox SL, Starke K, Trendelenburg AU. (2001)

Stimulation of mouse cultured sympathetic neurons by uracil but not adenine

nucleotides. Neuroscience, 103: 227-236

53. Lamont C, Wier WG. (2002) Evoked and spontaneous purinergic junctional

Ca2+ transients (jCaTs) in rat small arteries. Circ Res, 91: 454-456

65

54. Brain KL, Cuprian AM, Williams DJ, Cunnane TC. (2003) The sources and

sequestration of Ca(2+) contributing to neuroeffector Ca(2+) transients in the

mouse vas deferens. J Physiol, 553: 627-635

55. Volonte C, Apolloni S, Skaper SD, Burnstock G. (2012) P2X7 receptors:

channels, pores and more. CNS Neurol Disord Drug Targets, 11: 705-721

56. Di Virgilio F. (2012) Purines, purinergic receptors, and cancer. Cancer Res, 72:

5441-5447

57. Di Virgilio F. (2007) Purinergic signalling in the immune system. A brief

update. Purinergic Signal, 3: 1-3

58. Surprenant A, North RA. (2009) Signaling at purinergic P2X receptors. Annu

Rev Physiol, 71: 333-359

59. Barclay J, Patel S, Dorn G, Wotherspoon G, Moffatt S, Eunson L, Abdel'al S,

Natt F, Hall J, Winter J, Bevan S, Wishart W, Fox A, Ganju P. (2002)

Functional downregulation of P2X3 receptor subunit in rat sensory neurons

reveals a significant role in chronic neuropathic and inflammatory pain. J

Neurosci, 22: 8139-8147

60. Cockayne DA, Dunn PM, Zhong Y, Rong W, Hamilton SG., Knight GE, Ruan

HZ, Ma B, Yip P, Nunn P, McMahon SB, Burnstock G, Ford AP. (2005) P2X2

knockout mice and P2X2/P2X3 double knockout mice reveal a role for the

P2X2 receptor subunit in mediating multiple sensory effects of ATP. J physiol,

567: 621-639

61. Coull JA, Beggs S, Boudreau D, Boivin D, Tsuda M, Inoue K, Gravel C, Salter

MW, De Koninck Y. (2005) BDNF from microglia causes the shift in neuronal

anion gradient underlying neuropathic pain. Nature, 438: 1017-1021

62. Chizh BA, Illes P. (2001) P2X receptors and nociception. Pharmacol Rev, 53:

553-568

63. Tsuda M, Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S, Mizokoshi A, Kohsaka S, Salter

MW, Inoue K. (2003) P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile

allodynia after nerve injury. Nature, 424: 778-783

64. Jacob F, Perez Novo C, Bachert C, Van Crombruggen K. (2013) Purinergic

signaling in inflammatory cells: P2 receptor expression, functional effects, and

modulation of inflammatory responses. Purinergic Signal, 9: 285-306

66

65. Labasi JM, Petrushova N, Donovan C, McCurdy S, Lira P, Payette MM,

Brissette W, Wicks JR, Audoly L, Gabel CA. (2002) Absence of the P2X7

receptor alters leukocyte function and attenuates an inflammatory response. J

Immunol, 168: 6436-6445

66. Mulryan K, Gitterman DP, Lewis CJ, Vial C, Leckie BJ, Cobb AL, Brown JE,

Conley EC, Buell G, Pritchard CA, Evans RJ. (2000) Reduced vas deferens

contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature, 403: 86-

89

67. Yamamoto K, Korenaga R, Kamiya A, Qi Z, Sokabe M, Ando J. (2000) P2X(4)

receptors mediate ATP-induced calcium influx in human vascular endothelial

cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 279: H285-292

68. Yamamoto M, Jin JJ, Wu Z, Abe M, Tabara Y, Nagai T, Yamasaki E, Igase M,

Kohara K, Miki T, Nakura J. (2006) Interaction between serotonin 2A receptor

and endothelin-1 variants in association with hypertension in Japanese.

Hypertens Res, 29: 227-232

69. Jorgensen NR, Adinolfi E, Orriss I, Schwarz P. (2013) Purinergic signaling in

bone. J Osteoporos, 2013: 673684

70. Shigetomi E, Kato F. (2004) Action potential-independent release of glutamate

by Ca2+ entry through presynaptic P2X receptors elicits postsynaptic firing in

the brainstem autonomic network. J Neurosci, 24: 3125-3135

71. Koshimizu TA, Van Goor F, Tomic M, Wong AO, Tanoue A, Tsujimoto G,

Stojilkovic SS. (2000) Characterization of calcium signaling by purinergic

receptor-channels expressed in excitable cells. Mol Pharmacol, 58: 936-945

72. Qureshi OS, Paramasivam A, Yu JC, Murrell-Lagnado RD. (2007) Regulation

of P2X4 receptors by lysosomal targeting, glycan protection and exocytosis. J

Cell Sci, 120: 3838-3849

73. Bo X, Zhang Y, Nassar M, Burnstock G, Schoepfer R. (1995) A P2X

purinoceptor cDNA conferring a novel pharmacological profile. FEBS Lett, 375:

129-133

74. Tsuda M, Kuboyama K, Inoue T, Nagata K, Tozaki-Saitoh H, Inoue K. (2009)

Behavioral phenotypes of mice lacking purinergic P2X4 receptors in acute and

chronic pain assays. Mol Pain, 5: 28

67

75. Ulmann L, Hirbec H, Rassendren F. (2010) P2X4 receptors mediate PGE2

release by tissue-resident macrophages and initiate inflammatory pain. EMBO J,

29: 2290-2300

76. Ma W, Korngreen A, Weil S, Cohen EB, Priel A, Kuzin L, Silberberg SD.

(2006) Pore properties and pharmacological features of the P2X receptor

channel in airway ciliated cells. J Physiol, 571: 503-517

77. Zsembery A, Fortenberry JA, Liang L, Bebok Z, Tucker TA, Boyce AT,

Braunstein GM, Welty E, Bell PD, Sorscher EJ, Clancy JP, Schwiebert EM.

(2004) Extracellular zinc and ATP restore chloride secretion across cystic

fibrosis airway epithelia by triggering calcium entry. J Biol Chem, 279: 10720-

10729

78. Liang L, Zsembery A, Schwiebert EM. (2005) RNA interference targeted to

multiple P2X receptor subtypes attenuates zinc-induced calcium entry. Am J

Physiol Cell Physiol, 289: C388-396

79. Doctor RB, Matzakos T, McWilliams R, Johnson S, Feranchak AP, Fitz JG.

(2005) Purinergic regulation of cholangiocyte secretion: identification of a novel

role for P2X receptors. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 288: G779-786

80. Burnstock G. (2013) Purinergic mechanisms and pain--an update. Eur J

Pharmacol, 716: 24-40

81. Kawate T, Michel JC, Birdsong WT, Gouaux E. (2009) Crystal structure of the

ATP-gated P2X(4) ion channel in the closed state. Nature, 460: 592-598

82. Wildman SS, King BF, Burnstock G. (1999) Modulation of ATP-responses at

recombinant rP2X4 receptors by extracellular pH and zinc. Br J Pharmacol,

126: 762-768

83. Coddou C, Acuna-Castillo C, Bull P, Huidobro-Toro JP. (2007) Dissecting the

facilitator and inhibitor allosteric metal sites of the P2X4 receptor channel:

critical roles of CYS132 for zinc potentiation and ASP138 for copper inhibition.

J Biol Chem, 282: 36879-36886

84. Khakh BS, Proctor WR, Dunwiddie TV, Labarca C, Lester HA. (1999)

Allosteric control of gating and kinetics at P2X(4) receptor channels. J neurosci,

19: 7289-7299

68

85. Gum RJ, Wakefield B, Jarvis MF. (2012) P2X receptor antagonists for pain

management: examination of binding and physicochemical properties.

Purinergic Signal, 8: 41-56

86. Khakh BS, Burnstock G, Kennedy C, King BF, North RA, Seguela P, Voigt M,

Humphrey PP. (2001) International union of pharmacology. XXIV. Current

status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.

Pharmacol Rev, 53: 107-118

87. Virginio C, Robertson G, Surprenant A, North RA. (1998) Trinitrophenyl-

substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and

heteromeric P2X2/3 receptors. Mol Pharmacol, 53: 969-973

88. Jarvis MF, Khakh BS. (2009) ATP-gated P2X cation-channels.

Neuropharmacology, 56: 208-215

89. Fisher R, Grützmann R., Blasco HPJ, Kalthof B, Gadea PC, Stelte-Ludwig B,

Woltering E, Wutke M, (2005) Benzofuro-1,4-diazepin-2-one derivatives. Patent

Number: EP1608659A1

90. Norenberg W, Sobottka H, Hempel C, Plotz T, Fischer W, Schmalzing G,

Schaefer M. (2012) Positive allosteric modulation by ivermectin of human but

not murine P2X7 receptors. Br J Pharmacol, 167: 48-66

91. Kwon HJ. (2012) Extracellular ATP signaling via P2X(4) receptor and

cAMP/PKA signaling mediate ATP oscillations essential for prechondrogenic

condensation. J Endocrinol, 214: 337-348

92. Wu T, Dai M, Shi XR, Jiang ZG, Nuttall AL. (2011) Functional expression of

P2X4 receptor in capillary endothelial cells of the cochlear spiral ligament and

its role in regulating the capillary diameter. Am J Physiol Heart Circ Physiol,

301: H69-78

93. Casati A, Frascoli M, Traggiai E, Proietti M, Schenk U, Grassi F. (2011) Cell-

autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell

Death Differ, 18: 396-404

94. Voets T, Talavera K, Owsianik G, Nilius B. (2005) Sensing with TRP channels.

Nat Chemi Biol, 1: 85-92

95. Clapham DE. (2003) TRP channels as cellular sensors. Nature, 426: 517-524

69

96. Vriens J, Owsianik G, Voets T, Droogmans G, Nilius B. (2004) Invertebrate

TRP proteins as functional models for mammalian channels. Pflugers Arch, 449:

213-226

97. Vennekens R, Voets T, Bindels RJ, Droogmans G, Nilius B. (2002) Current

understanding of mammalian TRP homologues. Cell calcium, 31: 253-264

98. Montell C. (2005) The TRP superfamily of cation channels. Sci STKE, 2005:

re3

99. Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz

KR, Koltzenburg M, Basbaum AI, Julius D. (2000) Impaired nociception and

pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science, 288: 306-313

100. Jordt SE, Julius D. (2002) Molecular basis for species-specific sensitivity to

"hot" chili peppers. Cell, 108: 421-430

101. Kanzaki M, Zhang YQ, Mashima H, Li L, Shibata H, Kojima I. (1999)

Translocation of a calcium-permeable cation channel induced by insulin-like

growth factor-I. Nat Cell Biol, 1: 165-170

102. Smith GD, Gunthorpe MJ, Kelsell RE, Hayes PD, Reilly P, Facer P, Wright JE,

Jerman JC, Walhin JP, Ooi L, Egerton J, Charles KJ, Smart D, Randall AD,

Anand P, Davis JB. (2002) TRPV3 is a temperature-sensitive vanilloid receptor-

like protein. Nature, 418: 186-190

103. Liedtke W, Choe Y, Marti-Renom MA, Bell AM, Denis CS, Sali A, Hudspeth,

AJ, Friedman JM, Heller S. (2000) Vanilloid receptor-related osmotically

activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell, 103:

525-535

104. Nilius B, Vriens J, Prenen J, Droogmans G, Voets T. (2004) TRPV4 calcium

entry channel: a paradigm for gating diversity. Am J Physiol Cell Physiol, 286:

C195-205

105. Hoenderop JG, van Leeuwen JP, van der Eerden BC, Kersten FF, van der Kemp

AW, Merillat AM, Waarsing JH, Rossier BC, Vallon V, Hummler E, Bindels

RJ. (2003) Renal Ca2+ wasting, hyperabsorption, and reduced bone thickness in

mice lacking TRPV5. J Clin Invest, 112: 1906-1914

70

106. den Dekker E, Hoenderop JG, Nilius B, Bindels RJ. (2003) The epithelial

calcium channels, TRPV5 & TRPV6: from identification towards regulation.

Cell calcium, 33: 497-507

107. Lehen'kyi V, Raphael M, Prevarskaya N. (2012) The role of the TRPV6 channel

in cancer. J Physiol, 590: 1369-1376

108. Peng JB, Chen XZ, Berger UV, Vassilev PM, Tsukaguchi H, Brown EM,

Hediger MA. (1999) Molecular cloning and characterization of a channel-like

transporter mediating intestinal calcium absorption. J Biol Chem, 274: 22739-

22746

109. Peng JB, Chen XZ, Berger UV, Weremowicz S, Morton CC, Vassilev PM,

Brown EM, Hediger MA. (2000) Human calcium transport protein CaT1.

Biochem Biophys Res Commun, 278: 326-332

110. Balesaria S, Sangha S, Walters JR. (2009) Human duodenum responses to

vitamin D metabolites of TRPV6 and other genes involved in calcium

absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 297: G1193-1197

111. Meyer MB, Watanuki M, Kim S, Shevde NK, Pike JW. (2006) The human

transient receptor potential vanilloid type 6 distal promoter contains multiple

vitamin D receptor binding sites that mediate activation by 1,25-

dihydroxyvitamin D3 in intestinal cells. Mol Endocrinol, 20: 1447-1461

112. Nijenhuis T, Hoenderop JG, Nilius B, Bindels RJ. (2003) (Patho)physiological

implications of the novel epithelial Ca2+ channels TRPV5 and TRPV6. Pflugers

Arch, 446: 401-409

113. Nijenhuis T, Hoenderop JG, Bindels RJ. (2005) TRPV5 and TRPV6 in Ca(2+)

(re)absorption: regulating Ca(2+) entry at the gate. Pflugers Arch, 451: 181-192

114. Schindl R, Kahr H, Graz I, Groschner K, Romanin C. (2002) Store depletion-

activated CaT1 currents in rat basophilic leukemia mast cells are inhibited by 2-

aminoethoxydiphenyl borate. Evidence for a regulatory component that controls

activation of both CaT1 and CRAC (Ca(2+) release-activated Ca(2+) channel)

channels. J Biol Chem, 277: 26950-26958

115. Yue L, Peng JB, Hediger MA, Clapham DE. (2001) CaT1 manifests the pore

properties of the calcium-release-activated calcium channel. Nature, 410: 705-

709

71

116. Voets T, Prenen J, Fleig A, Vennekens R, Watanabe H, Hoenderop JG, Bindels

RJ, Droogmans G, Penner R, Nilius B. (2001) CaT1 and the calcium release-

activated calcium channel manifest distinct pore properties. J Biol Chem, 276:

47767-47770

117. Kovacs G, Danko T, Bergeron MJ, Balazs B, Suzuki Y, Zsembery A, Hediger

MA. (2011) Heavy metal cations permeate the TRPV6 epithelial cation channel.

Cell calcium, 49: 43-55

118. Hoenderop JG, Voets T, Hoefs S, Weidema F, Prenen J, Nilius B, Bindels RJ.

(2003) Homo- and heterotetrameric architecture of the epithelial Ca2+ channels

TRPV5 and TRPV6. EMBO J, 22: 776-785

119. Maruyama T, Kanaji T, Nakade S, Kanno T, Mikoshiba K. (1997) 2APB, 2-

aminoethoxydiphenyl borate, a membrane-penetrable modulator of Ins(1,4,5)P3-

induced Ca2+ release. J Biochem, 122: 498-505

120. Thomas P, Smart TG. (2005) HEK293 cell line: a vehicle for the expression of

recombinant proteins. J Pharmacol Toxicol Methods, 51: 187-200

121. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. (1985) A new generation of Ca2+

indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 260:

3440-3450

122. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. (1981) Improved

patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-

free membrane patches. Pflugers Arch, 391: 85-100

123. He ML, Zemkova H, Koshimizu TA, Tomic M, Stojilkovic SS. (2003)

Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of

purinergic P2X receptor channels. Am J Physiol Cell Physiol, 285: C467-479

124. Manohar M, Hirsh MI, Chen Y, Woehrle T, Karande AA, Junger WG. (2012)

ATP release and autocrine signaling through P2X4 receptors regulate

gammadelta T cell activation. J Leukoc Biol, 92: 787-794

125. Fischer W, Wirkner K, Weber M, Eberts C, Koles L, Reinhardt R, Franke H,

Allgaier C, Gillen C, Illes P. (2003) Characterization of P2X3, P2Y1 and P2Y4

receptors in cultured HEK293-hP2X3 cells and their inhibition by ethanol and

trichloroethanol. J Neurochem, 85: 779-790

72

126. Serrano A, Mo G, Grant R, Pare M, O'Donnell D, Yu XH, Tomaszewski MJ,

Perkins MN, Seguela P, Cao CQ. (2012) Differential expression and

pharmacology of native P2X receptors in rat and primate sensory neurons. J

neurosci, 32: 11890-11896

127. Nagata K, Imai T, Yamashita T, Tsuda M, Tozaki-Saitoh H, Inoue K. (2009)

Antidepressants inhibit P2X4 receptor function: a possible involvement in

neuropathic pain relief. Mol Pain, 5: 20

128. Fischer W, Franke H, Groger-Arndt H, and Illes P. (2005) Evidence for the

existence of P2Y1,2,4 receptor subtypes in HEK-293 cells: reactivation of P2Y1

receptors after repetitive agonist application. Naunyn-Schmiedebergs Arch

Pharmacol, 371: 466-472

129. Asatryan L, Popova M, Perkins D, Trudell JR, Alkana RL, Davies DL. (2010)

Ivermectin antagonizes ethanol inhibition in purinergic P2X4 receptors. J

Pharmacol Exp Ther, 334: 720-728

130. Gong QJ, Li YY, Xin WJ, Zang Y, Ren WJ, Wei XH, Li YY, Zhang T, Liu XG.

(2009) ATP induces long-term potentiation of C-fiber-evoked field potentials in

spinal dorsal horn: the roles of P2X4 receptors and p38 MAPK in microglia.

Glia, 57: 583-591

131. Li C, Peoples RW, Weight FF. (1998) Ethanol-induced inhibition of a neuronal

P2X purinoceptor by an allosteric mechanism. Br J Pharmacol, 123: 1-3

132. Michel AD, Chambers LJ, Walter DS. (2008) Negative and positive allosteric

modulators of the P2X(7) receptor. Br J pharmacol, 153: 737-750

133. Hoenderop JG, Vennekens R, Muller D, Prenen J, Droogmans G, Bindels RJ,

Nilius B. (2001) Function and expression of the epithelial Ca(2+) channel

family: comparison of mammalian ECaC1 and 2. J Physiol, 537: 747-761

134. Schwarz EC, Wissenbach U, Niemeyer BA, Strauss B, Philipp SE, Flockerzi V,

Hoth M. (2006) TRPV6 potentiates calcium-dependent cell proliferation. Cell

calcium, 39: 163-173

135. Li M, Jiang J, Yue L. (2006) Functional characterization of homo- and

heteromeric channel kinases TRPM6 and TRPM7. J Gen Physiol, 127: 525-537

73

X. Saját publikációk jegyzéke

X. 1. Az értekezés alapját képező publikációk

Balázs B, Dankó T, Kovács G, Köles L, Hediger MA, Zsembery A.

(2013) Investigation of the inhibitory effects of the benzodiazepine derivative, 5-BDBD

on P2X4 purinergic receptors by two complementary methods. Cell Physiol Biochem,

32: 11-24.

IF: 3,415

Kovacs G, Montalbetti N, Simonin A, Danko T, Balazs B, Zsembery A, Hediger MA.

(2012) Inhibition of the human epithelial calcium channel TRPV6 by 2-

aminoethoxydiphenyl borate (2-APB). Cell Calcium, 52: 468-80.

IF: 4,327

X. 2. Egyéb publikációk

Gönczi M, Birinyi P, Balázs B, Szentandrássy N, Harmati G, Könczei Z, Csernoch L,

Nánási PP.

(2012) Age- dependent changes in ion channel mRNA expression in canine cardiac

tissues. Gen Physiol Biophys, 31: 153-62.

IF: 0,852

Kovacs G, Danko T, Bergeron MJ, Balazs B, Suzuki Y, Zsembery A, Hediger MA.

(2011) Heavy metal cations permeate the TRPV6 epithelial cation channel. Cell

Calcium, 49: 43-55.

IF: 3,766

74

XI. Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. Zsembery Ákosnak tartozom hálával, akinek

hasznos tanácsai, önzetlen szakmai és emberi segítsége, iránymutatása nélkül ez a

disszertáció nem készülhetett volna el.

Köszönöm Dr. Kollai Márk és Dr. Benyó Zoltán Professzor Uraknak, akik lehetővé

tették számomra, hogy a Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézetben

végezhessem PhD tanulmányaimat.

Köszönettel tartozom Dr. Kovács Gergelynek és Dr. Dankó Tamásnak szakmai

segítségükért és önzetlen munkájukért.

Köszönöm az intézet valamennyi dolgozójának a segítséget és a baráti hangulatot,

amivel mindig fogadtak.

Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom férjemnek, családomnak és

barátaimnak támogatásukért, szeretetükért és segítségükért, akik nélkül nem juthattam

volna el idáig.

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 11

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

1421-9778/13/0321-0011$38.00/0

Original Paper

Copyright © 2013 S. Karger AG, Basel

Accepted: June 14, 2013

This is an Open Access article licensed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 License (www.karger.com/OA-license), applicable to the online version of the article only. Distribution for non-commercial purposes only.

Investigation of the Inhibitory Effects of the Benzodiazepine Derivative, 5-BDBD on P2X4 Purinergic Receptors by two Complementary Methods

Bernadett Balázsa Tamás Dankóa Gergely Kovácsb,c László Kölesd Matthias A. Hedigerb,c Ákos Zsemberya

aInstitute of Human Physiology and Clinical Experimental Research, Semmelweis University, Budapest;bInstitute of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Bern; cSwiss National Centre of Competence in Research, NCCR TransCure, University of Bern; dDepartment of Pharmacology and Pharmacotherapy, Semmelweis University, Budapest

Key WordsCalcium influx • Electrophysiology • ATP • 5-BDBD • P2X receptors

AbstractBackground/Aims: ATP-gated P2X4 purinergic receptors (P2X4Rs) are cation channels with important roles in diverse cell types. To date, lack of specific inhibitors has hampered investigations on P2X4Rs. Recently, the benzodiazepine derivative, 5-BDBD has been proposed to selectively inhibit P2X4Rs. However, limited evidences are currently available on its inhibitory properties. Thus, we aimed to characterize the inhibitory effects of 5-BDBD on recombinant human P2X4Rs. Methods: We investigated ATP-induced intracellular Ca2+ signals and whole cell ion currents in HEK 293 cells that were either transiently or stably transfected with hP2X4Rs. Results: Our data show that ATP (< 1 μM) stimulates P2X4R-mediated Ca2+ influx while endogenously expressed P2Y receptors are not activated to any significant extent. Both 5-BDBD and TNP-ATP inhibit ATP-induced Ca2+ signals and inward ion currents in a concentration-dependent manner. Application of two different concentrations of 5-BDBD causes a rightward shift in ATP dose-response curve. Since the magnitude of maximal stimulation does not change, these data suggest that 5-BDBD may competitively inhibit the P2X4Rs. Conclusions: Our results demonstrate that application of submicromolar ATP concentrations allows reliable assessment of recombinant P2XR functions in HEK 293 cells. Furthermore, 5-BDBD and TNP-ATP have similar inhibitory potencies on the P2X4Rs although their mechanisms of actions are different.

Institute of Human Physiology and Clinical Experimental Research,Semmelweis University Budapest, Tűzoltó utca 37-47, Budapest (Hungary)Tel. +36206660339, Fax +3613343162, E-Mail zsembery.akos@med.semmelweis-univ.hu

Ákos Zsembery MD, PhD

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 12

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

Introduction

Extracellular ATP and its breakdown products regulate a number of cellular functions by stimulating purinergic receptors [1]. In the last two decades 19 different purinergic receptors have been identified including four adenosine-activated P1 receptors, seven ATP-gated P2X receptor (P2XR) channels and eight metabotropic P2Y receptors which can be stimulated by adenosine and uridine tri- and diphosphates [2].

The seven P2X receptor subunits (P2X1-7) are widely distributed in both excitable and non-excitable cells providing cation permeable pathways (mainly for Ca2+ and Na+) through the plasma membrane. Previous studies revealed that these subunits might assemble as either homo- or heterotrimeric receptors [2]. Importantly, heteromerization can change functional and pharmacological properties of the P2XRs [2]. P2XRs are involved in presynaptic and postsynaptic actions of ATP [3-5] including taste sensation [6], hearing [7] and chemoreception [8]. P2XRs are also necessary for proper function of immune system [9]. In cardiovascular, respiratory, genitourinary and gastrointestinal systems several P2X receptor subunits seem to play pivotal role in both endothelial and epithelial cell functions [10]. Using pharmacological approaches and knockout animals, it has also become evident that P2XRs are involved in a broad range of pathophysiological processes such as chronic and inflammatory pain [11-15] arthritis [16] male infertility [17] and hypertension [18, 19].

A role for P2X4 receptors has been proposed in neuropathic pain [15], endothelial NO production [18], regulation of airway ciliary epithelia [20] and chloride secretion of respiratory [21, 22] and biliary epithelia [23]. However, validation of P2X4R involvement has been often hampered by the lack of specific inhibitors. In fact, P2X4 receptors are insensitive to the nonselective inhibitors, such as suramin and PPADS [24]. TNP-ATP has been found as a putative antagonist of P2X4 receptors. However, it blocks other P2X subtypes as well, such as P2X1, P2X2 and P2X3 [25]. Furthermore, TNP-ATP has been shown to be a weak blocker of P2X4 receptors (IC50 = 15 μM for 10 μM ATP stimulation) compared to its inhibitory potency at P2X1 and P2X3 receptors [26].

The benzodiazepine derivative, 5-(3-bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofuro[3,2-e]-1,4-diazepin-2-one (5-BDBD), has been recently shown to selectively inhibit P2X4 receptors (IC50 ~ 0.5 µM) [27]. Nonetheless, these results are described in a patent and details of the experimental procedure are not available. So far, limited experience has been available with 5-BDBD and there is no consensus about its pharmacologically relevant concentration range. In some studies low micromolar (5-10 μM) concentrations were used [28, 29] whereas others applied significantly higher doses of 5-BDBD (30-100 μM) [30, 31].

In the present study, we investigated ATP-induced cytosolic Ca2+ signals and inward ion currents in HEK 293 cells transfected either transiently or stably with hP2X4 receptors. We characterized P2X4 receptor-mediated whole cell ion currents and identified P2YR- and P2XR-dependent calcium signals using electrophysiological and fluorescence ion measurement techniques, respectively. Despite endogenous expression of P2YRs we were able to discern P2XR-dependent Ca2+ signals stimulating the cells with submicromolar concentrations of ATP. We also assessed the inhibitory effects of 5-BDBD and TNP-ATP on both intracellular Ca2+ signals and inward ion currents. Our data suggest that 5-BDBD and TNP-ATP have similar inhibitory potencies on P2X4Rs. Furthermore, we show that 5-BDBD functions as a competitive antagonist of hP2X4Rs.

Materials and Methods

Materials Cell culture medium, fetal bovine serum, cell culture supplements and antibiotics were purchased

from Csertex Inc. (Budapest, Hungary). TurboFect™ in vitro Transfection Reagent was purchased from Biocenter (Szeged, Hungary). Lipofectamine 2000 was obtained from Invitrogen (Life Technologies Europe B.V, Zug, Switzerland). Fluo-3/AM was purchased from Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA). 5-BDBD was obtained

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 13

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

from Tocris Inc. (Minneapolis, USA). Calcium-5 was purchased from Molecular Devices (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA). Ivermectin (IVM) was obtained from Merck AG (Merck, Zug, Switzerland). All other chemicals were purchased from Sigma-Chemical (St. Louis, MO).

DNA ConstructThe human P2X4R (imaGenes GmbH, Berlin, Germany) was amplified from human cDNA with the

following primer pair: 5’-TAT AAG ATC TCG CGG CCA TGG CGG GC-3’, 5’-TAT AGA ATT CCC TGG TCC AGC TCA CTA GCA AGA CCC TGC-3’The amplified product was subcloned into the pmCherry-N1 (Clontech Laboratories Inc.) vector by

using BglII and EcoRI restrictions sites. Amino acid sequence of the human P2X4 receptors fully corresponds to the isoform 3 described in gene database of the National Institute of Health.

Cell culture and establishment pmCherry-N1-hP2X4 expressing HEK 293 cell clonesHuman embryonic kidney (HEK) 293 cells were grown in plastic tissue culture flasks in DMEM/

Ham’s F-12 (1:1) medium supplemented with 5% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin and 100µg/ml streptomycin at 37°C in a cell culture incubator supplied with 5% CO2. Cells were subcultivated when confluency reached 90-95%. To establish pmCherry-N1-hP2X4 expressing HEK 293 cell clones, cells plated the day before on poly-D-lysine coated 35 mm dish were transfected with 2 µg pmCherry-N1-hP2X4 using 5 µl Lipofectamine 2000 per well as described in the manufacturer’s protocol. Transfection medium was changed to antibiotic-free medium after 4 hours. On the following day the medium was then changed with selection antibiotic (G418) containing medium. From then on, the cells were kept in this selection medium. After a massive cell death of the non-transfected cells, surviving cells were trypsinized and replated in a 96-well plate at such a dilution that 1 cell/well density was obtained. After several days, colonies of cells displaying red fluorescence were selected as hP2X4-expressing positive clones using fluorescence microscopy.

Transient transfectionBefore the day of transfection, cells were plated on poly-D-lysine coated round glass coverslips (25 mm

in diameter) at a density of 500,000 cells in 40 mm plastic Petri dishes. After 16-24 h, cells were transfected with 3µg pmCherry-N1-hP2X4 DNA and 5µl of TurboFect™ transfection reagent in 200µl of serum-free medium. Cells were subjected to experiments 16-48 h after transfection. The efficiency of transfection was 60-70%.

Cell surface biotinylation and western blottingP2X4 expressing HEK 293 cell clones were plated at 1.000.000 cell density into poly-D-lysine coated 60

mm dishes. 24 hours after plating, cells were rinsed with ice-cold PBS-Ca-Mg (PBS containing 0.1 mM CaCl2 and 1 mM MgCl2) followed by biotinylation of proteins at the plasma membrane with 1.5 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotin in 10 mM triethanolamine (pH 7.4), 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, and 150 mM NaCl for 90 minutes with horizontal shaking at 4°C. Next, excess biotin was quenched with PBS containing 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, and 100 mM glycine for 20 minutes at 4°C, and then rinsed three times with PBS. Cells were finally lysed in lysis buffer for 30 minutes and lysates were cleared by centrifugation. Protein concentrations were determined by DC Protein Assay. Portion of cell lysates of equivalent amounts of protein (1.33 mg/ml) were equilibrated overnight with streptavidin agarose beads at 4°C. Beads were washed sequentially with solutions A [50 mM Tris·HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, and 5 mM EDTA] three times, B [50 mM Tris·HCl (pH 7.4) and 500 mM NaCl] twice, and C (50 mM Tris·HCl, pH 7.4) once. Biotinylated surface proteins were then released by heating to 95°C with 4x Laemmli buffer. Proteins from the intracellular fraction were also heated to 95°C for 5 minutes with 4x Laemmli buffer.

Samples were run on a 10% SDS gel with 40 µl protein loaded from the cytosolic protein (1 mg/ml) and the plasma membrane samples. Samples were transferred onto a PVDF membrane in Towbin’s buffer using the semi-dry transfer method. Membranes were blocked with PBS containing 5% milk, 0.5% BSA and 0.02% NaN3 at room temperature for 1 hour. Afterwards, samples were incubated in blocking solution containing the appropriate primary antibody (1:1000 for mouse anti-mCherry (Clontech, 632543)) at 4°C for overnight followed by three washes with PBST. HRP-conjugated goat anti-mouse antibody (1:4000, BioRad) was used as secondary antibody. After three consecutive washes with PBST and a final wash

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 14

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

with PBS, the enhanced chemiluminescence (ECL) method was used for detection. For loading control the membrane probed with anti-mCherry was stripped and blotted with avidin-HRP (1:1000, BioRad).

HistochemistryAfter 24 hours of plating 400.000 P2X4-expressing HEK 293 clonal cells into a 35 mm dish, cells were

washed thoroughly with PBS. Next, cells were incubated with 0.1 mg/ml LC-sulfo-NHS(+)-biotin (Molbio) at room temperature for 1 hour followed by three washes with PBS. Thereafter, cells were fixed with 4% PFA at 370C for 15 minutes. Cells were washed three times with PBS before staining with Streptavidin conjugated to Alexa 488 (1:4000 dilution, Invitrogen) at room temperature for one hour. After washing the cells four times with PBS, samples were mounted with CitiFluor AF2 (EMS). Images were captured with a Nikon C1 confocal laser scanning microscopy system equipped with Multiline Argon and HeNe lasers using 40x magnification.

Measurement of intracellular calcium levelsTransiently transfected HEK 293 cells were loaded with Fluo-3/AM (4µl) in standard extracellular

solution for 45 min at room temperature. Fluorescence dye was dissolved in DMSO containing 20% Pluronic-F127. Additionally, the loading solution contained 1 mM probenecid to prevent dye leakage. After dye loading, cells were washed with standard extracellular solution. Standard extracellular solution contained (in mM): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-glucose and 10 HEPES, pH 7.4 (with NaOH). Nominally Ca2+-free solutions were prepared by simply omitting CaCl2.

Measurements were performed with a Axiovert 200 M Zeiss LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Jena, Germany) confocal laser scanning microscope equipped with a 20x Plan Apochromat (NA=0.80) DIC objective. For the excitation, 488-nm argon-ion laser was used. The emitted light was collected with BP 505-570 band pass filter. Data were obtained at a rate of 0.5 Hz. Changes in [Ca2+]i are displayed as the percentage of fluorescence relative to the intensity at the beginning of each experiment. The baseline fluorescence (100 %) was calculated from the average fluorescence of ROIs while bathing the cells with standard extracellular solution. Background fluorescence was subtracted from fluorescence intensity by measuring a cell-free area on every coverslip. Agonists and antagonists were administered directly to the solution at the desired concentrations. All experiments were done at room temperature (22-24 oC).

Fluorescence ion measurement experiments using FLIPRTetraCells were trypsinized and plated at 40,000 cells/well density in 100 µl volume onto 96-well black

plates coated with 100µg/ml poly-D-lysine 36 hours before the experiments. HEK 293 cells were used for testing the effects of compounds on endogenous P2Y receptors; whereas P2X4 activity was measured using P2X4-expressing HEK 293 cell clones. 36 hours later the medium was replaced with 100 µl of loading buffer (modified Krebs buffer containing 117 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1 mM CaCl2,1 mM MgCl2, 5 mM D-glucose, 10 mM HEPES, and Calcium-5 fluorescence dye). Cells were then incubated in the loading buffer at 37oC for one hour. Fluorescence calcium measurements were carried out using FLIPTetra high-throughput, fluorescence microplate reader. Cells were excited using a 470-495 nm LED module, and the emitted fluorescence signal was filtered with a 515-575 nm emission filter. After establishment of a stable baseline, cells were incubated with the compounds for five minutes followed by the administration of ATP with or without the tested compounds.

ElectrophysiologyVoltage-clamp recordings were carried out in the standard whole-cell configuration using an Axopatch

200B amplifier (Axon Instruments) [32]. Human P2X4-expressing cells were selected using a Diaphot 300 inverted patch clamp microscope (Nikon) equipped with an epifluorescent attachment (Elektro-Optika, Érd, Hungary). Micropipettes were pulled by a P-97 Flaming-Brown type micropipette puller (Sutter Instrument) from borosilicate glass capillary tubes (Harvard Apparatus) and had a tip resistance of 3–6 MΩ when filled with pipette solution. Patch pipette filling solution contained (in mM): 135 KCl, 5 NaCl, 1 MgCl2, 1 EGTA, 10 HEPES and an appropriate concentration of CaCl2, to give free [Ca2+]i = 0.1 µM. Free [Ca2+]i was estimated using MaxChelator software (Stanford University, Palo Alto, USA). The pH was adjusted to 7.2 with KOH. Standard extracellular solution contained (in mM): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-glucose, 10 HEPES, pH 7.4 (with NaOH). Solutions were delivered by continuous perfusion with a gravity-fed delivery system. Antagonists were added to the bath solutions 3-5 min. prior to agonist application.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 15

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

Experiments were performed at a holding potential of -60 mV. Command protocols and data acquisition were controlled by pClamp 6.03 software (Axon Instruments). Capacitative currents were compensated with analog compensation. Series resistance was accepted if lower than five times the pipette tip resistance. Analog data were filtered at 1 kHz with a low-pass Bessel filter and digitized at 5 kHz using a Digidata 1200 interface board. Data were analyzed using Clampfit 6.03 and Microsoft Excel softwares. All experiments were performed at room temperature.

Data presentation Areas under the curve (AUC) values were calculated using the trapezoidal rule, in the first 4 minutes

following agonist application (SigmaPlot 12.0 software). To estimate P2X receptor function, non-expressing cell responses were subtracted from the AUC values obtained in P2X4R expressing cells on the same coverslip.

Antagonist concentration-inhibition curves were obtained by using progressively increasing antagonist concentrations and a fixed agonist concentration close to the EC50 unless otherwise stated. IC50 values were calculated by least squares fitting to I = I0/[1 + (IC50/[Ant])-nH], where I and I0 represent peak responses in the presence and absence of antagonist at concentration [Ant].

Results were presented as means ± SEM of n observations if not otherwise indicated. Statistical significance was determined using paired Student’s t-test for parametric, whereas one-way ANOVA followed by Mann-Whitney U test for non-parametric variables. Differences were considered statistically significant when p < 0.05. Non-linear curve fitting was performed using the SigmaPlot 12.0 program.

Results

Localization and functional characterization of transfected hP2X4 receptors in HEK 293 cellsIn order to study the localization of transfected hP2X4 receptors in HEK 293 cells we used

immunohistochemical techniques. Co-localization of biotinylated cell surface proteins and mCherry fluorescent protein suggested the expression of P2X4Rs in the plasma membrane (Fig. 1). Furthermore, cell surface biotinylation and western blotting were used to separate the cytosolic and membrane fractions of proteins in HEK 293 cells. The P2X4-bound mCherry protein was detected at the plasma membrane and its expression was not altered by the presence of ivermectin (Fig. 2A). In control experiment we used avidin-HRP-conjugated antibody to confirm the localization of proteins in the membrane fraction (Fig. 2B).

Fig. 1. Cellular localiza-tion of P2X4Rs by im-munohistochemistry. Panel A: Cell surface proteins stained with LC-sulfo-NHS(+)-biotin and streptavidin-Alexa488. Panel B: Fluorescence image of mCherry tagged P2X4Rs in HEK 293 cells. Panel C: Merged image showing co-localization of P2X4Rs and bioti-nylated cell surface pro-teins. Panel D: Differ-ential interference con-trast (DIC) image of the P2X4Rs expressing cells. Scale bar represents 20 μm.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 16

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

To functionally characterize the plasma membrane localized hP2X4 receptors we measured whole cell currents in transfected HEK 293 cells. ATP (0.1-300 μM) elicited increasing maximal current amplitudes in cells expressing P2X4Rs (Fig. 2C and D). The agonist concentration-response curve for ATP were fit with the Hill-equation; E = Emax[1 + (EC50/[A])nH] where E stands for the peak current evoked by agonist concentration [A], Emax is the peak current evoked by a maximal agonist concentration, EC50 is the concentration giving half the maximal current, and nH represents the Hill coefficient. Our results showed that the EC50 value of ATP was 2.1 μM (Fig. 2D). Cells lacking P2X4R expression failed to respond to ATP (100 μM) (data not shown). To confirm the role of P2X4Rs in ATP-induced inward currents we pretreated the cells with ivermectin (IVM) (3 and 10 μM). As expected, IVM potentiated currents induced by ATP (0.5 μM) in a concentration-dependent manner (Fig. 2E). In addition, we tested the effects of TNP-ATP on ATP-induced (1 μM) currents. Under these conditions, we found that the half-maximal inhibitory concentration (IC50) of TNP-ATP was 1.5 μM (Fig. 2F). These data show the plasma membrane localized hP2X4 receptors are fully functional in transfected HEK 293 cells.

Fig. 2. Localization and functional characterization of transfected hP2X4 receptors in HEK 293 cells. Panel A: Cytosolic and cell surface proteins were separated. Human P2X4Rs are expressed both in cytosolic (lanes 1-4) and plasma membrane (lanes 5-8) fractions of proteins. Lane 1 and 5 indicate unstimulated cells, lanes 2 and 6 DMSO-pretreated (1:1000) cells, lanes 3 and 7 IVM-pretreated (10 μM) cells and lanes 4 and 8 IVM-pretreated (20 μM) cells. Panel B: In control experiments we obtained protein expression only in cell surface fraction (lanes 5-8) using avidin-HRP. Panel C: Representative traces showing ATP-induced inward currents in the absence; and panel E: presence of ivermectin (IVM). Panel D: Concentration-responses to ATP (0.1-300 μM) are shown. Panel F: Concentration-inhibitions to TNP-ATP (0.05-50 μM) in ATP-stimulated (1 μM) cells are shown. Values are means ± SEM. The error bars are not always visible due to the small SEM values. Experiments at each concentration were performed at least 3 times.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 17

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

ATP-induced Ca2+ influx is inhibited by 5-BDBD in cells stably expressing P2X4RsIn native HEK 293 cells ATP (0.5-100 μM) caused transient increases in cytosolic calcium

concentrations whereas lower doses of the agonist (0.1-0.25 μM) elicited no change in calcium levels (Fig 3A). In nominally calcium-free buffer ATP (0.1-100 μM) caused similar effects suggesting that the calcium signal was due to P2Y receptor-dependent Ca2+ release from the intracellular stores (Fig. 3B). Although the presence of external Ca2+ prolonged ATP-induced calcium signals, sustained responses could not been observed (Fig. 3A). Next, we studied ATP-induced Ca2+ signals in HEK 293 cell clones stably expressing P2X4Rs (see methods). In these cells ATP (0.1-0.25 μM) elicited changes in Ca2+ concentrations that were abolished in Ca2+-depleted medium indicating that Ca2+ entered the cells from the extracellular space (Fig. 3C and D). In addition, higher concentrations of ATP (≥ 1μM) caused sustained Ca2+ signals (Fig. 3C). Importantly, the P2X4 receptor-specific positive allosteric modulator IVM (20 μM) potentiated the ATP-induced (0.25 μM) Ca2+ entry (AUCATP = 852 ± 47; n=5 vs. AUCATP+IVM = 1026 ± 46; n=5; p<0.05). These data indicate that using low concentrations of ATP (≤0.25 μM) allows assessment of P2X4R-mediated Ca2+ signals independent of P2Y receptor activation. Thus, we next studied the effects of the benzodiazepine derivative 5-BDBD in the presence of 0.25 μM ATP. Under these conditions 5-BDBD (2-20 μM) significantly inhibited P2X4R-mediated Ca2+ entry (Fig. 4A). We obtained similar inhibitory effects of 5-BDBD when cells were stimulated by 0.5 μM ATP (Fig. 4B). Regardless of ATP concentrations used, 5-BDBD (1-20 μM) had no effects in native HEK 293 cells suggesting that endogenously expressed P2Y receptors were not inhibited (data not shown).

Fig. 3. ATP-induced changes of cytosolic calcium concentration measured using FLIPRTetra. Panels A and B: Administration of extracellular ATP induced dose-dependent, similar transient changes of cytosolic calcium in HEK 293 cells in the presence or absence of extracellular calcium. Panel C: In contrast, in HEK 293 cells stably expressing hP2X4 ATP-induced sustained calcium response in the presence of extracellular calcium Panel D: whereas in calcium-free buffer the responses were similar to the ones obtained in non-transfected cells. Average tracings of 6 individual experiments are shown.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 18

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

Single cell calcium imaging in cells transiently expressing P2X4Rs Single cell calcium imaging has been shown to provide an alternative method for the

assessment of P2X receptor channel activity [33]. Therefore, we also studied the ATP-induced intracellular Ca2+ signals at the single cell level. In order to conduct simultaneous measurements of cytosolic Ca2+ levels in P2X4R-expressing and non-expressing cells, we used

Fig. 4. 5-BDBD inhib-ited the ATP-induced Ca2+ signals in HEK 293 cells stably expressing hP2X4 receptors. Panels A and B: Concentration-dependent inhibition of Ca2+ signals by 5-BDBD when cells were stimulated with 0.25 μM and 0.5 μM ATP. Values are means ± SD. Each expe-riment was performed at least 4 times. A.U. means arbitrary units. *p<0.05 and **p<0.005 vs. ATP po-sitive controls (ANOVA).

Fig. 5. ATP induced concentration-dependent changes in [Ca2+]i in hP2X4-expressing and non-expressing HEK 293 cells. Panel A: Representative traces showing the effects of different ATP concentrations (0.1-1μM) on [Ca2+]i Each experiment was performed at least 5 times; Panel B: P2XR:P2YR-mediated Ca2+ response ratios are shown at different ATP concentrations. P2YR-mediated responses were estimated by the amplitude of cytosolic Ca2+ peaks while P2XR-mediated responses were assessed by “area under the curve” (AUC) values referring to the sustained nature of the Ca2+ signal. S.E.M. values are not shown for the representative traces because they were within 10% of the mean. A.U. means arbitrary units.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 19

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

the transient transfection method. First, we identified the extracellular ATP concentration at which P2XR:P2YR-mediated Ca2+ response ratio was the highest. The P2YR-mediated responses were estimated by the amplitude of cytosolic Ca2+ peaks while P2XR-mediated responses were assessed by “area under the curve” (AUC) values referring to the sustained nature of the Ca2+ signal. In cells lacking P2X4R expression, administration of 0.1 μM and 0.5 μM ATP evoked small peak increases without sustained Ca2+ signals (Fig. 5A). In cells expressing P2X4Rs, the magnitude of Ca2+ peaks induced by 0.1 μM and 0.5 μM ATP were significantly higher than in non-expressing cells. However, robust Ca2+ plateau was induced only by 0.5 μM ATP (Fig. 5A). Further increasing ATP concentrations (1 μM), a considerable rise in cytosolic Ca2+ peak was observed in cells lacking P2X4R expression. In contrast, the sustained component of the Ca2+ signal induced by 1 μM ATP did not significantly differ from that elicited by 0.5 μM ATP in P2X4R expressing cells (Fig. 5A). Consequently, as P2XR:P2YR-mediated Ca2+ response ratio was the highest at 0.5 μM ATP (Fig. 5B), in subsequent experiments this concentration was chosen to investigate single cell Ca2+ signals. To demonstrate that extracellular Ca2+ was necessary for ATP-induced sustained Ca2+ signal in cells expressing P2X4Rs, we repeated the experiments in Ca2+-depleted medium. Under these circumstances, the Ca2+ signal was only transient suggesting that Ca2+ entry was due to functional expression of P2X4Rs (Fig. 6). In cells lacking P2X4R expression, external Ca2+ did not influence the ATP-induced transient nature of cytosolic Ca2+ signal (Fig. 6). These data excluded the possibility that store-operated calcium channels played significant role in Ca2+ entry when cells were stimulated with 0.5 μM ATP. To further characterize the sustained Ca2+ signal, we pretreated the cells with IVM (10 μM) 5 min prior the application of ATP. Our results showed that ATP-induced Ca2+ plateau was significantly elevated in P2X4R expressing but not in non-expressing cells (Fig. 6).

Next, we tested the effects of 5-BDBD on ATP-induced (0.5 μM), P2X4R-mediated Ca2+ entry. Sustained Ca2+ signals were diminished in cells pretreated with different concentrations of 5-BDBD (0.5-20 μM). We observed 50% reduction of the AUC values in the presence of approx. 2 µM 5-BDBD (Fig. 7A). We also studied inhibitory effects of TNP-ATP which was reported as a putative antagonist of P2X4Rs [25]. As shown in Figure 7B, TNP-ATP (0.5-50 μM) reduced ATP-induced (0.5 μM) sustained Ca2+ signal in a concentration-dependent manner. Taken together, these data indicate that ATP-induced sustained Ca2+ signals were inhibited by both 5-BDBD and TNP-ATP in HEK 293 cells transfected with P2X4Rs.

Fig. 6. Top panels: ATP indu-ced changes in [Ca2+]i in Ca2+-containing or Ca2+-depleted medium. Bottom panels: Ivermectin (IVM) potentia-ted the ATP-induced Ca2+ sig-nal only in hP2X4-expressing cells.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 20

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

P2X4 receptor channels are competitively inhibited by 5-BDBDData presented in this paper show that 5-BDBD inhibited the P2X4R-mediated Ca2+

entry in both stably and transiently transfected HEK 293 cells (see above). Nonetheless, during measurements of intracellular Ca2+ concentrations activation of endogenous P2YRs and/or ion transporters that eliminate Ca2+ from the cytosol (i.e. plasma membrane Ca2+-ATPase, sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) might possibly interfere with the effectiveness of 5-BDBD. Therefore, we also tested the inhibitory effects of 5-BDBD in HEK 293 cells using the whole cell configuration of the patch clamp technique. We stimulated the cells with 1 µM

Fig. 7. Both 5-BDBD and TNP-ATP inhibited the ATP-induced Ca2+ signals in HEK 293 cells transiently trans-fected with hP2X4 receptors. Panels A and B: Concent-ration-dependent inhibiti-on of the ATP-induced Ca2+ response by 5-BDBD (0.5-20μM); and TNP-ATP (0.5-50μM). The number of inde-pendent experiments is indi-cated in parenthesis beneath the columns.

Fig. 8. 5-BDBD com-petitively inhibited the ATP-induced whole cell inward ion currents in HEK 293 cells transient-ly expressing hP2X4 re-ceptors. Panel A: Repre-sentative original traces showing the inhibitory effects of 5-BDBD at va-rious concentrations. Panel B: Concentration-dependent inhibition of 5-BDBD (0.1-50 μM) in ATP-stimulated (1 μM) cells are shown. Panel C: Concentration-depen-dent responses to ATP (0.1-300 μM) in cells that were pretreated with 2 or 20 μM 5-BDBD. The rightward shift of the ATP control curve and the unchanged maximal stimulation suggest that 5-BDBD competitively inhibited the P2X4 receptor channels. In the absence of 5-BDBD the Hill coefficient was 1.26. In the presence of 2 μM and 20 μM 5-BDBD nH values were 1.11 and 2.17, respectively. Values are means ± SEM. The error bars are not always visible due to the small SEM valu-es. Experiments at each concentration were performed at least 3 times.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 21

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

ATP (close to EC30 of ATP) because higher concentrations of the agonist induced premature cell damage in a number of experiments. Under these circumstances, 5-BDBD (0.1-50 µM) dose-dependently inhibited P2X4R-mediated inward currents (Icontrol: 1239 ± 105 pA, n=8 vs. I0.5µM: 983 ± 148 pA, n=4 vs. I2µM: 417 ± 33, n=4 vs. I20µM: 13 ± 1 pA, n=4) with an IC50 of 1.2 µM (Fig. 8A and B). To investigate whether the inhibitory effect of 5-BDBD was due to competitive or allosteric interaction with P2X4Rs, we performed additional electrophysiological experiments. Application of two different concentrations of 5-BDBD (2 µM and 20 µM) caused a rightward shift in ATP dose-response curve (from EC50 = 2.1 µM to 11.2 µM and 79.2 µM, respectively, using non-linear regression analysis). Since the magnitude of maximal stimulation did not change, these data suggest that 5-BDBD competitively inhibited the P2X4Rs (Fig. 8C).

Discussion

P2X4 receptors are involved in important physiological and pathophysiological functions such as afferent signalling, chronic pain and autocrine/paracrine communications of endothelial and epithelial cells. In these processes, investigations on the role of P2X4Rs are often hindered by lack of selective inhibitors. In recent years, considerable efforts have been made to discover novel effective antagonists of P2X4Rs. Although the benzodiazepine derivative 5-BDBD has been recently proposed to selectively block P2X4Rs [27], only limited experiences have been available concerning its inhibitory properties [28-31]. Moreover, to the best of our knowledge, there are no previous studies attempting to compare the inhibitory effects of 5-BDBD using both electrophysiological and intracellular calcium measurements. Therefore, we aimed to investigate the inhibitory potency of 5-BDBD on P2X4R-dependent Ca2+ entry. Our data provide evidence for competitive though moderate inhibitory effects of 5-BDBD. Depending on experimental conditions the degree of inhibition varied significantly. In patch clamp experiments, assessing the effects of 5-BDBD directly on its target protein, we obtained the strongest inhibition. In intracellular calcium measurements, 5-BDBD exhibited more robust effects in transiently transfected cells. This was probably due to both the higher level of P2X4R expression and the single cell calcium measurements. However, it is important to emphasis that AUC values are not in a linear fashion with [Ca2+]i and quantitative analyses of fluorometric Ca2+ assay may provide only a rough orientation.

Despite the endogenous expression of at least three different P2Y receptor subtypes [34, 35] HEK 293 cells are frequently used to study properties of P2X receptors [34, 36]. To assess the role of P2XRs in inducing changes of intracellular Ca2+ concentrations, some investigators often choose cell lines (i.e. excitable mouse immortalized gonadotropin-releasing hormone-secreting cells (GT1) and human astrocytoma cells (1321N1)) that are lacking P2Y receptors [33, 37]. Stojilkovic and his colleagues transfected both GT1 and HEK 293 cells with different P2X subtypes and compared ATP-induced Ca2+ signals. They concluded that intracellular Ca2+ measurements could be used for the characterization of P2X receptors only in GT1 but not in HEK 293 cells because activation of endogenously expressed P2Y receptors interferes with P2X receptor-mediated Ca2+ signals [33]. This is indeed the case when HEK 293 cells are stimulated with high concentrations of ATP (>10 μM). Nonetheless, here we propose an alternative approach to investigate P2XR functions in HEK 293 cells applying low doses of agonist. In the present study, we show that submicromolar concentrations of ATP (≤ 0.25 µM) cause changes in intracellular Ca2+ concentrations solely in P2X4R expressing cells. The ATP-induced increase in Ca2+ concentrations was further enhanced by pretreatment of ivermectin and was completely abolished in Ca2+-depleted medium suggesting that P2X4Rs were involved in Ca2+ influx. Furthermore, we found that higher doses of ATP (≥1 µM) prolonged the duration of Ca2+ signals in native HEK 293 cells. These effects were abolished in Ca2+-depleted medium suggesting the activation of P2X4R-independent Ca2+ influx mechanisms. The significantly higher initial phase of Ca2+ response in P2X4R expressing cells compared to native cells was probably due to the fact that we used

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 22

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

nominally Ca2+ free solutions. Nonetheless, according to our previous experience, we could not add calcium chelators because HEK 293 cells require extracellular Ca2+ to remain attached to the coverslip. We assume that, as a result of P2Y receptor-dependent Ca2+ release, store-operated Ca2+ entry could contribute to the overall Ca2+ signal when cells are stimulated with higher concentrations of ATP (>1 µM). Therefore, our results suggest that when sufficiently low ATP concentrations are applied, measurement of intracellular Ca2+ concentrations is a useful approach to assess properties of P2XR in HEK 293 cells.

Considering the fact that Ca2+ measurement in stably transfected cells did not allow concurrent investigations of the P2X4R-expressing and non-expressing cells, we also performed single cell calcium measurements in transiently transfected HEK 293 cells. Thus, we could simultaneously measure ATP-induced Ca2+ signals in P2X4R-expressing and non-expressing cells on the same coverslip. Our data suggest that up to the concentration of 0.5 μM, ATP causes only small transient changes in Ca2+ concentration whereas 1 μM ATP significantly enhances the signal amplitude in non-expressing cells. This phenomenon was probably due to the gradual activation of different endogenous P2Y receptor subtypes [35].

To our surprise, we found that amplitudes of ATP-induced Ca2+ signals were significantly higher in P2X4R-expressing than in non-expressing cells when experiments were performed in Ca2+-depleted medium (Fig. 6). Since we obtained similar results in stably transfected cells as well, we speculate that the difference was due to P2X4R-mediated Ca2+ entry rather than additional release of Ca2+ from the internal stores. High levels of P2X4R-expression and lack of Ca2+-chelation could both contribute to the Ca2+ entry. Furthermore, our data show that IVM enhances the ATP-induced Ca2+ entry only in P2X4R-expressing cells. In accordance with previous observations, IVM potentiated ATP-induced Ca2+ entry but did not increase surface expression of P2X4Rs [38, 39].

Our electrophysiological data confirmed the presence of functional P2X4Rs in transiently transfected HEK 293 cells. ATP caused IVM-sensitive activation of inward currents in P2X4R-expressing but not in non-expressing cells. We found EC50 value of ATP close to what was previously reported [26]. However, it is noteworthy that, in some experiments ATP-stimulated currents exhibited incomplete recovery following withdrawal of the agonist when its concentration was higher than 1 µM. This was probably due to the high level of P2X4R expression and massive Ca2+ influx which could consequently cause cellular damage. Therefore, inhibitory properties of both TNP-ATP and 5-BDBD were tested at 1 µM ATP stimulation.

Activation of P2X4Rs plays a key role in the pathogenesis of neuropathic pain [15]. In an attempt to mitigate the neuropathic pain Inoue and his colleagues investigated the possible role of antidepressants as inhibitors of P2X4Rs [37]. They found that paroxetine inhibited P2X4Rs dose-dependently. Paroxetine behaved as a noncompetitive antagonist with IC50 values of 2.5 µM and 1.9 µM for rat and human P2X4Rs, respectively. Interestingly, inhibitory effects of paroxetine were significantly stronger on rat P2X4Rs than that of TNP-ATP [37]. It is known that TNP-ATP is more than 1,000-fold more potent in blocking P2X1 and P2X3 than P2X4 receptors [24]. Nonetheless, TNP-ATP has been used as P2X4 antagonist in a number of studies [40, 41]. Our data also demonstrate that TNP-ATP inhibits both intracellular Ca2+ signals and inward ion currents induced by ATP. We found that TNP-ATP had an IC50 value of 1.5 µM for 1 µM ATP stimulation which was comparable with previous observations [25]. Noncompetitive antagonism of TNP-ATP at the P2X3Rs suggests similar mechanisms of action at P2X4Rs as well [25].

Recently, 5-BDBD has been proposed to selectively inhibit P2X4Rs [27]. Since then 5-BDBD has been used in a number of studies with contradictory results [28-31]. It has weak potency to inhibit recombinant human P2X4Rs [28] or native P2X4Rs in vascular endothelial cells (IC50 ~ 30 µM) [30]. In contrast, P2X4Rs were potently blocked by 10 µM 5-BDBD in prechondrogenic cell line [29]. Here we report that 5-BDBD and TNP-ATP have similar inhibitory potencies at recombinant human P2X4Rs expressed in HEK 293 cells. Our data suggest that 5-BDBD may competitively inhibit the P2X4Rs. However, we cannot exclude the possibility that 5-BDBD decreases the ligand-binding affinity of the channels. Such allosteric

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 23

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

alterations of ATP-binding affinity have been previously reported for P2X receptors [42, 43].In conclusion, the present study demonstrates that intracellular measurement of Ca2+

concentration in HEK 293 cells could be a useful method to investigate pharmacological properties of P2X receptor antagonists provided that submicromolar concentrations of ATP are used. 5-BDBD and TNP-ATP have similar inhibitory potencies at human recombinant P2X4Rs. Our data show that 5-BDBD shifts the ATP concentration-response curve to the right. This feature differs from the previously described noncompetitive behavior of other P2X4R antagonists such as TNP-ATP and paroxetine.

Acknowledgements

This work was supported by the OTKA K79189 grant and Swiss National Science Foundation (SNSF) through the National Centre of Competence in Research (NCCR) TransCure (website: http://www.transcure.org). The authors thank Péter Várnai and Dániel Tóth for their help to create the pmCherry-N1-hP2X4 construct.

References

1 Schwiebert EM, Zsembery A: Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells, Biochim Biophys Acta 2003;1615:7-32.

2 Burnstock G, Fredholm BB, North RA, Verkhratsky A: The birth and postnatal development of purinergic signalling. Acta Physiol 2010;199:93-147.

3 Jo YH, Role LW: Coordinate release of ATP and GABA at in vitro synapses of lateral hypothalamic neurons. J Neurosci 2002;22:4794-4804.

4 Sim JA, Chaumont S, Jo J, Ulmann L, Young MT, Cho K, Buell G, North RA, Rassendren F: Altered hippocampal synaptic potentiation in P2X4 knock-out mice. J Neurosci 2006;26:9006-9009.

5 Khakh BS, Kennedy C: Adenosine and ATP: Progress in their receptors' structures and functions. Trends Pharmacol Sci 1998;19:39-41.

6 Roper SD: Signal transduction and information processing in mammalian taste buds. Pflugers Arch 2007;454:759-776.

7 Housley GD, Marcotti W, Navaratnam D, Yamoah EN: Hair cells--beyond the transducer. J Membr Biol 2006;209:89-118.

8 Rong W, Gourine AV, Cockayne DA, Xiang Z, Ford AP, Spyer KM, Burnstock G: Pivotal role of nucleotide P2X2 receptor subunit of the ATP-gated ion channel mediating ventilatory responses to hypoxia. J Neurosci 2003;23:11315-11321.

9 Di Virgilio F: Purinergic signalling in the immune system. A brief update. Purinergic Signal 2007;3:1-3.10 Surprenant A, North RA: Signaling at purinergic P2X receptors. Annu Rev Physiol 2009;71:333-359.11 Barclay J, Patel S, Dorn G, Wotherspoon G, Moffatt S, Eunson L, Abdel'al S, Natt F, Hall J, Winter J, Bevan S,

Wishart W, Fox A, Ganju P: Functional downregulation of P2X3 receptor subunit in rat sensory neurons reveals a significant role in chronic neuropathic and inflammatory pain. J Neurosci 2002;22:8139-8147.

12 Cockayne DA, Dunn PM, Zhong Y, Rong W, Hamilton SG, Knight GE, Ruan HZ, Ma B, Yip P, Nunn P, McMahon SB, Burnstock G, Ford AP: P2X2 knockout mice and P2X2/P2X3 double knockout mice reveal a role for the P2X2 receptor subunit in mediating multiple sensory effects of ATP. J Physiol 2005;567:621-639.

13 Coull JA, Beggs S, Boudreau D, Boivin D, Tsuda M, Inoue K, Gravel C, Salter MW, De Koninck Y: BDNF from microglia causes the shift in neuronal anion gradient underlying neuropathic pain. Nature 2005;438:1017-1021.

14 Chizh BA, Illes P: P2X receptors and nociception. Pharmacol Rev 2001;53:553-568.15 Tsuda M, Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S, Mizokoshi A, Kohsaka S, Salter MW, Inoue K: P2X4 receptors

induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury. Nature 2003;424:778-783.16 Labasi JM, Petrushova N, Donovan C, McCurdy S, Lira P, Payette MM, Brissette W, Wicks JR, Audoly L, Gabel

CA: Absence of the P2X7 receptor alters leukocyte function and attenuates an inflammatory response. J Immunol 2002;168:6436-6445.

17 Mulryan K, Gitterman DP, Lewis CJ, Vial C, Leckie BJ, Cobb AL, Brown JE, Conley EC, Buell G, Pritchard CA, Evans RJ: Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature 2000;403:86-89.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Physiol Biochem 2013;32:11-24DOI: 10.1159/000350119Published online: July 04, 2013

© 2013 S. Karger AG, Baselwww.karger.com/cpb 24

Balázs/Dankó/Kovács/Köles/Hediger/Zsembery: Inhibition of P2X4 Receptors by 5-BDBD

Cellular Physiology and Biochemistry

Cellular Physiology and Biochemistry

18 Yamamoto K, Korenaga R, Kamiya A, Qi Z, Sokabe M, Ando J: P2X(4) receptors mediate ATP-induced calcium influx in human vascular endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000;279:H285-292.

19 Yamamoto M, Jin JJ, Wu Z, Abe M, Tabara Y, Nagai T, Yamasaki E, Igase M, Kohara K, Miki T, Nakura J: Interaction between serotonin 2A receptor and endothelin-1 variants in association with hypertension in japanese. Hypertens Res 2006;29:227-232.

20 Ma W, Korngreen A, Weil S, Cohen EB, Priel A, Kuzin L, Silberberg SD: Pore properties and pharmacological features of the P2X receptor channel in airway ciliated cells. J Physiol 2006;571:503-517.

21 Zsembery A, Fortenberry JA, Liang L, Bebok Z, Tucker TA, Boyce AT, Braunstein GM, Welty E, Bell PD, Sorscher EJ, Clancy JP, Schwiebert EM: Extracellular zinc and ATP restore chloride secretion across cystic fibrosis airway epithelia by triggering calcium entry. J Biol Chem 2004;279:10720-10729.

22 Liang L, Zsembery A, Schwiebert EM: RNA interference targeted to multiple P2X receptor subtypes attenuates zinc-induced calcium entry. Am J Physiol Cell Physiol 2005;289:C388-396.

23 Doctor RB, Matzakos T, McWilliams R, Johnson S, Feranchak AP, Fitz JG: Purinergic regulation of cholangiocyte secretion: Identification of a novel role for P2X receptors. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005;288:G779-786.

24 Gum RJ, Wakefield B, Jarvis MF: P2X receptor antagonists for pain management: Examination of binding and physicochemical properties. Purinergic Signal 2012;8:41-56.

25 Virginio C, Robertson G, Surprenant A, North RA: Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Mol Pharmacol 1998;53:969-973.

26 Jarvis MF, Khakh BS: ATP-gated P2X cation-channels. Neuropharmacology 2009;56:208-215.27 Fisher R, Grützmann R, Blasco HPJ, Kalthof B, Gadea PC, Stelte-Ludwig B, Woltering E, Wutke M: Benzofuro-

1,4-diazepin-2-one derivatives. 2005; Patent Number: EP1608659A128 Norenberg W, Sobottka H, Hempel C, Plotz T, Fischer W, Schmalzing G, Schaefer M: Positive allosteric

modulation by ivermectin of human but not murine P2X7 receptors. Br J Pharmacol 2012;167:48-66.29 Kwon HJ: Extracellular ATP signaling via P2X(4) receptor and cAMP/PKA signaling mediate ATP

oscillations essential for prechondrogenic condensation. J Endocrinol 2012;214:337-348.30 Wu T, Dai M, Shi XR, Jiang ZG, Nuttall AL: Functional expression of P2X4 receptor in capillary endothelial

cells of the cochlear spiral ligament and its role in regulating the capillary diameter. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011;301:H69-78.

31 Casati A, Frascoli M, Traggiai E, Proietti M, Schenk U, Grassi F: Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ 2011;18:396-404.

32 Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ: Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 1981;391:85-100.

33 He ML, Zemkova H, Koshimizu TA, Tomic M, Stojilkovic SS: Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. Am J Physiol Cell Physiol 2003;285:C467-479.

34 Fischer W, Wirkner K, Weber M, Eberts C, Koles L, Reinhardt R, Franke H, Allgaier C, Gillen C, Illes P: Characterization of P2X3, P2Y1 and P2Y4 receptors in cultured HEK293-hP2X3 cells and their inhibition by ethanol and trichloroethanol. J Neurochem 2003;85:779-790.

35 Fischer W, Franke H, Groger-Arndt H, Illes P: Evidence for the existence of P2Y1,2,4 receptor subtypes in HEK-293 cells: Reactivation of P2Y1 receptors after repetitive agonist application. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2005;371:466-472.

36 Serrano A, Mo G, Grant R, Pare M, O'Donnell D, Yu XH, Tomaszewski MJ, Perkins MN, Seguela P, Cao CQ: Differential expression and pharmacology of native P2X receptors in rat and primate sensory neurons. J Neurosci 2012;32:11890-11896.

37 Nagata K, Imai T, Yamashita T, Tsuda M, Tozaki-Saitoh H, Inoue K: Antidepressants inhibit P2X4 receptor function: A possible involvement in neuropathic pain relief. Mol Pain 2009;5:20.

38 Khakh BS, Proctor WR, Dunwiddie TV, Labarca C, Lester HA: Allosteric control of gating and kinetics at P2X(4) receptor channels. J Neurosci 1999;19:7289-7299.

39 Asatryan L, Popova M, Perkins D, Trudell JR, Alkana RL, Davies DL: Ivermectin antagonizes ethanol inhibition in purinergic P24 receptors. J Pharmacol Exp Ther 2010;334:720-728.

40 Manohar M, Hirsh MI, Chen Y, Woehrle T, Karande AA, Junger WG: ATP release and autocrine signaling through P2X4 receptors regulate γδ T cell activation. J Leukoc Biol 2012;92:787-794.

41 Gong QJ, Li YY, Xin WJ, Zang Y, Ren WJ, Wei XH, Li YY, Zhang T, Liu XG: ATP induces long-term potentiation of c-fiber-evoked field potentials in spinal dorsal horn: The roles of P2X4 receptors and p38 MAPK in microglia. Glia 2009;57:583-591.

42 Li C, Peoples RW, Weight FF: Ethanol-induced inhibition of a neuronal P2X purinoceptor by an allosteric mechanism. Br J Pharmacol 1998;123:1-3.

43 Michel AD, Chambers LJ, Walter DS: Negative and positive allosteric modulators of the P2X(7) receptor. Br J Pharmacol 2008;153:737-750.

Dow

nloa

ded

by:

Sem

mel

wei

s U

niv

of M

edic

ine

19

3.22

4.49

.128

- 1

/31/

2014

11:

50:5

2 A

M

Cell Calcium 52 (2012) 468– 480

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Cell Calcium

jo u rn al hom epa ge: www.elsev ier .com/ locate /ceca

Inhibition of the human epithelial calcium channel TRPV6 by2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB)

Gergely Kovacsa,c,∗, Nicolas Montalbetti a,c, Alexandre Simonina,c, Tamas Dankob,Bernadett Balazsb, Akos Zsemberyb, Matthias A. Hedigera,c,∗

a Institute of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Bern, 3012 Bern, Switzerlandb Institute of Human Physiology and Clinical Experimental Research, Semmelweis University, 1094 Budapest, Hungaryc Swiss National Centre of Competence in Research, NCCR TransCure, University of Bern, Switzerland

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 5 April 2012Received in revised form 25 August 2012Accepted 27 August 2012Available online 4 October 2012

Keywords:TRPV62-APBSOCCalcium channel

a b s t r a c t

TRPV6, a highly calcium-selective member of the transient receptor potential (TRP) channel superfamily,is a major pathway for calcium absorption in the fetal and adult body. It is expressed abundantly inthe duodenum, the placenta and exocrine tissues. TRVP6 was postulated to contribute to store-operatedcalcium channel (SOC) activity in certain cell types such as exocrine cells. In this study, we tested 2-APB, a widely used SOC inhibitor on human TRPV6 (hTRPV6) activity using fluorescence imaging, patchclamp and radioactive tracer techniques in transiently and stably transfected HEK293 cells. We foundthat the basal calcium and cadmium influx was higher in HEK293 cells transfected with hTRPV6 than innon-transfected cells. 2-APB inhibited hTRPV6 activity in both transient and stably transfected cells. Thiseffect was slightly sensitive toward extracellular calcium. The extracellular sodium concentration did notaffect the inhibition of hTRPV6 by 2-APB. However, N-methyl-d-glucamine significantly diminished theinhibitory effect of 2-APB presumably through direct interaction with this compound. Furthermore, 2-APBinhibited the activity of TRPV6 orthologs but not human TRPV5. 2-APB may serve as a parental compoundfor the development of therapeutic strategies specifically targeting the hTRPV6 calcium channel.

© 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

The rat and the human isoforms of the transient receptor poten-tial channel vanilloid type 6 (TRPV6, also known as CaT1), were firstidentified and cloned over a decade ago [1,2]. The human TRPV6gene is localized at chromosome 7q34 [2]. The promoter regionof human TRPV6 contains several vitamin D receptor binding siteswhich are involved in the regulation of TRPV6 expression and activ-ity by 1,25-dihydroxyvitamin D3 [3,4]. The TRPV6 gene encodes amembrane protein of 725 amino acids that contains six transmem-brane domains and intracellular N- and C-termini. The pore regionis presumably placed between TM5 and TM6. PKC and calmodulinregulate the activity of TRPV6 by binding to the C-terminal partof the protein. The N-terminal part of the protein contains threeankyrin repeats [5]. Altering of the N-glycosylation site on the firstextracellular loop the �-glucuronidase Klotho enhances the activityof TRPV6 [6].

∗ Corresponding authors at: Bühlstrasse 28, University of Berne, CH-3012 Bern,Switzerland. Tel.: +41 31 631 41 29; fax: +41 31 631 34 10.

E-mail addresses: gergely.kovacs@ibmm.unibe.ch (G. Kovacs),matthias.hediger@ibmm.unibe.ch (M.A. Hediger).

URL: http://www.transcure.org (M.A. Hediger).

The TRPV6 amino acid sequence is similar to that of TRPV5,with 75% amino acid sequence identity; whereas the similarity tothe homologs TRPV1 to TRPV4 is much lower (30–35% amino acidsequence identity). Furthermore, TRPV6 is a highly calcium selec-tive epithelial cation channel forming most likely homotetramers.

In the duodenal and placental epithelia, TRPV6 serves as a majorcalcium absorption pathway whereas its function is still elusivein secretory epithelial tissue of pancreas, prostate, salivary gland,etc.

The pharmacology of TRPV6 is still very poorly understood andno specific and efficient natural or synthetic inhibitors are currentlyknown. TRPV6 transports and is inhibited by Gd3+ and La3+ likemany other calcium channels [1,7]. We recently discovered thatZn2+ and Cd2+ block hTRPV6 similarly at high micromolar con-centrations [7]. TRPV6 was proposed to be a component of thecalcium-release activated Ca2+ channel (ICRAC) [8,9]. However, thisfinding was disputed because several properties of endogenousICRAC were found to be different compared to TRPV6 in heterol-ogously expressed system [10]. However, these differences alsodepended on the expression level in the expression system. Nev-ertheless, all studies used 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB)to help the evaluation whether TRPV6 can indeed function asstore-operated calcium channel. In this study, we addressed thecontroversy of the previously measured effects of 2-APB on TRPV6

0143-4160/$ – see front matter © 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.ceca.2012.08.005

G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480 469

by thoroughly investigating the mechanism of action of this com-pound.

2. Methods

2.1. Cell culture and molecular cloning

HEK293 cells were cultured in DMEM cell culture media supple-mented with 10% FBS, 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, and1% penicillin/streptomycin at 37 ◦C in a cell culture incubator. At90% confluency cells were subcultivated.

The entire coding region of mouse TRPV6 (mTRPV6), rat TRPV6(rTRPV6) and human TRPV5 (hTRPV5) cDNAs were amplifiedby PCR reaction using two primers. The 5′-primers (mTRPV6: 5′-GTAGAATTCAATGGGGTGGTCCCTGCCC-3′ with an EcoR1 restrictionsite; rTRPV6: 5′-GTAGAATTCAATGGGGTGGTCACTGCCC with anEcoR1 restriction site; 5′-CGGTACCATGGGGGGTTTTCTACCTAAGGCA-3′ with an Kpn1 restriction site) and the 3′-primer(mTRPV6: 5′-ACTGGTACCTTAGATCTGGTACTCCCAGCCCTCCC-3′ with a KpnI restriction site; rTRPV6: 5′-ACTGGATCCTTAGATCTGGTACTCCCAGCCCTCCC with a BamHI restriction site; hTRPV5:5′-CCGGATCCCTATCAAAAATGGTAGACCTCCTCTCCATC-3′ with aBamHI restriction site) which were used to subcloned TRPV6cDNA into the pTagRFP-C1 vector. We used the site directedmutagenesis kit (Stratagene) to introduce the desired mutationsinto the sequence of human TRPV6.

The pTagRFP-C1-hTRPV6 expressing HEK 293 cell clones wereestablished as described previously [7]. Briefly, cells were platedthe day before on poly-d-lysine coated 35 mm dish were trans-fected with 2 �g pTagRFP-C1-TRPV6 using 5 �l Lipofectamine 2000per well as described in the manufacturer’s protocol. Transfectionmedium was changed to antibiotic-free medium after 4 h. On thefollowing day the medium was replaced with selection antibiotic(G418) containing medium. From then on, the cells were kept in thisselection medium. After a massive cell death of the non-transfectedcells, surviving cells were trypsinized and replated in a 96-wellplate at such a dilution that 1 cell/well density was obtained. Afterseveral days, colonies of cells displaying red fluorescence wereselected as hTRPV6-expressing positive clones using fluorescencemicroscopy.

2.2. Live cell ion imaging

Cells plated onto poly-d-lysine coated coverslip in a 35 mm dishwere transfected with 2 �g pEYFP-C1-hTRPV6 using 5 �l Lipofec-tamine 2000. After 4 h, transfection medium was replaced withfresh antibiotic-free medium. Cells were imaged about 48 h aftertransfection. Non-transfected and transfected cells on the samepiece of coverslip were loaded with 5 �g/ml Fura-2 AM (stock solu-tion 5 �g/�l) for 1 h at 37 ◦C in serum-free medium in a cell cultureincubator. The fluorescence dye was dissolved in DMSO contain-ing 20% Pluronic-F127, as well as 1 mM probenecid to preventdye leakage. Thereafter, cells were placed into modified, nominallycalcium-free Krebs–Ringer HEPES (KRH) (118 mM NaCl, 4.8 mMKCl, 1 mM MgCl2, 5 mM d-glucose, and 10 mM HEPES, pH 7.4) for20 min in order to achieve full de-esterification of the Fura-2. Alter-nate excitation at 340 nm and 380 nm was applied to illuminateFura-2, and the F340/F380 ratio was monitored. The initial rate ofthe increase of the Fura-2 ratio after readdition of 1 mM calciumwas taken as a measure of calcium influx.

Fluorescence measurements were performed on a NikonEclipse TiU inverted microscope equipped with a polychromeV+ light source. Cells were visualized with a Nikon 40x S Fluorobjective. Images were taken with a Hamamatsu Orca-EG cooled,

monochrome CCD camera. Image acquisition and analysis weredone with SimplePCI 6.2 from CImaging.

2.3. Fluorescence ion measurements using FLIPR Tetra highthroughput, fluorescence microplate reader

Cells were trypsinized and plated at 20,000 cells/well densityin 100 �l volume onto 96-well black plates coated with 100 �g/mlpoly-d-lysine. The next day, cells were transfected with pTagRFP-C1-hTRPV6 construct using Lipofectamine 2000 according to themanufacturer’s protocol. When experiments were performed withhTRPV6-expressing cell clones, 40,000 cells were seeded in eachwell 24–36 h before experiments. On the experimental day, the cellculture medium was replaced with 100 �l of loading buffer (mod-ified Krebs buffer containing in mM 117 NaCl, 4,8 KCl, 1 MgCl2,5 d-glucose, 10 HEPES, and fluorescence dye(s)). When sodiumwas replaced with NMDG, the sodium concentration of the load-ing buffer was adjusted accordingly. Cells were then incubatedin the loading buffer at 37 ◦C for 1 h. Fluorescence calcium andcadmium measurements were carried out using FLIPR-Tetra high-throughput, fluorescence microplate reader. Cells were excitedusing a 470–495 or 510–545 nm LED module, and the emittedfluorescence signal was filtered with a 515–575 or 526–586 nmemission filter for calcium/cadmium and membrane potential mea-surements, respectively. After establishment of a stable baseline,cells were incubated with 2-APB under calcium-free conditions for5 min followed by the administration of either 2 mM CaCl2 or 50 �Mof CdCl2 (control). In the negative control group, neither substratenor compound was administered. Experiments were done with6 repeats per group. Relative IC50 values were calculated by thesoftware Screenworks 3.1.1.4.

2.4. Patch clamp experiments

Voltage clamp recordings were performed in the whole-cellconfiguration using an Axopatch 200B amplifier (Axon Instru-ments), as described previously [7]. Micropipettes were pulled fromborosilicate glass capillary tubes (Harvard Apparatus) using a P-97 Flaming-Brown type micropipette puller (Sutter Instrument),and had a tip resistance of 3–6 M� when filled with pipette solu-tion. Currents were monitored using ramp commands (−110 mV to+90 mV in 200 ms, 1 mV/ms) applied every 5 s at a holding potentialof −20 mV between ramps. All reported currents were normalizedby cell capacitance and expressed as current density (pA/pF). Seriesresistance was accepted if lower than five times the pipette tipresistance. Currents were filtered at 1 kHz (four-pole Bessel filter)and digitized at 5 kHz. Command protocols, data acquisition andanalysis were controlled by pClamp 6.03 software (Axon Instru-ments).

Patch pipette filling solution contained (in mM): 140 NMDG, 1MgCl2, 20 EGTA and 10 HEPES, adjusted to pH 7.2 with HCl. To studythe effect of 2-APB when applied to the intracellular face of themembrane whole-cell currents were recorded with patch pipettefilling solution containing (in mM): 145 Cs-glutamate, 8 NaCl, 1MgCl2, 10 EGTA 10 HEPES and 100 �M 2-APB, adjusted to pH 7.2with CsOH. Normal extracellular solution contained (in mM): 147NaCl, 3 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 d-glucose, 10 HEPES, adjusted topH 7.4 with NaOH. Divalent-free (DVF) control solution contained(in mM): 147 NMDG, 15 d-glucose, 10 HEPES, adjusted to pH 7.4with HCl. After whole-cell configuration was obtained in normalsolution, cells were initially bathed in DVF control solution for 5 minto allow proper dialysis of the cell interior. During recordings, thebath solution was changed to control solution supplemented with2 mM CaCl2. Solutions were delivered by continuous perfusion with

470 G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480

6

7nontra nsfe ctedtran sfected

6

7

nontransfected

transfected1 M C 2+

A B

3

4

5

6

3

4

5

6 transfected

ra-2

ra

tio

1 mM Ca2+

100 µM

ra-2

ra

tio

0

1

2

0

1

2

Fu

r

2-APB

Fu

r

1 mM Ca2+

120010008006004002000120010008006004002000

time (s)

e o

f

/s)

C

time (s)

8000

9000

non-transfectedtransfected

ial

incr

ease

tio

(1

0-5

U/

5000

6000

7000

8000 transfected

Rate

of

init

i

Fu

ra-2

rat

#1000

2000

3000

4000

R

*0

1000

BPA-2 Mµ 001lortnoc

Fig. 1. Inhibition of hTRPV6 activity by 2-APB in HEK293 cells transiently overexpressing hTRPV6 in nominally calcium free buffer. Representative Fura-2 tracings showthat cytosolic calcium concentration was the same in transfected and in non-transfected HEK293 cells in nominally calcium free buffer. The administration of 1 mM calciumresulted in a large, transient increase of cytosolic calcium that stabilized at much higher level after 5–7 min in transfected cells whereas this calcium response was small innon-transfected cells. 2-APB pretreatment significantly decreased this increase of cytosolic calcium in response to 1 mM extracellular calcium (Panel B). Panel C shows thesummarized data of the Fura-2 experiments performed in nominally calcium free buffer. The initial rate of the increase of Fura-2 ratio in response to administration of 1 mMof extracellular calcium was analyzed w/wo 100 �M 2-APB. Each bar represents at least 6 separate experiments and 50 individual cells. *p < 0.05; #p < 0.001.

a gravity-fed delivery system. All experiments were performed atroom temperature.

2.5. 45Ca uptake assay

HEK cells non-transfected or transfected with pTagRFp-C1-hTRPV6 or pTracer-CMV1-rTRPV6 were washed twice withmodified KRH solution after 48 h of transfection. Afterwards, cellswere incubated with/without 2-APB in the absence/presence of1 mM extracellular calcium for 5 min followed by 2 min expositionto 2 �Ci 45Ca in KRH solution containing 100 �M cold calcium in thepresence of 100 �M 2-APB. When the effect of 2-APB was examinedin the presence of 1 mM extracellular calcium solution the uptakesolution contained 10 �Ci of 45Ca and the cells were incubated for10 min. Calcium uptake was stopped by rinsing the cells with ice-cold KRH-solution with 1 mM cold calcium and samples were lysedin 1 ml 1 N NaOH overnight. Thereafter, samples were measured ina liquid scintillation counter (Packard Tri-Carb 2100 TR) followingadministration of 1 ml 1 N HCL and 5 ml scintillation liquid. Pro-tein concentration was determined by DC Protein Assay. TRPV6activity was calculated as the difference of the measured activitybetween the corresponding transfected and non-transfected cellgroups.

2.6. Cell surface protein biotinylation and Western blotting

First, cells were rinsed once with ice-cold PBS-Ca-Mg (PBScontaining 0.1 mM CaCl2 and 1 mM MgCl2). Afterwards, surface

proteins were biotinylated with 1.5 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotin in10 mM triethanolamine (pH 7.4), 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, and150 mM NaCl for 90 min with horizontal shaking at 4 ◦C. Next,excess biotin was quenched with PBS containing 1 mM MgCl2,0.1 mM CaCl2, and 100 mM glycine for 20 min at 4 ◦C, and thenrinsed three times with PBS. Cells were finally lysed in lysis bufferfor 30 min and lysates were cleared by centrifugation. Proteinconcentrations were determined by DC Protein Assay. Portion ofcell lysates of equivalent amounts of protein were equilibratedovernight with streptavidin agarose beads at 4 ◦C. Beads werewashed sequentially with solutions A [50 mM Tris·HCl (pH 7.4),100 mM NaCl, and 5 mM EDTA] three times, B [50 mM Tris·HCl(pH 7.4) and 500 mM NaCl] twice, and C (50 mM Tris·HCl, pH 7.4)once. Biotinylated surface proteins were then released by heat-ing to 95 ◦C with 4× Lämmli buffer. Proteins from the total lysateor intracellular fraction were also heated to 95 ◦C for 5 min with4× Laemmli buffer, after adjusting the protein concentration to1 mg/ml.

Samples were run on an 8% SDS gel with 20 �g protein loadedfrom the total and cytosolic protein samples. Using the semi-drytransfer method, samples were transferred onto a PVDF mem-brane in Dunn’s buffer. Membranes were blocked overnight withPBS containing 5% milk, 0.5% BSA and 0.02% NaN3. Afterwards,samples were incubated in blocking solution containing the pri-mary antibody (1:2000 for rabbit anti-tRFP (Evrogen AB233)) atroom temperature for 1.5 h followed by three washes with PBST.HRP-conjugated goat anti-rabbit (1:20,000, Santa Cruz SC1616)antibody was used as secondary antibody. After three consecutive

G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480 471

1 0

1.2

1 0

1.2250 µM Mn2+ 250 µM Mn2+100 µM 2-APB

359 n

m

359 n

m

BA

0.6

0.8

1.0

0.6

0.8

1.0

a-2

in

ten

sity

at

3

a-2

in

ten

sity

at

3

0 0

0.2

0.4

transfec ted

non-t ransfec ted

0 0

0.2

0.4

transfec ted

non-transfec ted

orm

ali

zed

Fu

ra

orm

ali

zed

Fu

ra

0 20 0 400 60 0 80 0 100 0

0.0

0 20 0 40 0 600 80 0 100 0

0.0

time (s )

No

time (s )

No

C

rea

se o

f

nm

(1

0-4

U/s

)

-5

0

BPA-2lortnoc

of

init

ial

dec

r

ensi

ty a

t 3

59

n

#-15

-10

Ra

te

Fu

ra-2

in

t e

-25

-20non-transfected

transfected

Fig. 2. 2-APB inhibits hTRPV6 activity in the presence of 1 mM extracellular calcium in HEK293 cells transiently overexpressing hTRPV6. As shown in representative,normalized Fura-2 tracings, manganese entry measured as quenching of Fura-2 intensity at 359 nm (calcium insensitive wavelength) was significantly higher in transfectedcells under basal conditions (Panel A). 2-APB preincubation markedly decreased manganese entry through hTRPV6 in transfected cells (Panel B). All data obtained by theanalysis of the rate of decrease of Fura-2 intensity in response to administration of 250 �M Mn2+ are summarized in the bar graph (n = 6 with at least 80 cells per group,#p < 0.001).

washes with PBST and a final wash with PBS, the enhanced chemi-luminescence (ECL) method was used for detection.

2.7. Materials

HEK293 cells were obtained from American Type Culture Collec-tion (ATCC). Lipofectamine 2000, Fura-2 AM, Pluronic Acid F-127,cell culture medium, fetal bovine serum, cell culture supplementsand antibiotics were from Invitrogen. pEYFP-C1-TRPV6 was a gen-erous gift from Prof. Christoph Romanin (Institute for Biophysics,Johannes Kepler University, Linz, Austria). pTagRFP-C1 plasmidwas purchased from Evrogen JSC (Moscow, Russia). Calcium-5assay kit was purchased from Molecular Devices (Sunnyvale, CA,USA). DC Protein Assay was purchased from Bio-Rad Laboratories(Reinach, Switzerland). 2-APB was purchased from Merck Bio-sciences (Darmstadt, Germany). All other materials were obtainedfrom Sigma–Aldrich Chemie GmbH (Buchs, Switzerland).

2.8. Statistics

Results are presented as mean ± SEM. Data were compared withthe rank sum t-test. p < 0.05 was considered significant.

3. Results

3.1. Effect of 2-APB on hTRPV6 activity in transiently transfectedHEK293 cells

As observed previously, fura-2 imaging experiments showedthat the basal intracellular calcium concentration was not elevatedin HEK293 cells transiently transfected with hTRPV6 compared tonon-transfected cells when kept in nominally calcium-free buffer(0.722 ± 0.085, n = 250 vs. 0.662 ± 0.038, n = 168). However, when1 mM extracellular calcium was added, cytosolic calcium levelsstabilized at a much higher level in transfected cells after a largetransient calcium increase (Fig. 1A). We have previously shownthat transfection of HEK293 cells with pEYFP-C1 (empty vector)did not change basal cytosolic calcium concentration and cal-cium entry [7]. Calcium influx through hTRPV6 was significantlyinhibited by 100 �M 2-APB in nominally calcium-free medium(Fig. 1B and C). In addition, calcium influx in non-transfected cellswas also blocked. Next, we examined the effect of extracellularcalcium on the inhibitory effect of 2-APB. hTRPV6 activity wasmeasured by manganese quenching assay in the presence of 1 mMextracellular calcium. Manganese entry was significantly larger intransfected cells compared to non-transfected cells showing that

472 G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480

3

3.5

non-transfected transfected

ke

A

0.8

1

1.2

1.4control100 µM 2-APB

*TR

PV

6 a

cti

vit

y

2

2.5

45C

a u

pta

0

0.2

0.4

0.6

No

rmalized

hT

*

With

calc

0.5

1

1.5

orm

aliz

ed

*ciu

m

0

BPA-2 Mµ 001lortnoc

3.5non-transfected

No

B

e

1 2

1.4controlti

vit

y

2.5

3transfected

Ca

up

take

0 2

0.4

0.6

0.8

1

1.2100 µM 2-APB

*

malized

hT

RP

V6 a

ct

With

ou

1

1.5

2

*

ma

lize

d45

0

0.2

No

rm

ut c

alc

ium

0

0.5

BPA-2 Mµ 001lortnoc

*

No

rm

Fig. 3. Inhibition of 45Ca uptake by 2-APB in HEK293 cells transiently transfected with hTRPV6. Summarized data are shown in bar graphs. 100 �M 2-APB inhibited 45Cauptake in both non-transfected and transfected cells in the presence of 1 mM extracellular calcium (Panel A) or in nominally calcium free buffer (Panel B). Insets show thecalculated hTRPV6 activity (n = 5; *p < 0.05).

this assay is suitable to test the effect of 2-APB on hTRPV6 activityin calcium-containing buffer (Fig. 2A). When cells were pretreatedwith 100 �M 2-APB under these conditions, hTPV6 activity was stillinhibited but to a bit less extent (65.88% inhibition with calcium vs.88.70% inhibition without calcium) (Fig. 2B and C).

Next, we tested the effect of 2-APB on calcium influx measur-ing 45Ca uptake into the cells. These experiments showed that basal45Ca entry was also significantly higher in hTRPV6-transfected cellsboth in the presence and absence of extracellular calcium (Fig. 3Aand B.). When cells were pretreated with 100 �M 2-APB calciumuptake decreased both in transfected and non-transfected cells(Fig. 3). The calculated hTRPV6 activity (the difference of 45Cauptake between transfected and non-transfected cells) was alsosignificantly blocked (see insets of Fig. 3A and B). The inhibitoryeffect of 2-APB on hTRPV6 activity was not changed significantlywhen extracellular calcium was present in the buffer (Fig. 3A vs. B).

In patch clamp experiments HEK293 cells transientlytransfected with hTRPV6 exhibited a Ca2+-evoked whole-cellinward current that reached a peak value within 60 s and subse-quently decreased until a steady-state level was reached (Fig. 4A).A decrease in TRPV6 activity was observed when the cells wereexposed to the store-operated channel inhibitor 2-APB. This effectwas observed when cells were exposed to 100 �M 2-ABP in theabsence (Fig. 4B and D) or presence (Fig. 4C and D) of 2 mMextracellular Ca2+.

Next, we examined the effect of 2-APB on the mouse and ratorthologs of hTRPV6 as well as on hTRPV5 using FLIPR Tetra. First,we tested whether the empty pTagRFP-C1 vector causes any changein our previously published cadmium influx assay. As shown inFig. 5, administration of 50 �M cadmium induced a robust increaseof cadmium-5 fluorescence intensity in HEK293 cells transientlytransfected with pTagRFP-C1-hTRPV6 (Fig. 5A) but not in pTagRFP-C1 transfected cells (Fig. 5B) compared to non-transfected cells(Fig. 5C). Applying the same assay using 2 mM calcium or 50 �Mcadmium we found that 2-APB inhibits all the activities of hTRPV6,

rTRPV6 and mTRPV6. The obtained dose–response curves suggestthat there is no difference in the efficiency of 2-APB when calcium isused as a substrate, however, mTRPV6 and rTRPV6 is less sensitivetoward 2-APB when cadmium was administered (Fig. 6). hTRPV5was found to be insensitive toward 2-APB (Fig. 6).

3.2. 2-APB blocks hTRPV6 activity in an hTRPV6-expressingHEK293 clone

After establishing RFP-hTRVP6 expressing HEK293 clones,TRPV6 expression was examined using biotinylation and Westernblot techniques. We found that hTRPV6 is well expressed in ourselected clone whereas no TRPV6 protein was observed in HEK293cells (Fig. 7). Furthermore, hTRPV6 was expressed in the membraneas shown by biotinylation experiments (Fig. 7). Arrow 1 showsthe fully glycosylated form of hTRPV6 whereas arrow 2 shows theunglycosylated form, as reported previously [7]. The 3rd band isprobably a degradation product of hTRPV6. The Western blot foractin shows that sample loading was consistent and the plasmamembrane fraction was clean (Fig. 7).

We previously reported that hTRPV6 also conducts cadmiumand that hTRPV6 activity can be easily and reliably measured usingthe fluorescence based FLIPR Tetra high-throughput screeningdevice [7]. In these experiments we used both calcium and cad-mium as substrates for hTRPV6. Our first observation was thatadministration of the fluid to the cells induced a transient increaseof cytosolic calcium in the absence of extracellular calcium suggest-ing that calcium was released from intracellular stores in responseto the mechanical stimulus. We found that 2-APB in the range of50–100 �M induced a delay in the recovery of this shear stress-induced calcium release. Furthermore, we observed that 2-APB atdoses ≥250 �M enhanced this transient elevation of cytosolic cal-cium in the absence of extracellular calcium (Fig. 8A and C). Bothcalcium and cadmium entry via hTRPV6 was inhibited by 2-APB

G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480 473

0

[Na+] = 150 mM [ Ca

2+] = 2 mM

100 µM 2-AP BBA

0

[Na+] = 15 0 mM [Ca

2+] = 2 mM

rre

nt

(pA

/pF

)

-60

-40

-20

rent

(pA

/pF

)

-40

-30

-20

-10

Time (sec)

0 100 200 30 0 40 0

Cur

-100

-80

Time (sec)

0 100 200 30 0 400

Curr

-60

-50

-40

( )

DC

Time (sec)

[Na+] = 150 mM [ Ca

2+] = 2 mM

0100 M 2-APBµContr ol

pA

/pF

)

-20

-10

0100 �M 2-AP B

ent

(pA

/pF

)

40

-20

*

Curr

ent

(p

-60

-50

-40

-30

Pe

ak

curr

e

-60

-40

non-transfected

Time (sec)

0 100 200 300

-80transfe cte d

Fig. 4. Effect of 2-APB on inward calcium currents obtained from hTRPV6 transiently transfected HEK293 cells. Cells were initially bathed in DVF solution. At the timeindicated by the black horizontal bar 2 mM Ca2+ and 147 mM Na+ was present in the solution. Only EYFP-hTRPV6-expressing HEK293 cells exhibited the Ca2+-evoked inwardcurrent (filled circles) (Panel A). The typical response of a wild type HEK293 cell is shown (empty diamonds). Cells were exposed to 100 �M 2-ABP (dashed line) after (PanelB) or before (Panel C) the addition of a solution containing 2 mM Ca2+ and 147 mM Na+ (black line). Bar graph showing the summarized data of the effect of store-operatedchannels inhibitors in EYFP-hTRPV6-expressing HEK293 cells. Each group represents 4 separate experiments (*p < 0.01) (Panel D).

pretreatment in nominally calcium free buffer with apparent IC50values of 22 and 17 �M, respectively (Fig. 8B and D).

To further test the effect of 2-APB in HEK293 clones stablyexpressing hTRPV6 we used the patch clamp technique in whole-cell configuration. Calcium influx was detected by monitoringinward currents at −80 mV during voltage ramps. Inwardly rectify-ing currents were observed in hTRPV6-expressing HEK293 clones inthe presence of 2 mM Ca2+, while no such currents were detected inthe absence of Ca2+ or in wild type HEK293 cells (Fig. 9A and B). Wefound that 100 �M 2-APB significantly decreases inward currentsin hTRPV6-expressing HEK293 clones in the presence of 150 mMNaCl (Fig. 9E). This effect was observed when hTRPV6-expressingHEK293 clones were exposed to 2-ABP either before (Fig. 9C) orafter (Fig. 9D) bathing the cells with a solution containing 2 mMCa2+ and 150 mM NaCl.

3.3. Characterization of the inhibition of human TRPV6 by 2-APB

First, we tested whether 2-APB changed the total and the plasmamembrane expression of the hTRPV6 protein. We performed mem-brane surface biotinylation experiments with and without a 5 minpretreatment with 100 �M 2-APB. We found that neither the lev-els of the total, expressed hTRPV6 protein nor that of the hTRPV6

protein expressed at the plasma membrane were changed inresponse to 2-APB treatment (Fig. 10).

It was reported that the amino acid residues, H426 and R696, inthe mouse TRPV3 protein sequence are crucial for the activation ofthe channel activity by 2-APB. In contrast, mutating the equivalentamino acid residues in rTRPV4 from N and W to H and R, respec-tively, changed rTRPV4 to be activated by 2-APB. Consequently, wemutated the equivalent amino acid residues at positions K314 andI597 in hTRPV6 to N and W, respectively (Fig. 11A). Measuring cad-mium uptake by hTRPV6-K314N and hTRPV6-I597W mutants usingFLIPRTetra, we found that these mutants are as sensitive toward2-APB as the wild type hTRPV6 (Fig. 11B).

Next, we tested whether protein kinase C (PKC) or calmodulinare involved in the inhibitory effect of 2-APB on hTRPV6. First, wemutated the PKC phosphorylation site at position T702 in hTRPV6to A. Additionally; we also created a �695–725 mutant where weinserted a stop codon at position 695 to delete the calmodulin bind-ing site. Interestingly the hTRPV6-�695–725 mutant had strikinglyless activity then the wt hTRPV6. However, 2-APB was still able toblock the activity of both hTRPV6-T702A and hTRPV6-�695–725mutants (Fig. 11B)

To study the effect of 2-APB when applied to the intracellu-lar face of the membrane whole-cell currents were recorded fromEYFP-hTRPV6-expressing HEK293 cells with 100 �M 2-APB in the

474 G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480

BARFP-hTRPV6 RFP

50 uM cadmium

no cadmium

Read_Mode_1

Average Graph

2

50 uM cadmium

no cadmium

Read_Mode_1

Average Graph

Baselin

e

250 µM Cd2+buffer 50 µM Cd2+buffer

0

1

Response o

ver

B

Baselin

eR

esponse o

ver

B

0

1

Time (Seconds)

0 100 200 30 0 40 0 50 0 600

Time (Seconds)

0 100 200 30 0 40 0 50 0 600

50 uM cadmium

no cadmium

Read_Mode_1

Average Graph

e

2

C

50 µM Cd2+buffer

non-transfected HEK293

Response o

ver

Baselin

1

2

Time (Seconds)

0 100 200 300 400 500 600

0

Fig. 5. Cadmium influx assay to measure hTRPV6 activity in transiently transfected HEK293 cells using FLIPR Tetra. Administration of 50 �M extracellular Cd2+ evoked alarge increase of calcium-5 fluorescence in pTagRFP-C1-hTRPV6 overexpressing HEK293 cells (Panel A). In contrast, in HEK293 cells transiently transfected with pTagRPF-C1vector or non-transfected cells, the Cd2+ influx was measurable but small (Panels B and C).

Fig. 6. Effect of 2-APB on the activities of human TRPV5 and of the orthologs of human TRPV6. Using the calcium and cadmium influx assays with FLIPR Tetra, 2-APB wasfound to inhibit hTRPV6, mTRPV6 and rTRPV6. hTRPV5 was resistant to 2-APB as shown in representative average tracings (Panel A). Obtained IC50 values are presented inPanel B (n = 2 with 5 repeats per group per experiment).

G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480 475

Fig. 7. Expression of hTRPV6 in HEK293 stably transfected with pTagRFP-C1-hTRPV6. Western blot image shows the expression of RFP-hTRPV6 in total cell lysate, in cysotolicand membrane fractions blotted with anti-tRFP antibody. Bands 1 and 2 are the full glycosylated and the non-glycosylated form of hTRPV6, respectively. The visible 3rd bandis probably a degradation product of the RFP-tagged hTRPV6. Actin loading control can be seen in the lower image.

Fig. 8. Dose-response curve of 2-APB on hTRPV6 activity in hTRPV6-expressing HEK293 cell clones using FLIPR Tetra. Average tracings show the effect of 2-APB at variousconcentrations on cadmium and calcium influxes through hTRPV6 (Panels A and C, respectively). Inhibitory dose response curves are shown in Panels B and D.

476 G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480

BA

-20 mV

110 mV

90 mV

pA

/pF

)

-20

-10

0

[Na+] = 150 mM [Ca

2+] = 2 mM

-110 mV

0 100 200 300 400

Curr

ent

(p

-50

-40

-30

-20

C20 ms

50 pATime (sec)

F)

0

[Na+] = 150 mM [Ca

2+] = 2 mM

100 M 2-APB

E control 100 M 2-AP B

Curr

ent

(pA

/pF

40

-30

-20

-10

0

D [Na+] = 150 mM [Ca

2+] = 2 mM

Time (sec)

0 100 200 300 400

-40

en

t (p

A/p

F)

-20

-10

*re

nt

(pA

/pF

)

-20

-10

0100 M 2-APB

Pe

ak c

urr

e

-40

-30

non-transfected

Time (sec)

0 100 200 300 400

Curr

-40

-30

-50

transfected

Fig. 9. Time course of Ca2+-evoked inward currents obtained from TRPV6-expressing HEK293 clones. (A) Original traces demonstrating current–voltage relationship in theabsence (gray) and presence of 2 mM Ca2+ (black) in TRPV6-expressing HEK293 clones. (B) TRPV6-expressing HEK293 clones were initially bathed in DVF solution. During thetime indicated by the black line the cells were bathed by a solution containing 2 mM Ca2+ and 147 mM Na+. Only TRPV6-expressing HEK293 clones exhibited the Ca2+-evokedinward current (filled circles). The typical response of a wild type HEK293 cell is shown (empty diamonds). Cells were exposed to 100 �M 2-ABP (dashed line) before (C) orafter (D) the addition of a solution containing 2 mM Ca2+ and 147 mM Na+ (black line). (E) Bar graph showing the summarized data of the effect of store-operated channelsinhibitors in hTRPV6-expressing HEK293 clones. Each group represents 3 separate experiments (*p < 0.01).

patch pipette. We did not observe an inhibitory effect of 2-APBunder these conditions. However, a decrease in hTRPV6 activitywas observed when 100 �M 2-APB was present in the bath solution(Fig. 12).

3.4. Effect of extracellular sodium and calcium on the inhibition ofhTRPV6 activity by 2-APB in an hTRPV6-expressing HEK293 clone

First, we evaluated the hTRPV6 activity by measuring howcadmium influx into the cells is affected by 2-APB by extra-cellular sodium or calcium using the FLIPR Tetra device. Asexpected, we found that addition of 2 mM calcium reduced cad-mium influx via TRPV6 (Fig. 13A vs. B). However, extracellularcalcium did not change the inhibitory effect of 2-APB on hTRPV6(Fig. 13A, B, and D). Interestingly, in the presence of 7.5 mMextracellular sodium, 2-APB did not inhibit hTRPV6 when sodiumwas replaced by N-methyl-d-glucamine (NMDG) (Fig. 13C andD). Also, replacement of extracellular sodium with choline orKCl did not change the inhibitory effect of 2-APB on hTRPV6

activity (Fig. 13D). As it was expected, the membrane depolar-ization induced by the replacement of sodium with potassiumsignificantly inhibited hTRPV6 activity (Fig. 13D). These results sug-gest that extracellular sodium does not influence the inhibitoryeffect of 2-APB. However, interaction might occur between N-methyl-d-glucamine or sucrose and the 2-APB molecules inthe extracellular milieu which would prevent inhibition ofhTRPV6.

The influence of extracellular sodium on the 2-APB-inducedTRPV6 inhibition was further tested with the patch clamp tech-nique. In the presence of 150 mM extracellular sodium, 2-APBinhibits TRPV6 activity in both HEK293 cells transiently transfectedwith hTRPV6 (Fig. 4) and in an hTRPV6-expressing HEK293 clone(Fig. 9). The effect of 2-APB under these conditions was indepen-dent of extracellular Ca2+. When 2-APB (100 �M) was assayed inthe absence of extracellular sodium, the inhibitory effect was notobserved (Fig. 14). These results are in agreement with the previ-ous findings, showing that replacement of extracellular sodium byNMDG prevents 2-APB-mediated inhibition of hTRPV6.

G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480 477

Fig. 10. Expression of hTRPV6 protein in hTRPV6-expressing HEK293 clone in response to 100 �M 2-APB treatment. Cytoplasmic (Panel A) and plasma membrane fractions(Panel B) of proteins obtained from hTRPV6-expressing HEK293 clone were blotted with anti-tRFP for hTRPV6 detection (upper part of the same membrane) and with anti-actin antibody for loading control (lower part of the same membrane). 3 specific bands were observed for hTRPV6. Biotinylation experiments without biotin were performedas a negative control for non-specific binding by streptavidin beads. 5 min 2-APB pretreatment did not change the expression of membrane or plasma membrane hTRPV6protein.

Fig. 11. The effect of 2-APB on hTRPV6 mutants. Panel A shows the sequence alignment of the N-terminal and C-terminal regions of mouse TRPV3, rat TRPV4, and humanTRPV6. Black boxes represent the identified amino acid residues of the 2-APB binding site in the mTRPV3 sequence. 2-APB inhibits the channel activity of all generatedhTRPV6 mutants measured by cadmium influx using FLIPR Tetra shown in Panel B (*p < 0.05).

4. Discussion

In spite of the detailed characterization of TRPV6 during the pastdecade, no specific or potent inhibitors, activators or modulatorsof this channel were discovered. The lanthanides gadolinium and

lanthanum were found to inhibit rat [1] and human [2,7] TRPV6in oocyte and mammalian over-expression systems. Furthermore,other divalent cations such as zinc, cadmium, manganese alsoinhibited TRPV6-mediated calcium influx [1,2,7]. Interestingly, lowmicromolar concentration of zinc stimulated human TRPV6 activity

478 G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480

�M 2

-APB

M 2

-APB

rol

rol

A B[Ca2+

] = 2 mM

pA

/pF

)

-20

-10

0

A/p

F)

-10

010

0 �M

100 µM

Con

tro

Con

troC

urr

ent (p

-40

-30

20

curr

ent (p

A/

-30

-20**

Time (sec)

0 50 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0

-50

Pe

ak

-50

-40

Fig. 12. Effect of 2-APB when applied to the intracellular face of the membrane. Typical whole-cell currents recorded from EYFP-hTRPV6-expressing HEK293 cell with100 �M 2-APB in the patch pipette without (filled circles) or with (gray triangles) 100 �M 2-APB in the bath. The characteristic response of a wild type HEK293 cell isshown (empty diamonds) (Panel A). In Panel B, the bar graph show the averaged data of the effect of the store-operated channels inhibitor 2-APB applied extracellularlyin EYFP-hTRPV6-expressing HEK293 cells without (empty bars, 5 separate experiments) or with (hashed bars, 3 separate experiments) 100 �M 2-APB in the patch pipette(*p < 0.01).

[7]. Ruthenium red was reported to be a potent inhibitor of TRPV5(IC50 121 ± 13 nm) but it also inhibited TRPV6 (IC50 9 ± 1 �m) [11].The anti-fungal drug, econazole inhibited TRPV6-mediated calciuminflux and cell proliferation at concentration 600 nM in HEK293cells overexpressing human TRPV6 [12]. However, econazole blocksmany calcium channels in non-excitable cells including TRPV5[13,14].

It has been debated for a long time whether TRPV6 is part of thestore-operated calcium channel system. In early reports, 2-APB, awidely used store-operated calcium channel inhibitor, was used toaddress this question. The obtained results showed that the effectof 2-APB on the rat isoform of TRPV6 is complex. It depends onthe cell type and the level of expression. In HEK293 cells rTRPV6-induced currents were constitutively active and found to be slightly

Fig. 13. Effect of extracellular calcium and sodium on hTRPV6 inhibition by 2-APB in HEK293-hTRPV6 clonal cells. The effect of 2-APB on hTRPV6 activity was measuredby cadmium influx assay in the absence (Panel A) and in the presence of 1 mM extracellular calcium (Panel B). Extracellular sodium was reduced from 150 mM (Panel A)to 7.5 mM (Panel C) by isoosmotically replacing it with NMDG. The inhibitory effect of 2-APB was clearly reduced and abolished when extracellular sodium was replaceby NMDG. In Panel D, the bar graph shows the effect of 2-APB on hTRPV6 activity when extracellular Na+ concentration was replaced by different substances (n = 2 with 6repeats per experiments per group; *p < 0.05).

G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480 479

A

0 100 M 2-APB

[Na+] = 0 mM [Ca

2+] = 2 mM

C

nt (p

A/p

F)

-20

-10

0 100 M 2-APB

non-transfected

transfected

0 50 100 150 200 250 300

Curr

en

-40

-30

4.0

4.5

[Na+] = 0 mM [Ca

2+] = 2 mM

B

Time (sec)

0 50 100 150 200 250 300

ed c

urr

ent

2.5

3.0

3.5

A/p

F)

-10

0

100 M 2-APBB

No

rma

lize

1.0

1.5

2.0

Curr

ent (p

A

-40

-30

-20

100 M 2-APBcontrol

0.0

0.5

Time (sec)

0 50 100 150 200 250

-50

Fig. 14. Effect of 2-APB on Ca2+-evoked inward currents in TRPV6-expressing HEK293 clones when extracellular Na+ was replaced by N-methyl-d-glucamine. TRPV6-expressing HEK293 clones were initially bathed in DVF solution. Cells were exposed to 100 �M 2-APB (dashed line) after the addition of a solution containing 2 mM Ca2+ inthe absence of Na+ (black line) (Panel A). Cells were initially exposed to 100 �M 2-APB (dashed line). During the time indicated by the black line the cells were bathed by asolution containing 2 mM Ca2+ in the absence of Na+ (Panel B). Bar graph showing the summarized data of the effect of 2-APB in the absence of Na+ tested on hTRPV6-expressingHEK293 clones. Each group represents 3 separate experiments (Panel C).

activated by 75 �M 2-APB [8]. In contrast in RBL cells, small currentdensities of rTRPV6 were inhibited while large ones were enhancedby 2-APB [8]. These effects were observed both in Ca2+-containingand divalent free solution. The mouse TRPV6-mediated currentswere also potentiated by 50 �M 2-APB [10].

Our results confirm that hTRPV6 heterologously expressedin HEK293 cells forms a constitutively active channel at theplasma membrane. Ion measurements with fluorescence indica-tors showed extracellular calcium-dependent elevation of basalcytosolic calcium levels and increased basal calcium influx. Thiseffect was clearly dependent on hTRPV6 expression because tran-fection of HEK293 cells with the empty pTagRFP vector did notcause any changes in calcium or cadmium influx compared tonon-transfected cells. Additionally, increased basal currents wereobserved in whole-cell patch clamp experiments in hTRPV6-expressing HEK293 cells. The uptake of 45Ca was also increasedin transfected cells. To our great surprise, the human isoformwas greatly blocked by 2-APB in HEK293 cells, regardless of theexpression system and detection method. Results of the measure-ments of calcium or cadmium uptake via TRPV6 using the FLIPRTetra fluorescence microplate reader showed that 2-APB inhibitshTRPV6 with an IC50 value ∼20 �M. We obtained similar resultsusing untagged hTRPV6 (data not shown). The effect of 2-APB wasreversible because the removal of 2-APB restored the full hTRPV6activity (data not shown). This inhibitory effect of 2-APB was onlyslightly influenced by the extracellular calcium concentration, that

is, in the presence of 1 or 2 mM extracellular calcium, the effect of2-APB was only reduced to a small extent.

Extracellular sodium modulates the activity of many calciumconducting channels. It was reported that lowering extracel-lular sodium directly activates porcine TRPV1 and facilitatesTRPV1-mediated responses to capsaicin, heat, protons and theendovanilloid 15(S)-HPETE [15]. It was also shown that extracel-lular sodium interacts with two glutamate residues (Glu600 andGlu648) of the proton binding sites of TRPV1. Although, in con-trast to TRPV1–4 which are non-selective cation channels, TRPV5and TRPV6 are highly calcium selective, we examined the effectof extracellular sodium on the inhibition of hTRPV6 by 2-APB[16,17].

Interestingly, replacement of extracellular sodium by potas-sium or choline did not change the 2-APB inhibition of hTRPV6. Asit was expected, plasma membrane depolarization by increasingthe level of extracellular potassium largely reduced the activ-ity of hTRPV6. Unexpectedly, NMDG significantly blocked theinhibitory effect of 2-APB. In our patch clamp experiments with 2-APB pretreatment, 2-APB was always administered in the absenceof extracellular sodium (replaced by NMDG), however, it inhib-ited hTRPV6 conductance only when calcium was added togetherwith sodium. It is well known that borinic acids are capableof reversible two-point covalent binding to diols, catechols, andhydroxy acids [18]. Hence, it is quite likely that there are inter-actions between 2-APB and the hydroxyl groups of the glucose

480 G. Kovacs et al. / Cell Calcium 52 (2012) 468– 480

derivative NMDG. Our results suggest that these interactions areresponsible for the reduction of 2-APB inhibition of TRPV6 whenlowering extracellular sodium concentration by replacing it withNMDG or sucrose.

In agreement with previous findings, 2-APB fully inhibited therodent orthologs of hTRPV6, namely rat TRPV6 and mouse TRPV6,only at higher concentrations (≥ 100 �M) in a transient overex-pression system. However, we found partial inhibition of theseorthologs by 50 �M 2-APB when calcium was used as a substrate.These discrepancies could be explained by using different cell mod-els and detection methods. In contrast, hTRPV5 activity was notchanged by 2-APB.

We also tested whether inhibited activity of hTRPV6 in responseto 2-APB treatment is due to reduced protein expression of thechannel at plasma membrane. We found that 5 min of treatment didnot induce any change. In fact, 1 h pretreatment was also ineffectiveon the hTRPV6 protein expression (data not shown).

2-APB was found to modulate many different types of TRP chan-nels: it activates TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPA1 and TRPM6, whereasTRPC4, TRPC5, TRPC6, TRPM2 and TRPM6 are inhibited by 2-APB[19]. Using a mTRPV3 mutant library generated by random muta-genesis, two residues, H426 and R696, were identified and foundto be critical for the activation of TRPV3 by 2-APB [20]. Inter-estingly, it was shown that the orthologs of TRPV3 from human,mouse, dog and frog, which all have histidine residues at themouse-equivalent position 426, are activated by 2-APB. In contrast,the chicken TRPV3 ortholog which has asparagine at this positionwas only weakly sensitive toward 2-APB. Equivalent amino acidresidues were responsible for the lack of sensitivity of TRPV4 to 2-APB. However, they were not implicated in the activation of TRPV1and TRPV2 by 2-APB. When we examined the role of the equivalentamino acid residues in hTRPV6 (K314 and I597), we found that theseresidues are also not involved in the inhibitory effect of 2-APB. Thus,these conserved residues which are located intracellularly cannotbe part of the putative 2-APB binding site in the hTRPV6 structure,also because hTRPV6 was inhibited only from outside, as revealedby our patch clamp experiments.

We also investigated the potential role of PKC and calmodulin inthe signal transmission of 2-APB inhibition. We found that neitherof them has any role in the inhibitory effect of 2-APB on hTRPV6activity.

Our results also demonstrate that 2-APB inhibits basal endoge-nous calcium influx (probably store-operated calcium channels) inthe same concentration range. Further increase of 2-APB concen-tration presumably results in calcium release from internal stores.Our results are consistent with the previous observation that 2-APBblocks non-mitochondrial Ca2+-pumps (IC50 value 91 �M) and, athigher concentrations (above 100 �M) also increases non-specificleaks from internal calcium stores [21].

In summary, we conclude that 2-APB is a reliable, but notspecific inhibitor of human TRPV6 but it is much less effectivefor rTRPV6 and mTRPV6. Our finding that 2-APB blocks hTRPV6does not answer the question of whether TRPV6 is part of thestore-operated calcium channel complex. As discussed above theactivities of many other TRP channels, that are not part of thestore-operated calcium channel complex, are modulated by 2-APB.Nevertheless, store-operated calcium channels are blocked by 2-APB at the same concentration range as that necessary to inhibithTRPV6.

Our results suggest that 2-APB can be used as a pharmacologicalinhibitor in hTRPV6 studies. Additionally, 2-APB could serve as aparental compound in the development of more efficient and morechannel subtype-specific TRPV6 inhibitors.

Further studies are required to unravel the mechanisms of inhi-bition of TRPV6 by 2-APB and to identify the 2-APB-specific binding

sites of hTRPV6. Strategies similar to those used to determine the2-APB binding site in TRPV3 can be pursued. Identification andcharacterization of the 2-APB binding sites in different TRP chan-nels will be of general broad interest to help understand how 2-APBtriggers different effects on channels belonging to the same familyand how exactly it modulates the regulation of intracellular calciumstores.

Acknowledgements

This publication was supported by the Swiss National ScienceFoundation (SNSF) through the National Centre of Competence inResearch (NCCR) TransCure (website: http://www.transcure.org)and OTKA K79189 grant. The authors thank Maria Feher for herexcellent cell culture assistance.

References

[1] J.B. Peng, X.Z. Chen, U.V. Berger, et al., Molecular cloning and characterizationof a channel-like transporter mediating intestinal calcium absorption, Journalof Biological Chemistry 274 (1999) 22739–22746.

[2] J.B. Peng, X.Z. Chen, U.V. Berger, et al., Human calcium transport proteinCaT1, Biochemical and Biophysical Research Communications 278 (2000)326–332.

[3] S. Balesaria, S. Sangha, J.R.F. Walters, Human duodenum responses to vitamin Dmetabolites of TRPV6 and other genes involved in calcium absorption, Amer-ican Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology 297 (2009)G1193–G1197.

[4] M.B. Meyer, M. Watanuki, S. Kim, N.K. Shevde, J.W. Pike, The human transientreceptor potential vanilloid type 6 distal promoter contains multiple vitaminD receptor binding sites that mediate activation by 1,25-dihydroxyvitamin D3in intestinal cells, Molecular Endocrinology 20 (2006) 1447–1461.

[5] T. Nijenhuis, J. Hoenderop, R. Bindels, TRPV5 and TRPV6 in Ca2+ (re)absorption:regulating Ca2+ entry at the gate, Pflügers Archiv European Journal of Physiology451 (2005) 181–192.

[6] P. Lu, S. Boros, Q. Chang, R.J. Bindels, J.G. Hoenderop, The beta-glucuronidaseklotho exclusively activates the epithelial Ca2+ channels TRPV5 and TRPV6,Nephrology Dialysis Transplantation 23 (2008) 3397–3402.

[7] G. Kovacs, T. Danko, M.J. Bergeron, et al., Heavy metal cations permeate theTRPV6 epithelial cation channel, Cell Calcium 49 (2011) 43–55.

[8] R. Schindl, H. Kahr, I. Graz, K. Groschner, C. Romanin, Store depletion-activated CaT1 currents in rat basophilic leukemia mast cells are inhibitedby 2-aminoethoxydiphenyl borate, Journal of Biological Chemistry 277 (2002)26950–26958.

[9] L. Yue, J.B. Peng, M.A. Hediger, D.E. Clapham, CaT1 manifests the pore propertiesof the calcium-release-activated calcium channel, Nature 410 (2001) 705–709.

[10] T. Voets, J. Prenen, A. Fleig, et al., CaT1 and the calcium release-activated calciumchannel manifest distinct pore properties, Journal of Biological Chemistry 276(2001) 47767–47770.

[11] J.G.J. Hoenderop, R. Vennekens, D.<Et-AL> Müller, Function and expression ofthe epithelial Ca2+ channel family: comparison of mammalian ECaC1 and 2,Journal of Physiology 537 (2001) 747–761.

[12] E.C. Schwarz, U. Wissenbach, B.A. Niemeyer, et al., TRPV6 potentiates calcium-dependent cell proliferation, Cell Calcium 39 (2006) 163–173.

[13] D. Franzius, M. Hoth, R. Penner, Non-specific effects of calcium entry antago-nists in mast cells, Pflügers Archiv European Journal of Physiology 428 (1994)433–438.

[14] B. Nilius, J. Prenen, R. Vennekens, J.G.J. Hoenderop, R.J.M. Bindels, G. Droog-mans, Pharmacological modulation of monovalent cation currents throughthe epithelial Ca2+ channel ECaC1, British Journal of Pharmacology 134 (2001)453–462.

[15] T. Ohta, T. Imagawa, S. Ito, Novel gating and sensitizing mechanism of capsaicinreceptor (TRPV1), Journal of Biological Chemistry 283 (2008) 9377–9387.

[16] C. Montell, Physiology, phylogeny, and functions of the TRP superfamily ofcation channels, Science’ STKE 2001 (2001) re1.

[17] K. Venkatachalam, C. Montell, TRP channels, Annual Review of Biochemistry 76(2007) 387–417.

[18] M.G. Chudzinki, Y. Chi, M.S. Taylor, Borinic acids: a neglected class oforganoboron compounds for recognition of diols in aqueous solution, Aus-tralian Journal of Chemistry 64 (2011) 1466–1469.

[19] D.E. Clapham, SnapShot: mammalian TRP channels, Cell 129 (2007) 220.[20] H. Hu, J. Grandl, M. Bandell, M. Petrus, A. Patapoutian, Two amino acid residues

determine 2-APB sensitivity of the ion channels TRPV3 and TRPV4, Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 106 (2009)1626–1631.

[21] L. Missiaen, G. Callewaert, H. De Smedt, J.B. Parys, 2-Aminoethoxydiphenylborate affects the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, the intracellular Ca2+

pump and the non-specific Ca2+ leak from the non-mitochondrial Ca2+ storesin permeabilized A7r5 cells, Cell Calcium 29 (2001) 111–116.