A membrántranszport molekuláris mechanizmusai

A membrántranszport molekuláris mechanizmusai

A membrántranszport alapjai 3.Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát

A membrántranszport alapjaiMembránpotenciál - bevezetés

Általában a sejtek belső tere negatívabb az extracelluláris térnél nyugalmi körülmények között.

V

( -70 mV)IntracellulárisExtracelluláris

+ (0 mV)

A membrántranszport alapjaiPotenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség

1. Diffúziós potenciálEltérő ionmobilitású anion és kation esetén.(pl. egy csepp sósav diffúziója)

V

+Cl- H+

ΔE

1, az oldat ionjait a koncentráció különbség mozgatja a túloldalra2, a különböző töltéssel rendelkező ionok átlépési sebessége a szemipermeábilis hártyán keresztül különböző – az ábrán az előre siető negatív töltésű ionok a túloldalon negatív töltésű réteget hoznak létre, így átmeneti feszültség: diffúziós potenciál alakul ki3, ez lassítja a további anion előrehaladást de gyorsítja a kationok átjutását – ez a hatás csökkenti a diffúziós potenciált4, a végén a koncentrációk kiegyenlítődnek, és a diffúziós potenciál eltűnik

-100 mV

Hány darab anion átlépése kell -100 mV feszültség kialakításához egy 1 μm2-es membránon?

db 6218

106101

965001,0

1011

2314

214

2

x

x

m

F

cm

FC

C

QU

Persze csak egy pillanatig, amíg a kation párja azonos irányban őt nem követi


2. MembránpotenciálElőfeltétel: egyenlőtlen ionmegoszlás és szelektív permeabilitás

A. Egyensúlyi potenciál

Szelektív permeabilitású membrán (átmegy: K+, nem: Cl-)

+

Cl-

100 mM KCl 10 mM KCl

Cl-

Cl-

K+

K+

K+

V

-60 mV

1. K+ áramlás a koncentráció- különbség miatt

2. A kialakuló feszültség leállítja a további áramlást (egyensúly)

Az egyensúlyi potenciál jellemzői

- Néhány ezer ion egyenlőtlen megoszlása elég a potenciálkülönbség kialakításához, az ionkoncentrációk változása elhanyagolható.

- Az egyensúlyi potenciál tartósan (elvileg végtelen ideig) fennállhat. Ilyenkor a koncentrációkülönbség miatt az egyik irányba ugyanannyi ion mozog, mint a potenciálkülönbség miatt a másikba.

- Minél nagyobb a membránon átjutó ion két oldalon található koncentrációinak hányadosa, annál nagyobb a potenciálkülönbség.


Az egyensúlyi potenciál kiszámítása

- Nernst egyenlet:

E = ln

E : membránpotenciál (volt) R: általános gázállandó ( 8.31 J/mol/K)T: abszolút hőmérséklet (K)z : töltésszám (K+-ra: pl. +1)F : Faraday-állandó ( 96500 C/mol)

- Gyakorlatban jól használható formája:

E= log10

- RTzF

cBELSŐ

cKÜLSŐ

cBELSŐ

cKÜLSŐ

- 60 mVz

Az egyes ionok egyensúlyi potenciálja állati sejtekbenfiziológiás ionmegoszlások esetén

EK= log10 - 90 mV140 mM

4 mM- 60 mV

+1

ENa= log10 + 60 mV15 mM

140 mM- 60 mV

+1

ECl= log10 - 80 mV4 mM

103 mM- 60 mV

-1

ECa= log10 + 120 mV10-7 M10-3 M

- 60 mV+2

B, Donnan-potenciál

- Ionokra átjárható, fehérjére nem permeábilis membrán esetén jön létre

- A negatív töltésekkel rendelkező fehérjék oldalán nagyobb kation koncentráció és a kis molekulájú, permeábilis anion alacsonyabb koncentrációja alakul ki az ellenkező oldalhoz képest, egyensúlyi állapot formájában. -10 – -15 mV potenciálkülönbség jön létre. (A fehérjék oldala a negatívabb.)

- A sejt nyugalmi membránpotenciálja döntően NEM a Donnan-potenciálon alapul.


http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/32/Gibbs-donnan-en.svg

C. Pumpapotenciál

- A H+-pumpa, és állati sejtek esetén a nátrium pumpa (Na+/K+-ATPáz) elektrogén. (3 Na+ ki, 2 K+ be)

- A H+-pumpa (és Na+-pumpa) folyamatos működése ezért negatívabbá teszi a sejt belsejét. Ez közvetlenül csak kb. 10-20 mV-tal járul hozzá a membrán-potenciálhoz.

- A Na+-pumpa azonban az egyenlőtlen külső és belső Na+ és K+ koncentrációkat biztosítja, és így közvetve a membránpotenciál fenntartásához szükséges.


A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet I.


10 mM NaCl 100 mM NaCl

“I” “E”

PK>>PNa=0

PCl=0

Em = ?

+

Cl-

Cl-

Cl-

K+

K+

K+

V

-60 mV

K+ egyensúlyipotenciál !! Vm = -60 mV

IK=INa=0

A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet II.



“I” “E”

PNa>>PK=0

PCl=0

Em = ?

+

Na+

Na+

Na+

Cl-

Cl-

Cl-

V

+60 mV

Na+ egyensúlyipotenciál !! Vm = +60 mV

IK=INa=0

A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet III.



“I” “E”

PNa=PK>0

PCl=0

Em = ?

IK = -INa>0

Vm = 0 mV

Koncentráció-kiegyenlítődés

Na+

V

0 mV

K+

A III. gondolatkísérlet ‘tanulságai’

1. A kifelé áramló pozitív töltések áramát tekintjük pozitívnak hagyomány szerint. (A példában IK>0)

2. Stabil membránpotenciál esetén a membránon átfolyó összes áram összege nulla. (A példában IK+INa=0) (Egyébként valamelyik oldalon töltésfelhalmozódás lenne, és Vm változna)

3. Ha membrán többféle ionra is permeábilis, akkor hosszú idő után a koncentrációk kiegyenlítődhetnek. (A példában mindkét oldalon [Na+] = [K+] = 55 mM értéken). In vivo ezt a Na+-pumpa akadályozza meg.

IV. Az állati sejtek nyugalmi membránpotenciálja



“I” “E”

PK >>PNa>0

PCl=0

Vm hol van azEK, 0, ENa

értékekhezképest?

IK = -INa>0, mert egyensúly van (állandó Vm)

EK < Vm << 0

Koncentráció-kiegyenlítődés

Na+

V

K+

+

A IV. gondolatkísérlet ‘tanulságai’

Egy ‘átlagos’ nyugvó állati sejtben: - kifelé K+ áramot befolyásolja:

nagy koncentrációkülönbség nagy K+ permeabilitás negatív membránpotenciál

- befelé Na+ áramot befolyásolja: nagy koncentrációkülönbség kis Na+ permeabilitás negatív membránpotenciál

Így a két áram egyenlő stabil nyugalmi Vm

• Vm: EK és ENa között van. Hogy hol, az a PK és PNa arányától függ.

• PNa<PK (nyugalmi) esetben: EK<Vm<<ENa

• PNa>PK esetben: EK<<Vm<ENa

• Képlettel: Vm= EK+ ENa+…

(ahol g=1/R: vezetőképesség (Siemens))

gKgteljes

gNagteljes

• Vm kiszámítható (Goldman-Hodgkin-Katz, GHK)

Vm = ln- RT

zF

PK[K+]I+PNa[Na+]I+PCl[Cl-]E

PK[K+]E+PNa[Na+]E+PCl[Cl-]C

A membrántranszport alapjaiA membránpotenciál kiszámítása

Mitől és milyen irányban változhat amembránpotenciál?

Vm : depolarizáció Vm : hiperpolarizáció “pozitívabbá válik” “negatívabbá válik”

1. Ionkoncentráció változás (in vivo nem jellemző)pl.[K+]E IK, out depol. [Na+]I INa, in hiperpol.

2. Permeabilitás változás (in vivo a szab. fő útja)pl. PK IK hiperpol.PNa INa depol.

)E– (Vg)E– (V

I xmxm

x R

Mi biztosítja a sejtmembrán szelektívpermeabilitását? Ioncsatornák

• Transzmembrán fehérjék, melyek hidrofil pórust képeznek ionok számára• Egy ion transzportja során nincs konformációváltozás, csak nyitás zárásnál• Igen magas katalitikus szám (106-108 ion/sec) • Erősen szelektívek lehetnek (1 hiba/103-104 ion)• Nyitás zárás szabályozott lehet, ez alapján csoportosíthatók:

- ligandfüggő - háttér (csurgó, leak)- feszültségfüggő- mechanoszenzitív

A membrántranszport alapjaiSzelektív permeabilitás - ioncsatornák

Ionszelektivitás szerinti felosztás

anioncsatornák(Cl-, NO3

-)kationcsatornák

Szelektív(K+, Ca2+)

nemspecifikus

csak egyértékű(monovalens) ionokatereszt át (Na+ és K+)

kétértékű (bivalens)ionokat is átereszt(Na+, K+ és Ca2+)

A membrántranszport alapjaiSzelektív permeabilitás - ioncsatornák

A csatorna négy alegységből szerelődik össze.

Amíg egyes K+-csatornák két, vagy négy alegységből szerelődnek össze, addig a Na+- és Ca2+-csatornákat egyetlen hosszú polipeptid lánc alkotja.

A membrántranszport alapjaiKation csatornák pórus hurkokkal

+H3N

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

CO2-

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

Outside

Inside

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

M2

M1

N

C +H3NCO2

-

K+ csatorna alegységek

Pórus motívum

A különféle ioncsatorna-féleségek alegységeinek síkban kiterített szerkezete.

Egy pórus hurkokkal rendelkező K+-ioncsatorna háromdimenziós modellje oldal- és felülnézetben.

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

M2

M1

N

C

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

N C

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

+H3N

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

CO2-

+

S1

S2

S3

S4

S6

S5+

Outside

Inside

M2

M1

N

C

+H3NCO2

-

Kir1 Kir2 Kir3 Kir4 Kir5 Kir6 Kir7 nIRK

Kir3.1 Kir 3.2 Kir 3.3 Kir 3.4Kv1 Kv2 Kv3 Kv4

Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv1.7, Kv1.8

Nátrium & Kalcium

Feszültség-kapuzott

KQT eag slo CNG Novel> 23 gén

K+ csatornákK+ csatornák

KVLQT KVLQT2

eag erg elk

slo slo2/slack

A Ca2+- és a Na+-csatornák génjei egy ősi K+-csatorna-gén ismételt duplikációja és módosulása nyomán képződtek. Az ioncsatornák génjei az evolúció során kialakult és bevált funkció megőrződéséről, variálódásáról szólnak.

A szűk járat belső felszínén karbonil- (C=O) oxigén-atomok vannak. Az oxigénatomok részleges negatív töltést hordoznak, és úgy helyezkednek el, hogy a járaton áthaladó K+-ionok a hidrátburok vízmolekulái helyett az oxigénatomokkal lépjenek kölcsönhatásba. A kölcsönhatás energetikailag kedvező környezetet teremt az ionok áthaladásához.

Szűk nyaki rész: 1,2 nm hosszú, átmérője 0,28 nm. A csatorna átmérője szabja meg, hogy milyen ionok haladhatnak át rajta. A nyaki rész falát a pórusmotívum (signature sequence) aminosavjai burkolják. Mivel a K+-ionok hidrátburkát alkotó vízmolekulák 0,28 nm-re vannak a K+-ion középpontjától, a járat túl szűk egy K+-ion áthaladásához. A hidrátburok vízmolekuláit csak komoly energiabefektetés árán lehet eltávolítani, ám a K+-csatornák működésük során nem fogyasztanak energiát. Mégis, miként lehetséges az, hogy a nyitott K+-csatornán másodpercenként nagyjából egymillió K+-ion halad át?

A szelektivitási filter szerkezete: a VGYG motívum KcsA (2TM1P) csatornában

A szelektivitási filter szerkezete (karbonil oxigének)

K+ ionok (zöld) és víz molekulák (piros) áthaladása a póruson. „Billiárd-típusú” átjutás

Roderick MacKinnon (47), laureate of the Nobel Prize in Chemistry 2003

A membrántranszport alapjaiKálium ionok átjutása Kv1.2 csatornán – számítógépes szimuláció

A K+-nál (1,33 Å) kisebb átmérőjű Na+-ionok (0,95 Å) számára a karboniloxigén-atomok (C=O) túlságosan távol helyezkednek el, amiért nem tudnak az ionnal kölcsönhatásba lépni, ami miatt a Na+-ionok nem tudnak átjutni a K+-csatornákon.

Másképpen: a Na+-ionok erősebben kötik a vizet, mint a K+-ionok, nem képesek elegendően közel menni a szűrőhöz, hogy elveszítsék a hidrátburkot. Szelektivitás: 1:1000.

K+ Na+

A membrántranszport alapjaiA szelektivitási filter szerkezete (a K+ szelektivitás mechanizmusa)

Kapuzás a “belső szájadékban”

Depolarizáció során a kapuzó hélix a sejthártya külseje felé mozdul, és miközben megváltozik az ioncsatorna szerkezete, kinyílik, rajta ionok áramlanak át.

Állati sejtekben az átáramló ionáram erőssége már a depolarizáció alatt csökkenni kezd, mert a csatorna inaktiválódik.

A kapuzó hélix (H5) helyzetét a sejtmembránban az határozza meg, hogy milyen kölcsönhatás van a membrán két oldalán felhalmozódott töltések és a kapuzó hélixek töltése között.

Állati sejtekben a feszültségfüggő Na+ csatorna inaktiválódik (akciós potenciál). Növényeknél nem jellemző a hasonló inaktiváció (pl. GORK 30 percig is aktív marad), az AP másként keletkezik.

A csatornának 3 funkcionális állapota van:

Zárt Nyitott

Inaktív

(nem vezet)

Depolarizáció

Spon

tán

Repolarizáció

A membrántranszport alapjaiAz inaktiváció

Em

INa

Idő (ms)

zárt nyitott inaktív

Az inaktiváció kísérletes kimutatása(makroszkópos áram)

Idő (ms)

A megnyílás és az inaktiváció is statisztikusjelenség az elemi áram szintjén

Em

elemi áramok több mérés soránegy csatornán

összegzettáram

Inaktiváció “tömeszeléses” mechanizmussal: N-típusú inaktiváció

Az N típusú inaktiváció esetében az ioncsatorna fehérje N-terminálisa a pórus citoplazma felőli bejáratához kötődik, bedugaszolja a csatornát

Kapuzás a szelektivitási filterben: C-típusú inaktiváció

C típusú inaktivációt - nevével ellentétben - nem a fehérje C-terminálisa, hanem a szűk nyaki rész körüli fehérjerészek okozzák: az ioncsatorna a fényképezőgépek blendéjéhez hasonlatos módon záródik.

A szűrő kálium-koncentrációtól függően zárt (low K+) és nyitott (high K+) állapotú lehet.Ha az aktivációs kapu nyílik (1), több kálium jut a szűrő közelébe, high K+ állapotú szűrő nyitódás (2). Zárt aktivációs kapu esetén a low K+ állapot alakul ki.

Ez a magyarázata a milliszekundumos nagyságrendű „pislákoló” ioncsatorna nyitódásnak-záródásnak, mely még nyitott feszültség-függő aktivációs kapu esetén is mérhető.

aktivációs kapu

szelektivitási szűrő

A szelektivitási szűrő K+-függő szerkezetváltozásának biológiai jelentősége.

1

2

A membrántranszport alapjaiK-csatorna inaktiváció

Nyugalmi helyzet, zárt csatorna

Depolarizált sejthártya, nyitott helyzet

Depolarizált sejthártya, N-típusú inaktiváció

Depolarizált sejthártya, C-típusú inaktiváció

A sejt ionáramainak mérése: patch clampSejtre tapasztott (cell-attached) felállás

Feszültség clamp

Mekkora áramot kell átfolyatnom,hogy Vm az általammegkívánt értéklegyen?

Pipetta széle és amembrán közöttNAGY (G) ellenállásúkapcsolat (seal).

mért csatornák

A sejt ionáramainak mérése: patch clampTeljes sejt (whole cell) felállás

Feszültség clamp

mért csatornák

A sejt ionáramainak mérése: patch clampKivágott folt (excised patch) felállás

Feszültség clamp

mért csatorna/csatornák(Akár egy csatornaárama is mérhető, az árampA (10-12 A) nagyságrendű.) Zárt

Nyitott

Az ioncsatornák működése: makroszkópos áram(sok ugyanolyan csatorna együttes árama)

K+ szelektív pórus (PK konstans, nem függvénye Vm-nek), szimmetrikus oldatok

I

Vm (mV)

Feszültség-áramösszefüggésC1 < C2

C2

C1

Pl.: mindkét oldalon 4 mM [K+]mindkét oldalon 140 mM [K+]

K+ szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok

I

Vm (mV)

C2

C1

Pl.: belül C2=140, kívül C1=4 mM [K+]IK=0, ha Vm=EK

EK

Feszültségfüggő, kifelé rektifikáló K+ csatorna (pl. GORK)

I

Vm (mV)

EK

nyitásivalószínűség

leak (csurgó)K+ áram(EK fölött IK>0)

I

Vm (mV)

Feszültségfüggő csatorna K+ árama(EK és küszöb között IK=0)

küszöb -30 mV

EK

PO

Vm (mV)

Befelé rektifikáló K+ csatorna (pl. KAT1)

I

Vm (mV)

EKleak (csurgó) K+ áram

I (nagyítva!)

Vm (mV) bef. rekt. csatorna K+ árama(EK felett: IK>0csak egy szűktartományban)

EK

PO

Vm (mV)nyitásivalószínűség

Cl- szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok

I

Vm (mV)

C1

C2

Pl.: belül C1=140, kívül C2=15 mM [Cl-]ICl=0, ha Vm=ECl

ECl

Feszültségfüggő Cl--csatorna

I

Vm (mV)

ECl

Vm (mV)

ECl

nyitásivalószínűség

leak (csurgó)Cl- áram

Feszütségfüggő csatorna Cl- árama

küszöb -75 mV

I

ECl pozitív értékű, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell

Vm (mV)

A membrántranszport alapjai6. A növényi ioncsatornák működése

PM, Anion csatornák

Turgor beállításnál hipotóniás stressz esetén a sók kiáramlását szabályozzaLegfőképp Cl- ionról van szó, ezek Ca2+-aktivált csatornák, 2 osztálya van:

S(slow)-típusú és R(rapid)-típusú feszültségfüggő anion csatorna

ECl általában pozitív értéket ér el, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell

3 db fontos funkció:

A csatornák nyitódása nem csak Cl- vesztést eredményez, hanem membrán depolarizációt is okoz.Ez aktiválja a kifelé egyenirányító K+-csatornákat a sók kiáramlásánál.

A jelátvitel során tapasztalható membrán-depolarizációban központi jelentőségű.

Erős hiperpolarizáció esetén nyitódnak (ha a befelé egyenirányító K+-csatornák működése gátolt pl. kevés külső K+ cc. esetén)

R-típusú S-típusú

Szerkezetük: 13 TM szegmens

Documents

A membrántranszport molekuláris mechanizmusai