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A mitocôndria como alvo de toxicidade
Crise bioenergética induzida por xenobióticos
MECHANISTIC TOXICOLOGY. The molecular basis of how
chemicals disrupt biological targets. Boelsterli, U.A., Taylor &
Francis, London, 2005.
Cap. 15: Disruption of cellular energy production by xenobiotics.
A mitocôndria como alvo de toxicidade 2
A mitocôndria como alvo de toxicidade
Locais de acção de xenobióticos 3
A mitocôndria como alvo de toxicidade 4
A membrana interna mitocondrial é um alvo frequente da
toxicidade de xenobióticos.
3 aspectos toxicologicamente relevantes :
1. A composição lipídica peculiar da membrana
mitocondrial interna: cardiolipina.
2. potencial transmembranar gerado pela respiração
mitocondrial (negativo no interior)
3. Poro de permeabilidade transitória
A mitocôndria como alvo de toxicidade 5
Aspectos toxicologicamente relevantes:
3. Poro de permeabilidade transitória
Mega-canal composto por
complexos proteicos, atravessando
membranas mitocondriais interna
e externa.
Normalmente, baixa condutância:
gradiente de H+ é mantido.
Alta condutância:
�colapso do potencial
transmembranar e
�libertação de moléculas
sinalizadoras para citosol (cit c)--
apoptose.
Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 6
Exs: FCCP e
DNP
Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 7
UCPs promovem dissociação moderada
da fosforilação oxidativa
Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 8
UCPs
[ácidos gordos] é regulada
hormonalmente
(noradrenalina)
Inibição do sistema de transporte de electrões 9
O fluxo de electrões pode ser
inibido em vários pontos da
cadeia de transferência de
electrões
Dois tipos de inibidores:
1) bloqueiam transporte de electrões, ligando-se a um componente da cadeia (rotenona,
cianeto);
2) estimulam fluxo de electrões na parte inicial da cadeia, mas captam-nos a determinado
nível, desviando-os da sua via normal (agentes promotores de ciclo redox, como
doxorubicina).
Inibição do sistema de transporte de electrões 10Inibidores que bloqueiam transporte de electrões, ligando-se a um componente específico
da cadeia.
Inibição do sistema de transporte de electrões 11
Inibição do sistema de transporte de electrões e aumento da geração de ROS 12
Inibidores que estimulam fluxo de electrões na parte inicial da cadeia, mas captam-
nos e desviam-nos da sua via normal. O caso da DOXORUBICINA.
DXR
Complexo I (NADH:ubiquinona oxidoredutase) alvo frequente da acção de
compostos que desviam os electrões do seu fluxo normal, actuando como
receptores de electrões.
Consequências: decréscimo da produção de energia e “stresse redutor”
Inibição do sistema de transporte de electrões e aumento da geração de ROS 13
O caso da
DOXORUBICINA
Geração de ROS, um mecanismo utilizado por alguns fármacos para favorecer a morte programada de células
cancerígenas 14
As células cancerígenas têm uma capacidade anti-oxidante muito inferior às células
normais; são, por isso, mais susceptíveis a agentes que elevam o stresse oxidativo.
Apoptose 15
Após recepção do sinal que desencadeia a apoptose1º evento: activação de CASPASES
-
Caspases iniciadoras
Activadoras de outras caspases
Caspases efectoras
Actuam em constituintes celulares
Caspases e pro-caspases 16
Acção de endonucleases activadas por caspases 17
Clivagem internucleossomal de DNA1ª alteração morfológica:
condensação da cromatina
Mecanismos gerais de apoptose 18
min. 3H
Como reconhecem os macrófagos a célula destinada a
sofrer apoptose? PS no lado externo da membrana celular.
Apoptose: duas vias distintas 19dependendo do tipo de célula e do sinal iniciador
O Papel da mitocôndria na apoptose 20
Mitocôndria sequestra arsenal de
proteínas pro-apoptóticas (AIF,
Smac/DIABLO, citocromo c)
O papel da mitocôndria na apoptose 21
A mitocôndria papel-chave na apoptose porque liberta factores que activam os eventos subsequentes.
Isto pode acontecer após activação do receptor de morte (via extrínseca) ou após estímulos internos
(via intrínseca). O stresse oxidativo é um evento importante desencadeador de apoptose.
O Papel do citocromo c na apoptose 22
Apoptose induzida por xenobióticos 23
Localização da Cardiolipina na Membrana Mitocondrial 24
A deficiência em CL e a diminuição da peroxidação de CL estão associadas com o aumento da resistência a estímulos pró-apoptóticos.
Interacção da Cardiolipina com o Citocromo c 25Caspase-8
BH3
A CL oxidada pode criar instabilidade transitória da
membrana mitocondrial, favorecendo a libertação de Cit. c
Localização da Cardiolipina na Membrana Mitocondrial 26
CL + PE (são os fosfolípidos maioritários nos
locais de contacto entre MMI e MME)
Formação de fases não lamelares podem
favorecer acesso de CL a face citosólica da
mitocôndria para ancorar tBid
proteínas Bcl-2 e inibidores de COX-2 27
Família de proteínas Bcl-2 e relação com poro de permeabilidade
transitória da membrana mitocondrial 28
Bcl-2 mantém MPTP no estado encerrado e inibe libertação de cit c;
Bax conduz à abertura do poro promovendo a apoptose.
O que é o poro de permeabilidade transitória da membrana mitocondrial
29
É um complexo proteico, composto por várias proteínas:
VDAC (canal aniónico dependente de voltagem), na membrana externa;
translocador de ADP/ATP, na membrana interna;
ciclofilina D,
outras proteínas acessórias.
Função fisiológica do poro: regular
Ca2+ intramitocondrial?!
Ionóforos de Ca 2+ adicionados a células
em cultura---aumento de Ca2+
mitocondrial---abertura do poro.
O stresse oxidativo é um importante indutor da
abertura do poro de permeabilidade transitória
da membrana mitocondrial 30
Muitos xenobióticos causadores de stresse oxidativo
(directamente, por darem lugar a ROS ou indirectamente, por
baixarem as defesas anti-oxidantes)
induzem a abertura do poro e a apoptose ou necrose.
Learning points 31
�A toxicidade mitocondrial induzida por xenobióticos pode ter por base vários mecanismos, todos os quais conduzem, por último, a um decréscimo da produção de ATP e a uma crise energética para a célula. Locais de interferência com a função mitocondrial
incluem disponibilidade de substratos e de oxigénio, ciclo de Krebs e produção de NADH,
transporte de electrões e ejecção de protões, síntese de ATP conduzida pela ATP sintetase.
�A dissociação da fosforilação oxidativa pode ser induzida por protonóforos que reconduzem os protões extruídos no espaço intermembranar para a matriz mitocondrial,
conduzindo um ciclo fútil.
�A inibição do transporte de electrões ao nível do Complexo I pode desviar os electrões e resultar na produção de ROS. Isto potencialmente conduz a dano oxidativo do DNAmitocondrial muito susceptível.
�Doxorubicina pode injuriar o músculo cardíaco devido a ter uma alta afinidade por cardolipina mitocondrial e poder iniciar um ciclo redox.
�O stresse oxidativo e outras formas de stresse induzido por compostos químicos pode levar à abertura do poro de permeabilidade transitória mitocondrial, com colapso do potencial membranar da mitocôndria, esgotamento do ATP e facilitando a libertação de factores pro-apoptóticos.
Abordagens técnicas ao estudo da
função mitocondrial sob o efeito
de xenobióticos
Bioquímica, Voet & Voet, 3ª Ed.,2004
e protocolos das aulas práticas
Avaliação do funcionamento da cadeia mitocondrial de transporte de electrões, por medida do consumo de oxigénio
em câmara fechada (eléctrodo de oxigénio) 33
Estabelecimento da sequência de complexos transportadores de electrões por bloqueamento do fluxo de electrões com
inibidores selectivos da cadeia mitocondrial 34
A fosforilação e a oxidação estão estreitamente associadas 35
ADP
Tempo
∆O2
Estado 4
Estado 3
Estado 4
veloc consumo O2 est.3
veloc consumo O2 est.4ICR =
Estequiometria da oxidação associada à fosforilação 36
Razão ADP/O = ATP sintetizado por átomo de Oxigénio reduzido (par de electrões captado)
Efeito de dissociadores da fosforilação oxidativa 37
[O2]≈0
ADPFCCP
FCCP
ADP
oligomicina
FCCP
Efeitos tóxicos de xenobióticos no potencial transmembranar mitocondrial 38
Registos típicos do potencial
transmembranar mitocondrial suportado
por succinato, na ausência e na presença de
metopreno nas concentrações indicadas.
Efeito do metopreno no potencial
transmembranar mitocondrial. O parâmetro
“Energização inicial” refere-se ao potencial
obtido para cada experiência, imediatamente
antes de adicionar o metopreno.
Efeitos de xenobióticos na indução da abertura do poro de
permeabilidade transitória mitocondrial induzida por Ca2+ 39
Decréscim
o da pseudo-
absorvência
intumescim
ento