Embed Size (px)
Citation preview
1
Värt att veta om:
Centrifugering
Värt att veta om:
Centrifugering
2 3
Syftet med denna skrift är att ge en introduktion om centrifugering; nomenklatur, typer av centri-
fuger och rotorer, separations tekniker och val av gradienter. Dessutom finns hänvisning till de
standards som styr säkerhet och underhållsarbete. Som underlag till denna skrift har ett internt
Axeb seminarieprogram och fakta från Heraeus/Sorvall använts.
När man vill studera enskilda partiklar i suspension; som äggviteämnen, fetter, socker, celldelar och
celler kan man utnyttja en "förstärkt gravitation" för att göra en separation. Genom att utsätta
dem för centrifugalkraft ökar tyngden på partiklarna och via detta kan separation/isolering ske av
de olika molekylerna i en suspension.
Centrifugering är en av de viktigaste och mest spridda metoderna inom praktisk forskningsteknik
för områden som biokemi, cell -och molekylärbiologi och inom medicin. Dagens forskning och
många kliniska applikationer är hänvisade till isoleringen av celler, subcellulära organeller och
makromolekyler. En centrifug utnyttjar centrifugalkraften (g-kraften) för att isolera suspenderade
partiklar från omgivande medium. Applikationerna är otaliga för centrifugering och kan inkludera
sedimentering av celler och virus, separation av subcellulära organeller och isolering av makro-
molekyler som DNA, RNA, proteiner och/eller lipider.
Till detta kommer koncentrering av prover, bindningsstudier eller generellt fysikaliska/kemiska
studier av substanser.
Man skiljer mellan preparativ och analytisk centrifugeringsteknik.
Med preparativ avses att avskilja partiklar för vidare analys utanför centrifugeringen.
Analytisk teknik innebär registrering av sedimenterade partiklars fysikaliska
egenskaper under centrifugering.
Centrifugen ett sätt att öka effekten av gravitationenOm man väntar tillräckligt länge kommer förr eller senare många partiklar/celler i en suspension
att lägga sig på botten av behållaren på grund av gravitationen (1xg).
Vid separation av blodkroppar utan centrifugalkraft, så krävs att blodet står i 48 timmar för en
uppdelning i huvudsakliga komponenter. I praktiska sammanhang är denna tid alldeles för lång.
Andra partiklar, som är extremt små, kommer inte alls att separera i den suspension de befinner
sig , om de inte utsätts för centrifugalkraft. När en lösning roteras i en bestämd hastighet (varv per
minut , Revolutions Per Minute RPM), gör centrifugalkraften att partiklarna rör sig radialt bort från
rotationsaxeln. Den kraft som verkar på partiklarna kallas den relativa centrifugal kraften (Relative
Centrifugal Force RCF). Exempel; en RCF av 500xg indikerar att kraften är 500 gånger större än
jordens gravitationskraft.
Om ett prov, med en vikt av 10 mg, centrifugeras vid 100.000 x g utvecklas
en vikt som motsvarar en liten bil! Belastning på rotor blir 6 bilar !
Och detta enbart beräknat på provet, dessutom tillkommer bägarens och
provrörets vikt.
2 3
Centrifugen ett sätt att öka effekten av gravitationenOm man väntar tillräckligt länge kommer förr eller senare många partiklar/celler i en suspension
att lägga sig på botten av behållaren på grund av gravitationen (1xg).
Vid separation av blodkroppar utan centrifugalkraft, så krävs att blodet står i 48 timmar för en
uppdelning i huvudsakliga komponenter. I praktiska sammanhang är denna tid alldeles för lång.
Andra partiklar, som är extremt små, kommer inte alls att separera i den suspension de befinner
sig , om de inte utsätts för centrifugalkraft. När en lösning roteras i en bestämd hastighet (varv per
minut , Revolutions Per Minute RPM), gör centrifugalkraften att partiklarna rör sig radialt bort från
rotationsaxeln. Den kraft som verkar på partiklarna kallas den relativa centrifugal kraften (Relative
Centrifugal Force RCF). Exempel; en RCF av 500xg indikerar att kraften är 500 gånger större än
jordens gravitationskraft.
Om ett prov, med en vikt av 10 mg, centrifugeras vid 100.000 x g utvecklas
en vikt som motsvarar en liten bil! Belastning på rotor blir 6 bilar !
Och detta enbart beräknat på provet, dessutom tillkommer bägarens och
provrörets vikt.
4 5
Centrifugklasser och huvudsakliga användningsområden
Centrifugklass
Rutin Höghastighet Ultra/mikroultra
Hastighet (rpm x 103) 0-15 15-30 30-150
Ca RCF (103) 7 100 800/900
Pelleterar
Bakterier Ja Ja (ja)
Animal- och växtceller Ja ja (ja)
Cellkärnor Ja Ja (ja)
Precipitat Vissa De flesta (ja)
Membran fraktioner Vissa Vissa Ja
Ribosomer/polysomer - - Ja
Makromolekyler - - Ja
Virus - De flesta Ja
()=kan göras men används vanligtvis inte i denna applikationHär är ett exempel; när cellhomogenat är centrifugerat vid 1000 x g i 10 minuter, pelleterar intakta
celler och tunga kärnor i botten av röret. Supernatanten kan fortsätta att centrifugeras vid 10000 x
g i 20 minuter för att pelletera subcellulära organeller; mitokondrie, lysosomer. Några av dessa
sedimenterande organeller är delvis rena men är vanligtvis kontaminerade. Upprepad tvätt, genom
att suspendera pelleten i isoton lösning, och centrifugering/pelletering igen resulterar i att man
kan ta bort kontaminanter. Genom hastighetscentrifugering renas organeller och dessutom tas
första steget för ytterligare rening genom andra typer av centrifugeringstekniker.
1:a centrifugering 2:a centrifugering 3:e centrifugering
startsuspension pellet 1 pellet 2 pellet 3
tvätt tvätt
Hastighetscentrifugering, separation efter storlek.Denna typ av separation är vanlig för enkel pelletering och syftet är att få en förhållandevis ren
preparation av subcellulära organeller och makromolekyler. För att studera subcellulära organeller
sönderdelas vävnad eller celler så att innehållet i cellerna frisättes. Denna suspension kallas för
homogenat. I samband med centrifugering av cellhomogenat, sedimenterar större partiklar snab-
bare än mindre och på så sätt får man en grund för att gå vidare med ytterligare centrifugeringar.
Cellhomogenatet kan centrifugeras i serie, med högre och högre g-kraft och/eller längre och längre
tider för att producera pellets av renade organeller.
Supernatant Supernatant
4 5
Här är ett exempel; när cellhomogenat är centrifugerat vid 1000 x g i 10 minuter, pelleterar intakta
celler och tunga kärnor i botten av röret. Supernatanten kan fortsätta att centrifugeras vid 10000 x
g i 20 minuter för att pelletera subcellulära organeller; mitokondrie, lysosomer. Några av dessa
sedimenterande organeller är delvis rena men är vanligtvis kontaminerade. Upprepad tvätt, genom
att suspendera pelleten i isoton lösning, och centrifugering/pelletering igen resulterar i att man
kan ta bort kontaminanter. Genom hastighetscentrifugering renas organeller och dessutom tas
första steget för ytterligare rening genom andra typer av centrifugeringstekniker.
1:a centrifugering 2:a centrifugering 3:e centrifugering
startsuspension pellet 1 pellet 2 pellet 3
tvätt tvätt
Hastighetscentrifugering, separation efter storlek.Denna typ av separation är vanlig för enkel pelletering och syftet är att få en förhållandevis ren
preparation av subcellulära organeller och makromolekyler. För att studera subcellulära organeller
sönderdelas vävnad eller celler så att innehållet i cellerna frisättes. Denna suspension kallas för
homogenat. I samband med centrifugering av cellhomogenat, sedimenterar större partiklar snab-
bare än mindre och på så sätt får man en grund för att gå vidare med ytterligare centrifugeringar.
Cellhomogenatet kan centrifugeras i serie, med högre och högre g-kraft och/eller längre och längre
tider för att producera pellets av renade organeller.
Supernatant Supernatant
6 7
Gradient media Cells Viruses Organelles Nucleoproteins Macromolecules
Sugars (e.g. sucrose) + +++ +++ + -
Polysaccharides (e.g. Ficoll) ++ ++ ++ - -
Colloidal silica (e.g. Percoll) +++ + +++ - -
Ionated media (e.g. Nycodenz) ++++ ++ ++++ +++ +
Alkali metal salts (e.g. CsCl) - ++ - ++ ++++
Exempel av media för densitetsgradient
Täthetsgradienter erhålls genom att lägga lager på lager av olika media med skilda tätheter i cen-
trifugeringsröret och skikta lagren så att det medium med lägst täthet finns i toppen. Antingen kan
skikten göras i kontinuerlig eller icke kontinuerlig följd. Cellfraktionen läggs längst upp i centrifu-
geringsröret och centrifugeras. Separation av partiklarna sker tack vare partiklars olika form/storlek
och olika täthet och föredras för att rena subcellulära organeller och makromolekyler.
Separation efter form/storlek (rate-zonal) utnyttjar skillnaden i partikelsform och massa istället för
partikelns täthet för att åstadkomma separation. Exempel på vanliga applikationer är separation av
cellorganeller som endosomer, eller separation av olika proteiner-antikroppar. Antikroppar har i
stort samma densitet, men olika form och massa. Separation baseras på detta faktum.
Kriteria för en lyckosam form/storleks centrifugering• Densiteten av suspensionen måste vara lägre än den lägsta densiteten i gradienten
• Densiteten av provets partikel måste vara högre än den högsta densitetsdelen i gradienten
• Vandringslängden för partikel genom gradienten måste vara tillräckligt lång så att
separering kan ske
• Tidsfaktorn är viktig, om tiden är för väl tilltagen hamnar allt som en pellet i botten av röret
Täthetsseparation (isopycnic) bygger på principen att en partikel, med en bestämd densitet kommer
att sjunka/röra sig tills att en position är nådd där densiteten i partikel är exakt den samma som i
lösningen. Då detta "jämviktsläge" har infunnit sig spelar det ingen roll hur lång tid centrifugerin-
gen fortsätter. Ett vanligt exempel för denna metod är separation av nukleinsyra i en CsClgradient.
Kriteria för lyckosam täthetsseparation • Densiteten av partikel måste falla inom gränserna för gradientens densitet
• Längd av gradient är oväsentlig
• Tid för körningen måste vara tillräcklig för att partiklarna skall bilda ett band vid
sin isopycnic punkt.
• För lång körtid har ingen effekt
Täthetsgradientcentrifugering
++++ excellent, +++ good, ++ good for some applications, + limited use, - unsatisfactory
Källa: D.Rickwood, T.C. Ford, J.Steensgard (1994) Centrifugation essential data, John Wiley & Sons Ltd. U.K.
6 7
Syfte med centrifugeringRotortyp Pelleting Form/storlek separation Täthet separation
Vinkel Mycket bra Begränsad Varierar*
Swing out Otillräcklig Bra Bra**
Vertikal Inte lämplig Bra Mycket bra
Rotortyper och användningsområde
*Bra för makromolekyler, dålig för celler och organeller
**Bra för celler och organeller, se upp vid användande med CsCl
Dessutom finns sk haematokrit-, zonal-, kontinuerligt flödes- och elutritationsrotor. Observera att
varje typ av rotor har sin styrka och begränsning beroende på vilken typ av separation det handlar om.
I en vinkelrotor är provröret fixerat i en kavitet i rotorn i en bestämd vinkel. När rotorn börjar röra
sig reorienterar sig lösningen i röret. Denna rotor är vanlig för användning för pelletering. Exempel
är pelletering av humanceller, bakterier och jäst. Den är också användbar för täthetsseparation av
makromolekyler som nukleinsyra.
I en swing-out rotor, laddas rören i individuella bägare som hänger vertikalt när rotor inte är i rörel-
se. När rotorn börjar röra sig svänger bägaren ut i horisontalläge. Denna rotor är speciellt lämpad
när det gäller att separera prov i densitetsgardienter. Den långa separationslängden tillåter bättre
separation av enskilda partiklar i en suspension. Emellertid är denna typ av rotor otillräcklig för pel-
letering. Dessutom måste försiktighet iakttagas så att man undviker punktbelastning som kan orsakas
av spinnande av CsCl och andra densitetsgradienter som kan precipitera.
I en vertikal rotor, sitter provrören i vertikal position under rörelse. Denna rotor är inte alls lämplig
för pelletering utan är som mest effektiv för täthetsseparationer tack vare sin korta separations-
sträcka. Applikationsområde är DNA, RNA och lipoproteinseparation.
8 9
För att förlänga rörets livslängd och att undvika att det går sönder:• Kontrollera produktspecifikationen för röret (provvolymer och maximala hastigheter)
• I vinkelrotor eller vertikalrotor: kör alltid rören fyllda, använd tunnväggiga, slutna rör
• Autoklavera enbart om det är absolut nödvändigt och vid 121°C i 15 min
• Undvik att göra ren rören i diskmaskiner, kan ge en värmeschock
• Oftast rekommenderas att rengöra rören med ett milt diskmedel, vatten och lufttorka
Rören måste omsorgsfullt matchas med rotor enligt nedan för att undvika förlust av prov och
eller misstag
Val av centrifugeringsrörGrundkravet är att skydda mot att provet läcker ut. Andra aspekter är att materialet skall vara
kemiskt inert, enkelt att hantera - samla upp prov efter körningar. I samband med val av plaströr
kan följande aspekter vara viktiga:
Rör plast typ Klarhet Kemisk resistens
Polypropylen (PP) Grumlig God
Polyallomer (PA) Grumlig God
Polycarbonat (PC) Klar Dålig
Polyetylen tereftalat (PET) Klar Dålig
RotortypRörtyp Vinkel Swingout Vertikal
Tunn vägg öppen topp Nej Ja Nej
Tjock vägg öppen topp Ja Ja Nej
Tunn vägg sluten Ja Vissa Ja
Oak ridge Ja Nej Nej
Frågor som skall ställas och besvaras då man köper en centrifug:• Hur många rör skall köras varje gång
• Hur stor volym per rör i ml
• Vilken storlek på centrifugen.
• Vilket g-tal behövs (RCF)
• Val av rotor; swing out, vertikal eller vinkel rotor
• Om kyla behövs
Följande praktiska krav kan ställas på en centrifug:• Enkel uppbyggnad och instrumentering
• Konstruktion och den tekniska utrustningen är typgodkänd
• Lätt att öppna och stänga
• Enkel att ladda och rengöra
• Tiden och hastigheten skall vara ställbar
• Temperaturen ställbar, om det är en kylcentrifug
• Broms skall finnas. Som man kan koppla till/från.
• Lucklåsning, centrifugen kan bara startas när lucka är stängd.
• Luckförregling. Luckan kan bara öppnas när rotorn står still
• Handhavandebeskrivning på svenska
Kontrollera att centrifug och service uppfyller följande:SS-EN IS0/IEC 17025 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories
SS-EN 60601 Elektrisk utrustning för medicinskt bruk, Säkerhet -Allmänna fordringar
IEC 61010-2-020 Säkerhetskrav för laboratoriecentrifuger.
IEC 61010-1 Generella säkerhetskrav för laboratorieutrustning.
Krav på kunskap hos underhållspersonal:Det är viktigt att inga reparationer, justeringar eller modifieringar utförs utan kunskap om appa-
ratens konstruktion, funktion och användning. Felaktigt modifierade eller bristfälligt underhållna
centrifuger kan orsaka skador på såväl personal som annan utrustning i laboratoriet. Det måste
också förutsättas att de tekniker som skall utföra elsäkerhetsmätningarna är väl förtrogna med
aktuella mätmetoder enligt SS IEC
Dessutom måste man ha goda kunskaper i mekanik för säkert underhåll, eftersom det finns stora
krafter i rörelse när centrifugen är i drift.
8 9
För att förlänga rörets livslängd och att undvika att det går sönder:• Kontrollera produktspecifikationen för röret (provvolymer och maximala hastigheter)
• I vinkelrotor eller vertikalrotor: kör alltid rören fyllda, använd tunnväggiga, slutna rör
• Autoklavera enbart om det är absolut nödvändigt och vid 121°C i 15 min
• Undvik att göra ren rören i diskmaskiner, kan ge en värmeschock
• Oftast rekommenderas att rengöra rören med ett milt diskmedel, vatten och lufttorka
Rören måste omsorgsfullt matchas med rotor enligt nedan för att undvika förlust av prov och
eller misstag
Val av centrifugeringsrörGrundkravet är att skydda mot att provet läcker ut. Andra aspekter är att materialet skall vara
kemiskt inert, enkelt att hantera - samla upp prov efter körningar. I samband med val av plaströr
kan följande aspekter vara viktiga:
Rör plast typ Klarhet Kemisk resistens
Polypropylen (PP) Grumlig God
Polyallomer (PA) Grumlig God
Polycarbonat (PC) Klar Dålig
Polyetylen tereftalat (PET) Klar Dålig
RotortypRörtyp Vinkel Swingout Vertikal
Tunn vägg öppen topp Nej Ja Nej
Tjock vägg öppen topp Ja Ja Nej
Tunn vägg sluten Ja Vissa Ja
Oak ridge Ja Nej Nej
Frågor som skall ställas och besvaras då man köper en centrifug:• Hur många rör skall köras varje gång
• Hur stor volym per rör i ml
• Vilken storlek på centrifugen.
• Vilket g-tal behövs (RCF)
• Val av rotor; swing out, vertikal eller vinkel rotor
• Om kyla behövs
Följande praktiska krav kan ställas på en centrifug:• Enkel uppbyggnad och instrumentering
• Konstruktion och den tekniska utrustningen är typgodkänd
• Lätt att öppna och stänga
• Enkel att ladda och rengöra
• Tiden och hastigheten skall vara ställbar
• Temperaturen ställbar, om det är en kylcentrifug
• Broms skall finnas. Som man kan koppla till/från.
• Lucklåsning, centrifugen kan bara startas när lucka är stängd.
• Luckförregling. Luckan kan bara öppnas när rotorn står still
• Handhavandebeskrivning på svenska
Kontrollera att centrifug och service uppfyller följande:SS-EN IS0/IEC 17025 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories
SS-EN 60601 Elektrisk utrustning för medicinskt bruk, Säkerhet -Allmänna fordringar
IEC 61010-2-020 Säkerhetskrav för laboratoriecentrifuger.
IEC 61010-1 Generella säkerhetskrav för laboratorieutrustning.
Krav på kunskap hos underhållspersonal:Det är viktigt att inga reparationer, justeringar eller modifieringar utförs utan kunskap om appa-
ratens konstruktion, funktion och användning. Felaktigt modifierade eller bristfälligt underhållna
centrifuger kan orsaka skador på såväl personal som annan utrustning i laboratoriet. Det måste
också förutsättas att de tekniker som skall utföra elsäkerhetsmätningarna är väl förtrogna med
aktuella mätmetoder enligt SS IEC
Dessutom måste man ha goda kunskaper i mekanik för säkert underhåll, eftersom det finns stora
krafter i rörelse när centrifugen är i drift.
10 11
Vanliga centrifugeringstermer och formler
Pellet: det hårdpackade koncentratet av partiklar i provröret efter centrifugering
Supernatant: den "klara" lösningen ovanför pelleten
RPM: Roteringar Per Minut (hastighet)
RMAX : maximala radien från rotationsaxel i cm
RMIN : minimala radien från rotationsaxel i cm
RCF: Relativa centrifugal kraften RCF=11,17 x RMAX (RPM/1000)2
K-faktor: Mått på pelleteringsförmågan av rotor. Ju mindre K-faktor desto bättre pelleteringsför-
måga.
K= 2,53 x 1011 ln (RMAX/ RMIN)
(RPM)2
Rotor omvandlings formel: Om tiden för att pelletera ett prov i en gammal rotor är känd kan
man räkna fram den tid det tar att pelletra samma prov i en annan/ny rotor.
T1 =T2 T1 = T2 x
K1
K1 K2 K2
T1 = tiden för att pelletera i den nya rotorn
T2 = tiden för att pelletera i den gamla rotorn
K1 = K-faktor i den nya rotorn
K2 = K-faktor i den gamla rotorn
200
500
1.000
1.500
2.000
3.000
4.000
6.000
10.000
15.000
20.000 200.000
150.000
100.000
20.000
40.000
30.000
20.000
15.000
10.000
5.000
2.000
rpm(varv/minut)
3
10
20
50
100
200
500
1.000
2.000
5.000
10.000
20.000
30.000 3.000.000
2.000.000
30.000
500.000
200.000
100.000
50.000
20.000
10.000
5.000
3.000
1.000
300
g-tal(RCF x g)
5
6
7
8
9
10
12
14
16
18
20
25
30
35
40
45
5020
18
16
14
12
10
9
8
7
6
5
4
3
2
radien(tum) (cm)
Hjälpmedel att översätta varv till g-tal
Exempel från diagram.10 cm och 3000 rpm : 1000 x g(radie) (varv) (RCF)
Använd formel för att fåexakta relationer
10 11
Vanliga centrifugeringstermer och formler
Pellet: det hårdpackade koncentratet av partiklar i provröret efter centrifugering
Supernatant: den "klara" lösningen ovanför pelleten
RPM: Roteringar Per Minut (hastighet)
RMAX : maximala radien från rotationsaxel i cm
RMIN : minimala radien från rotationsaxel i cm
RCF: Relativa centrifugal kraften RCF=11,17 x RMAX (RPM/1000)2
K-faktor: Mått på pelleteringsförmågan av rotor. Ju mindre K-faktor desto bättre pelleteringsför-
måga.
K= 2,53 x 1011 ln (RMAX/ RMIN)
(RPM)2
Rotor omvandlings formel: Om tiden för att pelletera ett prov i en gammal rotor är känd kan
man räkna fram den tid det tar att pelletra samma prov i en annan/ny rotor.
T1 =T2 T1 = T2 x
K1
K1 K2 K2
T1 = tiden för att pelletera i den nya rotorn
T2 = tiden för att pelletera i den gamla rotorn
K1 = K-faktor i den nya rotorn
K2 = K-faktor i den gamla rotorn
200
500
1.000
1.500
2.000
3.000
4.000
6.000
10.000
15.000
20.000 200.000
150.000
100.000
20.000
40.000
30.000
20.000
15.000
10.000
5.000
2.000
rpm(varv/minut)
3
10
20
50
100
200
500
1.000
2.000
5.000
10.000
20.000
30.000 3.000.000
2.000.000
30.000
500.000
200.000
100.000
50.000
20.000
10.000
5.000
3.000
1.000
300
g-tal(RCF x g)
5
6
7
8
9
10
12
14
16
18
20
25
30
35
40
45
5020
18
16
14
12
10
9
8
7
6
5
4
3
2
radien(tum) (cm)
Hjälpmedel att översätta varv till g-tal
Exempel från diagram.10 cm och 3000 rpm : 1000 x g(radie) (varv) (RCF)
Använd formel för att fåexakta relationer
12
Intresserad? Beställ ditt exemplar idag per telefon, fax, eller mejl. Du får det gratis.
Vi förbehåller oss rätten till tekniska ändringar avseende innehållet i denna trycksak. Reproduktion av innehål-let får inte ske utan föregående överenskommelse med Axeb AB.Reviderad 2008, utgiven första gången 2003
Axeb AB levererar med kvalitet. Som en del i vår vision har vi producerat en serie skrifter i serien ”Värt att veta om ...”. De ämnen som behandlats är • CO2-inkubatorer • Centrifuger • Miljötålighetstest •Frysar – köldmedia • Brandfarliga ämnen.
Axeb AB Box 43SE-193 21 SigtunaTelefon +46 (0)8 623 10 80Fax +46 (0)8 623 10 45Web www.axeb.seMail [email protected]
