(1)

การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนและคณสมบตทางชววทยา

Mild Strain Isolation of Citrus Tristeza Closterovirus and its Biological Properties

พฒตาล ทพเพง Puttarn Tippeng

วทยานพนธนส าหรบการศกษาตามหลกสตรปรญญา

วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาโรคพชวทยา มหาวทยาลยสงขลานครนทร

A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Plant Pathology

Prince of Songkla University 2556

ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

(2)

ชอวทยานพนธ การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนและคณสมบตทางชววทยา ผเขยน นางสาวพฒตาล ทพเพง สาขาวชา โรคพชวทยา อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก คณะกรรมการสอบ ……………………................................ ………………………………..ประธานกรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.รตนา สดด) (รองศาสตราจารย ดร.วสนณ เพชรรตน)

…………………………………..….….กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.รตนา สดด) …………………………….….….….…กรรมการ (นางสรภ กรตยะองกร) ……………………………………..….กรรมการ

(ดร.มณรตน คหาพทกษธรรม)

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร อนมตใหนบวทยานพนธฉบบน

ส าหรบการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาโรคพชวทยา

……………………………………….. (รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ)

คณบดบณฑตวทยาลย

(3)

ขอรบรองวา ผลงานวจยนเปนผลมาจากการศกษาวจยของนกศกษาเอง และขอขอบคณผ ทมสวนเกยวของทกทานไว ณ ทน

ลงชอ………………………………. (รองศาสตราจารย ดร.รตนา สดด) อาจารยทปรกษาวทยานพนธ ลงชอ………………………………. (นางสาวพฒตาล ทพเพง) นกศกษา

(4)

ขาพเจาขอรบรองวา ผลงานวจยนไมเคยเปนสวนหนงในการอนมตปรญญาในระดบใดมากอน และไมไดถกใชในการยนขออนมตปรญญาในขณะน

ลงชอ………………………………. (นางสาวพฒตาล ทพเพง) นกศกษา

(5)

ชอวทยานพนธ การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนและคณสมบตทางชววทยา ผเขยน นางสาวพฒตาล ทพเพง สาขาวชา โรคพชวทยา ปการศกษา 2556

บทคดยอ

โรคทรสเตซาสรางความเสยหายตอพชตระกลสมในแหลงปลกสมทวโลกรวมทงประเทศไทย ความรนแรงของโรคทรสเตซาขนอยกบชนดของสม และสายพนธของเชอสาเหต ซตรสทรสเตซาไวรส (Citrus tristeza Closterovirus, CTV) จดประสงคของการทดลองครงนเพอแยก เชอไวรสสายพนธออน ซงจะน าไปใชในการปองกนโรคทรสเตซาทรนแรงตอไป โดยแยกเชอจากแหลงเชอมะนาว SM4 ซงมอาการเสนใบใส และจากแหลงเชอสมโอ DAT4-5 มอาการใบเหลอง เตยแคระ และทรดโทรม น าเพลยออนสมสน าตาล (Toxoptera citricida) ซงเปนพาหะของ เชอซตรสทรสเตซาไวรสมาดดกนมะนาว SM4 และสมโอ DAT4-5 เพอรบไวรสเปนเวลา 24 ชวโมง จากนนยายแมลงพาหะไปดดกนเพอถายไวรสไปยงพชทดสอบ คอตนกลามะนาว [Citrus aurantifolia (Christm.) Swing.] เปนเวลา 24 ชวโมงโดยใชแมลง 1 ตวตอพชทดสอบ ผลการตรวจเชอไวรสในพชทดสอบทรบเชอจากแมลงพาหะโดยเทคนค ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) พบวาแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรส ไดรวมทงสน 12 ไอโซเลท โดยแยกไดจากแหลงเชอมะนาว SM4 และสมโอ DAT4-5 จ านวน 7 และ 5 ไอโซเลท ตามล าดบ จากอาการบนพชทดสอบพบเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกได ซงมแนวโนมเปนเชอสายพนธออน 4/12 ไอโซเลท แลวคดเลอก 3/4 ไอโซเลท คอ SM4-P5 SM4-P9 และ SM4-P10 มาจ าแนกสายพนธโดยใชลกษณะอาการทเชอแตละไอโซเลทชกน าใหเกดขนกบพชทดสอบ 3 ชนด คอ มะนาว (C. aurantifolia) สมโอ (C. grandis L.) และเกรฟรท (C. paradisi Macfad.) พบวาเชอทงสาม ไอโซเลทท าใหเกดอาการเสนใบใสเพยงเลกนอย (ระดบ 1) บนพชทดสอบมะนาวเทานน ท าใหสรปไดวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทง 3 ไอโซเลทเ เ อ ธออน ในการจ าแนกสายพนธของเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสดวยแบบแผน RFLP ซงไดจากการตดรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ของเชอซตรสทรสเตซาไวรสดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I ทง 3 ไอโซเลทมแบบแผน RFLP ทแตกตางกนและพบแบบแผนรวมมากกวา 1 แบบแผน โดยเปรยบเทยบกบแบบแผน RFLP ของเชอซตรสทรสเตซาไวรส ซงรายงานไวโดย Gillings และคณะ (1993) ไอโซเลท SM4-P5 พบแบบ

(6)

แผน RFLP ของเชอกลมสายพนธรนแรง ปานกลาง และออนรวมกน ไอโซเลท SM4-P10 พบแบบแผนของเชอกลมสายพนธ รนแรง และปานกลาง และไอโซเลท SM4-P9 พบแบบแผนทไมมในรายงานของ Gillings และคณะ (1993) และพบวาไอโซเลท SM4-P5 มอตราการถายทอดเชอโดยแมลงพาหะ 75 เ อ เซ ขณะทไอโซเลท SM4-P9 และไอโซเลท SM4-P10 มอตราการถายทอดเชอโดยแมลงพาหะเทากน คอ เ อ เซ และตรวจพบเชอซตรสทรสเตซาไวรส ไอโซเลท SM4-P5, SM4-P10 และ SM4-P9 ในน าคนจากเนอเยอ (เปลอกเขยวของกงมะนาว) ทระดบความเขมขน 0.064, 0.081, และ 0.350 ไมโครกรมตอมลลลตรของน าคนของเนอเยอ ซงไอโซเลท SM4-P9 มแนวโนมในการขยายพนธในเนอเยอมะนาวสงกวาไอโซเลท SM4-P5 และ SM4-P10

(7)

Thesis Title Mild Strain Isolation of Citrus Tristeza Closterovirus and its

Biological Properties Author Miss Puttarn Tippeng Major Program Plant Pathology Academic Year 2013

Abstract

Tristeza disease is one of the most destructive disease to citrus growing area worldwide including Thailand. Severity of tristeza disease depends on citrus species and strains of Citrus tristeza Closterovirus (CTV), a causal pathogen. The purpose of this experiment is to isolate citrus tristeza virus mild strain that will be used in cross protection. Citrus tristeza virus was isolated by a brown citrus aphid (Toxoptera citricida), the virus vector, from naturally infected West Indian lime SM4 showing vein clearing symptom and from pomelo DAT 4-5 showing yellow leaf, stunting, and declining symptoms. The aphids were allowed to feed on SM4 and DAT 4-5 to acquire the virus for 24 hr. Then they were transferred to feed on an index plant seedling [Citrus aurantifolia (Christm.) Swing.] for another 24 hr. in order to transmit the virus to the seedlings. A single aphid was used per seedling. Results from ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) showed that 12 isolates of citrus tristeza virus were recovered, 7 from SM4 and 5 from DAT 4-5. Among these, 4/12 isolates were likely to be mild strain according to induction of mild symptom on the index seedling. Further, severity evaluation was made on 3/4 isolates of mild symptom induction group including, SM4-P5, SM4-P9, and SM4-P10. Each isolate was inoculated into 3 species of citrus tristeza virus biological index plants, West Indain lime (C. aurantifolia), pomelo (C.grandis L.) and grapefruit (C. paradisi Macfad.). Only mild vein clearing symptom (level 1) was induced by the three isolates on C. aurantifolia. Results from biological indexing concluded that these three isolates are mild strains. The identification of citrus tristeza virus strain based on RFLP profile of coat protein gene (P25) cut with Hinf I. Results

(8)

indicated that the RFLP profiles found in citrus tristeza virus isolate SM4-P5, SM4-P9 and SM4-P10 were different. RFLP profiles belonging to severe, moderate and mild strains of citrus tristeza virus were recovered in SM4-P5 isolate while profile of severe and moderate strain were found in SM4-P10. However, profiles found in SM4-P9 were not recognized according to Gillings et al (1993). Aphid transmission of citrus tristeza virus was determined and resulted in SM4-P5 gave transmission rate of 75%. SM4-P9 and SM4-P10 were transmitted at the rate of 70%. In addition, detection of citrus tristeza virus by ELISA indicated that 0.064, 0.081 and 0.350 µgml-1 were recovered in sap extract from green bark of West Indian lime infected by SM4-P5, SM4-P10 and SM4-P9, respectively. This could mean that SM4-P9 multiplied better than SM4-P5 and SM4-P10.

(9)

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธ เลมน ส า เ รจลลวงไ ด ดวยด ขาพเ จาขอกราบขอบพระคณ รองศาสตราจารย ดร.รตนา สดด ประธานกรรมการทปรกษาวทยานพนธ ทกรณาใหความร ใหค าปรกษา ใหค าแนะน า และชแนะแนวทางในการด าเนนงาน ตลอดจนการเขยนและตรวจแกไขวทยานพนธฉบบนใหส าเรจลลวงไปไดดวยด และขอกราบขอบพระคณ รองศาสตราจารย ดร.วสนณ เพชรรตน ประธานกรรมการสอบวทยานพนธ คณสรภ กรตยะองกร และ ดร.มณรตน คหาพทกษธรรม กรรมการสอบวทยานพนธ ทกรณาใหค าแนะน าและตรวจแกไขขอบกพรองท าใหวทยานพนธเลมนมความสมบรณมากยงขน

ขอขอบพระคณบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร และโครงการสงเสรมการวจยในอดมศกษาและการพฒนามหาวทยาลยวจยแหงชาต ของส านกงานคณะกรรม การการอดมศกษา (NRU) ทใหความอนเคราะหสนบสนนเงนทนในการท าวจย

ขอขอบพระคณ Dr. Lucy Tran-Nguyen ทใหการสนบสนนและใหการตอนรบ ในการเขารวมเสนอผลงานทางวชาการในการประชม The 4th ASIAN CONFERENCE ON PLANT PATHOLOGY CONCURRENT WITH THE 18th BIENNIAL AUSTRANASIAN PLANT PATHOLOGY SOCIETY CONFERENCE (ACPP- APPS) ณ ประเทศออสเตรเลย และ The Crawford Fund ทใหทนสนบสนนในการเขารวมประชมครงนดวย

ขอขอบพระคณคณาจารย และบคลากรคณะทรพยากรธรรมชาต ทกทานทกรณาชวยเหลอ ใหความรและประสบการณในดานตางๆ

ขอขอบพระคณนายวศะพงศ เอกสมทราเมษฐ นายอษฎางค วงศการเวก นางสาวนราณ บอราเฮง นายสรเชษฐ มาฆทาน นายณฐพงศ สงฤทธ และเพอนๆ พๆ นองๆ ทกทานทคอยใหความชวยเหลอทงก าลงกายและก าลงใจในการท าวจยครงนจนส าเรจ

ขอขอบพระคณ คณพอชม คณแมละเมยด ทพเพง และครอบครว ตลอดจน ญาตพนองทกทานทคอยใหความชวยเหลอ สนบสนน และใหก าลงใจตลอดมาจนส าเรจการศกษาไดในครงน

พฒตาล ทพเพง

(10)

สารบญ

หนา บทคดยอ Abstract กตตกรรมประกาศ สารบญ

(5) (7) (9) (10)

รายการตาราง (11) รายการภาพประกอบ (12) บทท

1. บทน า 1 บทน าตนเรอง 1 ตรวจเอกสาร 3 วตถประสงค 11 2. วสด อปกรณ และวธการ 12 วสด อปกรณ

วธการด าเนนการ 12 20

3. ผลการศกษา 29 4. 5.

วจารณ สรป

49 53

เอกสารอางอง 55 ภาคผนวก 62 ประวตผ เขยน 65

(11)

รายการตาราง

ตารางท หนา

1 การใหคะแนนระดบความรนแรงของอาการทางใบ 25

2 การใหคะแนนระดบความรนแรงของอาการทางล าตน 25 3

แสดงผลการตรวจพบเชอ CTV ELISA ในพชทดสอบมะนาวซงรบการถายเชอจากแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida)

30

4 ลกษณะอาการของพชทดสอบมะนาวซงเกดจากการตดเชอ CTV ไอโซเลท ทแยกไดโดยใชแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล

31

5 ระดบความรนแรงของอาการทางใบและอาการทางล าตนทเชอ CTV ทแยกไดชกน าใหเกดบนพชทดสอบ

37

6 อตราการเจรญเตบโต (ความสง) ของพชทดสอบหลงปลกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธทแยกได

38

7 จ านวนชนและขนาดของชนดเอนเอของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ของเชอ CTV เมอตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I

42

8

9

10

11

12

แสดงแบบแผน RFLP ทไดจากการตดดเอนเอของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25 ดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I ของเชอ CTV สายพนธตางประเทศ รายงานโดย Gillings และคณะ (1993) การจดกลมแบบแผน RFLP ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ของเชอ CTV ไอโซเลทซงแยกโดยแมลงพาหะและแยกโดยวธ leaf grafting เมอตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I แสดงผลการตรวจพบเชอ CTV ELISA ในตนกลามะนาวทไดรบการถายทอดเชอ CTV สายพนธออนโดยแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida) อตราการถายทอดเชอ CTV สายพนธออนโดยแมลงพาหะเพลยออนสม สน าตาล (T. citricida) ปรมานความเขมขนของเชอ CTV ในเนอเยอพช

43

44

45

46

48

(12)

รายการภาพประกอบ

ภาพท หนา

1 แสดงแผนภมจโนมบนสายอารเอนเอของเชอ CTV ทประกอบดวย Open Reading Frame 12 ต าแหนง

4

2 ตวเตมวยของแมลง Toxoptera citricida (Kirkaldy) จบจากตนสมตามธรรมชาตแลวน ามาเลยงบนตนกลาสมจด (Citrus mitis) ปลอดโรคซง ปลกจากเมลด

21

3 มลง หะ Toxoptera citricida (Kirkaldy) ดดกนมะนาว SM4 ตดเชอ CTV ในแปลงปลกเพอรบเชอ CTV

21

4 มลง หะ Toxoptera citricida (Kirkaldy) ดดกนพชทดสอบมะนาว เพอถายเชอ CTV

22

5 การปลกเชอ CTV ลงในพชทดสอบ โดยใชเทคนค leaf grafting 24 6 แสดงแบบแผน RFLP ทไดจากการตดดเอนเอของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน

P25 ม ะ Hinf I ของเชอ CTV สายพนธตางประเทศ รายงานโดย Gillings และคณะ (1993)

26

7 อาการเสนใบใสบนพชทดสอบมะนาว 32 8 อาการรองบมบนพชทดสอบมะนาว 33 9 อาการเสนใบใสบนพชทดสอบมะนาว 35 10 ลกษณะอาการเสนใบแตก (corky vein) ละ รใ หล ง

มะ เมอตดเชอ CTV ไอโซเลท CmO2-1 36

11 12

13

14

ผลผลตดเอนเอของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ของเชอ CTV ทเพมปรมาณ โดย RT-PCR และใชไพรเมอรจ าเพาะตอ P25 gene แบบแผน RFLP ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I ของเชอ CTV ไอโซเลททแยกโดยแมลงพาหะ แบบแผน RFLP ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I ของเชอ CTV สายเชอในธรรมชาต และไอโซเลททแยกโดยวธ leaf grafting กราฟความเขมขนมาตรฐาน (standard curve) ของเชอ CTV บรสทธ (SM4)

39

40

41

47

1

บทท 1

บทน ำ

บทน ำตนเรอง

สมเปนพชเศษฐกจ และมการเพาะปลกกนแพรหลายในประเทศไทย ชนดของสมทปลก ไดแก สมโอ (Citrus grandis (L.) Osbeck) สมโชกน (Citrus reticulata Blanco) สมจก (Citrus reticulata Blanco) สมเขยวหวาน (Citrus reticulata Blanco) และมะนาว (Citrus aurantifolia (Christm.) Swing.) เปนตน ผลผลตทไดบรโภคภายในประเทศเปนหลก แตในการผลตสมประสบปญหาและอปสรรคเกยวกบโรคและแมลงศตรสม ท าใหปรมาณและคณภาพของผลผลตลดลง เพมตนทนในการผลต โรคทรสเตซาเปนโรคหนงทส าคญและสรางความเสยหายตอพชตระกลสมในแหลงปลกสมทวโลก ประเทศไทยมรายงานโรคทรสเตซาเกดขนกบพชตระกลสม และระดบความรนแรงของโรคขนอยกบชนดของสม และสายพนธของเชอทเขาท าลาย (รตนา สดด, 2537) สายพนธซตรสทรสเตซาไวรส (Citrus tristeza Closterovirus) ทพบในธรรมชาตม 2 กลม คอกลมสายพนธออน (mild strain) ทกอใหเกดอาการทไมรนแรง และกลมสายพนธรนแรง (severe strain) ซงประกอบดวยสายพนธเชอทท าใหเกดอาการตนกลาเหลอง (seedling yellow) ตนแคระแกรน (stunt) อาการทรดโทรม (decline) สายพนธเชอทท าใหเกดอาการล าตนบม (stem pitting) และมรายงานพบการตดเชอรวมของเชอซตรสทรสเตซาไวรสหลายสายพนธในตนสม (Koizumi et al., 2001) การจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสามารถท าไดหลายวธ เชน การจ าแนกโดยใชลกษณะอาการทเกดกบพชทดสอบ (biological index) (ไมตร พรหมมนทร และคณะ, 2529; Ochoa et al., 1993; Figueroa et al., 2009 และ Bekolo et al., 2007) การจ าแนกโดยวธการทางเซรมวทยา (serology) (รตนา สดด และคณะ, 2551 และ Nikolaeva and Karasev et al., 1995) และการจ าแนกโดยใชวธการทางชวโมเลกล (molecular biology) (Gillings et al., 1993)

เชอซตรสทรสเตซาไวรสแพรกระจายโดยตดไปกบทอนขยายพนธ และแมลงพาหะจ าพวกเพลยออน ซงมเพลยออน 4 ชนด ทเปนพาหะในการถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรส คอ เพลยออสมสน าตาล (Toxoptera citricida), เพลยออนสม (T. aurantii), เพลยออนฝาย (Aphis gossypii ) และ เพลยออนสมเขยวหวาน (A. spiraecola) และพบวาเพลยออนสมส

2

น าตาล (T. citricida) มประสทธภาพในการถายทอดเชอสงกวาเพลยออนฝาย (A. gossypii ) (Yokomi et al.,1994) แตอตราการถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยเพลยออน T. citricida ไมเทากนขนอยกบสายพนธไวรส นอกจากนยงมรายงานการใชแมลงพาหะเพลยออนสม (single aphid transmission) แยกสายพนธไวรสทตดเชอรวมกนในตนสมออกเปนเชอสายพนธ เดยว (Broadbent et al., 1996 และ ปรชา สงเสรม, 2548)

การควบคมโรคทรสเตซาโดยใชสารเคมควบคมแมลงพาหะจะท าใหตนทนการผลตสมเพมสงขน และเปนพษตอสงแวดลอม ทงนมรายงานการปองกนโรคชนดนดวยวธการปลกเชอสายพนธออนใหกบตนสมเพอปองกนการตดเชอสายพนธรนแรง (cross protection) ทมอยทวไปตามธรรมชาตและถกแพรกระจายไปโดยแมลงพาหะ ซงเปนวธหนงทใชไดผลดในการปองกน และลดความเสยหายจากโรคทรสเตซาและประสบผลส าเรจในหลายประเทศ เชน สหรฐอเมรกา บราซล อสราเอล อนเดย เปนตน (Costa and Muller ,1980)

ดงนนการแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสและจ าแนกสายพนธไวรสเพอใหไดไวรสสายพนธออนจะเปนประโยชนตอการน าไปใชควบคมโรคทรสเตซาของพชตระกลสมตอไป

3

กำรตรวจเอกสำร โรคทรสเตซำ

โรคทรสเตซาเปนโรคทส าคญ และสรางความเสยหายกบพชตระกลสมมากกวา 80 ลานตนทวโลก (Davino et al., 2005) มแหลงก าเนดในแถบทวปเอเชย และไดแพรกระจายไปยงพนทปลกสมทวโลก โดยตดไปกบสวนขยายพนธตอมาแพรกระจายโดยแมลงพาหะ (Rocha-Pena, 1995) ในป ค.ศ. 1930 ไดแพรกระจายและท าความเสยหายไปยงพนทปลกสมในเขตบราซล อารเจนตนาพนทตางๆ ในอเมรกาใต สหรฐอเมรกา อสราเอล และสเปนกวา (Korkmaz, 2002) โรคทรสเตซาเกดขนกบพชตระกลสม ระดบความรนแรงของโรคขนอยกบชนดของสม และสายพนธของเชอทเขาท าลาย ท าใหลกษณะอาการของโรคแตกตางกน (รตนา สดด, 2537) โดยเฉพาะมะนาวจะแสดงอาการของโรคเดนชด เรมจากใบออนพบอาการเสนใบใส (vein clearing), เสนใบแตก (corky vein), อาการใบถวย (leaf cupping), ตนกลาเหลอง (seedling yellow), ปลายกงแหงตาย (decline), ตนแคระแกรน (stunt) และอาการรองบมในเนอไม (stem pitting) สงผลใหผลผลตลดลง และตายในทสด (สรภทร พงษเสฐ, 2526) นอกจากนยงพบวาในสภาพแวดลอมทตางกนท าใหอาการของโรคทรสเตซาทปรากฏแตกตางกน (Garnsey et al., 2005)

สรภทร พงษเสฐ (2526) พบอาการของโรคทรสเตซาของสมเขยวหวานในสภาพแปลงปลกของเกษตรกรบรเวณรงสต มความสมพนธกบอายของตนพช สวนสมทมอาย 1-5 พบอาการแคระแกรนและสเหลองซดของใบ ตนสมทมอาย 6 ขนไป แสดงอาการตนโทรม ผลมขนาดเลกลง ใบเหลองซด รวง กงแหงตาย จนถงตนตาย ซตรสทรสเตซำไวรส

โรคทรสเตซามสาเหตมาจากเชอ Citrus tristeza Closterovirus ซงเปนไวรสทมอนภาคขนาดยาว อาศยอยในเซลลทออาหารเทานน มรปรางเปนทอนยาวคด (Flexuous rod) ยาวประมาณ 2,000 นาโนเมตร น าหนกโมเลกลประมาณ 13.3 × 106 ดาลตน อนภาคไวรสประกอบดวยอนภาคเดยว มสารพนธกรรมเปนแบบ single stranded RNA (Bar-Joseph et al., 1989) RNA ของ Closterovirus จะมความยาวตงแต 15.5 ถง 20 กโลเบส จโนมของเชอซตรสทรสเตซาไวรสประกอบดวย ORF (Open Reading Frame) 12 ต าแหนง และ ORF ทเปนรหส

4

พนธกรรมของเปลอกโปรตนม 2 รหส คอ CP หรอ P25 และ P27 ซงอยทปลายดาน 3’ ดงภาพท 1 (Hilf et al., 2005)

ภำพท 1 แสดงแผนภมจโนมบนสายอารเอนเอของเชอ CTV ทประกอบดวย Open Reading

Frame 12 ต าแหนง (ทมา: Hilf et al., 2005)

ในธรรมชาตพบเชอซตรสทรสเตซาไวรสหลายสายพนธ แยกออกเปน 2 กลม สายพนธ ตามลกษณะอาการ คอ กลมสายพนธออน หรอสายพนธไมรนแรง (mild strain) ซงท าใหเกดอาการไมรนแรง และกลมสายพนธรนแรง (severe strain) ประกอบดวยสายพนธทรดโทรมเมอใชตนตอซารวออเรนจ (decline, CTV-D) สายพนธตนกลาเหลอง (seedling yellow, CTV-SY) และสายพนธล าตนบม (stem pitting, CTV-SP) ในกลมสายพนธรนแรงนจะสงผลกระทบอยางมากตอพชตระกลสมทตดเชอ ท าใหตนตายหรออายสนลง (Bar-Joseph et al., 1985) และมรายงานการพบเชอซตรสทรสเตซาไวรสมากกวาหนงสายพนธอยรวมกนในตนสม (Koizumi et al., 2001)

Rocha-Pena และคณะ (1995) ไดท าการศกษาพชอาศยของเชอซตรสทรสเตซาไวรสและอาการตางๆ ทเกดกบพชอาศยแตละชนด พบวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสจะมพชอาศยจ ากดในพชตระกลสมซงอยในวงศ Rutaceae และ Passiflora gracilis ซงเปนพชนอกวงศ Rutaceae เชอซตรสทรสเตซาไวรสเกอบทกสายพนธท าใหเกดอาการเสนใบใส (vein clearing) บนมะนาว (Mexican Lime, Citrus auratifolia) ใบโคงงอเปนรปถวย (cupping) ตนแคระแกรนและล าตนบม ในสมเกลยง (sweet orange, C. sinensis (L.) Osbeck) หากเสยบยอดบนตนตอซารวออเรนจ เมอตดเชอกลมสายพนธรนแรง CTV-D แสดงอาการทรดโทรมอยางรวดเรวและตายเนองจากเกดการตายของ เซลลทออาหาร (phloem) ทบรเวณรอยตอของตนตอ (root stock) และสวนยอด (scion) Senan และคณะ (1997) ไดปลกเชอซตรสทรสเตซาไวรสลงบน Duncan

5

grapefruit พบวาท าใหเกดอาการตนกลาเหลอง (seedling yellow) ภายใน 2 สปดาหหลงจากการปลกเชอ

รตนา สดด และคณะ (2551) พบเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธล าตนบมในสมแมนดารน (Citrus reticulata Blanco) 3 ชนด คอ สมเขยวหวาน, สมโชกน สมโอเชยน และยงพบในสมโอและมะนาว ซงเปนการตดเชอตามธรรมชาต สมโชกนและสมโอเชยนทตดเชอสายพนธล าตนบม แสดงอาการรองบมขนาดใหญบนกงและล าตนซงมองเหนจากภายนอก ขณะทสมโอและมะนาวมอาการรองบมขนาดเลกในเนอไมตองตรวจดดวยกลองจลทรรศน และมอาการตนแคระแกรน Broadbent และคณะ (1996) รายงานการพบสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในควนแลนด ซงเปนสายพนธ ทท าใหเกดอาการล าตนบม (stem pitting) ในสมนาเวล (C. sinensis)

กำรถำยทอดเชอซตรสทรสเตซำไวรสโดยแมลงพำหะ

เชอซตรสทรสเตซาไวรสสามารถถายทอดโดยแมลงพาหะ เพลยออนเปนแมลง

พาหะทถายทอดเชอสาเหตโรคทรสเตซา ท าใหเกดการแพรกระจายของโรคไปอยางกวางขวาง และ รวดเรว เพลยออน (Homoptera: Aphidae) เปนแมลงปากดด (sucking type) ขนาดเลกผนงล าตวนม ขยายพนธโดยไมตองผสมพนธ และออกลกเปนตว มทงพวกทมปก (wing type) และไมมปก (wingless type) เพลยออนมกลไกการถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรสแบบ semi-persistent โดยไวรสจะถกดดกนเขาไปพรอมกบน าเลยงจากพชไปอยทบรเวณกระเพาะสวนหนา (foregut) ของแมลง โดยใชเวลาในการดดกนเพอรบเชอ (acquisition feed) นาน 30 นาท และใชเวลาในการดดกนเพอถายทอดเชอ (inoculation feed) 30 นาท บนพชปกต การเพมเวลาใน การถายทอดเชอจนถง 24 ชวโมง จะเพมประสทธภาพในการถายทอดเชอ ส าหรบเพลยออนทเปนพาหะถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรสม 4 ชนด คอ เพลยออนสมสน าตาล, เพลยออนสม, เพลยออนฝาย และ เพลยออนสมเขยวหวาน (Broughton, 2007) เนองจากเพลยออนสม T. citricida กบ T. aurantii มลกษณะคลายคลงกนแตสามารถจ าแนกไดจากลกษณะของหนวด (antenna) และปก T. citricida หนวดปลองท 3, 4 และ สวนมากของปลองท 5 ไมมส (pale) ในพวกทมปกหนวดปลองท 3 มสด าทงปลอง ปกมแขนงแตกออกเปน 2 แขนง และม pterostigma เปนสเทา สวน T. aurantii ตรงสวนปลายของหนวดปลองท 3, 4 และ 5 มสด าทงพวกทมปกและไมมปก ปกมแขนงเดยว และ pterostigma เปนสด า (Bänziger, 1977)

6

เพลยออนสมสน าตาล (T. citricida) ทเปนพาหะหลกในการแพรกระจายเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสมวงจรชวต 8-21 วน ขนอยกบอณหภมและพชอาศย ตวออนมรปรางแบบผลแพร (pear shape) มสน าตาลแดง สน าตาลถงด า ยาว 1-2 มลลเมตร เจรญเปนตวเตมวยภาย ใน 6-8 วน ทอณหภม 20 องศาเซลเซยส หรอสงกวา ตวเตมวยมสด าเปนมนวาว ยาวประมาณ 2 มลลเมตร มทงพวกทมปกและไมมปก ตวออน 1 ตว สามารถออกลกไดมากกวา 4,400 ตว ภายใน 3 สปดาห ถาไมมแมลงศตรรบกวน ม 25-30 รนตอป (Broughton, 2007) ส าหรบพชอาศยหลกของเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida) จ ากดอยในพชวงศ Rutaceae (Bänziger, 1977 และ Komazaki, 1993) แตมรายงานการพบเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida) บนพชอาศยตามธรรมชาตทอยนอกเหนอจากวงศ Rutaceae เชนพชในวงศ Anacardiaceae, Fabaceae, Rosaceae เปนตน แตไมสามารถยนยนไดวาเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida) สามารถเจรญเตบโตออกลกออกหลานบนพชเหลานนได (Halbert and Brown, 2003) Yokomi และคณะ (1994) ศกษาประสทธภาพในถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรส พบวาเพลยออนสมสน าตาลมประสทธภาพในการถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรส 4 สายพนธ ทไดมาจากพนทตางๆ คอ บราซล (B13), อสราเอล (B23), สเปน (B53) และสหรฐอเมรกา (B11) เฉลย 41 เปอรเซนต เปรยบเทยบกบอตราการถายทอดเชอโดยเพลยออนฝาย (A. gossypii) เฉลย 13 เปอรเซนต ในการทดลองใชจ านวนเพลย 1,5, 10 และ 15 ตวตอพชทดสอบ Mexican lime

กำรถำยทอดเพอแยกเชอซตรสทรสเตซำไวรส

การถายทอดเพอแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสจากสมทตดเชอในธรรมชาตโดยการเชอมตอเนอเยอ (graft transmission) เชน การเสยบยอด (top graft), การตดตา (budding) หรอการเชอมเนอเยอใบ (leaf grafting) และสามารถแยกไดโดยใชแมลงพาหะเพลยออนสม (aphid transmission) (รตนา สดด และคณะ, 2543) โดยประสทธภาพและอตราในการถายเชอจะขนอยกบสภาพแวดลอม ชนดของพชอาศย สายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรส แ ะ น อ พ ท สอบ (Corazza-Nunes et al., 2006)

Broadbent และคณะ (1996) ใชแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล 1 ตวตอพชทดสอบ (single aphid transmission) แยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสหลายสายพนธทตดเชอรวมในตนสมในสภาพแปลงปลก พบประสทธภาพในการถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงพาหะเพลยออนสม (T. citricida) อยในชวง 0-55 เปอรเซนต เมอถายเชอจากสมแมนดารนมอตรา

7

การถายทอดเชอ 20.7 เปอรเซนต และถายเชอจากเกรฟรท 5 เปอรเซนต แ ะ อ า เ อ าก ส ท อ ร สทร สเ า ร สทชกน าอาการร อ บ ( พบ า อ ราการ า ทอ อส ส ค อ เปอรเซนต จากการศกษาชใหเหนวาประสทธภาพในการถายทอดเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงขนอยกบชนดของพชอาศยในสภาพแปลงปลกและทตงทางภมศาสตร และยงพบวาจากการแยกเพอถายเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงพาหะเพลยออน (single aphid transmission) เพยงรอบเดยวไมสามารถแยกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสออก นสา พ น อ ท าอ า น อ รอบ กำรจ ำแนกสำยพนธเชอซตรสทรสเตซำไวรส กำรจ ำแนกดวยพชทดสอบ (Biological index)

การจ าแนกดวยพชทดสอบเปนการจ าแนกความแตกตางทางดานอาการทเชอซตรสทรสเตซาไวรสแตละสายพนธชกน าใหเกดขนบนพชทดสอบ พชทดสอบทนยมใชคอ มะนาว Citrus aurantifolia (Mexican lime) Broadbent และคณะ (1996) รายงานการน าพชทดสอบ 3 ชนดมาใชในการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรส คอ น าสวทออรเรนจมาใชในการจ าแนกอาการรองบมในเนอไม (stem pitting) ซงจดอยในกลมทใหอาการรนแรง น ายเรกาเลมอน และดลแคนเกรฟรทมาใชในการจ าแนกอาการตนกลาเหลอง (seedling yellow) และน ามะนาวมาใชในการจ าแนกอาการเสนใบใส Ochoa และคณะ (1993) จ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสดวยพชทดสอบ โดยท าการปลกเชอซตรสทรสเตซาไวรส 10 ไอโซเลท ดวยการตดตาลงพชทดสอบ 4 ชนด คอ มะนาว (Mexican lime), ยรกาเลมมอน (Eureka lemon), ซารวออเรนจ (sour orange) และ มาชเกรฟรท (Marsh grapefruit) จากการทดลองพบวาสามารถจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซไวรสไดออกเปน 3 กลมคอ กลมสายพนธทแสดงอาการออนมาก (mildest) กลมสายพนธทแสดงอาการปานกลางถงรนแรง (moderate to severe) และกลมสายพนธ ทแสดงอาการรนแรงมาก (very severe) ในการประเมนอาการทางใบแบงระดบความรนแรงของอาการออกเปน 5 ระดบตามความมากนอยของอาการ ระหวาง 0 (ไมแสดงอาการ) ถง 4 (แสดงอาการรนแรงมาก) Bekolo และคณะ (2007) จ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรส โดยใชพชทดสอบในการประเมนระดบความรนแรงของอาการทเกดกบพชทดสอบ คอ อาการรองบม

8

(stem pitting) ทปรากฏบนเนอไมโดยท าการแบงพชทดสอบออกเปน 8 สวน ประเมนอาการ stem pitting 8 กงตอตน

Figueroa และคณะ (2009) จ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยใชลกษณะอาการบนพชทดสอบ คอ อาการเสนใบใส, อาการเสนใบแตก, อาการใบถวย, เตยแคระ และอาการล าตนบม บนพชทดสอบ 5 ชนด คอ มะนาว (Mexican lime), ยเรกาเลมมอน (Eureka lemon), ดลแคนเกรฟรท (Duncan grapefruit), พายแอปเปล สวทออรเรนจ (pineapple sweet orange) และซารวออรเรนจ (sour orange) โดยใหระดบอาการทปรากฏบนพชทดสอบแตละชนดเรมจาก 0 ไมแสดงอาการ ถง 5 แสดงอาการรนแรงมาก แลวน าผลรวมของทกอาการทเกดกบพชทดสอบแตละชนดมาสรปหาระดบความรนแรงของเชอซตรสทรสเตซาไวรส ทเกดกบพชทดสอบแตละชนด

ไมตร พรหมมนทร และคณะ (2529) ไดรวบรวมตวอยางเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสตามแหลงปลกสมทวไปในประเทศไทย ระหวางป 2523-2528 มทงหมด 137 ไอโซเลท มาทดลองโดยวธเสยบกงแบบเสยบขางกบตนกลามะนาวอาย 2 ป ซงใชเปนพชทดสอบจากนนจ าแนกสายพนธของเชอโดยดจากลกษณะอาการทเชอชกน าใหเกดบนพชทดสอบมะนาว ภายในเวลา 2-8 เดอน จากการทดลองพบวาสามารถแบงอาการออกไดเปน 4 กลม คอ กลม T1 ตนกลามะนาวแสดงอาการเกอบปกต ใบมอาการคลายถวย และเสนใบมขดประโปรงแสง เลกนอย กลม T2 ตนกลามะนาวแสดงอาการผดปกต ใบมอาการบดงอ, เสนใบใส กลม T3 ตนกลามะนาวแสดงอาการแคระแกรนเลกนอย ใบแสดงอาการขาดธาตอาหาร, ใบมอาการบดงอ, ขดประโปรงแสงคอนขางรนแรง และกลม T4 ตนกลามะนาวแสดงอาการแคระแกรน ใบแสดงอาการขาดธาตอาหาร, ใบมอาการบดงอ, ขดประโปรงแสง และเสนใบแตกรนแรง

กำรจ ำแนกดวยวธกำรทำงเซรมวทยำ

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) เปนเทคนคทางเซรมวทยาทถกน ามาใชอยางกวางขวางในการตรวจหาเชอซตรสทรสเตซาไวรส เนองจากใหผลในการตรวจทถกตองแมนย า และมความไวสง (รตนา สดด, 2537 และ Roistacher, 1991) ตอมามการน า ELISA มาใชในการจ าแนกสายพนธเชอซตรสทรสเตซไวรส

Senan และคณะ (1997) น าเทคนค ELISA ใชในการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสเพอใชเปนขอมลในการก าจดการแพรระบาดของโรคทรสเตซา จากการทดสอบเมอน าแอนตบอดตอเชอซตรสทรสเตซาไวรส 2 ชนด คอ MCA13 (โมโนโคลนอล

9

แอนตบอด) และ 11B1+3E10 (โพลโคลนอลแอนตบอด) มาใชตรวจสอบดวยเทคนค ELISA พบวาการใชแอนตบอด MCA13 สามารถตรวจพบเชอ 4/19 ตวอยาง ซงเปนเชอสายพนธรนแรง (severe strain) และเมอใชแอนตบอด 11B1+3E10 สามารถตรวจพบเชอสายพนธรนแรง 7/19 ตวอยาง

Nikolaeva และ Karasev (1998) น าวธการทางเซรมวทยา (Serological) มาใชในการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยใชเทคนค I-DAS-ELISA (Indirect Double-Antibody Sandwich (I-DAS) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) โดยใชโพลโคลนอลแอนตบอด และ โมโนโคลนอลแอนตบอด 3E10 มาใชในการตรวจหาเชอซตรสทรสเตซาไวรสในในตวอยางทตดเชอจ านวน 76 ไอโซเลท จาก 20 ประเทศ จากการทดลองพบวาสามารถจ าแนกเชอซตรสทรสเตซาไวรสไอโซเลททท าใหเกดอาการล าตนบมใน สวทออรเรนจได

กำรจ ำแนกดวยวธกำรทำงชวโมเลกล

Gillings และคณะ, 1993 น าเทคนค Restriction fragment length polymorphism (RFLP) มาใชในการจ าแนกสายพนธของเชอซตสทรสเตซาไวรสโดยการน ารหสพนธกรรมเปลอกโปรตนหมอนภาคไวรส (Coat protein gene, CP gene) ของเชอซตรสทรสเตซาไวรสมาเพมขยายโดยเทคนคอารทพซอาร แลวน าผลผลตอารทพซอารมาตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I จากการทดลองน ารหสพนธกรรมเปลอกโปรตนหมอนภาคไวรสของเชอซตรสทรสเตซาไวรส 51 ไอโซเลท มาตดดวยเอนไซมจ าเพาะ พบวาสามารถจ าแนกออกเปน 7 กลม คอแบบแผน RFLP ก ท แ ะ 6 อาการรนแรง (Severe) กลมท 2 และ 7 จดเปนเชอซตรสทรสเตซาไวรสในกลมทใหอาการปานกลาง (Moderate) แ ะก ท แ ะ 5 จดเปนเชอซตรสทรสเตซาไวรสในกลมทใหอาการออน (Mild)

Barzegar และคณะ, 2005 ใชเทคนค RFLP ในการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในประเทศอหรานและจากตางประเทศพบวาแบบแผน RFLP ท ค า แ ก า ก น จากการศกษาบงชวาสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทมาจากพนททมความแตกตางทางภมศาสตรจะมคณสมบตทางชววทยาและพนธกรรมทแตกตางกน

Kano และคณะ (2006) น าเทคนค RFLP มาใชในการจ าแนกเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสในประเทศญป นทตดเชอซตรสทรสเตซาไวรสจ านวน 32/40 ไอโซเลท โดยน า

10

ผลผลตพซอารทไดมาตดดวยเอนไซมจ าเพาะ BstE II จากการทดลองพบวา 21 ไอโซเลท พบเฉพาะแบบแผนท 2 และอก 11 ไอโซเลทพบแบบแผนรวมระหวางแบบแผนท 1 และแบบแผนท 2

Zhou และคณะ, 2007 จ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสจ านวน 72 ตวอยางในประเทศจน ดวยเทคนค RFLP โดยน าผลผลตอารทพซอารของ P25 gene มาตดดวยเอมไซมจ าเพาะ Hinf I พบวาแบบแผน RFLP ของเปลอกโปรตน (P25 gene) สามารถน ามาจ าแนกสายพนธเชอซตรสทรสเตซาไวรสทพบในประเทศจนได สวนใหญจะเปนเชอทอยในกลมท 1 และ 3 ซงรายงานโดย Gillings และคณะ (1993) และจากแบบแผน RFLP ท าใหพบโรค ทรสเตซาทเกดขนในประเทศจนประมาณ 38 เปอรเซนต เปนการตดเชอรวมมากกวา 1 สายพนธ

Atta และคณะ, 2011 น ารหสพนธกรรมเปลอกโปรตนหมอนภาคไวรส (P25 gene) มาวเคราะหเพอศกษาถงคณสมบตของเชอสาเหตโรคทรสเตซาไวรสจ านวน 85 ไอโซเลท จาก 6 อ าเภอ ในจงหวดปญจาบ ประเทศปากสถาน ซงชกน าใหเกดอาการทแตกตางกนดวยเทคนค RFLP และใชเอนไซม Hinf I พบการตดเชอรวมสวนใหญในกลมท 1, 3 และ 6 ตามรายงานของ Gillings และคณะ (1993)

Ayazpour และคณะ, 2011 จ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยเปรยบเทยบระหวางเทคนค Bi-Directional Polymerase Chain Reaction (BD-PCR) กบ RFLP พบวาการใชเทคนค BD-PCR ไมสามารถจ าแนกสายพนธออนออกจากสายพนธรนแรงได แตเทคนค RFLP เปนเทคนคทมประสทธภาพสามารถแยกสายพนธออนออกจากสายพนธรนแรงได จากการใชเทคนค RFLP พบการตดเชอรวมในกลม 1 แ ะ 4 แ ะการ อร นก 6 แ ะ 7 ตามรายงานของ Gillings และคณะ (1993) นอกจากนยงพบกลมใหม 2 ก จากผลชใหเหนวาสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในประเทศมาเลเซยเปนสายพนธ ทแตกตางจากรายงานของ Gillings และคณะ (1993)

Jiang และคณะ, 2008 จ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรส จ านวน 30 อโ ท พบวา 21 อโ ท อร นก แ ะ น อ ร สทร ส า ร ส นก สา พ น ร นแร แ ะสา พ นธออน ตามล าดบ (Gillings et al., 1993) และพบวา ไอโซเลท S4 มการปรากฏของชนดเอนเอทมขนาด 298 และ 299 bp ซงเปนการรายงานเปน ครงแรก ผลทไดชใหเหนการพบพนธกรรมใหมของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในประเทศจน

11

คณสมบตของซตรสทรสเตซำไวรสสำยพนธออนในกำรปองกนเชอสำยพนธรนแรง

การควบคมโรคดวยวธ cross protection เปนการปองกนการเกดโรคของพชทมสาเหตมาจากการเขาท าลายของเชอไวรสสายพนธ รนแรง (severe strain) โดยใชเชอไวรสสายพนธออน (mild strain) ซงเปนทางเลอกหนงทน ามาใชในการจดการโรคพชทเกดจากเชอไวรสในพชปลกหลายชนด (Muller and Rezende, 2004) กลไกการปองกนและควบคมโรคไวรสดวยวธ cross protection เปนการใชเชอไวรสปองกนการตดเชอซ าดวยไวรสชนดเดยวกนแตตางสายพนธ โดยการปลกเชอไวรสสายพนธออน ซงไมมผลกระทบมากนกตอพชอาศยลงในพชแลวเชอไวรสดงกลาวกจะไปเพมปรมาณโดยการสรางเปลอกโปรตนในเนอเยอพชซงมอารเอนเอของเชอไวรสเปนเบาพมพท าใหพชตดเชอสายพนธออน เมอปลกเชอซ าดวยเชอชนดเดยวกนแตตางสายพนธท าใหเชอดงกลาวไมสามารถขยายพนธได (Mooney et al., 1994) ซงเทคนค cross protection ไดน ามาใชอยางกวางขวางในการควบคมโรคทรสเตซาของพชตระกลสมในออสเตรเลย บราซล อาฟรกาใต และญป น (Zhou et al., 2002)

คณสมบตของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนทจะน ามาใชในการปองกนเชอสายพนธรนแรงจะตองมคณสมบตทางชววทยา (biology) ทท าใหเกดอาการทไมรนแรง มการเคลอนทอยภายในพชอยางสม าเสมอและสามารถแพรกระจายไปยงยอดออนของพชทแตก ออกมาใหมไดอยางรวดเรว และในการคดเลอกสายพนธ ทเหมาะสมกบสภาวะแวดลอมทจะน ามาใชในการปองกน เพราะเชอซตรสทรสเตซาไวรสบางสายพนธเจรญไดดในเขตอบอน แตบางสายพนธชอบอณหภมต า และควรเลอกสายพนธออนทมอตราการถายทอดหรอแพรกระจายเชอสงโดยแมลงพาหะเพลยออน (Mooney et al., 1994)

วตถประสงค

1. เพอแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรส (CTV) ใหไดเชอสายพนธเดยว โดยใชแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida) 2. เพอจ าแนกเชอสายพนธออนโดยประเมนจากอาการทเชอชกน าใหเกดขนบนพชทดสอบ

3. เพอจ าแนกเชอสายพนธออนโดยประเมนจากแบบแผนอารเอฟแอลพ (RFLP profile) ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตนของเชอ

4. เพอทดสอบคณสมบตในการเพมขยายพนธในพชอาศย และอตราการถายทอดโดยแมลงพาหะของเชอไวรสสายพนธออน

12

บทท 2

วสด อปกรณและวธการ 1. วสด อปกรณ

1.1 วสดปลก - กระถางปลกตนไม

- ดนผสม - ป ยคอก - ป ยออสโมโคท

1.2 กรงเลยงแมลง 1.3 สารเคม

- Absolute Ethanol - Chloroform - Ethidium bromide - Isopropanol - Isoamyl alcohol - Sodium dodecyl sulfate (SDS) - CF11 cellulose powder - Sodium acetate - สารเคมทใชในการเตรยม TBE Buffer (รายละเอยดการเตรยมอยใน ภาคผนวก) - สารเคมในการเตรยม Loading dye (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมส าหรบปฏกรยาอารทพซอาร (RT-PCR reagent mixture) Sterile deionized water Primer จ าเพาะตอยน P25 Primer จ าเพาะตอยน P27

13

Reverse transcriptase (Super script III) Taq polymerase Taq polymerase buffer Magnesium chloride (MgCl2) dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Mineral oil

- สารเคมส าหรบปฏกรยา RFLP (RFLP reagent mix) Sterile deionized water 10×Buffer B Bovine serum albumin (BSA) Enzyme Hin f I - สารเคมทใชเตรยม Polyacrylamide gel (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมทใชเตรยม Agarose gel (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมทใชเตรยม STE (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมทใชเตรยม Phenol Hydroxyquinoline Tris-Cl Mercaptoethanol - สารเคมทใชเตรยม Coating buffer (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมทใชเตรยม Phosphate buffer saline (PBS) (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมทใชเตรยม Washing buffer (PBS-T) (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมทใชเตรยม Conjugate buffer (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก)

14

- สารเคมทใชเตรยม Substrate buffer (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก) - สารเคมทใชเตรยม Reaction stopping solution (รายละเอยดการเตรยมอยในภาคผนวก)

1.4 พชทใชในการทดลอง 1.4.1 พชทดสอบ พชทดสอบของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทใชในงานทดลอง ประกอบดวย มะนาว (Citrus aurantifolia (Christm.) Swing.) สมโอ (Citrus grandis (L.) Osbeck) และเกรฟรท (Citrus paradisi Macfad.) น าเมลดพนธของพชทดสอบแตละชนดมาเพาะในกระบะเพาะจนไดตนกลาอาย 2 เดอน แลวยายปลกในกระถางเปนตนเดยวๆ แลวน าไปเลยงในโรงเรอนตาขายปองกนแมลง ใหป ยออสโมโคท (15-15-15) ประมาณ 10-15 กรม ทกเดอน และใหน าอยางสม าเสมอ เมอตนกลาอายประมาณ 4 เดอน หลงจากยายปลกลงในกระถาง สามารถน ามาใชในการทดลองตอไป 1.4.2 พชทใชเลยงแมลงพาหะ ใชตนกลาสมจด (Citrus mitis) ปลอดโรคอาย 6-12 เดอนซงไดจากการเพาะเมลด และยายปลกในกระถางเปนตนเดยว และปลกเลยงในโรงเรอนตาขายปองกนแมลง ซงบ ารงดแลรกษาเชน เดยวกบพชทดสอบ

1.5 พชตดเชอทใชเปนแหลงของเชอซตรสทรสเตซาไวรส ในการทดลองใชมะนาว SM4 และ สมโอ DAT4-5 ซงตดเชอ CTV ในแปลงปลก โดยมะนาว SM4 ไดรบความอนเคราะหจากโครงการวจยการพฒนาวธการทางเซรมวทยาเพอวนจฉยโรคทรสเตซาของสมในประเทศไทย และสมโอ DAT4-5 จากสวนของนายส าเรจ กลคง ตงอยเลขท 65 ม. 15 ต. คลองนอย ในเขตลมน าปากพนง จงหวดนครศรธรรมราช มะนาว SM4 มอาการเสนใบใสระดบปานกลางเพยงอยางเดยว ขณะทสมโอ DAT4-5 มอาการใบเหลอง กงแหงจากปลายยอด แคระแกรนและทรดโทรม

1.6 แมลงทใชในการทดลอง จบเพลยออนสมสน าตาล Toxoptera citricida (Kirkaldy) จากธรรมชาตบรเวณแปลงทดลองภาควชาพชศาสตร คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลย สงขลานครนทร แลวน ามาเลยงบนตนกลาสมจด (C. mitis) ปลอดโรคซงปลกจากเมลดทม

15

ยอดออน โดยเลยงตวเตมวยของเพลยออนสมสน าตาลทจบจากธรรมชาตเมอไดตวออนระยะท 1 รนท 1 ยายไปเลยงบนตนกลาปลอดโรคตนใหมตนท 2 เมอไดตวออนระยะท 1 รนท 2 ยายไปเลยงบนตนกลาปลอดโรคตนใหมตนท 3 จนไดตวออนรนท 3 ถอเปนเพลยออนสมทปลอดโรค หลงจากนนเลยงเพลยออนบนตนกลาสมจดเพอเพมปรมาณไปเรอยๆ ใหไดจ านวนตวเตมวยตามทตองการ เพอน าไปใชในการทดลองตอไป

1.7 อปกรณในหองปฏบตการ - เครองหมนเหวยง (microfuge) - เครอง ELISA Reader - เครอง incubator - เครอง electrophoresis - เครอง power generator - เครอง Gel Document - ไมโครปเปตต - ครกบด

- Microtube - Pasture pipette - Pipettes tip - Graduate pipette 2. เทคนคทใชในการทดลอง

2.1 เทคนคการท าบรสทธซตรสทรสเตซาไวรส การท าบรสทธทรสเตซาไวรส ไดดดแปลงจาก Bar – Joseph และคณะ

(1985) โดยมขนตอนดงน น า 40 กรม ของเปลอกเขยวของล าตนสมมาบดในครกทมไนโตรเจนเหลว (Liquid N2) จนเปนผงละเอยด แลวน าผงทบดไดไปละลาย (thaw) ใน 0.1 M Tris-HCl buffer pH 7.8 (อตราสวนของผงเปลอกตอบฟเฟอร เปน 1 กรม : 5 มลลลตร) จากนนบดในครกนาน 5 นาท น าของเหลวทไดมากรองผานผากรอง 4 ชน และชนบนปดทบดวยกระดาษ Kimwipe แลวน ากากทคางอยบนผากรองมาละลายใน 0.1 M Tris-HCl ซ าอกครง น าของเหลวทกรองไดทงสองครงรวมกน จากนนน าไปหมนเหวยงท 5,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท เกบ ของเหลวทผานการหมนเหวยง (Supernatant) มาหมนเหวยง ท 6,000 รอบตอนาท นาน 8 นาท

16

ทงตะกอน (pellet) เกบของเหลวมากรองผานกระดาษกรองเบอร 4 เตม 20 มลลลตร ของ 30 เปอรเซนต (w/v) Polyethylene glycol (PEG Mw 6000) ซงละลายอยใน 0.6 N NaCl และ 2 มลลลตร ของ 20 เปอรเซนต (w/v) NaCl ตอทก 100 มลลลตร ของเหลวทกรองได กวนใหสวนผสมเขากน บมไว 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30-60 นาท หมนเหวยงท 6,000 รอบตอนาท นาน 45 นาท (ใช Beckman UC rotor 50.2 Ti ท 14,500 รอบตอนาท 15 นาท) เกบตะกอนแลวน ามาละลาย (resuspend) ใน 0.04 M sodium phosphate buffer pH 8.2 ปรมาตร 8 หรอ 25 มลลลตร คนใหละลายอยางเบาๆ ท 4องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง แลวเกบไวในต เยนคางคน (4 องศาเซลเซยส) น า suspension มาหมนเหวยงท 5,700 รอบตอนาท นาน 10 นาท ท 4 องศาเซลเซยส (angle head , Cool Spin Centrifuge) เกบของเหลวซงถอเปน partially purified viral extract เตม PEG 6000 และ NaCl ใหมความเขมขน 4 เปอรเซนต และ 2 เปอรเซนต ตามล าดบ (0.08 กรม PEG กบ 200 ไมโครลตร 20 เปอรเซนต NaCl เมอใช supernatant 2 มลลลตร) คนท 4 องศาเซลเซยส 1 ชวโมง แลวหมนเหวยงท 6,000 รอบตอนาท นาน 45 นาท เกบตะกอนมาละลายดวย 0.015 M Sodium phosphate pH 8.2 ปรมาตร 1.5 มลลลตร คนประมาณ 15 นาท แลว หมนเหวยงท 3,500 รอบตอนาท นาน 10 นาท เกบของเหลวไปอานคาดดกลนแสงท 280 และ 260 นาโนเมตร

2.2 เทคนคการสกดอารเอนเอสายค (double stranded RNA) การสกดอารเอนเอสายคดดแปลงจาก Dodd (1993) โดยมขนตอนดงน

บดเปลอกทลอกจากกงของสมหนก 5 กรม ดวยไนโตรเจนเหลวจนละเอยดเปนผง เตมบฟเฟอร (STE 20 มลลลตร, Phenol 10 มลลลตร, Chloroform 10 มลลลตร และ SDS 5 เปอรเซนต 10 มลลลตร) ปรมาตร 50 มลลลตร แลวคนใหเขากนเปนเวลา 30 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส น าสวนผสมมาหมนเหวยงทความเรวรอบ 6,500 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เกบของเหลว ทงตะกอน เตม Ethyl alcohol 95 เปอรเซนต จนไดความเขมขนของแอลกอฮอล 16.5 เปอรเซนต จากนนใส CF 11 หนก 2.5 กรม น าไปคนนาน 15 นาท ทอณหภมหอง จากนนน าสวนผสมบรรจลงในกระบอกฉดยาขนาด 20 มลลลตร ทงไว 5 นาท จนกระทง CF 11 ตกลงมาและจบตวเปนคอลมน ลางคอลมนดวยบฟเฟอร (STE ทมสวนผสมของแอลกอฮอล 16.5 เปอรเซนต) ปรมาตร 300 มลลลตร ชะเอา ds RNA ซงจบอยบนเมด CF 11 ดวยบฟเฟอร (STE) ทปราศจากแอลกอฮอลปรมาตร 15 มลลลตร เกบบฟเฟอรทใชชะ ds RNA ออกจาก CF11 คราวละ 5 มลลลตร 3 ครง จากนนน าบพเฟอรทเกบไดแตละครงไปอานคาดดกลน

17

แสงทคลนแสง 254 นาโนเมตร (OD 254) เพอตรวจหา ds RNA น าบฟเฟอรทตรวจพบ ds RNA (10 มลลลตร) ไปตกตะกอนดวย Ethyl alcohol 95 เปอรเซนต (25 มลลลตร) และ Sodium acetate เขมขน 3 M pH 5.5 (1.75 มลลลตร) แลวบมทอณหภม –20 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง จากนนน าไปหมนเหวยง ทความเรวรอบ 7,000 รอบตอนาท นาน 30 นาท เกบตะกอนของ ds RNA เทของเหลวทง ลาง ds RNA ดวย Ethyl alcohol 70 เปอรเซนต โดยเตมแอลกอฮอล 0.5 มลลลตร ลงในหลอดแลวหมนเหวยง 5 นาท ทความเรวรอบ 7,000 รอบตอนาท เทแอลกอฮอลทง แลวน า ds RNA ทไดไปท าใหแหงในโถแหง (dessicator) ท าการดดความชนออกในสภาพสญญากาศนาน 15-20 นาท ละลาย ds RNA ดวยน า (sterile deionized water) ปรมาตร 10 ไมโครลตร น าไปแชแขงทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

2.3 การเพมขยายรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25gene) ของเชอซตรสทรสเตซาไวรส ดวยเทคนค RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

น าอารเอนเอสายคทสกดไดมาเปนเบาพมพในการเพมขยาย P25 gene โดยเทคนค RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) โดยใชไพรเมอรจ าเพาะตอ P25 gene (forward 5’- ATGGACGACGAAACAAAGAAATTG- 3’ และ (reverse 5’-CATCAACGTGTGTTGAATTTCCCA-3’) ตามขนตอนทดดแปลงจาก van der Vyver และคณะ (2002) โดยมขนตอนดงน เตม ds RNA ซงสกดไดจากตวอยางโรคปรมาตร 2 ไมโครลตร ลงในสวนผสมของไพรเมอร (P25 gene) 0.4 ไมโครโมล ปรมาตร 2 ไมโครลตร และน า (sterile deionized water) 1 ไมโครลตร บมสวนผสมทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท เพอแยกสาย RNA (denature) ครบเวลาแชสวนผสมในน าแขงนาน 5 นาท จากนนบมไวทอณหภมหอง 30 นาท น าสวนผสมของ RNA และไพรเมอรผสมเขากบสวนผสมปฏกรยาพซอาร (PCR reaction mixture) ปรมาตร 20 ไมโครลตร รวมเปนปรมาตรทงสน 25 ไมโครลตร น าสวนผสมดงกลาวเขาเครอง PCR thermal cycler ซงมอณหภมรอบ ดงน

Reverse transcription step 50C 30 min.

Amplification 1 cycle 94C 2 min.

50C 40 sec.

68C 1 min.

35 cycle 95C 30 sec.

50C 40 sec.

18

68C 1 min.

1 cycle 94C 30 sec.

50C 40 min.

68C 5 min.

ตรวจหาผลผลตดเอนเอของสารพนธกรรม P25 ซงไดจากปฏกรยา อารทพซอาร อเลคโตรโฟรซสในเจล (Agarose gel) 1.5 เปอรเซนต โดยใช Agarose 0.45 กรม ละลายใน แลวหลอมละลายดวยความรอนโดยใชเตาไมโครเวฟ ) et ประกอบแลว ตงทงไว หลงจากนนผสมผลผลตดเอนเอ (RT-PCR product) 5 ไมโครลตร เขากบบฟเฟอร (loading buffer) 1 ไมโครลตร แลวน าไปหมนเหวยง ลงในเจล ตามล าดบ โดยชองแรกของเจลจะใส 1 kb DNA Ladd ) ฐ ท าการ ความตางศกยไฟฟาท ในการผลกใหโมเลกลของดเอนเอเคลอนท หลงจากนนตรวจดผลผลตดเอนเอดวยเครอง Transilluminator โดยใชคลนแสง 300 นาโนเมตร แลวถายภาพการเรองแสงของผลผลตดเอนเอ

2.4 การตดรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน 5

น าผลผลตอารทพซอาร คอดเอนเอของรหสพนธกรรม P25 ปรมาตร 5 ไมโครลตร มาตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I (Promega, USA) โดยใชความเขมขนของเอนไซมตามค าแนะน าของบรษทผผลต ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนน าดเอนเอทถกตดไปตรวจดวยเทคนคอเลคโตรโฟรซส โดยใชเจล (ultra pure agarose) เขมขน 3 เปอรเซนต ก าลงไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 1 ชวโมง 30 นาท แลวยอมดวย ethidium bromide เขมขน 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร แลวตรวจดแบบแผนอารเอฟแอลพทไดจากการตดดวยเครอง Transilluminator โดยใชคลนแสง 300 นาโนเมตร และถายภาพแบบแผนอารเอฟแอลพของเชอแตละสายพนธดวยเครอง Gel Documentation

19

2.5 การตรวจหาเชอ CTV โดยเทคนค ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

การตรวจหาเชอ CTV ดวยเทคนค ELISA ไดดดแปลงจาก Roistacher (1991) มขนตอนดงน น าเสนกลางใบของพชทดสอบ พชปกต (healthy control) และพชทเปนโรคทรสเตซา (positive control) มาหนเปนชนเลกๆ แลวน ามาบดใน coating buffer ในอตรา เนอเยอพช : บฟเฟอร เทากบ 1:10 จนไดน าคน (sap extract) น าน าคนทไดบรรจใสหลอดแลวน าไปหมนเหวยงดวยเครอง microfuge ทความเรวรอบ 7,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท จากนนดดของเหลวสวนบนใสในไมโครไตเตอรเพลต (microtiterplate) ตวอยางละ 2 หลมๆ ละ 200 ไมโครลตร ใชพาราฟลมปดดานบนของไมโครเพลต แลวน าไปบมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 คน เมอครบก าหนดเวลาเทน าคนทงแลวลางดวย washing buffer (PBS-T) 5 ครง โดยแชทงไวครงละ 3 นาท จากนนใส Blocking solution (bovine serum albumin, BSA) เขมขน 2เปอรเซนต หลมละ 200 ไมโครลตร ปดดวยพาราฟลม แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบเวลาเทของเหลวทงแลวลางดวย washing buffer 5 ครงๆ ละ 3 นาท จากนนใสแอนตเซรมของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทเจอจางดวย conjugate buffer ทมความเขมขน 2 ไมโครกรมตอมลลลตร หลมละ 200 ไมโครลตร ปดดวยพาราฟลม แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบเวลาเทของเหลวทงแลวลางดวย washing buffer 5 ครงๆ ละ 3 นาท จากนนใสเอนไซม GAR-AP (goat antirabbit conjugate with alkaline phosphatase, Sigma-Aldrich Pte Ltd.) ทเจอจางดวย conjugate buffer ในอตรา 1:4,000 หลมละ 200 ไมโครลตร ปดดวยพาราฟลม แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบเวลาเทของเหลวทงแลวลางดวย washing buffer ครงๆ ละ 3 นาท จากนนใส substrate (p-nitrophenyl phosphate) ทมความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร ทเจอจางดวย substrate buffer หลมละ 200 ไมโครลตร ปดดวยพาราฟลม แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบเวลาน ามาใสโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) เขมขน 3 โมลาร ซงเปนตวหยดปฏกรยาเอนไซม (stopping reagent) หลมละ 50 ไมโครลตร แลวน าไปอานคาดดกลนแสง ทความยาวคลนแสง 405 นาโนเมตร (OD 405) ดวยเครอง ELISA Reader การตรวจเชอในแตละตวอยางท า 2 ซ า และมมะนาวปกต (healthy control) และมะนาวตดเชอ ซตรสทรสเตซาไวรส (positive control) เปนชดควบคม

20

3. วธการด าเนนการ

3.1 การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงพาหะเพลยออน น าแมลงพาหะเพลยออน T. citricida ทเลยงจนเปนโคโลนปลอดเชอ

ไวรส (virus-free aphid) (ภาพท 2) โดยใชจ านวนแมลงใหมากเกนพอทจะใชในการถายทอดประมาณ 2 เทา แลวน าแมลงไปปลอยใหดดกนมะนาว SM4 และสมโอ DAT4-5 ทตดเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสในแปลงปลก เปนเวลา 24 ชวโมง (ภาพท 3) จากนนยายแมลงไปดดกนพชทดสอบมะนาวปลอดเชอทไดจากการเพาะเมลดแลวน าถงพลาสตกใสมาครอบพชทดสอบแตละตนเพอไมใหเกดการเคลอนยายของเพลยออนไปยงพชทดสอบตนอนเปนเวลา 24 ชวโมง เพอถายเชอ (ภาพท 4) เมอครบ 24 ชวโมงฉดพนสารเคมท าลายเพลยออน (คาราเต อตรา 0.75 ซซ. ตอน า 0.5 ลตร) ในการทดลองใชตวเตมวยของเพลยออน 1 ตวตอตนพชทดสอบมะนาวปกต (single aphid transmission) โดยท า 20 ซ าตอไอโซเลทของเชอ ตรวจหาเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยเทคนค ELISA ในพชทดสอบมะนาว 8 สปดาห ภายหลงการแยกเชอโดยแมลง ตามวธการของ Roistacher (1991) โดยใชโพลโคลนอลแอนตบอดของเชอซตรสทรสเตซาไวรส ซงไดรบความอนเคราะหจากโครงการวจยการพฒนาวธการทางเซรมวทยาเพอวนจฉยโรคทรสเตซาของสมในประเทศไทย และประเมนความรนแรงของอาการบนพชทดสอบทตดเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยการตดตามลกษณะอาการ และวดความสงของล าตนบนพชทดสอบภายหลงการปลกเชอทกเดอนเปนเวลา

21

ภาพท 2 ตวเตมวยของแมลง Toxoptera citricida (Kirkaldy) จบจากตนสมตามธรรมชาตแลว

น ามาเลยงบนตนกลาสมจด (Citrus mitis) ปลอดโรคซงปลกจากเมลด ภาพท 3 Toxoptera citricida (Kirkaldy) ดดกนมะนาว SM4 ตดเชอ CTV ในแปลง

ปลก (ลกศร) เพอรบเชอ CTV

22

ก

ภาพท 4 Toxoptera citricida (Kirkaldy) ดดกนพชทดสอบมะนาว เพอถายเชอ CTV ก. แมลงพาหะหนงตวตอพชทดสอบ (ลกศร) ข. แมลงพาหะดดกนพชทดสอบเพอถายเชอ 24 ชวโมง ในกรงเลยงแมลง

ข

23

3.2 การจ าแนกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนโดยใชลกษณะอาการบนพชทดสอบ

น าเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดโดยแมลงพาหะมาจ าแนกสายพนธโดยการปลกเชอลงในตนกลาของพชทดสอบ 3 ชนด คอ มะนาว (C.aurantifolia) สมโอ (C. grandis (L.) Osbeck) และเกรฟรท (C. paradisi) โดยวธ Leaf grafting (Roistacher, 1991) (ภาพท 5) โดยการน าทเจาะกระดาษมาเจาะใบพชตนสอบตนทรบเชอใหมเสนกลางใบอยตรงกลางเพอเอาเนอเยอทเจาะทงแลวน าเทปกาวใสมาปดทบบรเวณดานลางของใบรบเชอ จากนนเจาะตนทใหเชอใหมเสนกลางใบอยตรงกลาง จากนนน าเนอเยอจากตนทใหเชอไปทาบลงบนใบทรบเชอโดยใหเสนกลางใบเชอมตดกน แลใชเทปกาวใสปดทบบรเวณดานบน ท าการปลกเชอ 5 ใบตอตน และท าซ า 4 ตนตอชนดพชทดสอบ และมตนกลาของพชทดสอบทไมรบการปลกเชอแตละชนดๆ ละ 4 ตน เปนชดควบคม ตรวจหาเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยเทคนค ELISA ภายกลงการปลกเชอ 2 และ 6 เดอน ตดตามลกษณะอาการบนพชทดสอบภายหลงการปลกเชอทกเดอนเปนเวลา 12 เดอน วดความสงของล าตนของพชทดสอบทไดรบการปลกเชอ โดยวดจากระดบ 5 เซนตเมตร เหนอผวดนถงปลายยอดสดของล าตนหลก ท าการวดความสงทกเดอนภายหลงการปลกเชอเปนเวลา 12 เดอน แลวน าลกษณะอาการและการเจรญเตบโตทางดานความสงของพชทดสอบทตดเชอแตละไอโซเลทมาใชจ าแนกสายพนธ

24

ภาพท 5 การปลกเชอ CTV ลงในพชทดสอบ โดยใชเทคนค leaf grafting

25

โดยการประเมนอาการทางใบซงประกอบดวยอาการเสนใบใส (Vein clearing), อาการเสนใบแตก (Vein corking) และอาการใบถวย (Leaf cupping) โดยการสมใบของพชทดสอบเอาใบเพสลาดใบท 4-7 โดยนบจากปลายยอด จ านวน 4 ใบตอตน นบจ านวนขดใสทปรากฏบนใบทง 4 ใบ แลวใหระดบความรนแรงของอาการ 6 ระดบ ตามอาการทปรากฏ (Figueroa et al., 2009) ดงแสดงในตารางท 1 ตารางท 1 การใหคะแนนระดบความรนแรงของอาการทางใบ

ระดบ อาการ คะแนน 0 1 2 3 4 5

ไมพบอาการ (no reaction) พบอาการนอยมาก (very mild) พบขดใส 1-20 ขด พบอาการนอย (mild) พบขดใส 21-40 ขด พบอาการปานกลาง (moderate) พบขดใส 41-60 ขด พบอาการรนแรง (severe) พบขดใส 61-80 ขด พบอาการรนแรงมาก (very severe) พบขดใส 81 ขดขนไป

0 1 2 3 4 5

การประเมนอาการทางล า ตนอาการล า ตนบม )

) ากฏบนกงทมความยาว 5 เซนตเมตร โดยสมเกบมา 4 กง รอบทรงพม ตามจ านวนรองทปรากฏบนกง (Corazza-Nunes et al., 2006) ดงแสดงในตารางท 2

ตารางท 2 การใหคะแนนระดบความรนแรงของอาการทางล าตน

ระดบ อาการ คะแนน 0 1 2 3 4 5

ไมพบรองบม (no reaction) พบรองบม - พบรองบม - พบรองบม - พบรองบม - พบรองบมทวทงกง

0 1 2 3 4 5

26

จากนนรวมระดบความรนแรงของอาการทกประเภทในพชทดสอบแตละชนด ประเมนผลโดยรวมของระดบความรนแรงของเชอแตละสายพนธ ผลรวมของระดบความรนแรงทต ากวา 20 คะแนน จดเปนสายพนธออน (Figueroa et al., 2009)

3.3 การจ าแนกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนดวยแบบแผนอารเอฟแอลพ (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25

วเคราะหแบบแผน RFLP โดยน าแบบแผน RFLP ของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดจ านวน 7 แบงเปนไอโซเลททแยกโดยแมลงพาหะซงเปนผลของการทดลองในขอ 1 จ านวน 3 ไอโซเลท โดยวธ leaf grafting 3 ไอโซเลท และเชอซตรสทรสเตซาไวรสทปรากฏในมะนาวเปนโรคทรสเตซาในแปลงปลก ) มาจ าแนกสายพนธโดยเปรยบเทยบกบแบบแผน RFLP ทรายงานโดย ) ภาพ 6 ดงน คอแบบแผน RFLP ของกลมท 1, 3 และ 6 เปนแบบแผนของสายพนธ severe (T36, T3, Bla) กลมท 2 และ 7 เปนแบบแผนของสายพนธ moderate (PB14, B6) และกลมท 4 และ 5 เปนแบบแผนของสายพนธ mild (T4, PB5)

ภาพท 6 แสดงแบบแผน RFLP ทไดจากการตดดเอนเอของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน 5 Hinf I ของเชอ CTV สายพนธตางประเทศ รายงานโดย Gillings 1993)

27

3.4 การทดสอบคณสมบตทางชววทยาของเชอซตรสทรสเตซาไวรส สายพนธออน

3.4.1 คณสมบตในการแพรกระจายโดยแมลงพาหะ

ท าการทดลองถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนทจ าแนกไดจากขอ 9.2 และ 9.3 โดยน าแมลงพาหะเพลยออน T. citricida ทเลยงจนเปนโคโลนปลอดเชอไวรส (virus-free aphid) ไปดดกนตนมะนาวทตดเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนดงกลาวเปนเวลา 24 ชวโมง จากนนยายแมลงไปดดกนพชทดสอบมะนาวเปนเวลา 24 ชวโมง แลวฉดพนสารเคมท าลายเพลยออน ในการทดลองใชเพลยออน 1 ตวตอตน (single aphid transmission) โดยท า 20 ซ าตอสายพนธของเชอ โดยมชดควบคมเปนพชทดสอบทถกดดกนดวยแมลงพาหะปลอดเชอไวรส ตรวจหาเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยเทคนค ELISA ในพชทดสอบ 8 สปดาห หลงการถายทอดเชอโดยแมลง ประเมนประสทธภาพในการถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนจากอตราการถายทอดเชอ (Broadbent et al., 1996)

อตราการถายทอดเชอ = จ านวนพชทตดเชอ × 100 จ านวนพชทงหมดทถกดดกนโดยแมลงพาหะ

3.4.2 คณสมบตในการเพมปรมาณของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในพชทดสอบ แยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสใหบรสทธ (Purification) จากเปลอกเขยว (bark) ของมะนาวทตดเชอไอโซเลท SM4 โดยวธการของ Bar-Joseph และคณะ (1985) โดยใชเนอเยอ 10 กรม น าเชอบรสทธทไดไปอานคาดดกลนแสงท 280 และ 260 นาโนเมตร แลวน าคาดดกลนแสงมาค านวณหาความเขมขนของไวรสบรสทธทเตรยมได (Bar-Joseph et al., 1985) จากนนเจอจางไวรสบรสทธใหมความเขมขน 0.001, 0.01, 0.1 และ 1 มลลกรมตอมลลลตร น าเชอบรสทธในแตละความเขมขนไปตรวจหาเชอดวยเทคนค ELISA น าคา OD 405 ทไดในแตละความเขมขนมาสรางกราฟความเขมขนมาตรฐานของเชอซตรสทรสเตซาไวรส ท าการตรวจหาปรมาณความเขมขนของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนทจ าแนกไดจากขอ 9.2 และ 9.3 ในน าคนจากเนอเยอของพชทดสอบมะนาวโดยเทคนค ELISA ใชเนอเยอ (bark) ทตดเชอจากยอดทแตกใหมอาย 1 เดอน จ านวน 3 ยอดตอตนมาหนเปนชนเลกๆ แลวน ามาบดใน coating buffer ในอตรา เนอเยอพช : บฟเฟอร เทากบ 1 : 10

28

จนไดน าคน (sap extract) โดยตรวจ 3 ตนตอสายพนธเชอ จากนนน าคาปฏกรยา ELISA ของเชอ (OD 405) ไปเทยบหาความเขมขนจากกราฟมาตรฐาน เพอประเมนความสามารถในการเพมขยายปรมาณของเชอในเนอเยอของพชทดสอบจากคาความเขมขนของไวรสทตรวจวดไดจากปฏกรยา ELISA

29

บทท 3

ผลการศกษา 1. การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงพาหะเพลยออน

ผลการแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรส

ากแมลงโดยมแหลงเชอจากมะนาว SM4 ละสมโอ DAT4-5 ตดเชอซตรสทรสเตซาไวรส ชอซตรสทรสเตซาไวรส (ตารางท 4) SM -P4, SM4-P5, SM4-P9, SM4-P10 และ DAT4-5-P15 ท าใหเกดอาการเสนใบใสเพยงเลกนอยถงปานกลาง (ภาพท 7) และท าใหความสงเฉลยตอเดอนของพชทดสอบลดลง 17-20 เปอรเซนต เมอเปรยบเทยบกบพชปกต ขณะทไอโซเลท SM4-P15 SM4-P19 ใหอาการเสนใบใสระดบปานกลางถงรนแรง ความสงของพชทดสอบลดลง 10-20 เปอรเซนต และ SM4-P19 ใหอาการล าตนบมระดบเลกนอย กลม ไอโซเลททใหอาการระดบรนแรงคอ SM4-P2, DAT4-5-P2, DAT4-5-P5, DAT4-5-P8 - - งรนแรง นอกจากนพบอาการล าตนบม (ภาพท 8) SM4-P2, SM4- 9 -5-P8 ตามล าดบ ส าหรบเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดในกลมนท าใหความสงของพชลดต ากวา 50 เปอรเซนต จากความแตกตางของลกษณะอาการทเกดขนบนพชทดสอบท าใหประเมนในเบองตนวาอาจแยกสายพนธ เชอซตรสทรสเตซาไวรสทตดเชอรวมกนออกเปน สายพนธเดยว และพบวาไอโซเลท SM4-P4, SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 เสน 7)

30

ตารางท 3 แสดงผลการตรวจพบเชอ CTV ELIS นพชทดสอบมะนาวซงรบการถายเชอจากแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida)

แหลงเชอ ล าดบพชทดสอบ ELISA1/

OD405 ( X ±SD) มะนาว SM4 สมโอ DAT4-5

SM4-1 SM4-2 SM4-3 SM4-4 SM4-5 SM4-6 SM4-7 SM4-8 SM4-9 SM4-10 SM4-11 SM4-12 SM4-13 SM4-14 SM4-15 SM4-16 SM4-17 SM4-18 SM4-19 SM4-20 DAT4-5-1 DAT4-5-2 DAT4-5-3 DAT4-5-4 DAT4-5-5 DAT4-5-6 DAT4-5-7 DAT4-5-8 DAT4-5-9 DAT4-5-10 DAT4-5-11 DAT4-5-12 DAT4-5-13 DAT4-5-14 DAT4-5-15 DAT4-5-16 DAT4-5-17 DAT4-5-18 DAT4-5-19 DAT4-5-20

0.037±0.030 0.155±0.067 0.014±0.003 0.127±0.012 0.148±0.012 0.007±0.001 0.016±0.003 0.021±0.004 0.146±0.019 0.112±0.028 0.026±0.052 0.062±0.018 0.025±0.018 0.047±0.009 2.660±0.013 0.062±0.071 0.052±0.018 0.048±0.014 3.523±0.002 0.155±0.007 0.057±0.011 4.000±0.000 0.041±0.006 0.045±0.003 3.461±0.032 0.043±0.205 0.041±0.019 3.598±0.006 0.030±0.016 1.937±0.024 0.040±0.000 0.060±0.011 0.049±0.035 0.019±0.014 2.785±0.141 0.033±0.012 0.053±0.018 0.059±0.040 0.027±0.008 0.032±0.021

1/ คา OD405 ( X SD) ของตนกลามะนาวทไดรบการถายเชอสงเปน 2 เทาของคาดดกลนแสงของปฏกรยา ELISA จากใบมะนาวปกต

( X SD=0.0340.011) ถอเปนปฏกรยาบวก (ตรวจพบเชอทรสเตซาไวรส)

31

ตารางท 4 ลกษณะอาการของพชทดสอบมะนาวซงเกดจากการตดเชอ CTV ไอโซเลททแยกไดโดยใชแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล

ไอโซเลท อาการของพชทดสอบมะนาว1/ ความสงเฉลย/ 2/

(ซม) ความสงลดลง3/

(%) VC Y SP SM4-P2 SM4-P4 SM4-P5 SM4-P9 SM4-P10 SM4-P15 SM4-P19 DAT4-5-P2 DAT4-5-P5 DAT4-5-P8 DAT4-5-P10 DAT4-5-P15

3 1 1 1 2 3 2 3 3 2 2 2

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

1.9 2.4 2.3 2.4 2.3 2.3 2.7 1.5 1.5 1.6 1.7 2.4

34.5 17.2 20.7 17.2 20.7 20.7 6.9

48.3 48.3 44.8 41.4 17.2

1/ คะแนนความรนแรงของอาการ VC = Vein Clearing 0=ไมพบอาการ, 1=อาการนอยมาก (1-20 ขด), 2=อาการนอย (21-40 ขด), 3=ปานกลาง (41-60 ขด), 4=รนแรง (61-80 ขด), 5= รนแรงมาก (>80 ขด), Y = Yellow Leaf 0=ไมพบอาการ, 1=อาการนอยมาก ,SP = Stem Pitting 0=ไมพบอาการ, 1= พบรองบม 1-15 รอง

2/ ความสงเฉลยพชทดสอบมะนาวตดเชอ CTV เฉลยจาก 6 เดอนหลงการตดเชอ 3/ เปอรเซนความสงทลดลงของพชทดสอบมะนาวตดเชอ CTV เมอเปรยบเทยบกบความสงของ

มะนาวปกต (ความสงเฉลยของมะนาวปกต 3 ตน คอ 2.9 ซมตอเดอน)

32

ภาพท 7 อาการเสนใบใสบนพชทดสอบมะนาว

ก) มะนาวปกต ข) มะนาวไอโซเลท SM4-P4

ข

ก

33

ภาพท 8 อาการรองบมบนพชทดสอบมะนาว (ลกศร)

ก. ไอโซเลท SM4-P19 ข. มะนาวปกต

ก

ข

34

2. การจ าแนกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนโดยใชลกษณะอาการบนพชทดสอบ จากการคดเลอกเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดในขอ 1 และมแนวโนมเปน

สายพนธออนมาจ านวน 3 SM4-P5, SM4- 9 SM -P10 มาจ าแนกสายพนธโดยใชลกษณะอาการทเชอแตละไอโซเลทชกน าใหเกดขนกบพชทดสอบ 3 มะนาว (C. aurantifolia) สมโอ (C. grandis) และเกรฟรท (C. paradisi) ผลประเมนลกษณะอาการทางใบ ซงประกอบดวยอาการเสนใบใส (Vein Clearing, VC), อาการเสนใบแตก (Corky Vein, CV), L L L ตามเกณฑ ทใหไว พบวาเชอซตรสทรสเตซาไวรส ไอโซเลทท าใหเกดอาการเสนใบใสเพยงเลกนอย ( บนพชทดสอบมะนาวเทานน (ภาพท 8) แตไมกอใหเกดอาการเสนใบแตก (ภาพท 10), ทพบในไอโซเลท CmO2-1 ศ (ภาพท 10)

ในการประเมนอาการทางล าตน อาการล าตนบม (Stem Pitting, SP) พบวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทง 3 ไอโซเลทไมท าใหเกดอาการล าตนบมบนพชทดสอบทง 3 ชนด (ตารางท 5) และเมอวดความสงเฉลยทลดลงตอเดอนของเชอซตรสทรสเตซาไวรสบนพชทดสอบมะนาว เกรฟรท และสมโอ พบวาไอโซเลท SM4-P5 ลดลง 46.30 เปอรเซนต, 33.75 เปอรเซนต และ 35.48 เปอรเซนต ตามล าดบ ไอโซเลท SM4-P9 ลดลง 35.93 เปอรเซนต, 21.67 เปอรเซนต และ 33.87 เปอรเซนต ตามล าดบ และไอโซเลท SM4-P10 ลดลง 30.74 เปอรเซนต, 23.75 เปอรเซนต และ 24.19 เปอรเซนต ตามล าดบ (ตารางท 6)

เมอรวมคะแนนระดบความรนแรงของอาการทกประเภทในพชทดสอบแตละชนดผลรวมของระดบความรนแรงต ากวา 20 คะแนน (ตารางท 5) ท าใหสรปไดวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทง 3 SM - SM - 9 SM - ธออน

35

ภาพท 9 อาการเสนใบใสบนพชทดสอบมะนาว

ก. ไอโซเลท SM4-P5 ข. ไอโซเลท SM4-P9

ก ข

ค ง

36

ค. ไอโซเลท SM4-P10 ง. มะนาวปกต

ภาพท 10 ลกษณะอาการเสนใบแตก (corky vein) (yellow)

เมอตดเชอ CTV ไอโซเลท CmO2-1

37

ตารางท 5 ระดบความรนแรงของอาการทางใบและอาการทางล าตนทเชอ CTV ทแยกไดชกน าให

เกดบนพชทดสอบ

ไอโซเลท พชทดสอบ ความรนแรงของอาการ 1/

คะแนนรวม ระดบอาการ2/ VC CV CL Y SP

SM4-P5

SM4-P9

SM4-P10

มะนาว เกรฟรท สมโอ มะนาว เกรฟรท สมโอ มะนาว เกรฟรท สมโอ

3 2 2 2 3 2 1 2 3

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 2 2 2 3 2 1 2 3

1 1 1 1 1 1 1 1 1

1/ คะแนนความรนแรงของอาการ VC = Vein Clearing 0=ไมพบอาการ, 1=อาการนอยมาก (1-20 ขด), 2=อาการนอย (21-40 ขด), 3=ปานกลาง (41-60 ขด), 4=รนแรง (61-80 ขด), 5= รนแรงมาก (>80 ขด), CV = Corky Vein, CL = Cup Leaf, SP = Stem Pitting คะแนน 0=ไมพบอาการ

2/ 1= >20 คะแนน (mild strain), 2= 21-40 คะแนน (moderate strain), 3=<40 คะแนน (severe strain)

38

ตารางท 6 อตราการเจรญเตบโต (ความสง) ของพชทดสอบหลงปลกเชอซตรสทรสเตซาไวรส

สายพนธทแยกได

ไอโซเลท พชทดสอบ ความสงเฉลยตอ 1 เดอน (ซม) 1/ ความสงลดลง (%)2/

SM4-P5 SM4-P9 SM4-P10 SM4-P5 SM4-P9 SM4- P10 SM4-P5 SM4-P9 SM4- P10

มะนาว มะนาว มะนาว เกรฟรท เกรฟรท เกรฟรท สมโอ สมโอ สมโอ

1.45 1.73 1.87 1.59 1.88 1.83 1.60 1.64 1.88

46.30 35.93 30.74 33.75 21.67 23.75 35.48 33.87 24.19

1/ ความสงเฉลยพชทดสอบตดชอ CTV ลยจาก 6 2/ เปอรเซนตความสงทลดลงของพชทดสอบตดเชอ CTV เมอเปรยบเทยบกบความสงของของมะนาว, เกรฟรท และสมโอปกต จ านวน 4 ตน คอ 2.70, 2.40 และ 2.48 ซม./เดอน ตามล าดบ

3. การจ าแนกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนดวยแบบแผนอารเอฟแอลพ (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25

ผลการเพมขยายรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25 ของเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยใช ds RNA (double stranded RNA) ทสกดไดจากเนอเยอสมตดเชอซตรสทรสเตซาไวรสเปนเบาพมพโดย RT-PCR bp (ภาพท 11) เมอน าผลผลตดงกลาวมาตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I ไดแบบแผน RFLP ทแตกตางกนดงแสดงในภาพท 12 และ 13 จ านวนของชนดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมมตงแต 5 ชน จนถง 10 ชน และมขนาด 37, 42, 49, 74, 91, 170, 261, 300, 337 และ 386 bp ดงสรปไวใน ตารางท 7

ผลการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรส 3 ท ได SM ดวยแมลงพาหะและ (mild) คอ SM4-P5, SM4-P9 SM -P10 RFLP เปรยบเทยบกบแบบแผนของ

39

RFLP ซงรายงานโดย Gillings และคณะ (1993) ดงแสดงไวในตารางท 8 ทง 3ไอโซเลทใหแบบแผน RFLP ทแตกตางกน (ตารางท 9) คอไอโซเลท SM4-P5 ใหแบบแผน RFLP เหมอนกบเชอซตรสทรสเตซาไวรสในมะนาว SM4 คอมแบบแผนรวม 6 แบบแผน คอกลมแบบแผนท I (รนแรง), II (ปานกลาง), III (รนแรง), IV (ออน), VI (รนแรง) และ VII (ปานกลาง) ไอโซเลท SM4-P9 ไดแบบแผนทไมปรากฏในแบบแผน RFLP ของ Gillings และคณะ (1993) SM - I ( และ II ( นอกจากนไดมการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสไอโซเลททแยกไดโดยวธ leaf grafting จ านวน 3 ไอโซเลท พบวาไอโซเลท KS7-3 และ SM1-2 ใหแบบแผนทเหมอนกน คอ พบแบบแผนรวม 2 แบบแผน ระหวางแบบแผนท 2 (ปานกลาง) และ 7 (ปานกลาง) ไอโซเลท SM4-3 มแบบแผนรวม 3 แบบแผน คอ แบบแผนท I (รนแรง), II (ปานกลาง) และ VII (ปานกลาง)

ภาพท 11 ผลผลตดเอนเอของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ของเชอ CTV ทเพมปรมาณ

โดย RT-PCR และใชไพรเมอรจ าเพาะตอ P25 gene ชอง M ดเอนเอเปรยบเทยบ (ขนาด 1 kb) ชอง 1 ไอโซเลท SM4-P5 ชอง 2 ไอโซเลท SM4-P9 ชอง 3 ไอโซเลท SM4-P10

850 bp 1000 bp

650 bp P25 (672 bp)

M 1 2 3

40

ภาพท 12 แบบแผน RFLP ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I

ของเชอ CTV ไอโซเลททแยกโดยแมลงพาหะ ชอง M ดเอนเอเปรยบเทยบ (ขนาด 1 kb) ชอง 1 ไอโซเลท SM4-P5 ชกน าอาการออน ชอง 2 ไอโซเลท SM4-P9 ชกน าอาการออน ชอง 3 ไอโซเลท SM4-P10 ชกน าอาการออน

650 bp 400 bp

M 1 2 3

500 bp

200 bp

300 bp

100 bp

41

ภาพท 13 แบบแผน RFLP ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I

ของเชอ CTV สายเชอในธรรมชาต (ชองท 1) และไอโซเลททแยกโดยวธ leaf grafting (ชองท 2-4)

ชอง M ดเอนเอเปรยบเทยบ (ขนาด 1 kb) ชอง 1 เชอ CTV ทกอใหเกดโรคในมะนาว SM4 ชอง 2 ไอโซเลท SM4-3 ชกน าอาการออน ชอง 3 ไอโซเลท KS7-3 ชกน าอาการรนแรง ชอง 4 ไอโซเลท SM1-2 ชกน าอาการรนแรง

100 bp

200 bp

300 bp 400 bp 500 bp 650 bp

M 1 2 3 4

42

ตารางท 7 จ านวนชนและขนาดของชนดเอนเอ ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ของเชอ CTV เมอตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I

ไอโซเลท1/ จ านวนชนดเอนเอ

ขนาดของชนดเอนเอ (bp) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SM4 NI SM4-3 LG SM4-P5 A SM4-P9 A SM4-P10 A KS7-3 LG SM1-2 LG

10 9 10 5 7 7 7

386 386386 337 386 337 337

337 337337 261 337 261 261

300 300300 170 170 170 170

261 261261 91 91 91 91

170 170170 42 74 74 74

91 91 91

49 49 49

74 74 74

42 42 42

49 4949

42 4242

37

37

1/ A = ไอโซเลทแยกโดยแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาลจกางานทดลองในขอ 1

NI = เชอซตรสทรสเตซาไวรส (Natural infected CTV) LG = ไอโซเลททแยกโดยวธ leaf grafting

43

ตารางท 8 แสดงแบบแผน RFLP ทไดจากการตดดเอนเอของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25 ดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I ของเชอ CTV สายพนธตางประเทศ รายงานโดย Gillings และคณะ (1993)

สายพนธ1/

CTV ระดบความรนแรง

แบบแผน RFLP

จ านวนชนดเอนเอ

ขนาดของชนดเอนเอ (bp) 1 2 3 4 5 6

T36 PB14

T3 T4

PB5 Bla B6

Severe Moderate

Severe Mild Mild

Severe Moderate

I II III IV V VI VII

4 5 6 5 3 4 3

386 337 300 300 428300 337

170 170 170 170 170 261 261

74 74 74 91 74 74 74

42 49 49 74

37

42 42 37

37

1/ T36 สายพนธจากฟลอรดา PB14 สายพนธจากออสเตรเลย T3 สายพนธจากฟลอรดา T4 สายพนธจากฟลอรดา PB5 สายพนธจากออสเตรเลย Bla สายพนธจากเกาะรยเนยน B6 สายพนธจากแคลฟอรเนย

44

ตารางท 9 การจดกลมแบบแผน RFLP ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน (P25) ของเชอ CTV ไอโซเลทซงแยกโดยแมลงพาหะและแยกโดยวธ leaf grafting เมอตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hinf I

ไอโซเลท1/ ระดบอาการ กลมแบบแผน RFLP 2/

I II III IV V VI VII SM4 NI SM4-3 LG SM4-P5 A SM4-P9 A SM4-P10 A KS7-3 LG SM1-2 LG

Mild Mild Mild Mild Mild

Severe Severe

+ + + - + - -

+ + + - + + +

+ - + - - - -

+ - + - - - -

- - - - - - -

+ - + - - - -

+ + + - - + +

1/ A = ไอโซเลทแยกโดยแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาลจากงานทดลองในขอ 1 NI = เชอ CTV มะนาว SM4 LG = ไอโซเลททแยกโดยวธ leaf grafting

2/ กลมแบบแผน RFLP แยกตามรายงานของ Gillings และคณะ (1993) ดงแสดงไวในตารางท 8 ; + = พบแบบแผน, - = ไมพบแบบแผน

4. การทดสอบคณสมบตของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออน 4.1 คณสมบตในการแพรกระจายโดยแมลงพาหะ

จากการน าไอโซเลทของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดและเปนสายพนธออน คอ ไอโซเลท SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 มาถายเชอลงบนตนกลามะนาวโดยแมลงพาหะเพลยออนแลวตรวจเชอซตรสทรสเตซาไวรสในตนมะนาวทไดรบการถายเชอ (ตารางท 10) เพอหาอตราการถายเชอแตละไอโซเลทโดยแมลงพาหะ พบวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสไอโซเลท SM4-P5 มอตราการถายทอดเชอโดยแมลงพาหะ 75 ขณะทไอโซเลท SM4-P9 และไอโซเลท SM4-P10 มอตราการถายทอดเชอโดยแมลงพาหะเทากนคอ 70 (ตารางท 11)

45

ตารางท 10 แสดงผลการตรวจพบเชอ CTV ELISA นตนกลามะนาวทไดรบการ ถายทอดเชอ CTV สายพนธออนโดยแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida)

ไอโซเลท ล าดบพชทดสอบ ELISA

OD4051/( X ±SD) SM4-P5

SM4-P9

SM4-P10

SM4-P5-3 SM4-P5-4 SM4-P5-5 SM4-P5-6 SM4-P5-8

SM4-P5-10 SM4-P5-11 SM4-P5-12 SM4-P5-13 SM4-P5-14 SM4-P5-15 SM4-P5-16 SM4-P5-17 SM4-P5-18 SM4-P5-20 SM4-P9-2 SM4-P9-3 SM4-P9-4 SM4-P9-5 SM4-P9-6 SM4-P9-9

SM4-P9-11 SM4-P9-12 SM4-P9-13 SM4-P9-14 SM4-P9-15 SM4-P9-17 SM4-P9-18 SM4-P9-20 SM4-P10-1 SM4-P10-3 SM4-P10-5 SM4-P10-6 SM4-P10-7 SM4-P10-8 SM4-P10-10 SM4-P10-12 SM4-P10-13 SM4-P10-15 SM4-P10-16 SM4-P10-17 SM4-P10-19 SM4-P10-20

0.254±0.054 0.244±0.044 0.275±0.018 0.678±0.030 0.249±0.006 0.613±0.015 0.422±0.107 0.274±0.014 0.292±0.001 0.214±0.008 0.932±0.052 0.557±0.030 0.177±0.057 0.781±0.042 0.238±0.016 0.248±0.002 1.331±0.112 0.203±0.003 0.202±0.007 0.735±0.059 0.596±0.018 0.210±0.014 0.707±0.008 0.200±0.014 0.241±0.003 0.749±0.090 0.237±0.021 0.260±0.017 0.261±0.034 0.241±0.058 0.259±0.007 0.245±0.044 0.081±0.003 0.215±0.037 0.187±0.014 0.848±0.011 0.627±0.074 0.216±0.011 0.580±0.028 0.991±0.021 0.236±0.088 0.068±0.004 0.233±0.031

1/ คา OD405( X SD)ของตนกลามะนาวทไดรบการถายเชอสงเปน 2 เทาของคาดดกลนแสงของปฏกรยา ELISA จากใบมะนาวปกต ( X SD=0.0220.012) ถอเปนปฏกรยาบวก (ตรวจพบเชอทรสเตซาไวรส)

46

ตารางท 11 อตราการถายทอดเชอ CTV สายพนธออนโดยแมลงพาหะเพลยออนสมสน าตาล (T. citricida)1/

ไอโซเลท มะนาวตดเชอ/มะนาวทรบการถายเชอ2/ อตราการถายทอดเชอ (%)

SM4-P5 SM4-P9 SM4-P10

15/20 14/20 14/20

75 70 70

1/ น าแมลงพาหะไปดดกนตนมะนาวซงตดเชอแตละไอโซเลทนาน 24 ชวโมง เพอรบเชอ ยายแมลง

พาหะไปดดกนตนกลามะนาวนาน 24 ชวโมงเพอถายเชอโดยใชแมลงพาหะถายเชอ1 ตวตอตนกลามะนาว ใชตนกลามะนาว 20 ตนตอการถายเชอหนงไอโซเลท

2/ ตรวจการตดเชอของตนกลามะนาวทรบการถายเชอ CTV แตละไอโซเลทจากแมลงพาหะโดยเทคนค ELISA

4.2 คณสมบตในการเพมปรมาณของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในพชทดสอบ

จากการท าบรสทธเชอซตรสทรสเตซาไวรสจากตนมะนาว SM4 น าเชอบรสทธท

ไดมาเจอจางใหมความเขมขน 0.00016, 0.0008, 0.004, 0.02 และ 0.1 มลลกรมตอมลลลตร แลวน าเชอบรสธในแตละความเขมขนไปตรวจหาเชอดวยเทคนค ELISA น าคา OD 405 ทไดในแตละความเขมขนมาสรางกราฟความเขมขนมาตรฐานของเชอซตรสทรสเตซาไวรสดงผลใน ภาพท 14

47

y = 0.828x

R2 = 0.781

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6

ภาพท 14 กราฟความเขมขนมาตรฐาน (standard curve) ของเชอ CTV บรสทธ (SM4)

เมอท าการตรวจหาปรมาณความเขมขนของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนทจ าแนกได คอ SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 ในเนอเยอของพชทดสอบมะนาวโดยเทคนค ELISA ใชเนอเยอ (bark) ทตดเชอหนก 0.1 กรม จากยอดทแตกใหมอาย 1 เดอน จ านวน 3 ยอดตอตน จากนนน าคาปฏกรยา ELISA ของเชอ (OD 405) ไปเทยบหาความเขมขนจากกราฟมาตรฐาน พบวาไอโซเลท SM4-P5, SM4-P9, SM4-P10 และเชอ CTV จากมะนาว SM4 ใหปฏกรยา OD 405 1.788 และ 3.729 ตามล าดบ เมอน าปฏกรยา OD 405 ไปเทยบหาความเขมขนของเชอไวรสจากกราฟความเขมขนมาตรฐาน พบวาไอโซเลท SM4-P5, SM4-P9, SM4-P10 และ SM4 มความเขมขน 0. 64, 3.50, 0.81 และ 60.00 ไมโครกรมของเนอเยอหนงกรม ตามล าดบ (ตารางท 12) ซงหมายถงไอโซเลท SM4-P9 ขยายพนธในเนอเยอสงสดเมอเทยบกบไอโซเลท SM4-P5 SM - ซตรสทรสเตซาไวรสทพบในมะนาว SM4 ซงตดเชอ

ความเขมขนของเชอ CTV บรสทธ (µgml-1)

48

ตารางท 12 ปรมานความเขมขนของเชอ CTV ในเนอเยอพช ไอโซเลท ELISA OD405 ( X ±SD) ระดบความเขมขน (µgml-1)1/ SM4-P5 SM4-P9 SM4-P10 SM4

1.524±0.066 2.211±0.068 1.778±0.092 3.764±0.049

0.064 0.350 0.081 6.000

1/ ความเขมขนของเชอ CTV ทปรากฏในเนอเยอพช ซงไดจากการน าคาปฏกรยา ELISA OD405 เทยบหาความเขมขนของเชอ CTV จากคากราฟความเขมขนมาตรฐาน (ภาพท 14)

49

บทท 4

วจารณ 1. การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงพาหะเพลยออน

การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสดวยเพลยออน (single aphid transmission) ลงบนพชทดสอบมะนาวสามารถแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสได 12 ไอโซเลท โดยแยกมาจาก แ ล อ เ อซตรสทรสเตซาไวรสทตดเชอในแปลงปลก 2 แ ล อม า ซ อากา เ ด า กลา เ ย อย า เด ย แล มโอ DAT4-5 อากา เ ล อ ก แ จาก ลายยอด แ แก แล ท ดโท ม จากกา เม อากา บน ทด อ ม า พบวาแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสออกมาได กล ม อ กล มไอโซเลทท อากา อ อ (mild symptom) กลมไอโซเลททใหอาการปานกลาง (moderate symptom) และกลมไอโซเลททใหอาการรนแรง (severe symptom) เมอพจารณาอาการของมะนาว SM4 และสมโอ DAT4-5 ซงเปนแหลงของเชอซตรสทรสเตซาไวรสดงกลาวแลวขางตนรวมกบอาการทไอโซเลทของเชอซตรสทรสเตซาไวรสซงแยกไดจากแหลงเชอทงสองชกน าใหเกดขน าแ ล อ เ อซตรสทรสเตซาไวรสทงสอง ม กา ดเ อ มมากก า าย เนองจากไอโซเลทของไวรสทแยกไดชกน าใหเกดอาการของโรคทมระดบความรนแรงทแตกตางกน (ตารางท 4)

จากความแตกตางของลกษณะอาการทเกดขนบนพชทดสอบท าใหประเมนในเบองตนวาอาจแยกสายพนธเชอซตรสทรสเตซาไวรสทตดเชอรวมในแหลงเชอ SM4 และแหลงเชอ DAT4-5 ออกจากกนได

2. การจ าแนกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนโดยใชลกษณะอาการบนพชทดสอบ

ผลการประเมนอาการทางใบบนพชทดสอบทง 3 ชนด บงชวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทง 3 ไอโซเลท คอ SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 เปนเชอสายพนธออน เนองจากเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสทง 3 ไอโซเลทนนท าใหเกดอาการเสนใบใสเพยงเลกนอย (ระดบ 1) บนพชทดสอบมะนาวเทานน ไมพบอาการเสนใบแตก ใบถวย และอาการรองบมบนเนอไม ดงรายงานของ Ochoa และคณะ (1993) ทพบวาไอโซเลททจดอยในกลมสายพนธออนจะเกดอาการ เสนใบใสเพยงเลกนอยบนพชทดสอบ กลมปานกลาง และกลมรนแรงแสดงอาการปานกลาง

50

ถงรนแรงของอาการเตยแคระ เสนใบใส เสนใบแตก และใบถวย บนพชทดสอบมะนาว อาการ เตยแคระ และใบบดบนมาชเกรฟรท และรายงานของ Corazza-Nunes และคณะ (2006) ระบวาพชทดสอบมะนาวมความไวในการกอใหเกดอาการเสนใบใส (vein clearing), ใบมวน (leaf curling), ตนเตยแคระ (dwarfism) และรองบมในเนอไม (stem pitting)

3. การจ าแนกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนดวยแบบแผนอารเอฟแอลพ (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) ของรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25

ในการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสดวยแบบแผน RFLP โดยเปรยบเทยบกบแบบแผน RFLP ทรายงานโดย Gillings และคณะ (1993) เพอยนยนหรอพสจนสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสรวมกบลกษณะอาการทชกน าใหเกดบนพชทดสอบของ ไอโซเลททแยกโดยแมลงพาหะเพลยออนสม 3 ไอโซเลท คอ SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 การทดลองครงนพบวาไอโซเลท SM4-P5 และ SM4-P10 มแบบแผน RFLP มากกวาหนงแบบแผนอยรวมกน โดย SM4-P5 ม 6 แบบแผน (ตารางท 9) ซงเปนแบบแผนของเชอสายพนธออน สายพนธปานกลาง และสายพนธรนแรง (ตารางท 9) สรปคอไอโซเลท SM4-P5 มสายพนธไวรส 6 สายพนธรวมกน ส าหรบไอโซเลท SM4-P10 ปรากฏแบบแผน RFLP 2 แบบแผนคอแบบแผนของสายพนธรนแรงและสายพนธปานกลาง (ตารางท 9) แสดงวาไอโซเลท SM4-P10 ประกอบดวยไวรส 2 สายพนธ นอกจากนพบวาไอโซเลท SM4-P9 มแบบแผน RFLP ทไมพบในรายงานของ Gillings และคณะ (1993) ซงปรากฏการณดงกลาวนมความคลายคลงกบงานทดลองของ Zhou และคณะ (2007) ทพบวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดในประเทศจนสวนใหญมแบบแผน RFLP รวมกนมากกวาหนงแบบแผน และพบแบบแผนทแตกตางจากของ Gillings และคณะ (1993) เชนกน ส าหรบแบบแผน RFLP ทพบในไอโซเลทของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดโดยวธ leaf grafting พบแบบแผนรวมเชนเดยวกบทพบในไอโซเลทจากแมลงพาหะ ไอโซเลท SM4-3 พบ 3 แบบแผน ประกอบดวยแบบแผนของเชอสายพนธรนแรง 1 แบบแผน และของสายพนธปานกลาง 2 แบบแผน ขณะทไอโซเลท KS7-3 และ SM1-2 พบแบบแผน RFLP 2 แบบแผนของ สายพนธปานกลาง

เมอจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยใชลกษณะอาการบน พชทดสอบสรปไดวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทง ไอโซเลท อ - - แล - เ เ อ าย ธออน แตเมอจ าแนกดวยแบบแผน RFLP พบ าเ อซตรสทรสเตซาไวรสมการ ตดเชอรวมมากกวา าย ธ ดงนนการแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงพาหะเพลยออน

51

(single aphid transmission) เพยงรอบเดยวไมสามารถแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสออกมาเปนเชอสายพนธ เดยวๆ ได ดงการทดลองของ Broadbent และคณะ (1996) ไดท าการแยกเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสดวยแมลงพาหะเพลยออน (single aphid transmission) เพอแยกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทตดเชอรวมในแปลงปลก แตจากการทดลองพบวาในการแยก สายพนธ ทท าใหเกดอาการตนกลาเหลอง (seedling yellow) ไมสามารถแยกไดในรอบแรก บางครงพบสายพนธนในรอบทสอง ดงนนในการแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยแมลงพาหะ เพลยออนเพอใหไดเชอไวรสสายพนธเดยวตองท าการแยกเชอโดยแมลงพาหะอยางนอย 3 รอบ และอกทงในการจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสดวยแบบแผน RFLP ในครงนไดด าเนนการทดลองเพยงครงเดยวท าใหแบบแผน RFLP ทไดอาจยงขาดความชดเจน และปรมาณความเขมขนของเอนไซมจ าเพาะ Hinf I ทใชอาจไมเพยงพอในการตดดเอนเอไดทงหมด ดงจะเหนไดจากในบางไอโซเลท ยงพบการปรากฏของชนดเอนเอทมขนาด 672 bp ซงเปนผลผลตจากการเพมขยายรหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25 โดย RT-PCR (ภาพท 12) อาจสรปไดวาอาการทเกดขนบนพชทดสอบทเกดจากการปลกเชอซตรสทรสเตซาไวรสไอโซเลทซงแยกโดยแมลงพาหะและแยกโดย leaf grafting อาจเกดจากปฏสมพนธของสายพนธซตรสทรสเตซาไวรสทอยรวมกน ซงเสนอแนะใหมการทดลองซ าเพอยนยนสมมตฐานขอน 4. การทดสอบคณสมบตของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออน

4.1 คณสมบตในการแพรกระจายโดยแมลงพาหะ

คณสมบตของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนทจะน ามาใชในการปองกนการตดเชอสายพนธ รนแรงจะตองมคณสมบตทางชววทยา (biological characteristics) ทท าใหเกดอาการทไมรนแรง มการเคลอนทอยภายในพชอยางสม าเสมอและสามารถแพรกระจายไปยงยอดออนของพชทแตกออกมาใหมไดอยางรวดเรว และควรเลอกสายพนธออนทมอตราการถายทอดหรอแพรกระจายเชอสงโดยแมลงพาหะเพลยออน (Mooney et al., 1994) จากการศกษาคณสมบตในการแพรกระจายโดยแมลงพาหะโดยใชเพลยออนสม (T. citricida) โดยใช แมลงพาหะถายเชอลงบนพชทดสอบมะนาว พบวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนไอโซเลท SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 ถายทอดโดยแมลงพาหะในอตรา 70-75 เปอรเซนต (ตารางท 11) ซงสงกวาอตราการถายทอดทรายงานโดย Broadbent แล ณ 1996) ซงระบวาเพลยออน

52

สม T. citricida มอตราการถายทอดเชอไอโซเลททใหอาการ te tt n อากา แ ท เปอรเซนต

4.2 คณสมบตในการเพมปรมาณของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในพชทดสอบ

ในการตรวจวเคราะหปรมาณของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออน

ไอโซเลท SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 ในน าคนจากพชทดสอบทตดเชอ พบวาไอโซเลท SM4-P9 มปรมาณความเขมขนของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสงสดแตต ากวาปรมาณเชอ ซตรสทรสเตซาไวรสในแหลงเชอมะนาว SM4 ทงนเนองจากโพลโคลนอลแอนตบอดทน ามาใช ในการทดลองผลตจากสายพนธ เชอ SM4 และอกทงสายพนธ เชอ SM4 เปนสายเชอทมการ ตดเชอรวมหลายสายพนธ (รตนา สดด และคณะ, 2552) จงสงผลใหมปรมาณความเขมขน ของเชอซตรสทรสเตซาไวรสทสงสด สวนไอโซเลท SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 เปนไอโซเลททแยกมาจากแหลงเชอ SM4 ท าใหมจ านวนสายพนธลดนอยลงท าใหปรมาณความเขมขนของ เชอซตรสทรสเตซาไวรสทลดลงดวย

ดงนนคณสมบตในการเพมปรมาณของเชอซตรสทรสเตซาไวรส สายพนธออนในเนอเยอพชทด จะสงผลตอประสทธภาพทจะน าไปใชประโยชนในการควบคมปองกนหรอชะลอการตดเชอหรอการแสดงออกของอาการทมสาเหตมาจาเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธรนแรง (Powell et al., 1999) ตอไป

53

บทท 5

สรป

การทดลองครงนสามารถแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสไดรวมทงสน 12 ไอโซเลท โดยแยกไดจากแหลงเชอมะนาว SM4 และสมโอ DAT4-5 จ านวน 7 และ 5 ไอโซเลท ตามล าดบ โดยจดกลมเชอทแยกไดตามลกษณะอาการทชกน าใหเกดขน 3 กลม คอ กลมทใหอาการเสนใบใสระดบเลกนอยถงปานกลางและท าใหความสงเฉลยตอเดอนของพชทดสอบลดลง 17-20 เปอรเซนต ไดแกไอโซเลท SM4-P4, SM4-P5, SM4-P9, SM4-P10 และ DAT4-5-P15 กลมทใหอาการเสนใบใสระดบปานกลางถงรนแรง และท าใหความสงเฉลยตอเดอนของพชทดสอบลดลง 10-20 เปอรเซนต ไดแกไอโซเลท SM4-P15 และ SM4-P19 และในไอโซเลท SM4-P19 ยงพบอาการล าตนบมระดบเลกนอย และกลมทใหอาการรนแรงเนองจากใหอาการเสนใบใสระดบ ปานกลางถงรนแรง และความสงเฉลยตอเดอนของพชทดสอบลดต ากวา 50 เปอรเซนต ไดแก ไอโซเลท SM4-P2, DAT4-5-P2, DAT4-5-P5, DAT4-5-P8 และ DAT4-5-P10 นอกจากนยงพบอาการล าตนบมและอาการใบเหลองในพชทดสอบทตดเชอไอโซเลท SM4-P2, SM4-P19 และ DAT4-5-P8 ผลการประเมนเบองตนพบวาไอโซเลท SM4-P4, SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 มแนวโนมเปนเชอสายพนธออนเนองจากใหอาการเสนใบใสเพยงเลกนอย จากการคดเลอกเชอซตรสทรสเตซาไวรสไอโซเลททมแนวโนมเปนสายพนธออนมาจ านวน 3 ไอโซเลท คอ SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 มาจ าแนกสายพนธโดยใชลกษณะอาการทเชอแตละไอโซเลทชกน าใหเกดขนกบพชทดสอบ 3 ชนด คอ มะนาว (C. aurantifolia) สมโอ (C. grandis L.) และเกรฟรท (C. paradisi Macfad.) พบวาเชอทง 3 ไอโซเลทท าใหเกดอาการเสนใบใสเพยงเลกนอย (ระดบ 1) บนพชทดสอบมะนาวเทานน โดยมระดบอาการต ากวา 20 คะแนน ท าใหสรปไดวาเชอซตรสทรสเตซาไวรส ทง 3 ไอโซเลททแยกไดเปนเชอสายพนธออน การจ าแนกสายพนธซตรสทรสเตซาไวรส โดยการวเคราะหแบบแผน RFLP โดยการน ารหสพนธกรรมเปลอกโปรตน P25 มาตดดวยเอนไซมจ าเพาะ Hin f I พบวาไดแบบแผน RFLP ทแตกตางกน โดยจ านวนชนดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมมตงแต 5-10 ชน และมขนาด 37, 42, 49, 74, 91, 170, 261, 300, 337 และ 386 bp ผลการวเคราะหแบบแผน RFLP ของ เชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออน 3 ไอโซเลท คอ SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 พบวาทง 3 ไอโซเลท มแบบแผน RFLP ทแตกตางกน โดยพบแบบแผนรวมมากกวา 1 แบบแผน เมอ

54

เปรยบเทยบกบแบบแผน RFLP ซงรายงานไวโดย Gillings และคณะ (1993) โดยไอโซเลท SM4-P5 พบแบบแผน RFLP ของเชอกลมสายพนธ รนแรง ปานกลาง และออนรวมกน ไอโซเลท SM4-P10 พบแบบแผนของเชอกลมสายพนธรนแรงและปานกลาง และไอโซเลท SM4-P9 พบแบบแผนทไมปรากฏในรายงานของ Gillings และคณะ (1993) แตจากการจ าแนกสายพนธของเชอ ซตรสทรสเตซาไวรส โดยใชลกษณะอาการบนพชทดสอบสรปไดวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทง 3 ไอโซเลทเปนเชอในกลมสายพนธออน บงชวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดดวยแมลงพาหะประกอบดวยสายพนธมากวา 1 สายพนธ และปฏกรยาสมพนธของสายพนธไวรสทอยรวมกน อาจชกน าใหเกดอาการออน

การทดสอบคณสมบตของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนทง 3 ไอโซเลท ทแยกไดในการแพรกระจายโดยแมลงพาหะ (T. citricida) พบวาพบวาไอโซเลท SM4-P5 มอตราการถายทอดเชอโดยแมลงพาหะ 75 ขณะทไอโซเลท SM4-P9 และไอโซเลท SM4-P10 มอตราการถายทอดเชอโดยแมลงพาหะเทากน คอ และจากการทดสอบคณสมบตในการเพมปรมาณของเชอซตรสทรสเตซาไวรสในพชทดสอบมะนาวไอโซเลท SM4-P5, SM4-P9 และ SM4-P10 เปรยบเทยบกบเชอซตรสทรสเตซาไวรสทท าใหเกดการตดเชอในมะนาว SM4 ไดความเขมขน 0.064, 0.350, 0.081 และ 6.000 ไมโครกรมตอมลลลตรของน าคนของเนอเยอ พบวาไอโซเลท SM4-P9 มแนวโนมในการขยายพนธในเนอเยอมะนาวสงกวาไอโซเลท SM4-P5 และ SM4-P10 แตต ากวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสในแหลงเชอมะนาว SM4

จากการแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสดวยแมลงพาหะเพลยออนลงบนพชทดสอบมะนาวแลวจ าแนกสายพนธของเชอซตรสทรสเตซาไวรสดวยพชทดสอบ (biological ind การจ าแนกดวยวธการทางชวโมเลกล การแยกเชอโดยแมลงพาหะเพลยออน (single aphid transmission) เพยงรอบเดยวไมสามารถแยกสายพนธของ เชอซตรสทรสเตซาไวรสออกเปนสายพนธออนเดยวๆ ได แตจากการประเมนอาการบนพชทดสอบพบวาเชอซตรสทรสเตซาไวรสทแยกไดท าใหเกดอาการออน

55

เอกสารอางอง ปรชา สงเสรม. 2548. การถายทอดเชอซตรสทรสเตซาไวรสโดยเพลยออนสมสน าตาล (Toxoptera

citricida). ปญหาพเศษ วทยาศาสตรบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. ไมตร พรหมมนทร, กตตศกด กรตยะองกร, เครอพนธ กตตปกรณ และนวลจนทร ดมา. 2529.

ความแตกตางของลกษณะอาการของโรคทรสเตซาในมะนาวทเกดจาก isolate ทตางกน. วารสารวชาการเกษตร 4: 143-148.

รตนา สดด. 2537. โรคโทรมของสมจก (Citrus reticulate Blanco): เชอสาเหตและปจจยสงเสรม

ความรนแรงของโรค. วารสารสงขลานครนทร 16(4): 353-368. รตนา สดด, ปยวทย โทธรรม, ปรชา สงเสรม, อมาวด ไชยชนะ และอรสา รตนปถมภ. 2552.

ผลกระทบของเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธล าตนบมตอพชตระกลสม. รายงานการประชมวชาการพชสวนแหงชาตครงท 8 ณ โรงแรมดเอมเพรส อ าเภอเมอง จงหวดเชยงใหม, 6-9 พฤษภาคม 2552 หนา 106.

รตนา สดด, มลคล แซลม และสภาพ เกยรตทบทว. 2543. การควบคมโรคทรสเตซาในสมจก

โดยการปลกเชอสายพนธ ไมรนแรง. รายงานการวจยภาควชาการจดการศตรพช คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

รตนา สดด, สมปอง เตชะโต และJohn Milne. 2551. การพฒนาวธการทางเซรมวทยาเพอวนจฉย

โรคทรสเตซาของสมในประเทศไทย. รายงานวจยส านกงานกองทนสนบสนนการวจย (สกว.).

สรภทร พงษเสฐ. 2526. การวนจฉยโรคทรสเตซาของสมเขยวหวาน. วทยานพนธ วทยาศาสตร

มหาบณฑต มหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

56

Atta, S., Liu, Y., Cao, M., Yang, F., Zhou, Y. and Zhou, C. 2011. Molecular characterization of Citrus tristeza virus isolates from Pakistan based on CPG/Hinf I restriction fragment length polymorphism (RFLP) groups analysis. African Journal of Biotechnology 10(44): 8689-8694.

Ayazpour, K., Sijam, K., Vadamalau, G. and Jaafar, H. 2011. Molecular characterization

of citrus tristeza virus strains in Peninsular Malaysia. African Journal of Microbiology Research 5(18): 2838-2846.

Bänziger, H. 1997. Keys for the identification of aphids (homoptera) II. Field

Identification of common wingless aphids of crops in Thailand. Agriculture and Co-operatives. Bangkok, Thailand, 23 p.

Bar-Joseph, M., Gumpf, D.J., Dodds, J.A. Rosner, A., and Ginzberg, I. 1985. A simple

purification method for citrus tristeza virus and estimation of its genome size. Phytopathology 75: 195-198.

Bar-Joseph, M., Marcus, R. and Lee, R.F. 1989. The continuous challenge of citrus tristeza virus control. Annual Review Phytopathology 27: 291-316.

Barzegar, A., Sohi, H.H. and Rahimian, H. 2005. Comparative sequence analysis of coat

protein gene of Iranian citrus tristeza virus isolates. Journal of Phytopathology 153: 457-463.

Bekolo, N., Zachée, A., Louis, B.M. and Akoa, A. 2007. Discrimination of citrus tristeza

virus (CTV) strains using Mexican lime/citrange troyer combinations (Citrus poncirus/Citrus trifoliate x Poncirus sinensis). African Journal of Biotechnology 6(4): 375-378.

57

Broadbent, P., Brlansky, R. H. and Indsto, J. 1996. Biological characterization of Australian isolate of citrus tristeza virus and separation of subisolate by single aphid transmissions. Plant Disease 80: 329-333.

Broughton, S. 2007. Aphids in citrus. Western Australia, Department of Agriculture and

Food, 2007. Farmnote (South Perth, W.A.), Australia, 2 p. Corazza-Nunes, M.J., Machado, M.A., Stach-Machado, D.R., Nunes, W.M.C. and Müller,

G.W. 2006. Charaterization of citrus tristeza virus isolate from grapefruit (Citrus paradisi Macf.) accessions of citrus active germplasm bank. Summa Phytopathologica 32(4): 322-327.

Costa, A.S. and Muller, G. 1980. Tristeza control by cross protection. Plant Disease 64:

538-541. Davino, S., Rubio, L. and Davino, M. 2005. Molecular analysis suggests that recent

citrus tristeza virus outbreaks in Italy were originated by at least two independent introductions. European Journal of Plant Pathology 111: 289-293.

Dodds, A. 1993. dsRNA in diagnosis. In: Matthews REF, ed. Diagnosis of Plant Virus

Diseases. CRC Press, Boca Raton, pp. 94-273. Figueroa, J., Foguet, L., Castellanos, A.l.F. and Stein, B. 2009. Biological

characterization of citrus tristeza virus strains in lemon in Tucumán, Argentina. Revista Industrial y Agricola de Tucumán (2009) Tomo 86(1): 37-41.

58

Garnsey, SM., Civerolo, E.L., Gumpf, D.J., Paul, C., Hilf, M.E., Lee, R.F., Brlansky, R.H., Yokomi, R.K. and Hartung, J.S. 2005. Biological characterization of an international collection of citrus tristeza virus (CTV) isolates. Proceedings of the 16th Conference, International Organization of Citrus Virologists, USA, 3-6 November 2004, pp. 75-93.

Gillings, M., Broadbent, P., Indsto, J. and Lee, R.F. 1993. Characterization of isolates

and strains of Citrus tristeza closterovirus using restriction analysis of the coat protein gene amplified by the polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 44: 305-317.

Halbert, S.E. and Brown, L.G. 2003. Brown citrus aphid, Toxoptera citricida (Kirkaldy).

(online) Available from: http://edis. ifas. ufl. edu. (accessed November 12, 2009) Hilf, M.E., Mavrodieva, V.A. and Garnsey, S.M. 2005. Genetic marker analysis of a

global collection of isolates of citrus tristeza virus : characterization and distribution of CTV genotypes and association with symptoms. Phytopathology 95: 909-917.

Jiang, B., Hong, N., Wang, G.P., Hu, J., Zhang, J.K., Wang, C.X., Liu, Y. and Fan, X.D.

2008. Characterization of citrus tristeza virus strains from southern china based on analysis of restriction patterns and sequences of their coat protein gene. Virus Genes 37: 185-192.

Kano, T., Natsuaki, T., Isaka, M. and Suastika, G. 2006. Restriction fragment length

polymorphism analysis of citrus tristeza virus isolate in Japan and its application to cross-protection experiments. Bulletin of the National Institute of Fruit Tree Science 5: 63-70.

59

Karasev, A.V., Boyko, V.P., Gowda, S., Nikolaeva, O., Hilf, M.E., Kooni, E.V., Niblett, C.L., Cline, K., Gumpf, D.J., Lee, R.F., Lewandowski, D.J. and Dawson, W.O. 1995. Complete sequence of the citrus tristeza virus RNA genome. Virology 208: 511-520.

Koizumi, M. 2001. Citru tristeza virus : symptoms and control. (online) Available from:

http://fftc.imita.org/library.php?func=view&id=20110714095638 (accessed October 22, 2009)

Komazaki, S. 1993. Biology and virus transmission of citrus aphids. (online) Available

from: http://www.fftc.agnet.org/library.php?func=view&style=type&id=201107 12190621 (accessed December 25, 2009)

Korkmaz, S. 2002. Investigation of biological properties, double-stranded RNA patterns

and antigen concentration in citrus species infected with citrus tristeza virus. Phytoparasitica 30 (4): 420-428.

Mooney, P., Dawson, T. and Harty, A. 1994. Citrus tristeza virus preimmunization

strategies. (online) Available from: http://www.hortnet.co.nz/publications /science/kk0894.htm (accessed November 20, 2009)

Muller, G.W. and Rezende, J.A.M. 2004. Preimmunization: applications and

perspectives in virus disease control. Disease of Fruits and Vegetables 1: 361-395.

Nikolaeva, O.V., Karasev, A.V., Garnsey, S.M. and Lee, R.F. 1998. Serological

differentiation of the citrus tristeza virus isolate causing stem pitting in sweet orange. Plant Disease 82: 1276-1280.

60

Ochoa, F., Carballo, O., Trujillo, G., Izaquirre, M.L.M. and Lee, R.F. 1993. Biological characterization and evaluation of cross protection potential of citrus tristeza virus isolate in Venezuela. Proceedings of the 12th Conference, International Organization of Citrus Virologists, USA, 23-27 November 1992, pp. 1-7.

Powell, C.A., Pelosi, R.R., Rundell, P.A., Stover, E. and Cohen, M. 1999. Cross-

protection of grapefruit from decline-inducing isolate of citrus tristeza virus. Plant Disease 83: 989-991.

Rocha-Pena, M., Lee, R. F., Lastra, R., Niblett, C. L., Ochoa-Corona, F., Yokomi, R. K.

and Garnsey, S. M.1995. Citrus tristeza virus and its aphid vector Toxoptera citricida. Plant Disease 79: 437-445.

Roistacher, C.N. 1991. Graft-Transmissible disease of Citrus : Handbook for Detection

and Diagnoses. International Organization of Citrus Virologist. Rome, FAO, 286 p. Senan, A.A., Bonsi, C.K. and Basiouny, F.M. 1997. Indexing of citrus tristeza virus using

serological and biological tests. Proceeding of the Florida State Horticultural Society 119: 77-79.

van der Vyver, J.B., van Vuuren, S.P., Luttig, M. and da Graca, J.V. 2002. Changes in

the Citrus Tristeza Virus status of pre-immunized grapefruit field trees. Proceedings of the 15th Conference, International Organization of Citrus Virologists, Cyprus, 11-16 November 2001, pp. 175-185.

61

Yokomi, R.K., Lastra, R., Stoetzel, M.B., Damsteegt, V.D., Lee, R.F., Garnsey, S.M., Gottwald, T.R., Rocha-Pena, M. and Niblett, C.L. 1994. Establishment of the brown citrus aphid (Homoptera: Aphididae) in Central America and the Caribbean Basin and transmission of citrus tristeza virus. Journal Economic Entomology 87: 1078-1085.

Zhou, C.Y., Hailstones, D.L., Broadbent, P., Connor, R. and Bowyer, J. 2002. Studies on

mild strain cross protection against stem-pitting citrus tristeza virus. Proceedings of the 15th Conference, International Organization of Citrus Virologists, Cyprus, 11-16 November 2001, pp. 151-157.

Zhou, Y., Zhou, C.Y., Song, Z., Liu, K.H. and Yang, F.Y. 2007. Characterization of citrus

tristeza virus isolates by indicators and molecular biology methods. Agricultural Sciences in China 6(5): 537-579.

62

ภาคผนวก

63

1. สตรการเตรยม ลตร Tris base (0.45 M) 54 กรม Boric acid (0.45 M) 27.5 กรม EDTA pH 8.0 (0.01 M) 20 มลลลตร (0.5 M EDTA) 2. สตรการเตรยม Loading dye ปรมาตร 10 มลลลตร Glycerol 5 มลลลตร EDTA (1 mM) 40 ไมโครลตร (0.2 M EDTA) Bromophenol (0.25%) 0.04 กรม Xylene cyanol (0.25%) 0.04 กรม 3. สตรการเตรยม Polyacrylamide gel 8% TBE buffer (5×stock) 9 มลลลตร Acrylamide:Bis (30% stock) 12 มลลลตร Tetramethylethylenediamine (TEMED) 25 ไมโครลตร Ammonium persulfate (10% stock) 286 ไมโครลตร Sterile deionized water 24 ไมโครลตร 4. สตรการเตรยม Agarose gel 1.5% Agarose (Molecular grade) 0.45 กรม 0.5 เทา TBE buffer 30 มลลลตร 5. สตรการเตรยม STE buffer 1 เทา ปรมาตร 500 มลลลตร Tris-Cl (0.5 M) 50 NaCl (5 M) 10 EDTA (0.5 M) 1 มลลลตร 6. สตรการเตรยม Coating buffer ปรมาตร 1 ลตร Na2CO3 1.59 กรม

64

NaHCO3 2.93 กรม NaN3 0.20 กรม (pH 9.6)

7. สตรการเตรยม Phosphate buffer saline (PBS) ปรมาตร 1 ลตร

NaCl 8.00 กรม KH2PO4 0.20 กรม Na2HPO412H2O 2.90 กรม KCl 0.20 กรม (pH 7.2 – 7.4)

8. สตรการเตรยม Washing buffer (PBS-T) ปรมาตร 1 ลตร

PBS 1.0 ลตร Tween 20 0.5 มลลลตร

9. สตรการเตรยม Conjugate buffer ปรมาตร 1 ลตร

PBS-T 1.0 ลตร Polyvinylpyrrolidone Mr 40,000 20 กรม

10. สตรการเตรยม Substrate buffer ปรมาตร 1 ลตร

Diethanolamine 97 มลลลตร NaN3 0.2 มลลลตร

(ปรบ pH ใหได 9.8 ดวย HCl) 11. สตรการเตรยม Stopping reaction solution ปรมาตร 1 ลตร

NaOH 120 กรม

65

ประวตผเขยน ชอ สกล นางสาวพฒตาล ทพเพง รหสประจ าตวนกศกษา 5210620033 วฒการศกษา

วฒ ชอสถาบน ปทส าเรจการศกษา วทยาศาสตรบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2551 (การจดการศตรพช) ทนการศกษา

- ทนสนบสนนโครงการวจยวทยานพนธบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร - ทนสนบสนนจากโครงการสงเสรมการวจยในอดมศกษาและการพฒนามหาวทยาลยวจย

แหงชาต ของส านกงานคณะกรรมการการอดมศกษา การตพมพเผยแพรผลงาน พฒตาล ทพเพง และรตนา สดด. 2555. การแยกเชอซตรสทรสเตซาไวรสสายพนธออนดวยแมลง

พาหะเพลยออนสม [Toxoptera citricida (Kirkaldy)]. ว. วทยาศาสตรเกษตร. 43(2)(พเศษ): 269-272.

Tippeng, P. and Sdoodee, R. 2011. Characterisation of citrus tristeza closterovirus isolates from Thailand using restriction analysis of their coat protein gene. The 4th Asian conference on plant pathology concurrent with The 18th Biennial Australasian plant pathology society conference. New Frontiers in Plant Pathology for Asia and Oceania 26-29 April 2011. Darwin Convention Centre Darwin, NT, Australia. (ภาคโปสเตอร)